CN1153063A - 从人血浆分部分离过程产生的馏分中回收免疫球蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

通过依次进行下面的步骤来生产高效价免疫球蛋白制剂：从一种血浆库中分部分离血浆，由此分离出至少一种基本上含有多克隆免疫球蛋白G的工业可用馏分，获得至少一种残余馏分；由前步获得的残余馏分中或其亚馏份中含有的蛋白质成分制备一种蛋白质溶液，将产生的蛋白质溶液用至少一种配体类型的固定配体进行至少一次亲合色谱法处理，使特异性血浆蛋白质与配体结合，并除去结合的血浆蛋白质，将它们作为活性成分转化成一种高效价免疫球蛋白制剂。所得的这种免疫球蛋白可以加工成一种IV耐受良好、贮藏稳定的产品。可制备有价值的免疫球蛋白制剂的这种方法使用了到目前为止常规工业血浆分部分离方法中弃之不用的人血浆馏份。

Description

从人血浆分部分离过程产生的馏分中 回收免疫球蛋白的方法
本发明涉及免疫球蛋白制剂，并且更特别涉及一种生产一种高效价免疫球蛋白制剂的方法，此方法可用于从通常的血浆分部分离方法产生的馏分中回收免疫球蛋白，到目前为止，这种方法还不用于或至少尚未用于生产免疫球蛋白制剂。
在人血浆中有超过一百种不同的蛋白质。通过从供体血浆收集液中分部分离能够将它们中的一些纯化，并且用作如下实例的治疗产品：白蛋白用于在血蛋白过少或血容量减少中补偿肿胀缺陷；将凝血因子VIII和IX给药分别用作预防出血，并治疗血友病A和B；免疫球蛋白用作预防感染和治疗抗体缺乏疾病以及自发的血小板减少性紫癜；选自具有高效价特异性免疫球蛋白供体的免疫球蛋白用作超免疫球蛋白制剂，这些制剂用于预防和治疗诸如甲型肝炎或乙型肝炎这样的特异性感染。
例如，根据公知的乙醇分部分离方法，能够分离治疗用血浆蛋白质(Cohn，E.G.，等人，J.Am.Chem.Soc.，68，459，1946；Kistler，P.，和Nitschmann，H.，Vox Sang.，7，414，1962)。使用以上两种方法，能够分离大量的功能性血浆蛋白质，诸如白蛋白或免疫球蛋白，在适当的配方中，它们能够有利于临床应用。然而，当根据这些方法进行操作时，出现了沉淀物和/或上清液，它们不能在常规的工艺中使用。这些馏分的组合物变化很大。
另一方面，例如，在血浆与19％乙醇于pH5.8时的沉淀反应中，发现人阿朴脂蛋白A-1(apo  A-1)在上清液中(约50％的血浆apo A-1)和在沉淀物A(约40％)中的份数近似相等，根据Kistler和Nitschmann的方法，在接下来的分部分离步骤后发现了相同的蛋白质，它们在那些到目前为止还没有在商业上使用的馏分中：沉淀物IV和沉淀物B(每种约40％)(Lerch等人，Protides of the BiologicalFluids，36，409，1989)。
对于铜结合蛋白质血浆铜蓝蛋白得到了类似的分布形式。分部分离后，发现20％的原材料在沉淀物IV中且40％的原材料在沉淀物B中。
一种血浆蛋白的实例是转铁蛋白，在相同的分部分离方法中，它基本上100％浓缩在沉淀物IV中，而发现80％的白蛋白在通常使用的沉淀物C中。
根据Kistler-Nitschmann或Cohn的分部分离方法，50-60％的免疫球蛋白可以从沉淀物GG中回收。在这些方法中，剩余的30-40％分布在沉淀物IV(5％)，沉淀物B(30％)和滤液GG(5％)中。
上述百分数用来说明分布大小的顺序并且不起限制作用；它们随条件和所用方法而改变。
这些实例表明，在有些情况中，在沉淀物IV，沉淀物B，上清液C和上清液GG的馏分中，或者根据Cohn的方法，在相应的血浆分部分离的馏分中(馏分IV-1，馏分II+III，上清液V和上清液II-1，2)，存在着相当一定数量的治疗用蛋白质。由于产品规格的原因，也由于世界范围的人血浆和某些血浆成分的短缺，所以应该在免疫球蛋白的生产上进行改进，到目前为止它们的产量还不是很高。
免疫球蛋白在防止感染中起着重要作用。病毒特异性中和抗体阻断病毒在细胞受体上的吸附并预防感染，而细菌特异性抗体调理病原体并通过中性白细胞和巨噬细胞将病原体消除和杀死。来自几千供体的血浆库含有许多不同特异性的免疫球蛋白，并且来自这样库中的免疫球蛋白制剂也因此含有可测定效价的免疫球蛋白，它们可直接抵抗病毒，细菌和毒素的表位。不可抵抗自身抗原。从而它们可有效地抵抗许多种感染以及在多数可变的其它病理条件下的感染。然而，目前在某些情况下，需要的是利用一种具有高效价特异抗体的免疫球蛋白制剂，一种所谓的超免疫球蛋白制剂，到目前为止，这种制剂是在消耗大量的时间和资金的情况下，从具有高效价特异性抗体的特定供体血浆库中制备出来的。由于各种原因，带来了许多困难。作为一种抗乙型肝炎的制剂来说，如果有认可的接种方法，那么必须接种和选择供体，且必须单独加工处理提供的血液。然而，由于许多其它的症状表现，考虑道德的原因，供体的免疫接种不能进行。这里几乎不可能通过一种对供体的相关性选择找到高效价的血液(例如，在供体从特定的疾病状况恢复之后)，并通过加工处理提供的血液而获得一种制剂。
因此，本发明的一个目的是提供一种回收免疫球蛋白的方法，通过该方法可以获得有价值的免疫球蛋白制剂，并且能够从到目前为止尚未被利用的上述馏分和沉淀物中分离这些免疫球蛋白，所述的馏份和沉淀物在工业血浆分部分离方法中可以获得。其后，应该有可能将这些制剂(相当于超免疫球蛋白制剂)加工成一种耐受性好，特别适用于静脉内(IV)的，防病毒的液体或冷冻干燥制剂。
目前已经发现能够通过一种区别于现有技术方法的方法来生产超免疫球蛋白制剂或高效价免疫球蛋白制剂。这种新的方法使用来自一般血浆库的免疫球蛋白，它通过使用“无用的”馏分而改进了有价值的原料血浆的利用，并且甚至可以生产超免疫球蛋白制剂，该制剂具有远超过以前制剂的特异活性。这就是说，通过小剂量的IV给药，并且低剂量的IV给药蛋白质，即，在受体上有相对低的积存量，可以在短时间内给药高剂量的特异性免疫球蛋白。在本发明的方法中，通过在固定抗原上吸附而使特异性免疫球蛋白浓缩，通过在亲合色谱技术中使用加工处理的“无用”馏分，可以能实现上述的目的。
到这为止，根据本发明，这种生产免疫球蛋白制剂的方法的步骤有：从一种血浆库中分部分离血浆，因此分离出至少一种基本上含有多克隆免疫球蛋白G的工业用馏分，获得至少一种残余部分；由在这种残余馏分中含有的蛋白质成分制备一种蛋白质溶液，所述的残余馏分在上述步骤或在其细馏分中获得；将产生的蛋白质溶液用至少一种配体类型的固定配体进行至少一次亲合色谱法处理，特异性血浆蛋白质与配体结合，并除去结合的血浆蛋白质，将它们作为活性成分转变成一种高效价的免疫球蛋白制剂。
在本发明的方法中，将在血浆分部分离过程中获得的馏分，特别是一种无用的馏分首先进行加工处理，以致于能够用于亲合色谱分析。由于该馏分的来源不同，这种加工工艺可以变化很大。例如，可将上清液GG浓缩，用一种适当的缓冲液透析，并将其过滤。另一方面，必须首先将沉淀物或滤饼(这样的原材料实例目录列在下面的表1和2中)进行适当悬浮，即，通过离子强度，pH值，和/或温度的变化，或者通过加入除垢剂和盐，以这样的方式尤其可以将免疫球蛋白增溶。例如，在4℃时，电导5-20ms/cm条件下，pH值在3-9的范围内，可以将它们搅拌过夜，然后通过离心和/或过滤将它们纯化。在这一阶段，根据Horowitz的溶剂—除垢剂法(Thrombosis andHaemostasis，65，1163，1991)，美蓝法(Mohr等人，Infusionsther Infusionsmed 20，19[1993])或一些其它方法，可将上清液和悬浮液进行病毒失活处理。在悬浮后，通过以下方式可将免疫球蛋白进行预纯化：在一种柱的基体上进行预吸附，或用一种适当的肋滤剂或诸如氢氧化铝这样的吸附剂进行处理，对蛋白质A或G进行色谱法处理用于浓缩，或通过公知的硫酸铵，聚乙二醇，或乙醇沉淀或它们结合的方法进行一种或多种沉淀作用来增浓，浓缩，或排除干扰成分。
    上清液 沉淀物和残余物
    上清液C 沉淀物B
    上清液GG 沉淀物IV
DEAE处理后的残余物
氢氧化铝处理后的残余物
纯化过滤I，II和III后的残余物
表1：来源于Kistler和Nitschmann分级分离方法所产生的可能的原材料实例或来源于其他处理方法由制备IV可给药的稳定血浆产物所产生的原材料实例。
    上清液 沉淀物和残余物
    上清液V 沉淀物II+III
上清液II-1，2 沉淀物IV-1
DEAE处理后的残余物
氢氧化铝处理后的残余物
纯化过滤I，II和III后的残余物
表2：来源于Cohn的分级分离方法的可能的原材料或来源于制备可IV给药的稳定血浆产物所带来的其他处理步骤的可能的原材料的实例。
下面的目录列出了用于本发明亲合色谱法的可能配体实例。
下列微生物的抗原决定簇：
流感嗜血杆菌b
金黄色葡萄球菌
表皮葡萄球菌
无乳葡萄球菌(Staphylococcus agalactiae)
肺炎链球菌
酿脓链球菌
和其它细菌的致病菌株
破伤风毒素
金黄色葡萄球菌毒性休克毒素
和进一步致病细菌的或其它毒素
甲型肝炎病毒
乙型肝炎病毒
丙型肝炎病毒
人α疱疹病毒3型
巨细胞病毒
呼吸道合胞病毒
细小病毒B19
单纯疱疹病毒1型
单纯疱疹病毒2型
狂犬病毒
和其它致病病毒
CD2，CD3，CD4
CD5，CD28，CD40，CD72
ICAM，LFA-1，LFA-3
DNA
和其它潜在的人自身抗原
由于借助于本身公知的方法通过固定改性或非改性的配体(这样配体的实例列在上述目录中)已经制备出亲合凝胶，所以它们载有浓缩或稀释形式的加工的上清液和悬浮液，如果必要，还可以通过重复应用液流来进行。如果需要，可以用相同的悬浮液将各种亲合凝胶连续进行活化。此后，将这些凝胶洗涤，用这样一种方式使得将绝大部分非特异性结合蛋白质除去或将它们除去到足够的程度。例如，通过增加盐的浓度，通过加入一种除垢剂，和/或通过变换洗涤溶液中的pH值，上述过程是能够做到的。例如，通过在低或高pH值下洗脱，通过加入诸如硫氰酸钠或氯化镁这样的离液序列高的盐溶液，诸如SDS或脲这样的变性剂，诸如乙二醇这样的溶剂，通过改变温度，或通过将上述方法结合使用，可将结合的蛋白质与配体分离。
在有些情况中，需要通过诱变或通过化学或物理的方法来对固定的配体进行改性，以这样一种方式使得特异性免疫球蛋白仍然能够与它们的表位结合，但由于减少了亲合而使得洗脱能够在此用非改性配体更缓和的条件下进行。还可以对配体进行改性，以便促进并改善它们的固定和/或它们表位的形式。在Cuatrecasas，P.，and Anfinsen，C.B.(1971)，Ann，Rev.Biochem.40，259；Kull，F.C.，and Cuatrecasas，P.(1981)，J.Immunol.126，1279；Liebing等人(1994)，Vox Sang，67，117中，一般地介绍了亲合色谱工艺的具体技术和基本原理。
将特异性分离的免疫球蛋白(如果需要，还可附加过滤用于消除病毒)加工成一种终极产品，该产品能够优选进行IV给药并不含热原质，具有防病毒性并在加入或不加入稳定剂的情况下稳定，加入的稳定剂诸如白蛋白，氨基酸，或液体或冷冻干燥形式的碳水化合物。然而，也可以使用能够肌肉内或局部给药的配方。
本发明优选的具体实施方案通过下面的实施例加以描述并说明，这些实施例不起限定作用。实施例1
按照厂家指示通过将一级氨基与1ml活化的CH-琼脂糖(PharmaciaBiotech，Uppsala，瑞典)偶合使5mg重组体乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg，Abbott Diagnostics)固定，从而制备出HBsAg一琼脂糖。通过与另一种等分量的凝胶进行同样的偶合过程(但不加入HBsAg)来制备空白对照剂”一琼脂糖。将制成的凝胶贮藏在4℃，带有0.02％NaN3的PBS中。
在4℃时，于一种Rotary Mix装置上，将来自kistler-Nitschmann血浆分部分离(NBLOT，4.030.216)的70克沉淀物B在210ml液体中悬浮过夜，这210ml液体由100mM柠檬酸，pH4.0，0.25％的Triton X-100，10mMN-乙基马来酰亚胺(NEM)，1mM苯基甲基磺酰氟化物(PMSF)组成。在通过离心(5000g，4℃，10分钟)和过滤(孔径大小：1.2μm)分离不溶性成分后，根据Horowitz等人的方法(Thrombosis and Haemostasis，65，1163，1991)，在中性pH下，加入1％的正三磷酸丁酯(Merck，Darmstadt，德国)和1％的Triton X-100，并在30℃下搅拌保温4小时。在37℃下进行相的分离过夜，将纯净的下部相取出，经0.45μm的滤器过滤并在4℃下贮藏。
将130ml这样一种NB悬浮液用280ml PBS(磷酸盐缓冲溶液：150mM NaCl，10mM磷酸钠，pH7.1)进行稀释并将其过空白对照剂-琼脂糖柱，然后在4℃下将其过HBsAg-琼脂糖柱，并且使得柱流物返回到贮藏容器中。流速是8ml/小时，时间144小时。因此NB悬浮液总共三次抽过柱。在90小时后，中止装料，将柱分别进行洗涤，首先用PBS洗涤，然后用200mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH7.4洗涤，直到洗涤溶液具有的280nm(OD280)光密度小于0.01为止。在活化结束之后，再一次用PBS和200mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH7.4进行洗涤。将结合的蛋白质用5ml，pH2.5的200mM甘氨酸-HCl进行分离，立即将其中和并加工处理。
  凝胶   HBsAg   空白对照剂
  总装量
  蛋白质   1775mg  1775mg
  IgG   450mg  450mg
  抗-HBsIgG   4560mIU  4560mIU
  流量
  抗-HBsIgG   1140mIU  1140mIU
  洗脱液
  IgG   0.13mg  0.08mg
  抗-HBsIgG   5603mIU  114mIU
表3：用NB悬浮液的抗-HBsAg亲合色谱法。实施例2
从Cohn馏分II+III(而不是将血浆作为原材料)开始，进行kistler-Nitschmann的分部分离。在4℃时，于一种RotaryMix装置上，将70克来自这种Kistler-Nitschmann分部分离的沉淀物B(NBLot4.044.488)在2l0ml液体中悬浮过夜，这210ml液体由100mM柠檬酸(pH4.0)，0.25％Triton X-100，100mMNEM，1mM PMSF组成。在通过超离心法进行澄清和部分去脂作用后(100,000g，3小时，4℃：用一种注射器刺穿管壁抽出纯净相)，将悬浮液过滤10.45μm)并在4℃下贮藏。
将125ml这种N B悬浮液用375ml PBS稀释，将pH值用0.1M NaOH调整到7.1，将其过滤，并如实施例1所述，首先将其过空白对照剂-琼脂糖凝胶，然后将其过由类似实施例3制备的HBsAg-琼脂糖凝胶。将凝胶分别用PBS和200mM NaCl，50mMTris-HCl，pH7.4进行洗涤。用5ml的200mM甘氨酸-HCl(pH2.5)除去结合的蛋白质。表4列出了数值概要。
  凝胶   HBsAg 空白对照剂
  总装量
  蛋白质   1400mg  1400mg
  IgG   619mg  619mg
  抗-HBsIgG   10IU  10IU
  流量
  抗-HBsIgG   5IU   5IU
  洗脱液
  IgG   0.18mg  0.35mg
  抗-HBsIgG   3.3IU  0.08IU
表4：用NB悬浮液(Cohn II+III)进行的抗-HBsAg亲合色谱分析。实施例3
在PBS中将30升上清液GG(Lot No.X95.31.286.1)进行透过过滤，并将其浓缩到500ml。如实施例1所述，将该浓缩物以21ml/小时，时间118小时抽过空白对照剂和HBsAg柱。柱的洗涤和结合蛋白质的分离同样类似于实施例1进行，但要进行一个附加的用500mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH7.4洗涤的步骤。结果见表5。
  凝胶   HBsAg 空白对照剂
  总装量
  蛋白质   8800mg  8800mg
  IgG   320mg  320mg
  抗-HBsIgG   5000mIU  5000mIU
  流量
  抗-HBsIgG   ＜DL  ＜DL
  洗脱液
  IgG   0.05mg  0.14mg
  抗-HBsIgG   3035mIU  7mIU
表5：用上清液GG浓缩物进行抗-HBsAg亲合色谱分析。
DL：检测极限实施例4
将17.5g量的DEAE滤饼(lot 4.422.006.0)悬浮在52.5ml实施例1的悬浮缓冲液中，并将其加工处理。用160mlPBS稀释40ml悬浮液，将pH值调整到7.1，并将悬浮液过滤。如实施例3所述，将该悬浮液以21ml/小时，时间97小时抽过空白对照剂和HBsAg柱。柱的洗涤和结合蛋白质的分离也类似于实施例1进行。结果见表6。
  凝胶   HBsAg  空白对照剂
  总装量
  蛋白质   548mg  548mg
  IgG   280mg  280mg
  抗-HBsIgG   400mIU  400mIU
  流量
  抗-HBsIgG   ＜DL  ＜DL
  洗脱液
  IgG   0.07mg  0.11mg
  抗-HBsIgG   331mIU  14mIU
表6：用DEAE滤饼悬浮液进行抗-HBsAg亲合色谱分析。DL：检测极限实施例5
根据厂家的说明，利用0.1M N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺-HCl，通过将羧基与1ml EAH-琼脂糖(PharmaciaBiotech，Uppsala瑞典)偶合来固定11.5mg精制的破伤风类毒素(TT)，从而制备出破伤风类毒素C-琼脂糖。将制成的凝胶在4℃下贮藏在含有0.02％ NaN3的PBS中。
如实施例3所述，制备一种上清液GG的浓缩物，用类似于实施例2的TT-琼脂糖对其进行亲合色谱分析。在4℃条件下，以3.5ml/小时进行活化159小时。结果见表7。
凝胶 破伤风类毒素C
总装量
蛋白质  15000mg
IgG  320mg
抗-TTIgG  36μg
流量
抗TTIgG  16μg
洗脱液
IgG  0.16mg
抗-TTIgG  76μg
表7：用上清液GG浓缩物进行抗-破伤风类毒素亲合色谱分析。实施例6
根据厂家的说明将伯氨基与1ml活化的CH-琼脂糖(PharmaciaBiotech，Uppsala，瑞典)偶合来固定11.5mg精制的破伤风类毒素(TT)，从而制备出破伤风类毒素N-琼脂糖。用另一种等分量的凝胶进行同样的偶合过程来制备“空白对照剂”-琼脂糖，但不加入TT。将制成的凝胶在4℃下贮藏在含有0.02％ NaN3的PBS中。
根据实施例2来悬浮沉淀物B。
过滤后(1.2μm)，将这种悬浮液115ml用200ml PBS稀释，将pH值调整到7.1，并将其首先以3.5ml/小时，时间165小时抽过空白对照剂-琼脂糖，以这样一种方式使得梳流物在通过之后随即通过TTN-琼脂柱，然后返回到贮藏容器中。分别用PBS和0.5MNaCl，50mM Tris-HCl，pH7.1洗涤柱，直到柱流物的OD280小于0.01为止。结果见表8。
  凝胶 破伤风类毒素N 空白对照剂
  总装量
  蛋白质   1334mg  1334mg
  IgG   333mg  333mg
  抗-TTIgG   0.509mg  0.509mg
  流量
  抗-TTIgG   0.213mg  0.213mg
  洗脱液
  IgG   0.35mg  0.004mg
  抗-TTIgG   0.091mg  0.003mg
表8：用NB悬浮液进行抗破伤风类毒素亲合色谱分析。实施例7
根据实施例2悬浮沉淀物B。
过滤后(1.2μm)，将115ml这种悬浮液用200ml PBS稀释，将pH值调整到7.1，并首先将其以5ml/小时抽过HBsAG-琼脂糖柱165小时，以这样一种方式使得柱流物通过后立即通过TT-琼脂糖柱，并返回到贮藏容器中。分别用PBS和0.5MNaCl，50mMTrisHCl，pH7.1洗涤这些柱，直到柱流物的OD280小于0.01为止。结果见表9。
  凝胶    HBsAg 破伤风类毒素
  总装量
  蛋白质   1334mg  1334mg
  IgG   333mg  333mg
  抗-HBsAg   945mIU  945mIU
  抗-TTIgG   0.509mg  0.509mg
  流量
  抗-HBsAg   536mIU  536mIU
  抗-TTIgG   0.265mg  0.265mg
  洗脱液
  IgG   0.13mg  0.25mg
  抗-HBsAg   1152mIU
  抗-TTIgG  0.18mg
表9：用NB悬浮液进行抗-HBsAg和抗-破伤风类毒素亲合色谱分析。实施例8
使用一种振动混合器，在4℃条件下，将来自Kistler Nitschmann分部分离的15kg沉淀物B(Lot No.5,043,303)悬浮在45升液体中过夜，这45升液体由0.1M柠檬酸(pH4.0)，0.25％Triton X-100，10mM NEM，1mMP MSF组成。在经加入助滤剂和过滤(孔径大小：1.2μm)而分离不溶性成分后，根据Horowitz方法，将1％正三磷酸丁酯和1％ Triton X-100在中性pH下加入用于去脂作用和使病毒失活，并在30℃下搅拌保温4小时。此后，在37℃下进行相分离过夜，抽出纯净的下部相，将其用0.45μm的滤器过滤，并在4℃下贮藏。
将这种NB悬浮液的pH值用NaOH调整到7.1，并将它在4℃下抽过HBsAg柱和破伤风类毒素Affiprep柱，以这样一种方式使得柱流物返回到贮藏容器中，通过将250mg重组体HBsAg和破伤风类毒素分别与25mlAffiprep凝胶(BioRad Lab.Inc Hercules，CA 94547.U.S.A.)偶来合制备A ffiprep柱(50×13mm)。流速是6升/小时，时间62小时。于是将这种NB悬浮液总共三次抽过该柱。活化结束后，分别将柱进行洗涤，首先用PBS洗涤，然后用500mM NaCl，50mMTris HCl，pH7.4洗涤，直到洗涤溶液在280nm(OD280)处的光密度小于0.01为止。用200mM甘氨酸-HCl，pH2.5除去结合的蛋白质，并立即将该馏分的pH值调整到5.2。结果汇集在表10中。通过汇集这些含有LgG的馏分，进行渗滤，并用20mM NaCl将其分别浓缩成100IU/ml的溶液和2.5mg抗-TT-IgG/ml，从而将免疫球蛋白加工成稳定的制剂。加入10％的蔗糖，并将该溶液分别冷冻于燥成200IU单位和5mg的抗-TT-IgG。实施例9
将50克来自Kistler-Nitschmann血浆分部分离的沉淀物IV悬浮在500ml水中。将pH值用柠檬酸调整到5.0，并用NaCl使电导达13ms。在4℃下搅拌过夜后，在30,000g和4℃条件上离心30分钟进行纯化和部分去脂作用。测定悬浮液中分离的蛋白质，IgM，IgA，IgG，转铁蛋白和血浆铜蓝蛋白含量，并将它们记录在表11中。
  凝胶   HBsAg 破伤风类毒素
  总装量
  蛋白质   448g  448g
  IgG   204g  204gg
  抗-HBsIgG   1120IU  1120IU
  抗-TTIgG   317mg  317mg
  流量
  抗-HBsIgG   221IU  221IU
  抗-TTIgG   172mg  172mg
  洗脱液
  IgG   39.8mg  171mg
  抗-HBsIgG   1368IU
  抗-TTIgG  89mg
表10：用NB悬浮液进行抗-HBsAg和抗破伤风类毒素亲合色谱分析。
总蛋白质   IgM   IgA   IgG   转铁蛋白 血浆铜蓝蛋白
  5.5   0.063   0.628   0.488     2.582     0.09
表11：来自沉淀物IV的悬浮液(所有数值均以mg/ml表示)实施例10
在4℃和不同的pH值下，将来自Kistler-Nitschmann血浆分部分离(Lot No 4030.204.0)的50克沉淀物B在100mM柠檬酸中搅拌过夜，通过超速离心法(100,000g和4℃)离心3小时，将其纯化，并进行部分去脂。取出澄清的中间相，并测定其分离的蛋白质，IgM，IgA，IgG，转铁蛋白和血浆铜蓝蛋白的含量(表12)。
总蛋白质  IgM  IgA  IgG 转铁蛋白 血浆铜蓝蛋白
 pH4.0  4.9  1.2  1.3  1.9 ＜DL     0.06
 pH5.0  6.1  1.2  1.0  2.1 ＜DL     ＜DL
表12：来自沉淀物B的悬浮液(所有数值均以mg/ml表示)；
＜DL：低于检测极限
测定IgG抗特定病毒(表13)和细菌(表14)抗原的效价，并将它们在原血浆和现有免疫球蛋白制剂中的效价进行比较。
 血浆102  血浆103  SAGL  NB pH4.0   NB pH5.0
抗-HBsAg  0.02  0.05  0.01  0.05     0.05 IU/mgIgG
抗-CMV  0.28  0.16  0.3  0.52     0.34 PEIE/mgIaG
抗-VZV 0.08 0.09 n.d. 0.21 0.1 IU/mgIgG
抗-麻疹  0.9  0.2  0.02  2.1     0.81 IU/mgIgG
抗-HSV1  1037  n.d.  n.d.  2317     749 AU/mgIgG
表13：血浆液，SAGL和NB悬浮液血浆102/103中的抗病毒IgG：血浆液；SAGL：Sandoglobulin；NB pH4.0/5.0：分别在pH4.0和5.0下来自沉淀物B的悬浮液；IU：国际单位：PEIE：PAUL Ehrlich Institute单位；AU：任意单位；n.d.未测定。
血浆102 血浆103  SAGL  NB 4A  NB 14pH 4.0
抗-HiBOAg  162  286  436  100  283  μg/gIgG
抗-TT  1855  4159  2740  2928  2923  μg/gIgG
抗-SEB  412  689  783  918  670  AU/gIgG
表14：血浆液，SAGL和NB悬浮液血浆102/103中的抗细菌IgG：血浆液；SAGL：Sandoglobulin，NB 4A：来自pH4.0沉淀物的悬浮液；NB 14pH 4.0：来自pH 4.0沉淀物B且灭活病毒的悬浮液；Hi BOAg：流感嗜血杆菌B-寡糖抗原；TT：破伤风类毒素；SEB：葡萄球菌肠毒素；AU：任意单位。

Claims (16)

1.一种生产高效价免疫球蛋白制剂的方法，其中依次进行下面的步骤：
(a)从一种血浆液中分部分离血浆，从而分离出至少一种基本上含有多克隆免疫球蛋白G的工业可用饱分，获得至少一种残余馏分；
(b)由在步骤(a)中获得的残余馏分中或其亚馏份中含有的蛋白质成分制备一种蛋白质溶液，和
(c)将产生的蛋白质溶液用至少一种配体类型的固定配体进行至少一次亲合色谱法处理，特异性血浆蛋白与配体结合，除去结合的血浆蛋白质，将它们作为活性成分转化成一种高效价的免疫球蛋白制剂。
2.一种根据权利要求1的方法，其中在工业规模上进行血浆的分部分离，残余馏分是一种无用的馏分。
3.一种根据权利要求1或2的方法，其中根据步骤(a)的残余馏分是一种沉淀物或一种滤饼，通过用一种缓冲水溶液对该沉淀物或该滤饼进行处理而使蛋白质成分进入溶液，所述的缓冲水溶液具有的离子强度＜5M，pH值从3.0对9.0，从而形成一种溶液或悬浮液。
4.一种根据权利要求3的方法，其中缓冲溶液是一种磷酸盐缓冲液，一种三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液，或一种柠檬酸盐缓冲液。
5.一种根据权利要求3或4的方法，其中缓冲溶液含有一种除垢剂，一种或多种蛋白酶抑制剂，和/或一种盐。
6.一种根据权利要求3至5中之一的方法，其中将溶液或悬浮液进行过滤或用一种诸如氢氧化铝这样的吸附剂或一种含有DEAE基团的吸附剂进行预处理。
7.一种根据权利要求3至5中之一的方法，其中将溶液或悬浮液与硫酸铵，聚乙二醇，或乙醇反应，形成一种沉淀物，并将上清液或沉淀物进一步加工处理。
8.一种根据权利要求1或2的方法，其中根据步骤(a)的残余馏分是一种上清液，且通过过滤和浓缩，例如通过渗滤，制备蛋白质溶液。
9.一种根据权利要求8的方法，其中将上清液过滤或用一种诸如氢氧化铝这样的吸附剂或一种含有DEAE基团的吸附剂进行预处理。
10.一种根据权利要求1至9中之一的方法，其中固定的配体是天然的或重组体，病毒、细菌，或细胞抗原。
11.一种根据权利要求10的方法，其中配体选自以下抗原决定簇的物质组：硫感嗜血杆菌b，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，无乳葡萄球菌(staphylococcus agalactiae，肺炎链球菌，酿脓链球菌，破伤风毒素，金黄色葡萄球菌毒性休克毒素，甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，人α疱疹病毒3型，巨细胞病毒，呼吸道合胞病毒，细小病毒B19，单纯疱疹病毒1型和2型，狂犬病毒，和潜在的人自身抗原CD2，CD3，CD4，CD5，CD28，CD40，CD72 ICAM，LFA-1，LFA-3，DNA和磷脂。
12.一种根据权利要求10或11的方法，其中通过诱变或化学或物理方法将配体进行改性。
13.一种根据权利要求1至12中之一的方法，其中所得的高效价免疫球蛋白制剂仅由G类或A类或M类或它们任意组合的免疫球蛋白组成。
14.一种根据权利要求1至13中之一的方法，其中将所得的高效价免疫球蛋白制剂进行病毒失活处理，如果必要的话，将其稳定，将一种诸如白蛋白，氨基酸，或碳水化合物这样的稳定剂加入和/或将产品冷冻干燥。
15.一种根据权利要求1至14中之一的方法，其中将所得的高效价免疫球蛋白制剂转变成一种药物上可接受的产品，例如，制成一种静脉内，肌内，或局部给药的制剂。
16.一种生产高效价免疫球蛋白制剂的方法，其中依次进行下面的步骤：
(a)由一种残余馏分或其亚馏分的蛋白质成分制备一种蛋白质溶液，所述的残余馏分或其亚馏分在血浆分部分离过程中获得，和
(b)将产生的蛋白质溶液用至少一种配体类型的固定配体进行至少一次亲合色谱法处理，特异性血浆蛋白质与配体结合，并分离结合的蛋白质，将它们作为活性成分转化成一种高效价免疫球蛋白制剂。
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