CN101035439B

CN101035439B - 通过亲和色谱法进行的连续蛋白质分离和提纯方案

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Publication number: CN101035439B
Application number: CN200580027498XA
Authority: CN
Inventors: 史蒂文·詹姆斯·伯顿; 巴尔德夫·贝恩斯; 约翰·柯林; 蒂莫西·基思·海斯; 德文胡·陈; 克里斯托弗·布莱恩特; 大卫·约翰·哈蒙德
Original assignee: Prometic Biosciences Ltd; American National Red Cross
Current assignee: Prometic Bioseparations Ltd; American National Red Cross
Priority date: 2004-08-20
Filing date: 2005-08-19
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2025-08-19
Also published as: CA2576963C; TWI392685B; JP2008510724A; EP1786273B1; TW200621798A; BRPI0514435B8; EP1786273A2; BRPI0514435B1; ES2710025T3; CN101035439A; WO2006023831A3; AU2005277190A1; BRPI0514435A; US8198407B1; DK1786273T3; PL1786273T3; WO2006023831A2; JP4970260B2; MX2007002085A; EP1786273A4

Abstract

本发明公开了通过亲和色谱法从生物样品中连续分离和提纯蛋白质的方法。使用选择性和特异性结合到生物样品中的蛋白质上的配体或配体载体络合物进行亲和色谱法。配体或配体载体络合物以预定顺序连续与生物样品接触以使各个配体或配体-载体络合物从生物样品中连续结合蛋白质。

Description

通过亲和色谱法进行的连续蛋白质分离和提纯方案

相关申请的交叉引用

本申请要求2004年8月20日提交的临时专利申请序列号60/602,868的优先权，其全部内容在此完整引入作为参考。

技术领域

本发明涉及从生物样品中分离蛋白质的方法。特别地，本发明涉及连续从生物样品中回收高纯蛋白质的方法。

背景技术

蛋白质加工和发育要求以最少步骤数和最大输出量进行高效加工以实现所需纯度。由于蛋白质的多样性、与每种蛋白质制品有关的可能的污染物和/或杂质的不同性质、和制造生物药品通常所需的大量蛋白质，蛋白质分离和提纯法面临着特有的挑战。传统的提纯技术通常包括以分离单种蛋白质目标为目的的一系列提纯步骤。随着每一步骤，收率降低且制造成本提高。蛋白质分离和提纯成本通常构成所有治疗用蛋白质总制造成本的50％以上。

亲和色谱法是药物发现和工艺开发中最重要的分离技术之一。亲和步骤的选择性越高，整个企业的效率就越高，这是蛋白质分级实验中的关键要求。亲和色谱法在从多组分流中提纯、检测和去除目标分子时找到许多实际用途。亲和色谱法基于目标分子和与其结合的实体(即配体)之间特异性的三维相互作用。可以分离或生成以特异性和可逆方式结合到几乎任何目标分子上的配体。潜在配体包括生物分子，例如蛋白质、抗体、肽和类似物，和专门设计或选择的合成配体。可以使用组合合成技术生成数百万种潜在配体的库，其中许多是本领域中公知的(参看，例如Lam等人，Nature：354，82-84(1991))。为了有助于从样品中分离目标分子，配体可以固定到固体载体基质，例如单独的粒子(例如色谱法树脂珠)或邻接载体(contiguoussupports)(例如阵列)上。然后使用固定在固体载体基质上的配体从复合溶液中提纯目标物。

在生物制药单克隆抗体提纯领域中可能已经实现了规模化亲和色谱法的最大成功。对蛋白质A树脂的年需求超过10,000升并以每年50％的速度增长，这代表蛋白质A吸附剂市场在2002年超过5千万美元。免疫亲和色谱法的使用能够生产血浆衍生的和重组的凝血因子VIII和IX以及来自天然和重组来源的其它血浆蛋白质和生物药品。

然而，用在下游加工中的现代亲和色谱法的最有效形式之一不依靠来自天然来源(例如抗体)的配体，而是依靠高稳定性合成亲和配体的使用。参看，例如，Sproule等人，New Strategy for the Design ofLigands for the Purification of pharmaceutical proteins by affinitychromatography；J.Chromatography B，740，17-33(2000)。这种方法使用定制或设计成的(designer)配体代替使用现成化合物。

在本领域中分离的血浆蛋白质中，对于医疗用途，特别以白蛋白和丙种球蛋白为靶。常用于从血浆中分离这些蛋白质的程序是基于E.J.Cohn和同事在二十世纪四十年代开发出的冷乙醇沉淀法。参看Cohn et.al.，Preparation and Properties of Serum and Plasma Proteins.IV.A System for the Separation into Fractions of the Protein and LipoproteinComponents of Biological Tissues and Fluids；J.Am.Chem.Soc.，68，459-475(1946)。最初开发出该方法用于高收率制造白蛋白，而不是用于分离和提纯现在由血浆制成的各种蛋白质。特别地，通过这些技术产生的次要血浆蛋白质组分的收率总是如此低以致这些技术在总分级收率方面不可避免地低效。参看，例如，授予Uemura等人的美国专利5,138,034。

亲和色谱法用于血清白蛋白是本领域中已知的，参看Harvey MJ.In：Curling JM(ed)Methods of Plasma Protein Fractionation.AcademicPress London.pp 189-200。第一次报导的从血浆中分离蛋白质追溯到大约30年前并涉及通过色谱法从血浆中消耗人类血清白蛋白(HSA)以便识别并提纯低浓度蛋白质。Travis，J.和Pannell，R.Behring Inst.Mitt.54：30-32(1974)。使用Procion Blue dextran-Sepharose

共轭物进行该操作并确定染料-亲和色谱法的首要问题，即染料渗入洗出液。作者关心从血浆中分离α1-抗胰蛋白酶并描述了在高离子强度下从白蛋白中困难地分离这种蛋白质，其中任何非特异性离子交换结合处于最小程度。

还论述了从血浆中分离各种其它蛋白质。例如，现有技术的方法描述了分离和提纯血浆蛋白因子VIII和粘连蛋白馏分，参看，例如，美国专利4,822,872、4,093,608和4,565,651。在例如美国专利3,842,061中公开了抗凝血酶-III的分离和提纯方法。在例如Science：170，1095(1970)、美国专利4,361,652和4,361,653中公开了血纤维蛋白溶酶原的分离和提纯方法。在美国专利4,371,520和4,093,606中描述了免疫球蛋白的分离和提纯方法。在例如美国专利4,061,735和4,137,307中描述了hepataglobulin的分离和提纯方法。但这些方法缺乏从相同原材料(例如人类血浆)中分离用于制造多种生物药剂的蛋白质所需的特异性和选择性。

尽管从生物样品中分离蛋白质的方法已经在提高的比活度和纯度以及在收率或回收率方面对产品质量提供了一定的改进，但仍然需要进一步的工艺改进，从而以高收率和高纯度获得蛋白质浓缩物，同时最大限度地减少通常与现有技术的方法有关的分离的蛋白质的比活度降低。在从共同的来源同时分离多个蛋白质目标的情况下，尤为如此。本发明通过提供使用亲和色谱技术(其以预定和指定次序与吸附法结合)从生物材料，特别是从血浆中有效分离和提纯各种蛋白质的方法，解决了这些和其它长期以来的需要。

发明内容

本文所公开和描述的本发明提供了从生物样品中连续分离和提纯蛋白质的方法。这些方法包括(i)提供生物样品，(ii)提供两种或多种配体，它们各自选择性并特异性地结合到来自生物样品的目标蛋白质上，其中各个配体任选连接到载体上以形成两种或多种配体-载体络合物，(iii)使两种或多种配体或配体载体络合物以预定顺序与生物样品连续接触以使各个配体或配体载体络合物从生物样品中连续结合目标蛋白质，其中生物样品在接触之前不通过预调节步骤进行处理，(iv)洗脱结合到两种或多种配体或配体载体络合物的每一个上的目标蛋白质，和(v)连续从生物样品中分离目标蛋白质。预调节步骤包括如下各种过程——例如，醇沉淀、冷沉淀、脂质和/或脂蛋白的去除、优球蛋白沉淀、或它们的组合。

在一个实施方案中，生物样品是血浆，目标蛋白质包括血纤维蛋白原(Fg)、α-1蛋白酶抑制剂(A1PI)、载脂蛋白A1(ApoA1)、免疫球蛋白(IgG)、对氧磷酶(PON)、凝血因子、血管性血友病因子(vWF)、因子VIII(FVIII)、人血清白蛋白(HSA)、血纤维蛋白溶酶原(Pg)或它们的任意组合。

在另一实施方案中，生物样品包括体外发酵或细胞培养物或从转基因动物或植物中提取的组织或流体，蛋白质是重组蛋白质。

在再一实施方案中，在蛋白质分离过程中，在生物样品中基本保持对氧磷酶的活性。

在一个实施方案中，vWF/FVIII在其它蛋白质之前或在其它蛋白质之后从血浆中分离。

在另一实施方案中，载脂蛋白A1在其它蛋白质之后从血浆中分离。

在再一实施方案中，白蛋白在IgG之前或在IgG之后从血浆中分离。

在另一实施方案中，血纤维蛋白溶酶原在血纤维蛋白原之前从血浆中分离。

在再一实施方案中，两种或多种配体与生物样品接触的预定顺序导致vWF/FVIII、Pg、Fg、ApoA1/PON、IgG、HSA和A1PI以所述顺序连续结合。

在另一实施方案中，两种或多种配体与生物样品接触的预定顺序导致vWF/FVIII、ApoA1/PON、Pg、Fg、IgG、HSA和A1PI以所述顺序连续结合。

在再一实施方案中，两种或多种配体与生物样品接触的预定顺序导致vWF/FVIII、IgG、HSA和A1PI以所述顺序连续结合。

本发明的配体包括多肽或核酸基分子、抗体或抗原结合片段、非多肽或核苷酸基分子、碳水化合物模拟物、肽模拟物、小分子、无机材料、染料、碳水化合物、脂质、或它们的任意组合。

在一个实施方案中，配体是含有大约1至大约15个氨基酸的肽。

在另一实施方案中，配体和/或配体载体络合物包括合成的亲和配体，例如Mimetic Blue

配体、Mabsorbent 配体、ProMetic PBL112-80、ProMetic PBL 112-81、ProMetic PBL 112-82和ProMetic PBL 112-83。

载体包括合成材料和/或天然材料。载体的例子包括琼脂糖、聚丙烯酰胺、葡聚糖、纤维素、多糖、硝基纤维素、二氧化硅、矾土、氧化铝、二氧化钛、氧化钛、氧化锆、苯乙烯、聚二氟乙烯尼龙、苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物、聚甲基丙烯酸酯、羟乙基甲基丙烯酸酯、丙烯酸类、聚乙烯醇、聚乙二醇、衍生的二氢唑酮聚合物或共聚物、玻璃、纤维素、琼脂糖、任何前述物质的衍生物、和任何前述物质的组合。

在优选实施方案中，载体是多糖或树脂珠。

在另一方面，本发明提供了包含通过本发明的连续蛋白质分离法制成的基本纯净的血浆蛋白质的制品。

在一个实施方案中，血浆以至少70％的纯度基本纯化。

在另一实施方案中，制品基本纯化，不含任何免疫吸附剂引起的杂质，并已经经过至少一个病原体灭活步骤。

在再一实施方案中，在接触步骤之前用缓冲剂处理生物样品以进一步保持生物样品中的一种或多种目标试剂的浓度和活性。

在另一方面，将该制品配制成药用组合物。

本文中详细公开了本发明的这些和其它方面和实施方案。

具体实施方式

本文公开了从生物样品中有效分离和提纯蛋白质的方法。特别地，本发明公开了使用亲和色谱法从血浆中连续提纯蛋白质的方法。本发明的连续蛋白质提纯法使用两种或多种配体，各个配体任选连接到载体上以形成配体-载体络合物。各个配体或配体载体络合物以预定顺序选择性并特异性结合到目标血浆蛋白质上以使各个配体或配体载体络合物从血浆中连续结合目标蛋白质。

本发明的连续蛋白质分离和提纯法高度特异性，并且在与配体接触之前不需要现有技术中惯用的血浆的特异性预调节。这种预调节步骤不包括缓冲或一般过滤。在本发明范围内的预调节步骤尤其包括如下方法和过程——例如醇沉淀、冷沉淀、脂质和/或脂蛋白的去除、优球蛋白沉淀或它们的组合。本文中还预计到，将上述预调节步骤专门排除在所要求的本发明外。本发明的血浆蛋白质提纯法由于它们有效且迅速地制造基本纯净且高度活性的血浆蛋白质的能力，在生物药品制造中非常有价值。本发明的方法还可用于多种其它用途，包括异常状态的预测、诊断和/或检测。

I.定义

本申请中所用的定义用于解释说明，其不限制本发明的范围。

本文所用的“样品”包括含有可通过本发明的方法分离和提纯的目标蛋白质的任何样品。样品可以获自可能含有目标蛋白质的任何来源。这些来源尤其包括动物、植物、土壤、空气、水、真菌、细菌和病毒。动物样品，例如，获自活组织检查、血液、毛发、口腔刮物(buccalscrapes)、血浆、血清、皮肤、腹水、胸腔积液、胸腔穿刺液、脊髓液、淋巴液、骨髓、呼吸液(respiratory fluid)、肠液、外阴液、粪便、尿、唾液、泪液、痰液、肿瘤、器官、组织、体外细胞培养物成分的样品、胎儿细胞、胎盘细胞或羊膜细胞和/或羊水。

本文所用的“细胞培养物”包括任何原核或真核培养物，例如细菌、酵母或其它微生物细胞培养物、哺乳动物细胞培养物、植物细胞培养物、和昆虫培养物、发酵液和用于制造和传送生物药品和制备治疗剂的其它细胞培养物。

本文所用的“血浆”是指液态血液成分并包括血浆衍生物，和含血浆的组合物。

本文所用的“连接”在本发明的范围内具有广泛定义，并包括两种实体之间的任何类型的物理、化学或生物结合法，包括，例如但不限于，吸收、吸附、共价键合、离子交换、疏水、氢键合、偶极子、四极子或亲和相互作用、带电物的形成、亲和配体(例如，包括，肽、寡核苷酸、蛋白质、间隔臂、疏水部分和氟化材料)的连接。

本文所用的“配体”在本发明的范围内具有广泛定义，并包括结合到目标蛋白质上的化学或生物实体。配体是结合到目标蛋白质上并可以从天然或合成材料中分离的化合物、分子、细胞和细胞成分。配体可以是原核生物或真核生物内源或外源的。配体包括肽、多肽、肽模拟物、小分子、染料、含三嗪的化合物、抗体或抗原结合片段、核酸基分子、非多肽或核苷酸基分子、碳水化合物、碳水化合物模拟物、脂质、无机材料、抑制剂、底物或它们的任意组合。

本文所用的“基本纯化”或“基本不含”是指从其天然环境中提取并分离并至少大约70％不含，优选大约85％不含，更优选大约95％不含，最优选大约99％不含与其天然相联的其它成分的蛋白质。

本文所用的“多肽基分子”包括任何蛋白质、多肽或肽片段、天然肽、重组肽、合成肽、生物活性片段、基本同源的多肽、寡肽、同型二聚体、杂二聚体、多肽的变体、改性多肽、衍生物、类似物、融合蛋白、激动剂、拮抗剂、和抗体。

本文所用的“小分子”包括，但不限于，碳水化合物、碳水化合物-模拟物、肽模拟物、分子量小于大约10,000克/摩尔的有机或无机化合物(即包括heteroorganic和有机金属化合物)、分子量小于大约5,000克/摩尔的有机或无机化合物、分子量小于大约1,000克/摩尔的有机或无机化合物、分子量小于大约500克/摩尔的有机或无机化合物、和盐、酯和这些化合物的其它化学可接受形式。

本文所用的术语“病原体”是指可以在血液样品之类的生物样品中找到或感染生物体的任何可复制介质。这些病原体包括本领域技术人员已知通常在全血或血液成分中找到的或感染全血或血液成分的各种病毒、细菌、原生动物和寄生物，和未知的其它致病污染物。这些病原体的示例性例子包括，但不限于，细菌，例如链球菌属、埃希氏菌属和杆菌属；病毒，例如人类免疫缺陷病毒和其它逆转录病毒、疱疹病毒、副粘病毒、巨细胞病毒、肝炎病毒(包括甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎)、痘病毒和toga病毒；和寄生物，例如疟原虫，包括疟原虫属和锥体虫寄生物。

可用领域中的普通技术人员通常会理解本文所用的在蛋白质提纯领域中使用的其它术语。

在一个实施方案中，本发明提供了从血浆中提取特定血浆蛋白质的方法。这些方法采用其上连有对两种或多种血浆蛋白质呈选择性和特异性的配体的色谱法树脂。使树脂与血浆接触，这种接触导致目标蛋白质与配体的选择性结合。然后以高回收率和纯度洗脱目标蛋白质。由此，根据本发明的方法，可以有效地将血浆分级成各种血浆蛋白质成分。本文中公开了特定血浆蛋白质的提取和随后分离的优选顺序。

本发明范围内的血浆蛋白质包括血浆中存在的超过10,000种不同蛋白质中的任一种，例如但不限于，丁酰胆碱酯酶(BChE)、凝血因子(例如血纤维蛋白原、因子II、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI和因子XII)、纤连蛋白、凝血酶原、蛋白质C、血纤维蛋白溶酶原、抗凝血酶-III、结合珠蛋白、转铁蛋白、白蛋白、α1蛋白酶抑制剂、载脂蛋白A1(也称作ApoA1脂蛋白)、免疫球蛋白、对氧磷酶、血管性血友病因子(vWF)，所有这些均天然出现在未患病状态的生物体的血浆中。

或者，在与患病状态相关的血浆中存在本发明范围内的血浆蛋白质，它们在健康对象的血浆中可以或不可以找到。由于试剂，例如药物的施用而存在于血浆中的血浆蛋白质也在本发明的范围内。在这点上，血浆蛋白质可以是传染性PrPsc朊病毒蛋白。

1.配体

本发明的蛋白质提纯方法利用连接到载体体系上的两种或多种配体。配体可以包含一个或多个官能团以提供与待分离的生物分子上的相应基团的离子型、疏水、氢键合或范德瓦尔斯相互作用。适合本发明的方法的配体包括例如通过直接合成法或化学物库(diversitylibraries)，例如随机或组合的肽或非肽库制成的合成化学化合物。本领域已知的其它库包括化学合成库、重组库(例如噬菌体展示库)、和体外转译库。可以针对特异性结合到本发明的目标蛋白质上的分子筛选这些库。

例如在Fodor等人，Science 251：767-773(1991)；Houghten等人，Nature 354：84-86(1991)；Brenner and Lemer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5381-5383(1992)和美国专利6,117,996中描述了化学合成库的例子。例如在Scott和Smith，Science 249：386-390(1990)；Devlin等人，Science 249：404-406(1990)和Christian等人，J.Mol.Biol.227：711-718(1992)中描述了噬菌体展示库的例子。在Mattheakis等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9022-9026(1994)中描述了体外转译库。

在一个实施方案中，本发明的配体是主要由大约3至大约5、8、10、15或30个氨基酸或更多氨基酸构成的肽。氨基酸是D和/或L氨基酸。肽可以方便地选自任何肽库，包括随机肽库、组合肽库、或偏移肽库。术语“偏移”在本文中用于指控制生成该库的方法以限定控制所得分子集合的多样性的一种或多种参数。

在肽库中，随着所进行偶联反应的数量、肽的尺寸和所用的不同氨基酸的数量，不同次序的离散肽的数量急剧提高。例如，19个氨基酸随机并入五肽中产生了具有不同次序的多达2,476,099(19⁵)个独立的肽(Lam等人，见上)。组合法能够在载体上直接生成配体库。通常，在载体粒子上合成配体，从而在各个粒子(例如珠粒)上合成单种配体的多个复制品，尽管这不是本发明所要求的。

Ostresh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11138-11142(1994)描述了可用的库的另一例子，其中肽中的酰胺官能已经被permethylated以产生化学转化的组合库。

非肽库可以粗略分成两类：decorated单体和低聚物。Decorated单体库采用相对简单的骨架(scaffold)结构，在其上添加各种官能团。通常，骨架是具有已知有效的药理活性的分子。例如，骨架可以是苯并二氮杂卓(benzodiazepine)结构。

非肽低聚物库采用大量单体，它们以产生新形状的方式组合在一起的，这种新形状取决于单体的顺序。已用的单体单元包括氨基甲酸酯、pyrrolinones、和morpholinos。类肽，和肽类低聚物(其中侧链连接到α氨基而非α碳上)构成另一版本的非肽低聚物库的基础。第一非肽低聚物库采用单种单体并由此含有重复骨架。最近的库已经采用一种以上的单体，这增加了库的灵活性。

Ecker和Crooke，Bio/Technology 13：351-360(1995)描述了本发明中可用的其它非肽库。这些库使用苯并二氮杂卓(benzodiazepine)之类的化合物(参看，例如，Bunin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：4708-4712(1994))。此外，还可以使用类肽库(例如，Simon等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：9367-9371(1992))。肽库中所用的其它化合物包括乙内酰脲、哌嗪二酮、联苯、糖类似物、β-巯基酮、芳基乙酸、酰基哌啶、苯并吡喃、立方烷、黄嘌呤、胺化酰亚胺和噁唑酮。

可以通过多种公知的方法实现库的筛选。参看，例如，下列参考文献，它们公开了肽库的筛选：Parmley和Smith，Adv.Exp.Med.Biol.251：215-218(1989)；Scott和Smith，id.；Fowlkes等人，BioTechniques13：422-427(1992)；Oldenburg等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5393-5397(1992)；和Yu等人，Cell 76：933-945(1994)。也可以通过使库成员与固定在固相上的目标蛋白质接触并收取结合到相关蛋白质上的库成员来进行筛选以确定与目标蛋白质结合的分子。例如在Fowlkes等人(同上)中描述了这种筛选方法的例子，名为“panning”技术。

优选地，通过建模和组合化学来设计本发明的配体，并包括可以是对称或不对称、单一或分支分子的合成/仿生配体。配体优选是耐碱的并承受正常的碱再生和消毒程序。本发明的配体具有非常低的渗漏性，是安全的，并具有与目标蛋白质的高结合能力和高特异性。

本发明范围内所用的优选配体或配体和载体体系包括，例如但不限于，Mimetic Blue

配体(用于HSA柱)，树脂是选定的MimeticBlue

SAHL P6XL；MAbsorbent

配体(用于结合IgG)，吸附剂是选定的MAbsorbent

A2P；用于A1PI的ProMetic PBL 112-80吸附剂；用于血纤维蛋白原的ProMetic PBL 112-81吸附剂；用于血纤维蛋白溶酶原的ProMetic PBL 112-82吸附剂；用于vWF/FactorVIII的ProMetic PBL 112-83吸附剂；ECH-Lys-琼脂糖凝胶(Sepharose)FF.Lot#243526；SAHL P6XL-树脂；和包括ARQFDF的肽配体树脂(SEQID NO：1)。前述吸附剂使用Purabead 6XL(交联琼脂糖)作为载体基质。Purabead 6或6XL载体基质本身不会吸附这些蛋白质。

2.载体

在本发明的方法的一个实施方案中，将配体连接到载体上。本文所用的术语“载体”是指用于固定配体的任何载体基质，例如本领域已知的那些固体载体。载体或载体基质是可以在其上连接配体并提供在接触溶液中将配体与溶质分离的方便手段的任何固体或液体物质，其是多孔或无孔的二维或三维物质。优选地，载体在配体连接之后是惰性的，从而使与目标物的共价反应最小化。

本发明的范围内还包括使用间隔臂将配体偶联到载体上。间隔臂可以具有多种不同形式，包括但不限于，羟基化材料，例如聚乙二醇、聚环氧乙烷、直链或支链烷、二胺、甘醇、芳环、和碳水化合物或它们的任意组合。

在一个实施方案中，载体基质包括能够吸附或吸收目标试剂的多孔粒子。粒子任选被一种或多种材料涂布以改变载体基质的表面性质，这种材料在有机流体或水流中是不可溶胀或可溶胀的并基本不溶于水或流体。

本发明的连续蛋白质提纯方案所用的优选载体基质是多孔粒子。吸附分离用的多孔粒子可以以多种不同的材料(包括二氧化硅、玻璃、纤维素、琼脂糖)和多种不同的聚合物(包括聚苯乙烯聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、琼脂糖、水凝胶、丙烯酸树脂和用于电泳的其它类型的凝胶)提供。许多多孔吸附粒子(例如二氧化硅、玻璃和聚合物)可以干燥并具有表面积为大约1-2平米/克干燥粒子至超过300平米/克干燥粒子的互连孔。粒子的其它类型为交联水凝胶。

特别优选的载体基质是琼脂糖和聚羟基化甲基丙烯酸酯树脂。多种珠状琼脂糖凝胶和聚合物树脂可购得。这些载体可以在与配体预连接的情况下购买，或者，配体可以使用标准方法间接连接或直接固定在载体上(参看，例如，Harlow和Lane，Antibodies，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)；Biancala等人，Letters inPeptide Science，7(291)，297(2000)；MacBeath等人，Science，289，1760-1763(2000)；Cass等人，ed.，Proceedings of the ThirteenthAmerican Peptide Symposium.Leiden，Escom，975-979(1994)；美国专利5,576,220；Cook等人，Tetrahedron Letters；35，6777-6780(1994)和Fodor等人，见上)。在一个实施方案中，在载体表面上合成配体，这在生成肽库时是有利的。配体可以化学配合到载体上或可以经由连接剂(例如抗生蛋白链菌素、β-丙氨酸、甘氨酸、含甘氨酸-丝氨酸的聚合物、式--(CH₂)的短链烃、聚乙二醇、ε氨基己酸、和含--O(CH₂)n的连接剂，其中n是1-30)连接。

3.目标蛋白质的结合和洗脱

通常通过使配体或配体-载体络合物与含目标物的水溶液接触来使目标蛋白质或目标生物分子结合到配体或配体-载体络合物上。这可以通过多种方法实现，包括但不限于，使含有目标物的溶液通过配体-载体络合物的填充床或柱，或在搅拌釜或淤浆中分批吸附。优选地，使用泵使水溶液通过色谱柱以控制流速，由此捕获目标蛋白质。理想地，蛋白质目标的结合应该以下述方式进行：不需要溶液的预先调节且含目标物的溶液直接施加到配体-载体络合物上。然而，当结合需要时，可以通过例如稀释、pH、离子强度或极性的改变、温度改变、和添加可溶试剂(包括但不限于缓冲盐、无机盐、有机盐、螯合化合物、硫醇、洗涤剂、表面活性剂、有机溶剂、醇、甘醇、离液剂、金属离子或它们的任意组合)来调节含目标物的溶液的性质。

为了从配体或配体-载体络合物中回收目标蛋白质，可以使配体或配体载体络合物与促进目标蛋白质从配体或配体-载体络合物中离解的溶液(例如，“转移溶液”或“洗脱缓冲剂”)接触。转移溶液可以选自具有各种盐浓度、pH值或变性能力的缓冲剂、有机溶剂、极性改性剂，例如醇和去离子水。或者，或此外，电梯度或温度变化可以从蛋白质-配体-载体络合物中离解出目标蛋白质。转移溶液还可以包含配体(与蛋白质-配体-载体络合物的配体不同)、目标蛋白质的辅因子、对映体特异性分子、和类似物。不同转移溶液的使用能够探测洗脱条件或使特定目标蛋白质转移。选择本发明的方法中使用的离解和转移条件以使配体和目标蛋白质的破坏最小化。换言之，洗脱和转移条件不应该使配体从载体中释放出来或改变目标蛋白质的性质，除非这是需要的。

在一个实施方案中，在洗脱之前，在蛋白质-配体载体上检测并识别目标蛋白质。目标蛋白质在蛋白质-配体载体上的检测和识别包括进行结合分析。结合分析通常包括使蛋白质-配体载体与已知结合到底物上的部分接触。用在结合分析中的结合部分包括，例如，抗体或其抗原结合片段、蛋白质或寡核苷酸。优选地，使蛋白质-配体载体与结合目标蛋白质(或目标蛋白质的化学或生物副产物或其片段)的抗体或其抗原结合片段接触。结合部分优选用可检测标签(例如放射性同位素、发色团或荧光标签)标注。在这种结合分析中，检测可检测标签发出的信号，由此发出目标蛋白质存在的信号。一旦证明在蛋白质-配体载体上存在目标蛋白质，就可以分离蛋白质。

在例如，Harlow和Lane，见上；Sambreok等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989)；和Haugland，Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals(第九版)，Molecular Probes，Eugene，OR(2002)中进一步描述了用于检测目标物的结合分析。任选地，本发明的方法可以在检测之前进一步包含洗涤步骤以去除过量的未结合的部分或标记物。

或者，本发明的方法可以包括进行酶活性分析以根据生物活性表征目标蛋白质。将酶底物施加到蛋白质-配体载体上，其能够使底物被目标蛋白质酶促改性以形成产物。然后检测产物，由此确定在样品中存在目标蛋白质。

可以通过任何合适的方法测量目标蛋白质的结合和洗脱，这些方法多数是现存的且其性能和对于特定用途的适用性是本领域技术人员已知的。

4.使用方法

本文所述的本发明提供了从生物样品中连续分离蛋白质的方法，这些方法产生了高度活性和基本纯化的蛋白质。本发明的方法高度灵敏并能够从样品中分离微小量的目标蛋白质。本发明的连续蛋白质分离法可用于多种用途，包括体外表达的基因产物的预测、诊断、检测、提纯、分离、加工和生物药品的制造。本发明的提纯和提取技术通过减少提纯步骤的数量、改进收率、提高纯度和克服与传统方法有关的限制，提供了优于传统提纯技术的优点。

特别地，本发明的方法优化蛋白质提纯工艺并通过提高效力和纯度来改进生物药品的制造工艺。生物药品是包含蛋白质、肽或其它复合多核苷酸或蛋白质基大分子的药品(统称为“基因产品”)。它们的制造方法包括从其宿主生物质，例如血浆或非人类生物源(例如重组或非重组细胞培养物、转基因动物的乳汁或其它重组或非重组来源)中回收所需基因产品。从生物质中回收商业可行产量的所需蛋白质是具有挑战性的，因为生物质含有不需要的宿主蛋白质、核酸分子和其它天然产生的化学实体。

在一个实施方案中，本发明的方法用于从全血、红血球浓缩物、血小板浓缩物、血浆、血浆衍生物、白细胞、去白细胞血、哺乳动物细胞培养物、发酵液和用于制造和传送生物药品和制备治疗剂的其它介质中分离蛋白质。

在优选实施方案中，本发明的方法连续从血浆样品中分离高活性血浆蛋白质。通过本发明的方法，可以从旨在制造治疗品和/或药品的血浆加工工业中的任何流体中同时并迅速地从样品中分离多种蛋白质。下表1中公开了血浆蛋白质的分离顺序的一个例子。

表1：血浆蛋白质提纯方案

完整进程	进程1	简化进程	反转进程
				vWF/FVIII PON Pg Fg IgG HSA UF/DF A1PI	vWF/FVIII Pg Fg IgG UF/DF HSA UF/DF A1PI	IgG HAS UF/DF A1PI	vWF/FVIII HAS IgG UF/DF A1PI

分离的血浆蛋白质是“基本纯化的”，其具有大约70％，优选大约85％，更优选大约95％，最优选大约99％或更高的纯度。在此，通过列举这些特定的纯度值，所列的值还包括在所列值之间的所有特定整数量。例如，大约85％意在还包括80％，81％，82％，83％和84％，而不用实际列出每一特定的基本纯化程度。

相关领域普通技术人员会理解的是，考虑到普通技术人员已知的信息，根据本文所含的本发明的描述，容易看出对本文所述的方法和应用的其它合适的修改和调适，它们可以在不脱离本发明的范围或其任何实施方案的情况下进行。尽管已经详细描述了本发明，但参照下列实施例可以更清楚地理解本发明，，这些实施例仅用于举例说明而非限制本发明。

实施例

实施例1：直线级联顺序方案1-7的定义

直线级联(linear cascade)是由五个亲和色谱柱构成的：白蛋白(HSA)、血纤维蛋白原(Fg)、IgG、血纤维蛋白溶酶原(Pg)和PON1/ApoA1。首先，使这些柱以四种不同的顺序相继运行以确定最适合直线级联的顺序。为了简化进行中的样品分析，仅收集未稀释的流过物(flow-through)作为该序列中下一柱的装载物。具体而言，这有助于使背景蛋白质的浓度在整个实验过程中保持恒定。其还简化了每个柱上输出量与输入量的对比。分析装载物和每一流过物的样品以监测流过物中目标和非目标蛋白质的回收率。使用这些值检测每个柱以测定其以最小的下游目标蛋白质截留量捕获目标蛋白质的能力。使用最适合这一标准的顺序作为直线级联顺序(LCS)。一旦获得来自首次操作的分析数据，就测试另外三个顺序，对于方案6和7，增加A1PI柱。

材料和设备

在装在Pharmacia XK 50柱(20或30米长)中的级联柱(cascades)中使用下列树脂：

血纤维蛋白溶酶原柱：Pharmacia ECH-Lys-Sepharose FF.Lot# 243526

血纤维蛋白原柱：ProMetic Purabead，(串联的两个柱)Lot#CG1251和Lot#CG1252

IgG柱：ProMetic MAbsorbent A2P，Lot#FA0582-Z

HSA柱：ProMetic Mimetic Blue SAHL P6XL Batch#FA0500Z

PON1/ApoA1柱：Peptide International，Toyopearl WWLHANLot#217772

A1PI柱：ProMetic 12/330P6XL Resin Batch#CG 1255

使用带有950个馏分收集器的AKTA Explorer 100色谱系统(Amersham Biosciences)进行所有色谱法。用使用两个200平方厘米Hydrosart乙酸纤维素膜(10kD截留分子量)的Sartorius Sartocon Slice200超滤系统进行超滤(UF)/透滤(DF)。

方法

对于每一操作，第一柱的装载物是汇集的人血浆+50mM Tris，pH 7.5，过滤至0.2微米。分多份收集每个柱的流过物，并根据色谱图的UV吸光度(A₂₈₀)分布图将其汇集。使用这种汇集物作为该序列中下一柱的装载材料。如果下一柱要在第二天开始工作，将流过物消毒过滤(0.2微米真空滤器)并储存在室温。在方案6和7中，使用UF/DF减少体积并如下表2中所示在汇集的流过物上进行缓冲液交换。要求这一操作将A1PI装载材料带入A1PI柱流动缓冲剂(15mM磷酸钠，pH 6.1)中。

表2：柱顺序

方案#1	Pg→Fg→IgG→HSA→ApoA-1/PON1

[0101]

结果

下面显示每个方案的步骤收率表和图。N/A是指数据不可得。＜LOD是指蛋白质的量低于该特定分析法的检出限。

表3：方案#1的％步骤收率

表3概括了方案#1的结果。

表4：方案#2的％步骤收率

表4概括了方案#2的结果。

表5：方案#3的％步骤收率

表5概括了方案#3的结果。

表6：方案#4的％步骤收率

表6概括了方案#4的结果。

表7：方案#5的％步骤收率

^*基于活性分析，浊度法结果不可得

表7概括了方案#5的结果。

表8：方案#6的％步骤收率

Pg

Fg

ApoA1

HSA

A1PI

IgG

Pg FT

2.00％

91.48％

82.09％

89.67％

81.29％

89.06％

[0122]

表8概括了方案#6的结果。

表9：方案#7的％步骤收率

表9概括了方案#7的结果。

结论

在方案#1之前的操作(与方案#1的顺序相同)中，原材料是不含任何添加的缓冲体系的过滤血浆。在将血浆装载在柱上时，流过物的pH值大致达到峰值。由于这种观察结果，在装载到第一柱中之前，将1M Tris缓冲剂，pH 7.5添加到血浆中至50mM Tris的最终浓度。关于缓冲剂选择法的概述，参看下文的实施例3。第七方案证实了直线级联的亲和柱作为有效血浆蛋白质提纯法运行的可行性。分析数据并根据下列观察结果选择顺序。在方案1中，在整个操作过程中，下游目标蛋白质的回收率保持较高。在方案2中，IgG柱几乎完全耗尽血纤维蛋白溶酶原、血纤维蛋白原和ApoA1的进料流。再在方案3中，IgG柱捕获ApoA1。根据这种观察结果，确定PON1、Pg和Fg柱必须在该序列中位于IgG柱之前。

在根据该实验决定色谱步骤在直线级联中的顺序时，考虑下列要点：

·PON1、Pg和Fg的捕获步骤应该位于IgG之前。

·由于白蛋白和柠檬酸盐会干扰A1PI色谱法，A1PI色谱柱应该位于白蛋白柱之后。流过物需要在A1PI柱之前进行UF/DF步骤以交换缓冲液。

·IgG应该位于白蛋白之前以避免IgG损失。

因此，该实验中的直线级联顺序应该选择为：PON1/ApoA1→血纤维蛋白溶酶原→血纤维蛋白原→IgG→HSA→UF/DF→A1PI。

应该指出的是，在另一实验中，从目前的级联顺序中去除PON1/ApoA1柱，并在树脂变得可用时在血纤维蛋白溶酶原之前插入vWF/FVIII。

实施例2：血浆蛋白质的亲和捕获

该实验中使用下列柱顺序：

vWF/FVIII→血纤维蛋白溶酶原→血纤维蛋白原→IgG→UF/DF→HSA→UF/DF.

血浆制品：四升冷冻汇集血浆获自-20℃储藏。

将血浆汇集物在水浴中在37.0℃±2℃解冻。一旦血浆解冻，迅速将其从水浴中取出。使用1M Tris的50x稀释液，pH 7.5和2M NaCl的40x稀释液将血浆调节至20mM Tris，50mM NaCl。将血浆充分混合并使用SartoPure 300PP2(8微米)消毒滤器过滤。

a.血管性血友病因子/因子VIII(vWF/FVIII)亲和捕获

制备含有410毫升为vWF/FVIII亲和捕获的捕获开发的亲和吸附剂的7厘米×10.6厘米填充床柱。该柱在长期不用时通常保存在含有0.1N NaOH的储存溶液中。将预存柱用3CVs的Milli Q水以80厘米/小时的流速洗涤直至传导率降至1mS/cm以下。将该柱用4CVs的平衡(EQ)缓冲剂平衡，该缓冲剂由20mM Tris、20mM柠檬酸盐、140mM NaCl构成，pH 7.5。将过滤血浆施加到柱上。当280纳米的吸光度达到满刻度的吸光度单位(AUFS＝2)的5％时，收集流过的流出物。

用4CV的EQ缓冲剂洗涤该柱，同时继续收集柱流出物直至吸光度降至AUFS的5％。将溶液充分但轻轻混合，然后经由3/0.8umSartoClean CA(H8)，然后经由0.45/0.22um Sartobran P(H8)滤器过滤。将滤器用500毫升的EQ缓冲剂后漂洗。将合并的滤液轻轻地混合。这种滤过的溶液构成vWF/FVIII捕获步骤的流过馏分(vWF/FVIII-FT(流过物))。将vWF/FVIII用4CV的洗脱缓冲剂洗脱，该缓冲剂由20mM Tris、500mM NaCl、3mM CaCl₂、0.01％Polysorbate 80、30％乙二醇构成，pH 6.5。该柱的流速设为30厘米/小时。一旦％UV升至2％AUFS，就开始收集洗出液。持续收集洗出液直至吸光度降回AUFS的2％。将柱洗出液轻轻混合并储存在-80℃直至准备用于进一步加工。用由0.5N NaOH/1％Triton X100构成的CIP-1溶液使树脂再生。以“上升流”方向以5毫升/分钟的降低的流速向柱施加CIP-1溶液达大约3CV。然后用2CV的由在0.5N NaOH中的30％异丙醇构成的CIP-2溶液以5毫升/分钟洗涤树脂。将树脂用3CV的储存溶液平衡直至下次使用。

b.血纤维蛋白溶酶原亲和捕获

制备含有255毫升为血纤维蛋白溶酶原捕获开发的亲和吸附剂的5厘米×13厘米填充床柱。该柱在短期不用时通常保存在含有0.1N NaOH的储存溶液中。将预存柱用1-2CVs的Milli Q水以160厘米/小时的流速洗涤直至传导率降至1mS/cm以下。将该柱用3-4CVs的平衡(EQ)缓冲剂平衡，该缓冲剂由20mM Tris、20mM柠檬酸盐、140mM NaCl构成，pH 7.5。将来自上一捕获步骤的vWF/FVIII-FT施加到柱上。当280纳米的吸光度达到AUFS的5％时，收集流过的流出物。

用2-3CV的EQ缓冲剂洗涤该柱，同时继续收集柱流出物直至吸光度降至AUFS的5％。将溶液轻轻混合，然后经由0.22um Sartobran滤器过滤。将滤器用500毫升的EQ缓冲剂后漂洗。将合并的滤液轻轻地混合。这种滤过的溶液构成血纤维蛋白溶酶原捕获步骤的流过馏分(Pg-FT)。将该柱用2CV的由在EQ中的30mM辛酸盐构成的洗涤缓冲剂，pH 7.5洗涤，然后用2CV的EQ缓冲剂洗涤。将血纤维蛋白溶酶原用2-3CV的洗脱缓冲剂洗脱，该缓冲剂由50mM磷酸钠、0.5M EACA构成，pH 7.0。一旦％UV升至2％AUFS，就开始收集洗出液。持续收集洗出液直至吸光度降回AUFS的2％。将柱洗出液轻轻混合并储存在-80℃直至准备用于进一步加工。用由0.5N NaOH构成的CIP-1溶液使树脂再生。以“上升流”方向以40毫升/分钟的降低的流速向柱施加CIP-1溶液达大约4CV。然后将树脂用3CV的储存溶液平衡直至下次使用。

c.血纤维蛋白原(Fg)亲和捕获

制备含有790毫升为血纤维蛋白原捕获开发的亲和吸附剂的10厘米×10.1厘米填充床柱。该柱在短期不用时通常保存在含有0.1NNaOH的储存溶液中。将预存柱用1-2CVs的Milli Q水以60厘米/小时的流速洗涤直至传导率降至1mS/cm以下。

将该柱用3-4CVs的平衡(EQ)缓冲剂平衡，该缓冲剂由20mM Tris、20mM柠檬酸盐、140mM NaCl构成，pH 7.5。将来自上一捕获步骤的Pg-FT施加到柱上。当280纳米的吸光度达到AUFS(吸光度单位满刻度)的5％时，收集流过的流出物。用4-5CV的EQ缓冲剂洗涤该柱，并连续收集柱流出物直至吸光度降至AUFS的5％。将溶液轻轻混合，并经由0.22um Sartobran滤器过滤。将滤器用500毫升的EQ缓冲剂后漂洗。将合并的滤液轻轻地混合。这种滤过的溶液构成血纤维蛋白原捕获步骤的流过馏分(Fg-FT)。将血纤维蛋白原用4-5CV的洗脱缓冲剂洗脱，该缓冲剂由20mM Tris、20mM柠檬酸盐、140mM NaCl、1％胆酸盐、10％丙二醇构成，pH 7.5。一旦％UV升至2％AUFS，就开始收集洗出液。持续收集洗出液直至吸光度降回AUFS的2％。将柱洗出液轻轻混合并储存在-80℃直至准备用于进一步加工。用由1.0N NaOH构成的CIP-1溶液使树脂再生。以“上升流”方向以80毫升/分钟的降低的流速向柱施加CIP-1溶液达大约4CV。将树脂用3CV的储存溶液平衡直至下次使用。

d.免疫球蛋白G(IgG)亲和捕获

通过在Fg-FT中添加1/10体积的载量调节缓冲剂(在EQ中的300mM辛酸盐)并充分混合，制备装载物。制备含有1880毫升为IgG捕获开发的亲和吸附剂的14厘米×12.2厘米填充床柱。该柱在短期不用时通常保存在含有0.1N NaOH的储存溶液中。将预存柱用2CVs的Milli Q水以73厘米/小时的流速洗涤直至传导率降至1mS/cm以下。将该柱用2CVs的由20mM Tris，20mM柠檬酸盐、1M NaCl构成的洗涤缓冲剂(pH 7.5)平衡，然后用3-5CV的由30mM辛酸盐、20mM Tris、20mM柠檬酸盐、140mM NaCl构成的IgG平衡缓冲剂(pH 7.5)平衡。将来自上一捕获步骤的Fg-FT施加到柱上。当280纳米的吸光度达到AUFS(吸光度单位满刻度)的5％时，收集流过的流出物。

用4-5CV的洗涤缓冲剂洗涤该柱，继续收集柱流出物直至吸光度降至AUFS的5％。将溶液轻轻混合，然后经由0.22um Sartobran滤器过滤。将滤器用500毫升的EQ缓冲剂后漂洗，并将合并的滤液轻轻地混合。这种滤过的溶液构成IgG捕获步骤的流过馏分(IgG-FT)。在IgG洗脱之前，将该柱用1CV的预洗脱缓冲剂调节，该缓冲剂由50mM柠檬酸盐构成，pH 6.0。用4CV由50mM柠檬酸盐构成的洗脱缓冲剂，pH 3.0洗脱IgG。一旦％UV升至2％AUFS，就开始收集洗出液。持续收集洗出液直至吸光度降回AUFS的2％。将柱洗出液轻轻混合并储存在-80℃直至准备用于进一步加工。用由1.0N NaOH构成的CIP-1溶液使树脂再生。以“上升流”方向以170毫升/分钟的降低的流速向柱施加CIP-1溶液达大约4CV，然后以下降流方向施加3CV的Milli-Q水。然后将树脂用3CV的储存溶液平衡直至下次使用。

e.超滤/透滤

进行过滤以浓缩IgG-FT产物直至达到大约1.5-2升的目标体积。对着6倍体积的EQ缓冲剂以18±1psi的滤器入口压力(P1)和15±1psi的TMP进行透滤。在透滤开始时以及在透滤的大约每一渗余物体积下，将渗透物取样以进行pH和传导率测量，从而监测透滤何时完成。

f.白蛋白(HSA)亲和捕获

制备含有5600毫升为白蛋白捕获开发的亲和吸附剂的20厘米×17.8厘米填充床柱。该柱在短期不用时通常保存在含有0.1N NaOH的储存溶液中。将预存柱用2CVs的Milli Q水以86厘米/小时的流速洗涤直至传导率降至1mS/cm以下。将该柱用3-4CVs的EQ缓冲剂平衡。将来自上一步骤的UF/DF渗余物施加到柱上。当280纳米的吸光度达到AUFS(吸光度单位满刻度)的5％时，收集流过的流出物。

用2-3CV的EQ缓冲剂洗涤该柱，继续收集柱流出物直至吸光度降至AUFS的5％。将溶液轻轻混合。这种滤过的溶液构成白蛋白捕获步骤的流过馏分(HSA-FT)。在白蛋白洗脱之前，将该柱用2CV的预洗脱缓冲剂调节，该缓冲剂由50mM柠檬酸盐，300mM NaCl构成，pH 7.5。将白蛋白用2-3CV的洗脱缓冲剂洗脱，该缓冲剂由50mM柠檬酸钠、50mM辛酸钠构成，pH 6.2。一旦％UV升至2％AUFS，就开始收集洗出液。持续收集洗出液直至吸光度降回AUFS的2％。将柱洗出液轻轻混合，然后储存在-80℃直至准备用于进一步加工。用由1.0N NaOH构成的CIP-1溶液使树脂再生。以“上升流”方向以400毫升/分钟的降低的流速向柱施加CIP-1溶液达大约4CV，然后以下降流方向施加3CV的Milli-Q水。将树脂用3CV的储存溶液平衡直至下次使用。

g.浓缩HSA流过物

将含有样品剩余物的HSA-FT袋连接到产物储器上的管道入口。在Slice 200系统上以1300毫升/分钟的“恒定流速”启动泵。将滤器出口(P2)的压力设为13±1psi。这导致18±1psi的滤器入口压力(P1)和15±1psi的TMP。在浓缩产物的同时，在该系统储器中连续加入追加的HSA-FT。持续浓缩HSA-FT直至达到大约1.5-2升的目标体积。在从滤器系统收取UF产物之前，在没有压力或没有过滤透过膜的情况下，继续再循环大约1分钟。在储器中添加大约500-1000毫升平衡缓冲剂以漂洗滤器系统。再循环在没有过滤或压力的情况下缓慢开始以避免使系统漂洗液“发泡”，其持续大约3至5分钟。将UF产物合并、漂洗并储存在-80℃。HAS-FT浓缩物被视为A1PI提纯的合适的原材料。

结果

表10：vWF/FVIII捕获的关键属性

样品	平均值	SD
			装载：
VWF浓度(ug/mL)	10.88	1.34
			FVIII浓度(ng/mL)	78.5	6.7
体积(L)	4061	116
			pH	7.73	0.06
传导率(mS/cm)	15.6	0.5
			流过：
VWF浓度(ug/mL)	1.09	0.39
			FVIII浓度(ng/mL)	12.87	2.23
体积(L)	5597.1	87.5
			pH	7.6	0.13
传导率(mS/cm)	17	0.577
			洗脱：
VWF浓度(ug/mL)	26.8	5.48
			FVIII浓度(ng/mL)	298.5	72.1
体积(L)	697.1	121.6
			pH	8.47	0.56
传导率(mS/cm)	22.64	0.69

[0162] 表11：血纤维蛋白溶酶原捕获的关键属性

样品	平均值	SD
			装载：
滴定度(克/升)	0.081	0.003
			体积(升)	5859	145
pH	7.75	0.09
			传导率(mS/cm)	17.32	1.19
通过：
			滴定度(克/升)	0.005	0.005
体积(升)	6346	269
			pH	7.71	0.07
传导率(mS/cm)	17.50	0.76
			洗脱：
滴定度(克/升)	1.488	0.127
			体积(升)	236.3	17.5
pH	7.27	0.06
			传导率(mS/cm)	14.71	3.68

表12：血纤维蛋白原捕获的关键属性

样品	平均值	SD
			装载：
滴定度(克/升)	1.43	0.06
			体积(升)	6716	181
pH	7.72	0.04
			传导率(mS/cm)	16.57	0.84

[0166]

通过：
			滴定度(克/升)	0.0323	0.005
体积(升)	9507	231
			pH	7.55	0.08
传导率(mS/cm)	17.00	0.96
			洗脱：
滴定度(克/升)	3.433	0.253
			体积(升)	2539	227
pH	7.55	0.08
			传导率(mS/cm)	14.00	1.41

表13：IgG捕获的关键属性

样品	平均值	SD
			装载：
滴定度(克/升)	2.251	0.259
			体积(升)	10429	267
pH	7.54	0.25
			传导率(mS/cm)	18.52	0.92
通过：
			滴定度(克/升)	0.015	0.003
体积(升)	12620	876
			pH	7.61	0.09
传导率(mS/cm)	32.17	6.05
			洗脱：
滴定度(克/升)	3.762	.481
			体积(升)	6086	741

[0169]

pH	7.64	0.64
			传导率(mS/cm)	10.64	6.55

表14：HSA捕获的关键属性

样品	Mean	SD
			装载：
滴定度(克/升)	28.55	1.84
			体积(升)	3814	211
pH	7.45	.08
			传导率(mS/cm)	17.21	1.75
通过：
			滴定度(克/升)	.047	.003
体积(升)	10463	2015
			pH	7.39	0.13
传导率(mS/cm)	17.42	1.79
			洗脱：
滴定度(克/升)	18.27	2.47
			体积(升)	5906	650
pH	6.76	.04
			传导率(mS/cm)	22.00	3.78

表15：目标蛋白质的过程收率

蛋白质	分析类型	平均收率	Std.Dev.
				血管性血友病因子	ELISA	43％	12％
因子VIII	ELISA	65％	11％

[0174]

血纤维蛋白溶酶原	浊度法	72％	6％
				血纤维蛋白原	浊度法	79％	6％
IgG	浊度法	87％	7％
				HAS	浊度法	88％	8％
A1PI	浊度法	90％	6％

实施例3：用在直线级联法中的血浆缓冲体系的评测和选择

进行该实验以测定最适合直线级联连续血浆蛋白质提纯方案的缓冲体系。据观察，在IgG柱装载过程中，pH值攀升至比血浆pH值(pH～7.5)高两个单位。在IgG装载过程中观察到数次pH值变化，其似乎取决于装载物的蛋白质耗减程度。这意味着，某些血浆蛋白质具有缓冲能力，且从装载溶液中去除这些蛋白质可能提高pH值转变的可能性。用于血浆的缓冲体系必须保持血浆中的蛋白质浓度和活性。缓冲体系必须使pH值在整个过程中保持在大约7.5±0.4的可接受范围内。

为了确保在随后的操作中不发生pH值变化，用于随后操作的血浆装载物必须使用pH 7.5的1M Tris的储液缓冲。使用两种单独的原料，1M Tris Base和1M Tris HCl制造这种储备的缓冲剂。将这些缓冲剂彼此滴定至pH 7.5。然后将储液在过滤之前在血浆中1∶20稀释。最终制成的装载物含有50mM Tris调节的血浆，用0.45/0.2微米滤器过滤。使用这种缓冲体系监测直线级联顺序(LCS)实验1-7。在整个过程中，在血浆和流动的缓冲剂中使用50mM Tris缓冲剂。在使用50mM Tris，pH 7.5时，在柱装载过程中没有观察到任何pH问题。表15概括了使用50mM Tris，pH 7.5作为血浆缓冲剂进行的LCS提纯的步骤收率。

表15：在用50mM Tris，pH 7.5缓冲的LCS中，目标蛋白质的％步骤收率

50mM Tris 缓冲剂	Fg	FXIII	IgG	A1PI	A1PI(活性)
						Pg	95±2.7 (n＝6)	91.3±7.4 (n＝4)	98±3.7 (n＝7)	100±13 (n＝7)	100.3±15.8 (n＝5)
Fg			86.6±8 (n＝7)	95.5±5.3 (n＝7)	107.7±9.1 (n＝5)
						IgG				87.8±13.3 (n＝7)	96.7±7.4 (n＝5)
HSA				96.1±19.5 (n＝7)	98.5±23 (n＝4)

由于在生产规模下50mM Tris缓冲剂的相对较高的投入成本，寻求另一缓冲体系。在用pH 7.5的碳酸氢盐、磷酸盐和Tris缓冲的血浆的小等分试样上进行了一些实验。这些实验持续数天以模拟多天LCS。将相同血浆汇集物的等分试样缓冲并留在室温(RT)下培养数天。分析每一样品的活性和蛋白质浓度。表16中列出了用每一体系缓冲血浆时每一培养步骤的收率。用50mM Tris缓冲的血浆作为比较的基准点操作数次。

表16：预备性血浆缓冲研究的概要

在室温培养后的

收率

FG

FG(act)

FXIII (act)

IgG

A1PI

A1PI(ac)

在用50mM Tris缓冲

100％

99％(n＝2)

100％

95％

101％

98％

[0185]

结果表明，当与对照物水比较时，使用各种受试的缓冲剂没有更大的蛋白质或活性损失。在血浆中添加缓冲剂没有对任何目标蛋白质造成不利影响。然后在级联研究中测试各个缓冲方案以确定最佳缓冲条件。

在LCS实验过程中评测10mM磷酸钠的缓冲体系。在血浆装载物制备过程中，用血浆将储备缓冲剂稀释20倍，用其将0.2M磷酸钠的储液稀释至10mM磷酸钠。在用于直线级联研究之前，将10mM磷酸盐缓冲的血浆过滤至0.2微米。在这种缓冲方案的测试中，目标蛋白质的蛋白质活性和指示蛋白质活性的其它要素显著降低。下表17概括了使用10mM磷酸盐缓冲剂的数个LCS实验的步骤收率。

表17：在用50mM磷酸钠，pH 7.5缓冲的LCS中，目标蛋白质的％步骤收率

10mM 磷酸盐缓冲剂

Fg

FXIII

IgG

A1PI

A1PI(活性)

[0190]

Pg	94±3.5 (n＝6)	80.4±7.4 (n＝5)	96.9±5.1 (n＝6)	97.3±6.2 (n＝6)	95.5±7.8 (n＝6)
						Fg	78.2±5.5 (n＝6)	90.9±8 (n＝6)	89.5±25 (n＝5)
IgG				87.2±7.4 (n＝5)	80±21 (n＝4)
						HAS		94±8.1 (n＝3)	ND

尽管在50mM的Tris缓冲血浆已经成功地避免了pH值波动，但仍需要更加成本有效的缓冲血浆的方法。因此，将20mM Tris，pH 7.5用于LCS。通过1M Tris，pH 7.5的50倍稀释液，将血浆调节至20mMTris，pH 7.5。这种储备缓冲剂如上制成，用Tris HCl滴定tris碱。表18显示了使用滴定至20mM Tris的血浆进行的LCS操作的性能在目标蛋白质回收率、缓冲能力和装载稳定性方面比得上如上所述的50mM Tris缓冲剂。

表18：在用20mM Tris，pH 7.5缓冲的LCS中，目标蛋白质的％步骤收率

20mM Tris缓冲剂	Fg	FXIII	IgG	A1PI	A1PI (活性)
						Pg	97±5.6 (n＝8)	88.7±17 (n＝8)	103.2±13.4 (n＝8)	99.3±8 (n＝8)	104.3±13 (n＝4)
Fg			86.4±7.1 (n＝8)	90±6.2 (n＝8)	90±12 (n＝4)

[0194]

IgG				87.1±3.2 (n＝7)	91.7±7 (n＝3)
						HSA				95±6.8 (n＝6)	88.2±19 (n＝3)

表19：使用不同缓冲剂体系的LCS中的HSA步骤收率

用各种缓冲剂的HSA	Tris 50mM	磷酸盐10mM	Tris 20mM
				Pg	97.4±3.9 (n＝6)	95.5±4.3 (n＝6)	95.6±8.1 (n＝8)
Fg	95±5.7 (n＝6)	94.8±9.2 (n＝6)	97.8±4.6 (n＝7)
				IgG	84±9.8 (n＝6)	79.1±18.3 (n＝5)	86.4±2.1 (n＝7)
总收率	77.4	71.6	80.1

表19代表了评测的缓冲体系之间在LCS中的HSA步骤收率方面的比较结果。总体而言，在三个受试缓冲剂中，HSA捕获的步骤回收率彼此相当，但是用10mM磷酸盐时，对于IgG捕获步骤表现出较低的HSA收率。此外，当使用10mM磷酸盐缓冲剂时，IgG，较高值目标蛋白质，在血纤维蛋白原捕获步骤中具有较低的回收率。所有的值均是各个捕获步骤显示出的％收率。从0.5升操作中收集数据，仅根据装载物和流过物中存在的白蛋白量计算步骤回收率。

结论是，含有50mM Tris的缓冲剂是有效的血浆缓冲剂，但在该工艺的规模扩大至生长规模时，其可能太昂贵。评测了Tris的一些替代物并进行完整的LCS操作。根据缓冲能力、使用简易性、成本和蛋白质浓度和活性的保持性评判这些替代物。据发现，pH 7.5的降低摩尔浓度的Tris(20mM)是有效的血浆缓冲剂。

本发明可以在不脱离其精神或基本属性的情况下表现为其它具体形式，因此，应该参照所附权利要求而非前述说明书以指出本发明的范围。

Claims

1.连续的蛋白质分离和提纯方法，包括(i)提供血浆样品，(ii)提供多于两种的配体，它们各自特异性地结合到血浆样品中的目标蛋白质上，其中所述多于两种的配体任选连接到载体上以形成多于两种的配体-载体络合物，(iii)使多于两种的配体或配体载体络合物以预定顺序与血浆样品连续接触以使各个配体或配体载体络合物从血浆样品中连续结合目标蛋白质，其中所述配体或配体载体络合物以预定顺序与血浆样品连续接触导致在IgG之前结合血纤维蛋白溶酶原，且在白蛋白之前结合IgG；和其中在所述接触之前，血浆样品在接触之前不通过预调节步骤进行处理，所述预调节步骤选自醇沉淀、冷沉淀、脂质和/或脂蛋白的去除、优球蛋白沉淀、或它们的组合，(iv)洗脱结合到多于两种的配体或配体载体络合物的每一个上的目标蛋白质，和(v)连续从血浆样品中分离目标蛋白质。

2.权利要求1的方法，其中目标蛋白质选自血纤维蛋白原、α-1蛋白酶抑制剂、载脂蛋白Al、IgG、对氧磷酶、凝血因子、vWF/FVIII、白蛋白、血纤维蛋白溶酶原或它们的组合。

3.权利要求2的方法，其中血纤维蛋白原在IgG之前从所述血浆分离。

4.权利要求2的方法，其中在蛋白质分离过程中在血浆样品中保持对氧磷酶的活性。

5.权利要求2的方法，其中vWF/FVIII在血纤维蛋白溶酶原之前从血浆中分离。

6.权利要求2的方法，其中载脂蛋白Al在IgG之前从血浆中分离。

7.权利要求2的方法，其中α-1蛋白酶抑制剂在白蛋白之后从血浆中分离。

8.权利要求2的方法，其中血纤维蛋白溶酶原在血纤维蛋白原之前从血浆中分离。

9.权利要求1的方法，其中配体包括肽、肽模拟物、染料、含三嗪的化合物、核酸基分子或核苷酸基分子、碳水化合物、脂质、无机材料、抑制剂、底物或它们的任意组合。

10.权利要求9的方法，其中配体包括由3至15个氨基酸组成的肽。

11.权利要求1的方法，其中载体包括合成材料和/或天然材料。

12.权利要求1的方法，其中载体包括聚丙烯酰胺、多糖、硝基纤维素、二氧化硅、矾土、氧化铝、二氧化钛、氧化钛、氧化锆、苯乙烯、聚二氟乙烯尼龙、苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物、聚甲基丙烯酸酯、玻璃、或任何前述物质的组合。

13.权利要求12所述的方法，其中所述载体包括多糖，且多糖是琼脂糖、葡聚糖或纤维素。

14.权利要求1的方法，其中载体是树脂珠。

15.权利要求1的方法，其中在接触步骤之前用缓冲剂处理血浆样品以进一步保持血浆样品中的一种或多种目标蛋白质的浓度和活性。