TWI392685B - 利用親和力色析之連續蛋白質分離及純化流程 - Google Patents

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Description

利用親和力色析之連續蛋白質分離及純化流程 與相關應用技術交互參考
本申請案主張2004年8月20日所提申的臨時專利申請案第60/602,868號之利益，在此將該申請案的全部內容以參照方式納入本文中。
本發明係關於自生物樣本中分離蛋白質的方法。特別是，本發明係關於從生物樣本中連續回收高純度蛋白質的方法。
蛋白質的加工與發展需要具有最少的步驟數和最高產量的高效率處理以達到所需要的純度。因為蛋白質的多樣化，可能污染物的不同自然特性，及/或，伴隨每個蛋白質製備的不純物，及生物醫藥的製造通常需要大量的蛋白質，所以蛋白質分離和純化的方法代表著一種獨特的挑戰。傳統的純化技術通常包含了一系列的純化步驟，其目標在於分離一個單一的蛋白質標的。隨著每一個步驟，產率會降低而且生產的花費會提升。蛋白質分離和純化的花費通常佔了超過所有具有療效的蛋白質的總生產費用的50%。
親和力色層分析是在藥物發現與方法開發的核心裡的最重要的分離技術之一。親和力步驟的選擇力愈好，整個 過程的效率也就愈好，而這是一個在蛋白質分離實驗中最關鍵的一項要求。親和力色層分析在從多種成分的流體中純化，偵測以及移除標的分子上有許多實用的應用。親和力色層分析是根據在標的分子和它所結合的實體(也就是配位子)之間專一的，三度空間上的交互作用。配位子可以被分離或製備，以用於與幾乎任何標的分子以一種專一且可回復的方式結合。可能的配位子包括了像是蛋白質，抗體，胜肽，和其類似物的生物分子，以及經過特別設計或挑選的合成配位子。擁有數以百萬計的可能配位子的資源庫可以用組合合成的技術來製備，其許多是廣為人知的(參閱，例如，Lam等人，自然雜誌(Nature)：354,82-84(1991))。為了幫助從樣本中把標的分子分離出來，配位子可以被固定在固體的撐體基質上，例如個別的粒子(例如，色層分析的合成樹脂小珠)或者連續的撐體(例如，陣列)。被固定在固態的撐體基質上之配位子之後就可以被用來從複雜的溶液中純化標的物。
在規模上，或許親和力色層分析最大的成就已在生物醫藥單株抗體純化的領域中達成。每年的蛋白質A(Protein A)合成樹脂的需求超過一萬公升而且以每年50%的速度在增加，代表著一個在2002年超過五千萬美元的蛋白質A吸附劑市場。使用免疫親和力色層分析可以用來從天然或重組來源生產從血漿裡獲得的或基因重組的第八及第九凝血因子以及其它的血漿蛋白質及的生物醫藥。
然而，在下游加工時所使用的現代親和力色層分析中 最具威力的一種形式所依賴的並非是從天然來源所取得的配位子，例如抗體，而是使用具高穩定度的合成親和力配位子。參閱例如，Sproule等人，設計利用親和力色層分析來純化藥用蛋白質的配位子的新策略；J.Chromatography B ,740 ,17-33(2000)。這個方法使用了訂製或設計的配位子而不使用現成的化合物。
在技藝中經分離的血漿蛋白質中，蛋白素(albumin)和珈瑪球蛋白(gammaglobulin)是特別被用於醫學用途。通常被用來從血漿中分離這些蛋白質的流程是根據E.J.Cohn及其同僚在1940年代所發展出來的冰乙醇沈澱法。參閱，Cohn等人，血清和血漿中蛋白質的製備和性質。IV。將生物組織和體液分離成蛋白質和脂蛋白質的系統；美國化學誌，J.Am.Chem.Soc .,68 ,459-475(1946)。這個流程原先是被用來高產率生產蛋白素，但不是設計用來分離與純化目前從血漿中所生產的各樣的蛋白質。特別地，用這些技術時，微量血漿蛋白質成分的產率總是如此的低以致於這些方法在整體的分離產率上不可避免的是低效率的。參閱，例如，Uemura等人的美國專利第5,138,034號。
利用親和力色層分析來純化血漿中蛋白素於技藝中係已知的，參閱，Haryvey MJ，血漿中蛋白質的分離方法，Curling JM編輯，倫敦學術出版社，頁189-200。第一個被報導的血漿蛋白質分離於三十年前被提出，是關於利用色層分析方法將血漿中人類血清蛋白素耗盡以使鑑定和純化低濃度蛋白質成為可能。Travis,J,.與Pannell,R.Behring,Inst.Mitt. 54：30-32(1974)。這件工作是利用Procion Blue葡聚糖-Sepharose®共軛物來進行且發現了一個與染劑親和力分層分析有關的初始問題，也就是染劑會漏進沖提液中。這些作者的興趣在於從血漿中分離α1抗胰蛋白酶(alpha 1 antitrypsin)，且描述了將這個蛋白質和蛋白素分開的困難，因為在高離子強度的狀況下任何的非專一離子交換結合都是在最微弱的狀況。
將各種不同的其它種蛋白質從血漿中分離出來也被報導過。例如，先前技術方法敘述血漿第八凝血因子和細胞連結蛋白(fibronectin)部分的分離與純化，參閱，美國專利第4,822,872；4,093,608；和4,565,651號。分離和純化抗凝血酵素III(antithrombin III)的方法被揭示於，例如，美國專利第3,842,061號。分離和純化纖維蛋白溶酶原(plasminogen)的方法被揭示於，例如，科學雜誌(Science )：170,1095(1970)，美國專利第4,361,62號和4,361,653號。分離和純化免疫球蛋白(immunoglobulin)的方法被描述於，例如，美國專利第4,371,520號和4,093,606號，分離和純化肝球蛋白(hepataglobulin)的方法被描述於，例如，美國專利第4,061,735號和4,137,307號。然而，這些方法缺少了從同樣的起始原料中，例如，人類血漿，純化用來製造多重生物藥品所需的專一性和選擇性。
雖然從生物樣本中把蛋白質分離出來的製程在產品品質，從增強專一的活性和純度，也在產率和回收率的方面，都有了些許的進展，但仍需要進一步改善製程來得到有著 高產率和高純度蛋白質濃縮液，同時也將經分離蛋白質在專一活性上與先前技藝方法相關的損失減到最小。在從同一個來源中分離多個蛋白質的情況下這更是如此。本發明藉由提供利用親和力色層分析的技術來有效率地從生物原料，特別是從血漿中，分離和純化各種不同的蛋白質的方法來來解決這些和其它長久以來存在的需要，也就是結合了預決定的和介定的吸附流程來達成。
本發明，如本文所揭示和描述，提供從生物樣本中連續蛋白質分離和純化的方法。該方法包括(i)提供生物樣本，(ii)提供二或多種選擇地和專一地從生物樣本中結合標的蛋白質的配位子，其中每種配位子可視需要地和撐體連結而形成二或多種配位子-撐體複合物，(iii)以已定的順序連續地使二或多種配位子或配位子撐體複合物和生物樣本接觸以使每種配位子或配位子撐體複合物可以連續地和生物樣本中的標的蛋白質結合，其中在接觸之前生物樣本未經過預-條件化步驟(pre-conditioned step)處理的步驟，(iv)將與二或多種配位子或多種配位子撐體複合物結合的標的蛋白質沖提出，(v)連續地將標的蛋白質從生物樣本中分離出。預-條件化步驟包括了各種處理，例如，酒精沈澱，低溫沈澱，移除脂質和/或脂蛋白質，優球蛋白沈澱，或其組合，與其它。
在一個具體實例中，生物樣本是血漿而標的蛋白質包括血纖維蛋白原(fibrinogen，Fg),阿爾法－1－蛋白質酶抑制劑(alpha－1 proteinase inhibitor(A1PI))，載脂蛋白原A1(apolipoprotein A1(ApoA1)，免疫球蛋白(IgG)，低密度脂蛋白氧化酶(paraoxonase，PON)，凝血因子，凡威力布蘭德因子(Von Willebrand factor，vWF)，第八凝血因子(FVIII)，人類血清蛋白素素(HSA)，纖維蛋白溶酶原(plasminogen，Pg)，或者其任何組合。
在另一個具體實例中，生物樣本包含在從試管內發酵物或細胞培養物，或從基因轉殖動物或植物中萃取出來的組織或液體，而標的蛋白質為基因重組蛋白質。
在另一個具體實例中，低密度脂蛋白氧化酶在生物樣品中的活性在蛋白質分離中實質上被保持。
在一個具體實例中，VWF/FVIII係在其它蛋白質之前或之後，被從血漿中純化。
在另一個具體實例中，載脂蛋白A1在其它蛋白質之後被從血漿中純化。
而在另一個具體實例中，蛋白素在IgG之前或IgG之後被從血漿中純化。
在另一個具體實例中，血纖維蛋白原在纖維蛋白溶酶原之前被從血漿分離。
而在另一個具體實例中，生物樣本與二或多種配位子接觸之預決定順序使vWF/FVIII，Pg，Fg，ApoA1/PON，IgG，HSA和A1PI以描述的順序結合。
而在另一個具體實例中，生物樣本與二或多種配位子接觸之預決定順序使vWF/FVIII，ApoA1/PON，Pg，Fg，IgG，HSA和A1PI以描述的順序結合。
而在更進一步的具體實例中，生物樣本與二或多種配位子接觸之預決定順序使vWF/FVIII，IgG，HSA和A1PI以描述的順序結合。
本項發明的配位子包括多肽或以核酸為基礎的分子，抗體或抗原結合片段，非以多肽或核酸為基礎的分子，碳水化合物的模擬物，胜肽模擬物，小分子，無機物質，染劑，碳水化合物，脂質，或其任何組合。
在一個具體實例中，配位子包括由大約一至大約十五個胺基酸所組成的胜肽。
在另一個具體實例中，配位子及/或配位子撐體複合物包括合成的親和力配位子如Mimetic Blue®配位子，MAbsorbent®配位子，ProMetic PBL 112-80，ProMetic PBL 112-81，ProMetic PBL 112-82，以及ProMetic PBL 112-83。
撐體包括合成原料，天然原料，或兩者。撐體的例子有瓊脂糖，聚丙烯醯胺，葡聚糖，纖維素，多醣，硝化纖維素，二氧化矽，氧化鋁，鋁氧化物，氧化鈦，鈦氧化物，氧化鋯，苯乙烯，聚二氟乙烯尼龍，苯乙烯和二乙烯苯的共聚合物，聚甲基丙烯酸酯，氮雜內酯聚合物或共聚物，玻璃，纖維素，瓊脂糖，任何前述物的衍生物，以及任何前述物的組合。
在一個較佳的具體實例中，撐體物是多醣或樹脂小珠。 在另一方面，本發明利用本發明的連續蛋白質分離提供含有實質上純的血漿蛋白質的製備物。
在一具體實例中，血漿實質上以至少70%的純度被純化。
在另一個具體實例中，該製備物實質上被純化，沒有任何因免疫吸收而造成的不純物，且已進行至少一次的病原活性抑步驟。
而在另一個具體實例中，生物樣本在開始接觸步驟之前先以緩衝劑處理，以進一步保持一或多種標的物在生物樣本中的濃度和活性。
在另一方面，該製備物製備成藥品組成物。
本發明的這些與其它方面和具體實例在這裡被詳細地說明。
有效率地從生物樣本中分離和純化出蛋白質的方法在這裡揭示。特別是，本發明揭示利用親和力色層分析從血漿中連續純化蛋白質的方法。本發明的連續純化蛋白質方法利用二或多種配位子，每一種配位子視需要被連結到撐體上以形成配位子撐體複合物。每一種配位子或配位子複合物以已決定的順序，選擇性地和專一性地和標的血漿蛋白質結合，以使每一種配位子或配位子複合物連續地和血漿中的蛋白質結合。
本發明的連續蛋白質分離和純化方法是高度專一，而且在與配位子接觸之前，不像先前技術所慣例使用者一樣，需特別地預－條件化血漿。這些預－條件化不包含緩衝和一般過濾。本發明範疇中的預－條件化步驟包含了，例如，酒精沈澱，低溫沈澱，移除脂質和/或脂蛋白，優球蛋白沈澱，或其組合的方法和處理。此處意指著前述的預－條件化步驟在本發明申請專利範圍中特別地被排除。本發明的血漿蛋白質純化方法在生物醫藥的製造上是高價值的，因為可以有效率和快速地大量地製造實質上純的高活性的血漿蛋白質。本發明的方法在許多其它應用上，包含預後的，診斷的，及/或是偵測異常症狀上也都是有用的。
1.定義
此應用所使用的定義是作為說明使用而且不限制本發明的範疇。
用於本文，”樣本”包含了任何含有可以用本發明的方法分離和純化標的蛋白質的樣本。樣本可以從任何可能含有標的蛋白質的來源獲得。這些來源包含了動物，植物，土壤，空氣，水，真菌，細菌，和病毒，以及其他。動物樣本可以來自，例如，組織切片，血液，毛髮，口腔刮膜，血漿，血清，皮膚，腹水，肋膜腔積水，胸腔穿刺液，脊髓液，淋巴液，骨膸，呼吸道分泌液，腸道分泌液，生殖器分泌液，糞便，尿液，痰，淚液，唾液，腫瘤，器官，組織，試管內細胞培養成分，胚胎細胞，胎盤細胞或羊膜細胞及/或液，以及其他。
用於本文，“細胞培養物”包含任何原核或真核生物的培養物，例如，細菌，酵母菌和其它微生物細胞培養物，哺乳類細胞培養物，植物細胞培養物和昆蟲細胞培養物，發酵液態培養物物及其它用於生物醫藥的製造和傳送以及治療製劑的細胞培養物。
用於本文，”血漿”意指液態血液成分以及包含了血漿衍生物，和含有血漿的組成物。
用於本文，”附著”在本發明的範疇內被廣泛地定義，而且包含了在兩個實體之間任何物理上，化學上和生物上的結合方式，和包含了，例如但不限於，吸收，吸附，共價鍵結，離子交換，疏水性，氫鍵鍵結，偶極力，四極或親和力交互作用，帶電族群的形成，親和力配位子的附著(例如：包含胜肽，寡核苷酸，蛋白質，空間臂，疏水性部分和添加氟化的材料)，以及其它。
用於本文，”配位子”在本發明的範疇內被廣泛地定義，而且包含了和標的蛋白質結合的化學或生物實體。配位子是和標的蛋白質結合而且可以被從天然或合成製造的材料中分離出來的化合物，分子，細胞和細胞的成分。配位子對原核或真核細胞可以是內生的也可以外生的。配位子包含了胜肽，多肽，胜肽模擬物，小分子，染劑，含有三氮雜苯的化合物，抗體或抗原結合片段，以核酸為基礎的分子，非以多肽或核酸為基礎的分子，碳水化合物，碳水化合物之模擬物，脂質，無機物質，抑制劑，受質，或任何其組合。
用於本文，”實質上純的，或”實質上不含”意指蛋白質被從它們自然的環境中移出和被分離或純化，而且係至少70%，較佳為85%，更佳為95%，而最佳為99%或更高地不含其他該蛋白質天然所連接的成分。
用於本文，”以多肽為基礎的分子”包含了任何蛋白質，多肽或胜狀片段，天然胜肽，重組胜肽，合成胜肽，具生物活性片段，實質上相似的多肽，寡胜肽，同質雙聚物，異質雙聚物，多肽的變體，經修飾的多肽，衍生物，相似物，融合蛋白質，促效劑，拮抗劑，和抗體，以及其它。
用於本文，”小分子”包含，但不限於，碳水化合物，碳水化合物之模擬物，胜肽模擬物，分子量少於10,000克每莫耳的有機或無機的化合物(即，包含異有機(heterorganic)和有機金屬(organometallic)化合物)，分子量少於5,000克每莫耳的有機或無機化合物，分子量少於1,000克每莫耳的有機或無機化合物，分子量少於500克每莫耳的有機或無機化合物，以及鹽類，酯類和其它在化學上可接受的此種形式的化合物。
用於本文，術語”病原體”意指用來表示任何可以在生物樣本，例如血液樣本中，複製或感染生物的媒介。這些病原體包含了對那些熟習技術者已知常被發現於或感染整個血液或血液部分的各種病毒，細菌，原生動物和寄生蟲，以及其它未知的病原污染物。此類的病原體的說明例子包含，但不侷限於，細菌，如鏈球菌類，大腸桿菌類，桿菌類；病毒，如人類免疫缺乏病毒和其它反轉錄病毒，皰疹病毒，類黏液病毒，細胞巨大型病毒，肝炎病毒(包含了A型肝炎，B型肝炎，C型肝炎)，水痘病毒，披蓋病毒(toga virus)；以及寄生蟲，如瘧疾寄生蟲，包含了瘧原蟲類和錐原蟲類寄生蟲。
其他本文所使用的用在蛋白質純化領域的術語通常可被在此領域有著熟習技術的人所瞭解。
在一個具體實例中，本發明提供從血漿中萃取特定血漿蛋白質的方法。這些方法是利用色層分析樹脂，其上連附對二或多種血漿蛋白質具有選擇性和專一性的配位子。樹脂和血漿接觸，而此接觸導致標的蛋白質選擇性地和配位子結合。之後，標的蛋白質可被以高回收率和純度地沖提。因此，根據本發明的方法，血漿可被有效率地分成各種成分血漿蛋白質部分。較佳的萃取順序和特定蛋白質的接續分離在本文被揭示。
血漿蛋白質在本發明的範疇裡包含了任何且所有超過一萬種在血漿裡的不同蛋白質，包含，例如但不限於，丁醯膽鹼脂化酶(butyrylcholinesterase，BChE)，血液凝血因子(即，血纖維蛋白原，第二凝血因子，第五凝血因子，第七凝血因子，第八凝血因子，第九凝血因子，第十凝血因子，第十一凝血因子以及第十二凝血因子)，凝血酵素原，蛋白質C，纖維蛋白溶酶原，抗凝血酵素原III，肝球蛋白，運鐵蛋白，蛋白素，阿爾法－1－蛋白酶抑制劑，載脂蛋白A1(也稱做載脂A1脂蛋白)，免疫球蛋白，低密度脂蛋白氧化酶，凡威力布蘭德因子(Von Willebrand factor，vWF))，其所有在生物無疾病的狀態下都可以被自然地血漿中找到。
或者，在本發明的範疇裡血漿蛋白質在與疾病狀態相關血漿中出現，可能會也可能不會在健康者的血漿中被發現。也為本發明的範疇所涵蓋者為那些因為服用劑物，也就是藥品，而出現在血漿中的血漿蛋白質。在此考量下，血漿蛋白質可以是具感染力的PrPsc普利昂蛋白質(PrPsc prion protein)。
1.配位子
本發明的蛋白質純化方法利用了二或多種連結到撐體系統的配位子。配位子可能包含一或多種官能基以提供離子性，疏水性，氫鍵鍵結或凡得瓦作用力與要被分離的生物分子上相關基作用。用於本發明方法的適合配位子包含例如利用直接合成或像是隨機或組合胜肽或非胜肽資源庫的多樣資源庫所製造的合成化合物。在此技術中被熟知的其它資源庫包含了化學合成資源庫，重組資源庫(即，噬菌體展示資源庫)，和以試管內轉譯為基礎的資源庫。這些資源庫可以被用來篩選和本發明的標的蛋白質專一性地結合的分子。
化學合成資源庫的例子係敍述於，例如，Fodor等人，Science 251：767－773(1991)；Houghten等人.Nature 354：84－86(1991)；Brenner和Lemer，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89：5381－5383(1992)，和美國專利第6,117,996號，以及其它。噬菌體展示資源庫的例子係敍述於，例如，Scott和Smith，Science 249：386－390(1990)；Devlin等人,Science 249：404－406(1990)；和Christian等人,J.Mol.Boil. 227：711－718(1992)，以及其它。以試管內轉譯為基礎的資源庫的例子係敍述於，例如，Matteakis et al.,Proc.Natl.Acad.Sci .USA 91：9022－9026(1994)，以及其它。
在一個具體實例中，本發明的配位子是一個基本上由大約3到大約5，8，10，15或30或更多的胺基酸所組成的胜肽。胺基酸是D或L型的胺基酸。胜肽可以很方便地從任何資源庫中被挑選出來，包含了隨機胜狀資源庫，組合胜肽資源庫，或偏倚胜肽資源庫(biased peptide library)。在此所使用的術語”偏倚”意指產生此資源庫的方法被操作以致於限制了一或多種控制分子的最終集合之多樣性的參數。
在胜肽資源庫中，不同序列的不同胜肽的數目會隨著偶合反應的次數，胜肽的大小，和不同的胺基酸的使用數目而劇烈地增加。例如，隨機地將十九種胺基酸加入含五個胺基酸的胜肽可產生達2,476,099(195 )個不同序列的個別胜肽(Lam，等人，如上述 )。組合方法可以直接在撐體上產生配位子的資源庫。典型地，配位子是在撐體的顆粒上被合成，所以在每個粒子(即小珠))上可以合成一種配位子的多重拷貝，雖然這在本發明的內容裡不是必要的。
另一個可以使用的資源庫的例子，其胜肽的醯胺基官能基已被泛甲基化而產生化學上轉變的組合資源庫，已在Ostresh等人，Proc.Natl.Acad.Sci .USA 91：11138－11142(1994)中被描述。
非胜肽的資源庫可廣泛地分成兩種類型：經裝飾的單體和寡聚體。經裝飾的單體資源庫利用了相對較簡單的骨架構型，而在其中加上了各樣的官能基。通常此骨架會是具有已知醫藥活性的分子。例如：骨架可能是苯二酚(benzodiazepine)結構。
非胜肽寡聚體資源庫利用了大量的單體結合在一起，其結合方式依照單體次序創造出的新構型。在單體單元中曾被使用的是胺基甲酸，派羅利諾(pyrrolinone)，嗎啉代(morpholinos)。類胜狀(peptoids)和類－胜肽寡聚體，其支鏈連結於阿爾法胺基而非阿爾法碳上，形成另一種形式的非胜肽多聚體資源庫的基礎。第一個非胜肽多聚體資源庫利用了單一型式的單體，因此包含重覆的骨架。近期的資源庫則使用多於一種的單體，使資源庫增加了靈活性。
其它在本發明中有用的非胜肽資源庫是，例如，在Ecker和Crooke,Bio/Technology 13：351－360(1995)中所描述的資源庫。這些資源庫使用了像是，例如，苯二酚(benzodia)，(參閱，例如，Bunin等人，Proc.Natl.Acad.Sci .USA 91：4708－4712(1994))，可被用來改造後使用。此外，類胜肽資庫(例如，Simon等人，Proc.Natl.Acad.Sci .USA 89：9367－9371(1992))也可被使用。其它在胜肽資源庫被使用的化合物包含尿囊素，哌二酮，聯苯，糖類似物，貝塔巰基酮，芳基醋酸，醯基哌啶，苯並哌喃，正立方烷(cabanes)，黃嘌呤，胺化亞胺(aminimide)和唑啉酮，以及其它。
資源庫篩選可以用各種任何通常已知的方法來完成。參閱，例如，下列的參考資料，其揭示胜肽資源庫的篩選：Parmley與Simth,Adv.Exp.Med.Biol .251：215－218(1989)；Scott與Smith,如上所述；Fowlkes等人，BioTechniques 13：422－427(1992)；Oldenburg等人，Proc.Natl.Acad.Sci .USA 89：5393－5397(1992)；以及Yu等人，Cell 76：933－945(1994)，以及其它。以篩選方式來尋找可以與標的蛋白質結合的分子，也可以使用讓資源庫的成員和固定在固相的標的蛋白質結合並將和標的蛋白質結合的成員收取下來的方法來完成。用此稱為”淘洗(panning)”技術之篩選方法的例子在Fowlkes，如上所述的例子中被描述。
較佳的，本發明中的配位子是用模擬和組合化學的方式來設計，且包含那些可能是對稱或不對稱，單鏈或分支的合成/生物模擬配位子。配位子較佳是抗鹼以及忍受普通鹼再生(alkali regeneration)和消毒程序。本發明的配位子有非常低的漏損量，具安全性以及對標的蛋白質具有高結合容量及專一性。
本發明的範疇裡所使用之較佳的配位子或配位子與撐體系統包含，例如但不限於，Mimetic Blue配位子(HSA管柱用)，而樹脂被命名為Mimetic BlueSAHL P6XL；MAbsorbent配位子(IgG結合用)，而吸附劑命名為MAbsorbentA2P；用於A1PI的ProMetic PBL 112－80；用於纖維蛋白原的ProMeticPBL 112－81吸附劑；用於纖維蛋白溶酶原的ProMetic PBL 112－82吸附劑；用於vWF/第八凝血因子的ProMetic PBL 112－83吸附劑；ECH－Lys－Sepharoe FF，批號第243526；SAHL P6XL－樹脂；和包含ARQFDF(SEQ ID NO：1)的胜肽配位子樹脂。前述的吸附劑使用Purabead 6L(交連瓊脂糖)為撐體基質。Purabead 6或6XL撐體基質本身並不會吸附這些蛋白質。
2.撐體
本發明方法的一個具體實例中，配位子連結到撐體上。這裡所使用的術語”撐體”指任何撐體基質，例如那些此技術中已知的固態撐體，其用於固定配位子。撐體或撐體基質是任何固態或液態的物質，具孔洞或非具孔洞，二度空間或三度空間的，而配位子可以連附在其上並提供了將配位子從接觸溶液中與溶質分離的便利方法。較佳地，撐體在配位子連附後是成惰性，如此與標的的共價作用會減至最低。
也包含在本發明的範疇內的是空間臂的使用以把配位子連結到撐體上。空間臂可以使用廣泛地各種不同型式，包含但不限於，氫氧化的材料如聚乙烯乙二醇，聚乙烯氧化物，直鏈或支鏈的烷類，二胺，乙二醇，芳香環和，碳水化合物，或任何這些與其他的組合。
在一個具體實例中，撐體基質包含可以吸附和吸收標的物質的具孔洞粒子。粒子可視需要地覆蓋一或多種物質以修飾撐體基質的表面性質，此物質在有機液體或水性液體裡是會漲大或不漲大的，且是實質上不溶於水或液體。
用於本發明的連續蛋白質純化流程較佳的撐體基質是具孔洞的粒子。用於吸附分離的具孔洞粒子可以以大量不同材料的各種型式中取得，包含矽膠，玻璃，纖維素，瓊脂糖，以及各式不同的聚合物，包含聚苯乙烯，聚甲基甲基丙烯酸酯，聚丙烯醯胺，瓊脂糖，水凝膠，丙烯酸樹脂以及其它各種用於電泳的凝膠。許多具孔洞的吸附粒子例如矽膠，玻璃和聚合物可以被乾燥而且具有互連的孔洞表面積範圍從乾的粒子每克約有1－2平方公尺到乾的粒子每克有超過300平方公尺。其它類型的粒子是交連水凝膠。
特佳的撐體基質是瓊脂糖和聚氫氧化甲基丙烯酸酯樹脂。各種顆粒化的瓊脂糖凝膠和聚合物樹脂可以在市面上買到。這些撐體可以在購買時已有配位子連結或者是，配位子可以利用標準方法被間接地連結或直接固定在撐體上(參閱，例如，Harlow與Lane,Antibody,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1988)；Biancala等人，Letters in Peptide Science ,7(291),297(2000)；MacBeath等人，Science,289,1760－1763(2000)；Cass等人編輯，Proceedings of the Thirteenth American Peptide Symposium ,Lieden,Escom,975－979(1994)；美國專利第5,576,220號；Cook等人，Tetrahedron Letters ；35，6777－6780(1994)以及Fodor等人，如上述)。在一個具體實例中，配位子在撐體的表面上合成，這對產生胜肽資料庫是有利的。配位子可以化學性地結合到撐體或者透過連結子來連結，如鏈球菌抗生物素蛋白，貝塔丙胺酸，甘胺酸，含有甘胺酸－絲胺酸的聚合物，短鏈有化學式(－CH2)的碳氫化合物，聚乙二醇，epsilon胺基己酸，以及含有－O(CH2 )n 的連接子，其中n的數目為1到30。
3.標的蛋白質的結合和沖提
標的蛋白質或標的生物分子和配位子或配位子撐體複合物的結合通常是藉由讓含有標的物的水溶液和配位子或配位子撐體複合物接觸來進行。此可以用各種方法達成，包含但不限於，讓含標的物的溶液通過已填充配位子撐體複合物的床或管柱，或是在攪伴槽或漿體中做批次吸附。較佳的，標的蛋白質是經由用幫浦控制流速讓水溶液通過管柱來抓取。理想地蛋白質標的結合應該是溶液的前處理是不必要的且含有標的的溶液係直接加入配位子撐體複合物這樣的方式來進行的。然而，當結合所需時，含標的物的溶液的特性可能被調整，例如，稀釋，改變pH，離子強度或極性，溫度改變，以及添加可溶性作用劑，包含但不限於，緩衝盬，無機盬，有機盬，嵌合化合物，硫醇，清潔劑，界面活性劑，有機溶劑，醇類，乙二醇，高離液(chaotropic agents)，金屬離子，或任何其組合。
為將標的蛋白質從配位子或配位子撐體複合物中回收，配位子或配位子撐體複合物可以以接觸促進標的蛋白質從配位子或配位子撐體複合物上分離的溶液(即，轉移液(transfer solution)或沖提液(elution solution))。轉移液可以選自由具有不同的盬濃度，pH，或變性能力之緩衝液，有機溶劑，極性修飾媒介如酒精和二次去離子水。另一選擇，或除此之外，電梯度或溫度改變可以將標的蛋白質從蛋白質配位子撐體複合物中分離。轉移液也可以包含配位子(不同於蛋白質配位子撐體複合物中的配位子)，標的蛋白質的輔因子，鏡像專一分子，以及相似物。使用不同的轉移液可以研究沖提的條件或特定標的蛋白質的轉移。用於本發明方法的分離和轉移條件係經選擇以使配位子和標的蛋白質的崩解降至最低。換句話說，沖提或轉移的條件不應該將配位子從撐體上釋放或將標的蛋白質變性，除非這是必要的。
在一個具體實例中，標的蛋白質在沖提之前已在蛋白質配位子撐體上被偵測和確認。在蛋白質配位子撐體上偵測和確認標的蛋白質可以包含進行結合測試。結合測試通常包含了讓蛋白質配位子撐體和一個已知會和受質結合的部分接觸。用於結合測試的結合部分包含了，例如，抗體或其抗原結合片段，蛋白質，或寡核苷酸。較佳地，蛋白質配位子撐體和會結合標的蛋白質(或是標的蛋白質化學上或生物上的副產物或其片段)的抗體或其抗原結合片段接觸。較佳結合部分是經可偵測標籤標記，例如，放射性同位素，發色基，或螢光標籤。在這樣的結合測試裡，由可偵測標籤所發出的訊號被偵測，因而傳達了標的蛋白質的存在。一旦標的蛋白質在蛋白質配位子撐體上的存在被確認，蛋白質就可以被分離。
標的偵測的結合測試被進一步的描述於，例如，Harlow與Lane,如上述 ；Sambrokk等人，Molecular Cloning,實驗手冊，第二版，Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；以及，Haugland,Handbook of Fluorescent Probe and Research Chemicals(9th ed.),Molecular Probe,Eugene,OR(2002)。可選擇的，本發明之方法可以進一步包含洗滌步驟以在偵測之前移除過量，未結合的結合部分或是標記。
或者，本發明方法可以包含進行酵素活性測試以在生物活性的基礎上定出標的蛋白質的特徵。酵素的受質被放入蛋白質配位子撐體使受質經標的蛋白質的酵素修飾而形成產物。然後產物被偵測，因此確認了標的蛋白質在樣品中的存在。
標的蛋白質的結合和沖提可以用任何適當的方法來測量，許多方法存在而且其在某一特定目的上的表現和適用性是熟習該項技術者所熟知的。
4.使用的方法
在此描述的本發明提供從生物樣品中連續分離蛋白質的方法，其方法生產高活性和高度純化的蛋白質。本發明的方法是高靈敏的而且可以從樣本中分離出量極少的標的蛋白質。本發明的連續蛋白質純化方法在各式的應用上是有用的，包含預後的，診斷的，偵測，純化，分離，在試管內表現的基因產物的加工，以及生物醫藥的製造。本發明的純化和萃取技術提供了減少分離步驟次數，改進的產率，增加純度以及克服了傳統方法的限制等超越傳統純化技術的優點。
特別的，本發明的方法最佳化純化方法和以增加效率和純度的方法改善了生物醫藥的生產方法。生物醫藥是包含蛋白質，胜肽或其它複合聚核苷酸或蛋白質為基礎的巨分子(總括為“基因產物“)的藥物。其生產方法包含了從宿主生物量(biomass)中，例如血漿或非人類生物來源(即，重組或非重組細胞培養物，基因轉殖動物的乳汁，或其它重組或非重組的來源)，回收想要的基因產物。從生物量中回收想要的蛋白質到商業上可實行的產率是具挑戰性的，因為生物量中含有不想要的宿主蛋白質，核酸分子以及其它天然出現的化學物。
在一個具體實例中，本發明的方法用來從全血，紅血球濃縮液，血小板濃縮液，血漿，血漿衍生物，白血球，去白血球血液，哺乳類細胞培養物，發酵液態培養基以及其它用來生產和傳送生物醫藥和製備治療法的基質中分離蛋白質。
在一個較佳的實例中，本發明的方法連續地從血漿樣本中分離高活性的血漿蛋白質。任何血漿加工工業其目標在於生產治療用或生物醫藥產品的生產線上，利用本發明的方法可以同時且快速地從樣本中分離多種蛋白質。一順序地分離血漿蛋白質的實例在下面表1中被揭示：
經分離的血漿蛋白質是“實質上純的“，具有大約是70%，較佳為約85%，更佳地為約95%，而最佳地為約99%或更高的純度。在這裡列舉出這樣特定的純化數值是想指出，舉出的數值也包含了那些在列舉數值之間的所有特殊整數值。例如，大約85%意指包含80%，81%，82%，83%和84%而非真正地指出該處之實質上純的特定程度。
熟習相關技術的人會了解對在這裡所描述的方法和應用適當的修改和改編，基於具有通常知識者所知的知識，從本發明的描述中是很明顯的，且不會遠離本發明或其任何實例的範疇。經詳細描述本發明後，藉由參考接下來的實施例，其隨附在此只為了說明的目的而且非限制本發明，本發明會更清楚地的被了解。
實施例 實例1：線性級聯順序方案1-7的定義
線性級聯由五個親和力色層分析管柱所組成：蛋白素(HSA)，血纖維蛋白原(Fg)，IgG，纖維蛋白溶酶原(Pg)，以及PON1/ApoA1。最初，這些管柱以四種不同的順序連續地進行以決定線性級聯的最佳順序。為了簡化進行中的樣本分析，只收集未稀釋的流經液作為順序中下一個管柱的起始物。特別地，此步驟幫助了在整個實驗過程中背景蛋白質的濃度維持在一定值。同時也簡化了每一管柱的輸出和輸入之間的比較。起始物和每一個流經液的樣本都被分析以監控流經液裡的標的以及非標的蛋白質的回收率。這些數值用來監測每一根管柱以決定其抓取標的蛋白質且對下游標的蛋白質有最小的滯留的能力。最能符合這個條件的順序被用來當做線性級聯順序(LCS)。一旦從第一次實驗組的分析資料出現，另外三個順序也被測試，A1PI管柱加進成為方案6和7。
材料與裝備下列的樹脂被用於級聯中，填充在Pharmacia XK 50管柱中(20或30公尺長)：纖維蛋白溶酶原管柱：Pharmacia ECH－Lys－Sepharose FF.批號243256血纖維蛋白原管柱：ProMetic Purabead,(系列中的兩個管柱)，批號CG1251和批號CG1252。IgG管柱：ProMetic MAbsorbent A2P，批號FA0582－Z。HSA管柱：ProMetic Mimetic Blue SAHL P6XL批號FA0500Z PON1/ApoA1管柱：Peptide International,Toyopearl WWWLHAN批號217772。
A1PI管柱：ProMetic 12/330 P6XL樹脂，批號CG1255。
所有的色層分析的進行都使用AKTA Explorer 100色層分析系統配備950分液收集器(Amersham Biosciences)。超過濾(Ultrafiltation(UF))/透析過濾(diafiltration(DF))使用兩張200平方公分Hydrosart醋酸酯維素膜(10kD分子量半徑)在Sartorius Sartocon Slice200超過濾系統中進行。
方法 每一次實驗，第一根管柱的起始物是混合的人類血漿加上50 mM Tris,pH 7.5，以0.2毫米的孔徑過濾。每一管柱的流經液以流份的方式收集並依照色層分析的UV吸收(A280)圖形混合。此混合物被用作為順序中下一管柱的起始物。如果下一管柱要在次一天才進行，流經液會被滅菌過濾(0.2毫米真空過濾)並儲存在室溫下。在方案6和7中，UF/DF被用來縮小體積以及進行如在表2中所指出的經混合流經液的緩衝液交換。此對將A1PI的起始物原料帶進A1PI管柱實驗緩衝液(15mM sodium phsphate,pH 6.1)係必要的。
結果 每一個方案的步驟產率表及圖表顯示如下。N/A意指資料是無法得到的。<LOD意指蛋白質的量低於特定測定方法的偵測極限。
表3摘要了方案#1的結果
表4摘要了方案#2的結果
表5摘要了方案#3的結果
表6摘要了方案#4的結果
表7摘要了方案#5的結果
表8摘要了方案#6的結果
表9摘要了方案#7的結果
結論
在方案1之前的實驗(和方案1一樣的順序)，起始物為經過濾過的血漿而不添加任何緩衝液系統。當血漿加進管柱中，流經液的pH有顯著的變化。因為這觀察的結果，在加入到第一根管柱之前，1M的Tris緩衝液，pH 7.5，被加入血漿中到最後濃度為50 mM。參閱接下來的實施例3以得到緩衝液選擇方法的摘要。此七個方案展示了以進行親和力色層分析的線性級聯來作為有效率地純化血漿蛋白質方法的可行性。分析資料以及根據下列觀察選擇順序。在方案1，下游標的蛋白質的回收率在整個實驗過程中維持地相當高。在方案2，IgG管柱幾乎耗盡了纖維蛋 白溶酶原，血纖維蛋白原以及ApoA1的進樣流。同樣地在方案3，IgG管柱抓取了ApoA1。在這些觀察的基礎下，PON1，Pg和Fg管柱被決定在順序上必須被置於IgG管柱之前。
下列幾點在根據這個實驗決定線性級聯管柱色層分析步驟的順序之時被考慮。
●PON1，Pg和Fg的抓取步驟應置於IgG之前
●因為蛋白素和檸檬酸會干擾A1PI管柱色層分析，A1PI管柱應置於蛋白素管柱之後。在A1PI管柱之前，流經液需要UF/DF步驟來進行緩衝液交換。
●IgG應置於蛋白素管柱之前以避免流失IgG。
因此，在此實驗的線性級聯順序被選為：PON1/ApoA1→纖維蛋白溶酶原→血纖維蛋白原→IgG→HSA→UF/DF→A1PI。
這裡需指出的是在另一個實驗中，PON1/ApoA1管柱從此級聯中移除而且vWF/FVIII在樹脂可用時在插入置於纖維蛋白溶酶原之前。
實例2：血漿蛋白質的親和力抓取
以下的管柱順序被用於此實驗中：vWF/FVIII→纖維蛋白溶酶原→血纖維蛋白原→IgG→UF/DF→HSA→UF/DF
血漿製備：四公升的冷凍混合血漿從-20℃的儲存中 得到。血漿混合在37.0℃±2℃的水浴中解凍。一旦血漿已解凍，迅速地將其移出水浴。用50倍稀釋的1M Tris,pH 7.5以及40倍稀釋的2M NaCl將血漿調整為20 mM Tris,50mM NaCl。血漿被混合均勻以及使用SartoPure 300 P2(8毫米)滅菌過濾器過濾。
a. vonWillebrand氏因子/第八凝血因子(vonWillebrand Factor/Factor VIII，vWF/FVIII)親和力抓取
一根7公分乘10.6公分填充床管柱含有410毫升發展用於vWF/FVIII親和力抓取的抓取的親和力吸收劑被準備好。在長時間不使用時，此管柱通常維持在含有0.1 N氫氧化鈉的儲存溶液中。先前儲存的管柱用流速為80公分/小時的三倍管柱體積的Milli Q水來洗滌直到電導度降到1mS/cm之下。管柱用4倍管柱體積的平衡(EQ)緩衝溶液來平衡，其含有20 mM Tris，20 mM檸檬酸，140 mM NaCl，pH 7.5。過濾好的血漿被加入管柱。當280nm吸收值到達吸收單位全規模(AUFS=2)的5%時，收集流經液。
管柱用4倍管柱體積的EQ緩衝液來洗滌，同時持續收管柱的流出液直到吸收值降至AUFS的5%。溶液徹底但溫和地的混合，然後使用3/0.8毫米SartoClean CA(H8)緊接著用0.45/0.22毫米SartoClean P(H8)過濾器來過濾。過濾器用500毫升的EQ緩衝液做後清洗。結合的過濾液溫和地混合。此過濾液構成了vWF/FVIII抓取步驟的流經液 (vWF/FVIII-FT(流經液))。vWF/FVIII以4倍管柱體積的沖提液來沖提，其含有20 mM Tris,500 mM NaCl,3 mM CaCl2,0.01% Polysorbate 80,30%乙二醇，pH 6.5。管柱的流速設為30公分/小時。沖提液的收集在UV上升至AUFS的2%時開始。沖提液持續收集至吸收降至AUFS的2%以下。管柱沖提液溫和地被混合並儲存在-80℃直到準備好進一步的處理。樹脂用CIP-1溶液來再生，其含有0.5N氫氧化鈉/1% Triton X-100。大約3倍管柱體積的CIP-1溶液以降低的流速3毫升/分鐘，逆流的方式加入管柱中。樹脂接著以2倍管柱體積的CIP-2溶液洗滌，其組成為30%異丙醇在0.5N的氫氧化鈉浴液中，流速為5毫升/分鐘。樹脂以3倍的管柱體積的儲存液平衡直到下次使用。
b.纖維蛋白溶酶原(Pg)親和力抓取
一根5公分乘13公分填充床管柱含有255毫升發展用來親和力抓取纖維蛋白溶酶原用的親和力吸收劑被準備好。當短時間不使用時，管柱通常維持在含有0.1N氫氧化鈉的儲存溶液中。先前儲存的管柱用流速為160公分/小時的1到2倍管柱體積的Milli Q水來洗滌直到電導度降到1mS/cm之下。管柱用3到4倍管柱體積的平衡(EQ)緩衝溶液來平衡，其含有20 mM Tris，20 mM檸檬酸，140 mM NaCl，pH 7.5。先前抓取步驟的vWF/FVIII-FT被加入管柱。當280nm吸收值到達AUFS(吸收單位全規模)的5%時，收集流經液。
管柱用2到3倍管柱體積的EQ緩衝液來洗滌，同時持續收管柱的流出液直到吸收值降至AUFS的5%。溶液被徹底但溫和地的混合，然後使用0.22毫米的Sartobran過濾器來過濾。過濾器用500毫升的EQ緩衝液做後清洗。收集的過濾液溫和地被混合。此過濾液構成了纖維蛋白溶酶原抓取步驟的流經液(Pg-FT)。管柱以兩倍管柱體積的洗滌緩衝液來洗滌，其組成為EQ含有30mM辛酸，pH 7.5，接著使用2倍管柱體積的EQ緩衝液洗滌。纖維蛋白溶酶原以2到3倍管柱體積的沖提液來沖提，其含有50 mM磷酸鈉，0.5 M EACA，pH 7.0。沖提液的收集在UV上升至AUFS的2%時開始。沖提液持續收集至吸收降回至AUFS的2%以下。管柱沖提液被溫和地混合並儲存在-80℃直到準備好進一步處理。樹脂用CIP-1溶液來再生，其含有0.5N氫氧化鈉。大約4倍管柱體積的CIP-1溶液以降低的流速40毫升/分鐘，逆流的方式加入管柱中。樹脂以3倍的管柱體積的儲存液平衡直到下次使用。
c.血纖維蛋白原(Fg)親和力抓取
一根10公分乘10.1公分填充床管柱含有790毫升發展用來親和力抓取血纖維蛋白原用的親和力吸收劑被準備好。當短時間不使用時，此管柱通常維持在含有0.1 N氫氧化鈉的的儲存溶液中。先前儲存的管柱用流速為60公分/小時的1到2倍管柱體積的Milli Q水來洗滌直到電導度降到1mS/cm之下。
管柱用3到4倍管柱體積的平衡(EQ)緩衝溶液來平衡，其含有20 mM Tris，20 mM檸檬酸，140mM NaCl，pH 7.5。先前抓取步驟的Pg-FT被加入管柱。當280nm吸收值到達AUFS(吸收單位全規模)的5%時，收集流經液。管柱用4到5倍管柱體積的EQ緩衝液來洗滌，同時持續收管柱的流出液直到吸收值降至AUFS的5%。溶液被溫和地的混合，然後使用0.22毫米的Sartobran過濾器來過濾。過濾器用500毫升的EQ緩衝液做後清洗，結合的過濾液溫和地被混合。此過濾液構成了纖維蛋白溶酶原抓取步驟的流經液(Fg-FT)。血纖維蛋白原以4到5倍管柱體積的沖提液來沖提，其含有20 mM Tris，20 mM檸檬酸，140 mM NaCl，1%膽酸鹽，10%丙二醇，pH 7.5。沖提液的收集在UV上升至AUFS的2%時開始。沖提液持續收集至吸收降至AUFS的2%以下。管柱沖提液溫和地被混合並儲存在-80℃直到準備好進一步處理。樹脂用CIP-1溶液來再生，其含有1.0N氫氧化鈉。大約4倍管柱體積的CIP-1溶液以降低的流速80毫升/分鐘，逆流的方式加入管柱中。樹脂以3倍的管柱體積的儲存液平衡直到下次使用。
d.免疫球蛋白G(IgG)親和力抓取
起始物以添加十分之一體積的起始物調整緩衝液(300mM辛酸溶於EQ)至Fg-FT中並且混合均勻而製備。一根14公分乘12.2公分填充床管柱含有1880毫升發展用來親和力抓取IgG用的親和力吸收劑被準備好。當短時間不便用時，此管柱通常維持在含有0.1 N氫氧化鈉的的儲存溶液中。先前儲存的管柱用流速為73公分/小時的2倍管柱體積的Milli Q水來洗滌直到電導度降到1mS/cm之下。管柱用2倍管柱體積的平衡(EQ)緩衝溶液來平衡，其含有20 mM Tris，20 mM檸檬酸，1 M NaCl，pH 7.5，緊接著使用3到5倍管柱體積的IgG平衡緩衝液，其組成為30 mM辛酸，20 mM Tris，20 mM檸檬酸，140 mM NaCl，pH 7.5。先前抓取步驟的Fg－FT被加入管柱。當280nm吸收值到達AUFS(吸收單位全規模)的5%時，收集流經液。
管柱用4到5倍管柱體積的洗滌液來洗滌，同時持續收管柱的流出液直到吸收值降至AUFS的5%。溶液被溫和地的混合，然後使用0.22毫米的Sartobran過濾器來過濾。過濾器用500毫升的EQ緩衝液做後清洗，收集的過濾液被溫和地混合。此過濾液構成了IgG抓取步驟的流經液(IgG－FT)。在IgG沖提之前，管柱先以1倍管柱體積的前沖提液調整，其組成為50 mM檸檬酸，pH 6.0。以4倍管柱體積的沖提液來沖提IgG，其組成為50 mM檸檬酸，pH 3.0。沖提液的收集在UV上升至AUFS的2%時開始。沖提液持續收集至吸收降至AUFS的2%以下。管柱沖提液被溫和地混合，以足量的1M Tris－Base將pH調整至7以上並儲存在－80℃直到準備好進一步的處理。樹脂用CIP－1溶液來再生，其含有1.0N氫氧化鈉。大約4倍管柱體積的CIP－1溶液以降低的流速170毫升/分鐘，逆流的方式加入管柱中，緊接著是3倍管柱體積的Milli Q水，以順流的方式。樹脂以3倍的管柱體積的儲存液平衡直到下次使用。
e.超過濾/透析過濾
進行過濾以濃縮IgG-FT產物直到大約1.5到2公升的目標容量達到。透析過濾以相對6倍體積的EQ緩衝液進行，同時過濾進口壓力(P1)為18±1 psi並且TMP為15±1 psi。透析物在透析過濾開始時和幾乎每一個透析過濾的滯留體積被取樣量測pH和電導度以監測透析過濾何時完成。
f.人類血清蛋白素(HSA)親和力抓取
一根20公分乘17.8公分填充床管柱含有5600毫升發展用來親和力抓取蛋白素用的親和力吸收劑被準備好。當短時間不使用時，此管柱通常維持在含有0.1 N氫氧化鈉的的儲存溶液中。先前儲存的管柱用流速為86公分/小時的1到2倍管柱體積的Milli Q水來洗滌直到電導度降到1mS/cm之下。管柱用3到4倍管柱體積的EQ緩衝溶液平衡。先前步驟的UF/DF滯留液被加入管柱。當280nm吸收值到達AUFS(吸收單位全規模)的5%時，開始收集流經液。
管柱用2到3倍管柱體積的EQ緩衝液來洗滌，同時持續收管柱的流出液直到吸收值降至AUFS的5%。溶液溫和地被混合。此過濾液構成了蛋白素抓取步驟的流經液(HSA-FT)。在沖提蛋白素之前，管柱先以2倍管柱體積的前沖提液調整，其組成為50 mM檸檬酸，300 mM NaCl，pH 7.5。蛋白素以2到3倍管柱體積的沖提液來沖提，其組成為50 mM檸檬酸鈉，50 mM辛酸鈉，pH 6.2。沖提液的收集在UV上升至AUFS的2%時開始。沖提液持續收集至吸收降至AUFS的2%以下。管柱沖提液被溫和地混合，並儲存在－80℃直到準備好進一步處理。樹脂用CIP－1溶液來再生，其含有1.0N氫氧化鈉。大約4倍管柱體積的CIP－1溶液以降低的流速400毫升/分鐘，逆流的方式加入管柱中，緊接著是3倍管柱體積的Milli Q水，以順流的方式。合成樹脂以3倍的管柱體積的儲存液平衡直到下次使用。
g. HSA流經液濃縮 連結裝有剩餘樣本的HSA－FT袋到在產物貯存槽的管柱入口。啟動在Slice 200系統上的幫浦，設在1300毫升/分鐘的定值流速。設定過濾器出口的壓力為13±1 psi。這樣應會造成過濾器入口壓力為18±1 psi而TMP為15±1 psi。當濃縮產物時，額外的HSA－FT仍持續加入系統貯存槽。濃縮持續進行至大約1.5到2公升的目標體積達到。在從過濾系統收取UF產物之前，無壓力和過濾在膜上的再循環持續約一分鐘。約500到1000毫升的平衡緩衝液加到貯存槽以清洗過濾系統。再循環慢慢地啟動以避免形成氣泡，系統無過濾和壓力地清洗約3到5分鐘。收集UF產物，清洗之並儲存在－80℃。HSA－FT濃縮液被認為是純化A1PI的適當起始原料。
結果
實例3：評估及選擇使用在線性級聯的血漿緩衝系統
本實驗是用來決定線性級聯順序血漿蛋白質純化流程的最佳緩衝液系統。在IgG管柱負載時，pH值上升至比血漿(pH~7.5)高2個單位被觀察到。在IgG負載時，pH值的改變被觀察到好幾次而且這似乎與蛋白質耗盡的程度有關。這代表了某些血漿蛋白質具有緩衝的能力，而這些蛋白質從負載液的移除可能會增加pH值變化的可能性。用於血漿的緩衝系統是必須的以保持血漿中蛋白質濃度和活性。緩衝系統必須能夠在整個過程中使pH維持在大約7.5±0.4的可接受範圍內。
為確保pH的改變不會出現在接下來的實驗，之後操作用的血漿負載液用1 M Tris pH 7.5的儲備液來做緩衝。此儲備液用兩個不同的儲備液來產生，1 M Tris Base和1 M Tris HCl。此兩種儲備液相互滴定至pH 7.5。在過濾之前，此儲備液在血漿做1比20的稀釋。最後製備好的負載液含有經50 mM Tris調整的血漿，經0.45/0.2毫米的過濾器過濾。此緩衝系統用於決定線性級聯順序(LCS)實驗1－7的測定中。50 mM Tris在整個過程中被用於血漿及實驗溶液中。當使用50 mM Tris,pH 7.5時，在管柱負載時沒有pH值的問題被觀察到。表15摘要了使用50 mM Tris,pH 7.5做為血漿緩衝液時LCS純化的步驟產率。
由於在量產的規模使用50mM Tris的相對高之推測費用，因此尋找代替的緩衝液系統。於小量分裝進行幾個實驗，其血漿以碳酸氫鹽，磷酸監和Tris，pH 7.5緩衝液。這些實驗進行幾天的規模以用來模擬多天的LCS實驗。同一血漿混合之分裝被緩衝並且在室溫(RT)下放置數日。每個樣本都分析其活性和蛋白質濃度。表17所展示的是當血漿以各個系統緩衝時每一培養步驟的產率。以50mM Tris緩衝的血漿進行了幾次以做為比較的基準點。
當與控制組，水，做比較時，結果指出各種測試的緩衝液沒有造成較大的蛋白質或活性流失。沒有標的蛋白質在添加緩衝劑後被反面地影響。每一個緩衝流程接著級聯研究測試以決定最佳的緩衝條件。
10 mM的磷酸鈉緩衝系統在LCS實驗中被評估。在血漿負載製備時，0.2 M的磷酸鈉儲備液以儲存液與血漿做二十倍的稀釋成10 mM磷酸鈉。在使用於線性級聯測試前，以10 mM磷酸鈉緩衝的血漿先經0.2毫米的過濾。在此緩衝流程的測試中，對標的蛋白質以及其它對蛋白質活性具指標性之因子的蛋白質活性顯著地較低。以下表18摘要了用10mM磷酸鈉緩衝液的幾個LCS的步驟產率。
雖然50mM Tris緩衝的血漿成功地避免了pH值的游移，一個更經濟的血漿緩衝方法是需要的。因此，20 mM Tris,pH 7.5，被使用於LCS。血漿用1 M Tris,pH 7.5做50倍稀釋以調整血漿成20 mM Tris，pH值在7.5。此儲備液以前述的方法製造，以Tris－HCl滴定Tris－Base。表19展示了用滴定成20 mM Tris的血漿之LCS的表現可以和如前述以50 mM Tris緩衝液者在標的蛋白質的回收率，緩衝能力和負載穩定度上相互比較。
表20展示測試的緩衝系統間透過LCS的HSA步驟產率之比較的結果。整體來說，HSA捕捉的步驟回收率在三個測試的緩衝液中是可以相互比較的，除了用10mM磷酸鈉之外，在IgG抓取步驟明顯有較低的HSA產率。此外，IgG，一有較高價值的標的蛋白質，當使用10 mM磷酸鈉時，在血纖維蛋白原抓取步驟時有較低的回收率。每個抓取步驟都以百分比產率值來表示。這些資料由0.5公升的實驗中收集，步驟回收率的計算僅利用蛋白素在負載液和流經液裡的量。
結論是含有50mM Tris的緩衝液是有效的血漿緩衝液，其可能在整個方法提高到量產規模時是過高的花費。多個Tris替代方案被評估並進行整個LCS實驗。這些替代方案以緩衝能力，使用的方便性，花費和蛋白質濃度與活性的保存為判斷的基礎。發現降低莫耳濃度的Tris(20mM)在pH 7.5是有效的血漿緩衝液。
本發明可在不悖離其精神與基本特點之下以其他特殊形式來具體化，因此，應參照隨附申請專利範圍，而非前述說明書，以表明本發明之範疇。
SEQ ID NO：1
胺基酸
ARQFDF

Claims (14)

  1. 一種連續蛋白質分離和純化的方法，其包含(i)提供血漿樣本，(ii)提供多種配位子，每一種皆專一地和該血漿樣本裡的標的蛋白質結合，其中該等配位子之每一者係視需要和撐體結合以形成多種配位子撐體複合物，(iii)將該多種配位子或配位子撐體複合物連續地且在預先決定的順序下和該血漿樣本接觸，以使每個配位子或配位子撐體複合物連續地和該血漿樣本中的標的蛋白質結合，其中該將該多種配位子或配位子撐體複合物和該血漿樣本接觸的預先決定的順序導致纖維蛋白溶酶原在IgG之前結合且IgG在蛋白素之前結合，且其中在該接觸之前該血漿樣本未經過預-條件化步驟(pre-conditioned step)處理，該預-條件化步驟選自由酒精沈澱、低溫沈澱、移除脂質和/或脂蛋白、優球蛋白沈澱、或其組合所組成的群組，(iv)沖提與該多種配位子或配位子撐體複合物之每一者結合的標的蛋白質，以及(v)連續地從該血漿樣本分離該標的蛋白質。
  2. 根據申請專利範圍第1項的方法，其中該標的蛋白質包括血纖維蛋白原、阿爾法-1蛋白酶抑制劑、載脂蛋白A1、免疫球蛋白、低密度脂蛋白氧化酶(paraoxonase)、凝血因子、vWF/FVIII、蛋白素、纖維蛋白溶酶原、或其組合。
  3. 根據申請專利範圍第2項的方法，其中血纖維蛋白原在IgG之前被從該血漿分離。
  4. 根據申請專利範圍第2項的方法，其中在該蛋白質分離期間低密度脂蛋白氧化酶在該血漿樣本裡的活性被維 持。
  5. 根據申請專利範圍第2項的方法，其中vWF/FVIII在纖維蛋白溶酶原之前被從該血漿分離。
  6. 根據申請專利範圍第2項的方法，其中載脂蛋白A1在IgG之前被從該血漿分離。
  7. 根據申請專利範圍第2項的方法，其中阿爾法-1蛋白酶抑制劑在蛋白素之後被從該血漿分離。
  8. 根據申請專利範圍第2項的方法，其中纖維蛋白溶酶原在血纖維蛋白原之前被從該血漿分離。
  9. 根據申請專利範圍第1項的方法，其中該配位子包含胜肽、多肽、胜肽模擬物、小分子、染劑、含有三氮雜苯的化合物、抗體或抗原結合片段、以核酸為基礎的分子、非以多肽或核酸為基礎的分子、碳水化合物、碳水化合物模擬物、脂質、無機物質、抑制劑、受質、或其任何組合。
  10. 根據申請專利範圍第9項的方法，其中該配位子包含基本上由約1到約15個胺基酸所組成的胜肽。
  11. 根據申請專利範圍第1項的方法，其中該撐體包含合成材料、天然材料、或兩者皆有。
  12. 根據申請專利範圍第1項的方法，其中該撐體包含瓊脂糖、聚丙烯醯胺、葡聚糖、纖維素、多醣、硝化纖維素、二氧化矽、氧化鋁、鋁氧化物、氧化鈦、鈦氧化物、氧化鋯、苯乙烯、聚二氟乙烯尼龍、苯乙烯和二乙烯苯的共聚合物、聚甲基丙烯酸酯、氮雜內酯聚合物或共聚物、玻璃、纖維素、瓊脂糖、任何前述物的衍生物、以及任何 前述物的組合。
  13. 根據申請專利範圍第1項的方法，其中該撐體是樹脂小珠。
  14. 根據申請專利範圍第1項的方法，其中該血漿樣本在該接觸之步驟之前以緩衝劑處理，以進一步保持該血漿樣本中一或多種標的物劑之濃度和活性。
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