CZ286885B6

CZ286885B6 - Process for preparing immunoglobulin preparation with high titer

Info

Publication number: CZ286885B6
Application number: CZ19962748A
Authority: CZ
Inventors: Hanspeter Amstutz; Peter Lerch; Jean Jacques Morgenthaler
Original assignee: Rotkreuzstiftung Zentrallab
Priority date: 1995-09-22
Filing date: 1996-09-18
Publication date: 2000-07-12
Also published as: ES2170788T3; JP2952572B2; BR9603826A; RO117921B1; HU9602570D0; NO963952L; AU6572596A; KR100236762B1; HUP9602570A2; DE59509979D1; KR970015745A; AU715427B2; EP0764658B1; JPH09124508A; PL316126A1; FI963719A0; CZ274896A3; CN1089609C; NO963952D0; HUP9602570A3

Description

Způsob přípravy imunoglobulinového preparátu s vysokým titrem

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu získání imunoglobulinů z frakcí, kterých se při dnes běžné frakcionaci plazmy k výrobě klinických preparátů nepoužívá, nebo alespoň nepřipadají v úvahu při výrobě imunoglobulinových preparátů.

Dosavadní stav techniky

V lidské krevní plazmě se nachází více než stovka různých proteinů. Některým z nich je možno použít z dárcovské plazmy jako terapeutických produktů po frakciovaném vyčištění. Jsou známy následující příklady: Albumin se nasazuje k vyrovnání onkotického deficitu pri hypeproteinemii nebo při hypovolemii (sníženém nebo zvýšeném množství bílkovin v krvi). Faktor srážlivosti krve VIII, případně IX se provádí k profylaxi a terapii krvácení při hemofilii A, případně B. Při nemocech s nedostatečnými protilátkami se používají imunoglobuliny k profylaxi a terapii infekcí i při idiopatické trombocytové růži. Imunoglobuliny od vybraných dárců s vysokými titry specifických imunoglobulinů se nasazují jako hyperimunoglobulinové preparáty k profylaxi a k ošetřování specifických infekcí, jako je například hepatitis A nebo B.

Izolace terapeuticky použitelných plazmaproteinů může probíhat například podle známých metod ethanolové frakcionace (Cohn, E.G. a kol., J. Am. Chem. Soc., 68, str. 459, 1946, a Kistler P. aNitschmann H. Vox Sang., 7, str. 414, 1962). Oběma způsoby je možno izolovat velká množství funkčních plazmaproteinů, jako jsou albumin nebo imunoglobuliny, které je možno s klinickým užitkem nasazovat ve vhodných prostředcích. Při zpracování podle těchto metod vznikají však sraženiny případně přebytky, kterých nelze pri konvenčním zpracování dosud použít. Sloužení těchto frakcí je velmi rozdílné.

Zatímco je například lidský apolipoprotein A-l (Apo A-l) pri vysrážení krevní plazmy 19% ethanolem při hodnotě pH 5,8 v přibližně stejných dílech v přebytku a (asi 50 % plazma-ApoA1) a ve sraženině A (asi 40 %), je stejný protein po následujících frakcionačních krocích podle Kistlera a Nitschmanna pak v těch frakcích, kterých nebylo dosud komerčně využito: sraženina IV a sraženina B (po přibližně 40 %) (Lerch a kol., Protides of the Biological Fluids, 36, str. 409, 1989).

Podobný obraz rozdělení se jeví také u caeruloplazminu, který je transportním proteinem mědi. Po frakcionaci výchozího materiálu je 20 % ve sraženině IV a 40 % ve sraženině B.

Příkladem plazmového proteinu je transferin, který se pri stejném postupu frakcionace hromadí až prakticky do 100 % ve sraženině IV, zatímco albumin lze nalézt až v 80 % ve dnes využívané sraženině C.

Imunoglobuliny je možno Kistler-Nitschmannovu nebo Cohnovou frakcionaci získávat až z 50 až 60 % ve sraženině GG. Zbývajících 30 až 40 % se po těchto postupech rozdělí na sraženinu IV (5 %), sraženinu B (30 %) a filtrát GG (5 %). Uvedená procenta mají ilustrovat řádově rozdělení a nemají být považována za omezení; mění se podle použitých podmínek a podle metody.

Tyto příklady ukazují, že částečně značná množství terapeuticky využitelných proteinů se nacházejí ve frakcích sraženiny IV, sraženiny B, přebytku c a přebytku GG nebo v odpovídajících frakcích plazmové frakcionace podle Cohna (frakce OV-1, frakce II+III, přebytek

V a přebytek 11-1,2). Z etických důvodů, ale také vzhledem ke světovému nedostatku lidské

-1 CZ 286885 B6 krevní plazmy a určitých složek plazmy, je třeba se snažit o zlepšení dosud nepříliš velkého výtěžku imunoglobulinů.

Imunoglobuliny mají v boji proti infekcím hlavní úlohu. Buď pro viry specifické, neutralizující protilátky, zabraňují absorpci virů na buněčné receptory a zabraňují tak infekci, nebo pak pro bakterie specifické protilátky opsonizují původce nemoci a umožňují tak jejich eliminaci a usmrcení vlivem neutrofílů a makrofágů. Soubory plazmy od několika tisíc dárců obsahují imunoglobuliny velmi rozdílných specifit a imunoglobulínové preparáty z těchto souborů plazmy obsahují v důsledku toho také měřitelné titry imunoglobulinů, zaměřených proti epitopům na virech, bakteriích, toxinech, ale také proti autoantigenům. Jsou proto účinné proti mnoha infekcím a v dalším nejrůznějších patologických stavech. Za určitých okolnosti je však nyní žádoucí používat imunoglobulinový preparát s vysokými titry specifických protilátek, tak zvaný hyperimunoglobulinový preparát. Dosud se takové preparáty připravovaly velmi náročně a za cenu vysokých nákladů ze specifických souborů plazmy od dárců se zvýšenými titry specifických protilátek. To je z různých důvodů spojeno s obtížemi. Pokud existují uznávané způsoby očkování, jako v případě preparátu proti hepatitis B, musejí se dárci očkovat, vybrat a darovaná krev se musí odděleně zpracovávat. U mnoha jiných indikací nemůže však dojít k imunizaci dárců z etických důvodů. Jen vzácně je možno náročným výběrem dárců (například po prodělání specifické nemoci) najít předanou krev s vysokými titry a jejím zpracováním získat příslušný preparát.

Je tedy úkolem vynálezu vyvinout způsob, kterým je možno zpřístupnit a izolovat cenné imunogobulinové preparáty z uvedených, dosud sotva využitelných frakcí a sraženin vznikajících při průmyslových postupech frakcionace plazmy. Tyto preparáty, odpovídající hyperimunoglobulinovému preparátu, musejí být dále zpracovatelné na snášenlivý, zejména i.v. snášenlivý, proti virům účinný, tekutý nebo lyofilizovaný preparát.

Nyní bylo původci tohoto vynálezu s překvapením zjištěno, že je možná výroby hyperimunoglobulinových preparátů, popřípadě imunoglobulinových preparátů s vysokými titry rozličnými cestami úpravou jedním z dosavadních postupů. Tento nový způsob používá imunoglobulinů z obecných souborů plazmy, zlepšuje použitím „odpadních“ frakcí využití cenné suroviny krevní plazmy a umožňuje dokonce výrobu imunoglobulinových preparátů s daleko vyššími specifickými aktivitami, než jaké vykazují dosavadní preparáty. To znamená, že je možno malým vpraveným objemem a nepatrným množstvím vpravených proteinů, to je odpovídajícím nepatrnému zatížení příjemce, podávat v krátkém čase vysoké dávky specifických imunogobulinů. Umožňuje to způsob podle vynálezu obohacené specifickými imunoglobuliny absorpcí na imobilizované antigeny, tedy použitím „odpadních“ frakcí zpracovaných afinitní chromatografií.

Podstata vynálezu

Způsob přípravy imunoglobulinového preparátu s vysokým titrem, zejména s obsahem imunoglobulinu G, spočívá podle vynálezu v tom, že se provádějí postupně následující operace:

a) frakcionuje se krevní plazma ze souboru plazmy od různých dárců, přičemž se oddělí alespoň jedna průmyslově zhodnotitelná frakce obsahující zejména polyklonální imunoglobulin G, za získání alespoň jedné zbytkové frakce,

b) připraví se proteinový roztok z proteinových složek získaných ze zbytkové frakce podle odstavce a) nebo z jejích podfrakcí,

c) výsledný roztok proteinů se podrobuje alespoň jednou afinitní chromatografií s mobilizovanými ligandy alespoň jednoho ligandového typu, přičemž se specifické proteiny plazmy vážou

-2 CZ 286885 B6 na ligandy a uvolňují se vázané proteiny plazmy, které se převádějí jako aktivní složky do imunoglobulinového preparátu s vysokým titrem.

Způsobem podle vynálezu se zpracuje například frakce získaná při postupu plazmové frakcio5 nace, obzvláště odpadní frakce tak, aby jí bylo možno použít vafínitní chromatografii. Podle původu frakce může toto zpracování vypadat velmi rozdílně. Může se například zkoncentrovat přebytek GG, dialyzovat vůči vhodnému pufru a filtrovat. Sraženiny, nebo filtrační koláče (seznam příkladů takových výchozích materiálů obsahují tabulky I a II) musejí být naproti tomu suspendovány, to je například měněním iontové síly, hodnoty pH, teploty, přidáním detergencí 10 a solí, tak, aby imunoglobuliny byly cíleně učiněny rozpustnými. Mohou se například přes noc míchat v rozmezí hodnot pH 3,0 až 9,0 při vodivosti 5 až 20 mS/cm při teplotě 4 °C a vyčeřit následně odstředěním a/nebo filtrací. Jak supematanty, tak suspenze se mohou v tomto stupni podrobit postupu inaktivace virů systémem rozpouštědlo/detergent Horowitzovým způsobem (Thrombosis and heamostasis, 65, str. 1163, 1991), způsobem používajícím methylenovou modř 15 (Mohr a kol. Infusiother. Infúsionsmed. 20, str. 19, 1993) nebo jiným způsobem. Imunoglobuliny je možno po suspendování podrobit také předběžnému čištění předběžnou adsorpcí na matrici sloupce nebo zpracováním vhodným pomocným filtračním prostředkem nebo adsorbentem, jako je hydroxid hlinitý, chromatografii přes protein A nebo G k obohacení nebo jedním nebo několika vysrážením běžnými způsoby síranem amonným, polyethylenovému a/nebo ethanolo20 vému vysrážení nebo jejich kombinaci k obohacení, koncentraci nebo ochuzení o rušivé složky.

Tabulka I

Příklady možných výchozích materiálů pocházejících zfrakcionace podle Kistlera a Nitschmanna nebo z dalších přípravných operací, které připadají v úvahu při výrobě i.v. snášenlivých stabilních plazmových produktů supematant supematant c supematant GG sraženiny a zbytky sraženina B sraženina IV zbytek po zpracování DEAE zbytek po zpracování hydroxidem hlinitým zbytky po vyčeřovacích filtracích I, II a III

Tabulka II

Příklady možných výchozích materiálů pocházejících z frakcionace podle Cohna nebo z dalších přípravných operací, které připadají v úvahu při výrobě i.v. snášenlivých stabilních plazmových produktů supematanty supematant V supematant 11-1,2 sraženiny nebo zbytky sraženina II+III sraženina IV-1 zbytek po zpracování DEAE zbytek po zpracování hydroxidem hlinitým zbytky po vyčeřovacích filtracích I, II a III

Následující seznam obsahuje možné ligandy pro afinitní chromatografii podle vynálezu.

Antigenové determinanty z

Haemophilus influenza b

Staphylococus aureus

Staphylococus epidermis Staphylococus agalactiae Staphylococus pneumoniae Staphylococus pyogenes a další patogenní bakteriální kmeny Tetanus Toxin

Staphylococus aureus toxický šokový toxin a další patogenní bakterie nebo jiné toxiny Hepatitis A virus

Hepatitis B virus Hepatitis C virus virus Varizella Coster

Cytomegalo virus respirační syncytial virus parvovirus B 19

Herpes Simplex virus 1

Herpes Simplex virus 2 viru vztekliny a další patogenní viiy

CD2, CD3, CD4

CD5, CD28, CD40, CD72

ICAM, LFA-1, LFA-3

DNA a další potenciální lidské autoantigeny.

Po vyrobení afinitních gelů mobilizováním modifikovaných nebo nemodifikovaných ligandů (příklady takových ligandů jsou v uvedeném seznamu) známými způsoby se na ně nanesou připravené supematanty a suspenze v koncentrované nebo zředěné formě, popřípadě opakovaným průtokem. Popřípadě mohou být různé afinitní gely naplněny postupně stejnou suspenzí. Gely se pak promyjí tak, že se v převážné nebo v postačující míře odstraní nespecificky vázající proteiny. K tomu může dojít například zvýšením koncentrace soli, přidáním detergentu a/nebo různou hodnotu pH vymývajícího roztok. Vázané proteiny se od ligandů uvolní, například elucí při nízké nebo vysoké hodnotě pH přidáním, chaotropních solných roztoků jako natriumhiokyanátu nebo chloridu hořečnatého, denaturujících činidel jako SDS a nebo močoviny, rozpouštědel jako ethylenglykolu, změnou teploty nebo kombinací těchto opatření.

Za jistých okolností může být žádoucí modifikace ligandů, určených k imobilizaci mutagenezí nebo chemickými nebo fyzikálními způsoby tak, že se sice mohou ještě vázat imunoglobuliny na epitopy, avšak se sníženou afinitou, takže eluce může probíhat za mírnějších podmínek než s nezměněnými ligandy. Modifikací ligandů má také dojít k usnadnění a zlepšení jejich imobilizace a/nebo k presentaci jejich epotopu. Technické podrobnosti a podklady afinitní chromatografie jsou všeobecně popsány v literatuře: Cuatrecasas, P. a Anfinsen, C.. (1971) Ann. Rev. Biochem. 40, str. 259; Kuli, F.C. a Cuatrecasas, P. (1981) J.Immunol. 126, str. 1279; Liebing a kol. (1994) Vox Sang. 67, str. 117.

Specifické uvolněné imunoglobuliny se zpracovávají popřípadě dodatečnou filtrací k vyloučení virů na konečné produkty, kterých lze použít s výhodou i.v. a jsou prosté pyrogenů, s protivirovým zajištěním a s přísadou nebo bez přísady stabilizátorů, jako jsou albuminy, aminokyseliny nebo uhlovodíky v tekutém nebo lyofilizovaném stavu a které jsou stabilní. Použít se dá také prostředků, jež umožňují použití i.m. nebo topické použití.

-4CZ 286885 B6

Vynález blíže objasňují, nijak však neomezují, následující příklady praktického provedení.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Připraví se HBaAg-sepharosa tím, že se 5 mg rekombinantního povrchového antigenu viru Hepatitis B (HBsAg, Abbott Diagnostics) imobilizuje kopulací primárních aminoskupin na 1 ml aktivované CH-sepharosy podle předpisu výrobce (Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko). Připraví se sepharosa „placebo“ tím, že se provede stejný kopulační postup s dalším gelovým alikvotem, avšak bez přidání HBsAg. Hotové gely se uskladní při teplotě 4 °C v PBS s 0,02 % NaN₃.

Přes noc se při teplotě 4 °C suspenduje na přístroji RotaryMix 70 g sraženiny B z plazmové frakcionace podle Kistler-Nitschmanna (NB šarže 4 030,216) ve 210 ml 100 mM kyseliny citrónové s hodnotou pH 4,0, 0,25 % Tritonu X-100, 10 mM N-ethylmaleimidu (NEM), 1 mM fenylmethylsulfonylfluoridu (PMSF). Po oddělení nerozpustných složek odstředěním (5000 g, 4 °C, 10 minut) a filtraci (velikost pórů 1,2 pm) se při neutrální hodnotě pH přidá podle Horowitze a kol. (Thrombosis and Haemostatis, 65, str. 1163, 1991) 1 % tri-n-butylfosfátu (Měrek, Darmstadt, Německo) a 1 % Tritonu X-100 a za stálého míchání se inkubuje 4 hodiny při teplotě 30 °C. Nato se přes noc provede při teplotě 37 °C oddělení fází, čirá spodní část se oddělí, zfiltruje se filtrem 0,45 pm a uskladní se při teplotě 4 °C.

130 ml takové NB-suspenze se zředí 280 ml PBS (fosfátem pufrovaný solný roztok: 150 mM chloridu sodného, 10 mM natriumfosfátu, hodnota pH 7,1) a čerpá se při teplotě 4 °C přes placebo a následně přes sloupec HBsAg-sepharosy tak, že po průtoku sloupcem se dostane zpět do zásobní nádrže. Průtočná rychlost je 8 ml/h po dobu 144 hodin. NB-suspenze se pak celkově prožene oběma sloupci. Po 90 hodinách se zaplnění přeruší a sloupce se promývají jednotlivě napřed PBS a pak 200 mM chloridu sodného, 50 mM kyseliny tris-chlorovodíkové pH 7,4 až vykáže promývací roztok optickou hustotu při 280 nm (OD₂₈o) menší než 0,01. Po ukončeném zaplnění se opět promyje PBS a 200 mM chloridu sodného, 50 mM Tris-HCl pH 7,4. Vázané proteiny se uvolní 5 ml systému 200 mM glycin-kyseliny chlorovodíková, pH 2,5, okamžitě se zneutralizuje a zpracuje. Výsledky jsou uvedeny v tabulce III.

Tabulka III

Afmitní chromatografíe anti-HBsAg s NB-suspenzí

Gel

HBsAg placebo

Celkové naplnění: protein

IgG anti-HBs IgG

Průběh: anti-HBs IgG

Eluát:

IgG anti-HBs IgG

1775 mg

450 mg 4560 mlU

1140 mlU

0,13 mg 5603 mlU

1775 mg

450 mg

4560 mlU

1140mlU

0,08 mg

114mlU

-5CZ 286885 B6

Příklad 2

Při výchozí Cohnově frakci ΙΙ+ΙΠ (místo krevní plazmy jako výchozího materiálu) se provede frakcionace podle Kistler-Nitschmanna. 70 g sraženiny B (NB šarže 4 044488) z této frakcionace podle Kistler-Nitschmanna se suspenduje přes noc při teplotě 4 °C ve 210 ml 100 mM citrónové kyseliny, pH 4,0, 0,25% Tritonu X-100, 10 mM NEM, 1 mM PMSF v přístroji RotaiyMix. Po vyčeření a částečné delipinaci ultraodstředěním (100 000 g, 3 h, 4 °C, čirá fáze se odejme bočním zavedením trubičky kanylou) se suspenze zfiltruje (0,45 pm) a uskladní se při teplotě 4 °C.

125 ml této NB-suspenze se zředí 375 ml PBS, nastavené na hodnotu pH 7,1 0,lM NaOH, zfiltruje se a obdobně jako podle příkladu 1 se přečerpává rychlostí 14,5 ml/h napřed přes placebo a pak přes gely HBsAg-sepharosy, které byly připraveny obdobně jako při příkladu 3. Nakonec se gely promyjí odděleně PBS a 200 mM chloridu sodného, 50 mM Tris-HCl s hodnotou pH 7,4. Vázané proteiny se uvolní 5 ml 200 mM systému glycin-kyselina chlorovodíková s hodnotou pH 2,5. Výsledky jsou shrnuty v tabulce IV.

Tabulka IV

Afinitní chromatografie anti-HBsAg s NB-suspenzí (Cohn II+III)

Gel	HBsAg	placebo
Celkové naplnění:
protein	1400 mg	1400 mg
IgG	619 mg	619 mg
anti-HBs IgG	10 1U	10 1U
Průběh:
anti-HBs IgG	5 1U	5 1U
Eluát:
IgG	0,18 mg	0,35 mg
anti-HBs IgG	3,3 IU	0,08 1U

Příklad 3

1 supematantů GG (šarže č. X95.31.286.1) se diafiltruje v PBS a zkoncentruje se na 500 ml. Obdobným způsobem jako podle příkladu 1 se přečerpá koncentrát rychlostí 21 ml/h během 118 hodin přes placebo a přes sloupec HBsAg. Sloupce se promyjí a vázané proteiny se uvolní rovněž obdobně jako podle příkladu 1, provede se však přídavná promývací operace 500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl s hodnotou pH 7,4. Výsledky obsahuje tabulka V.

-6CZ 286885 B6

Tabulka V

Afinitní chromatografie anti-HBsAg se supematantem GG koncentrátu NG: průkazní mez

Gel

HBsAg placebo

Celkové naplnění: protein

IgG anti-HBs IgG

Průběh:

anti-HBs IgG

Eluát:

IgG anti-HBs IgG

8800 mg

320 mg 5000 mlU

8800 mg

320 mg 5000 mlU <NG

0,05 mg 3035 mlU <NG

0,14 mg mlU

Příklad 4

Suspenduje a zpracuje se 17,5 g filtračního koláče DEAE (šarže 4.422.006.0) v 52,5 ml suspenzního pufru podle příkladu 1.

ml suspenze se zředí 160 ml PBS a hodnota pH se nastaví na 7,1, načež se zfiltruje. Obdobným způsobem jako podle příkladu 3 se přečerpá suspenze rychlostí 21 ml/h během 97 hodin přes placebo a přes sloupec HBsAg. Sloupce se promyjí a vázané proteiny se uvolní obdobně jako podle příkladu 1. Výsledky obsahuje tabulka VI.

Tabulka VI

Afinitní chromatografie anti-HBsAg se suspenzí filtračního koláče

DEAE

NG: Průkazní mez

Gel

HBsAg placebo

Celkové naplnění:
protein	548 mg	548 mg
IgG	280 mg	280 mg
anti-HBs IgG	400 mlU	400 mlU
Průběh:
anti-HBs IgG	<NG	<NG
Eluát:
IgG	0,07 mg	0,11 m
anti-HBs IgG	331 mlU	14mlU

Příklad 5

Připraví se Tetanus toxoid-C-sepharosa tím, že se 11,5 mg vyčištěného Tetanus toxoidu (TT) imobilizuje kopulací karboxyskupin a 1 ml EAH-sepharosy (Pharmacie Biotech, Uppsala, Švédsko) pomocí 0,lM systému N-ethyl-N-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid-kyselina chlorovodíková podle předpisu výrobce. Hotové gely se uskladní při teplotě 4 °C v PBS s 0,02 % NaN₃.

Obdobně jako podle příkladu 3 se připraví koncentrát z GG-supematantu a použije se ho k afmitní chromatografii TT-sepharosou obdobně jako podle příkladu 2. Naplnění se provede rychlostí 23,5 ml/h během 159 hodin při teplotě 4 °C. Výsledky jsou v tabulce VII.

Tabulka VII

Afmitní chromatografie anti-tetanového toxoidu s supematantem GG-koncentrátu

Gel

Celkové naplnění: protein

IgG anti-TT IgG

Průběh: anti-TT IgG

Eluát:

IgG anti-TT IgG

Tetanus toxoid C

000 mg

320 mg pg pg

0,16 mg pg

Příklad 6

Připraví se Tetanus toxoid-N-sepharosa tím, že se 11,5 mg vyčištěného Tetanus toxoidu (TT) imobilízuje kopulací primárních aminoskupin na 1 ml aktivované CH-sepharosy podle předpisu výrobce (Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko). Připraví se „placebo“-sepharosa tím, že se stejný kopulační postup provede s dalším gelovým alikvotem, avšak bez přísady TT. Hotové gely se uskladní při teplotě 4 °C v PBS s 0,02 % NaN₃.

Obdobně jako podle Příkladu 2 se suspenduje sraženina. Po filtraci (1,2 pm) se 115 ml této suspenze zředí 200 ml PBS, hodnota pH se nastaví na 7,1 a rychlostí 3,5 ml/h se během 165 hodin přečerpá napřed přes placebo-sepharosu tak, že po okamžitě následujícím průtoku sloupcem TT-N-sepharosy se dostane zpět do zásobní nádrže. Sloupce se promyjí jednotlivě napřed PBS a pak 0,5M chloridu sodného, 50 mM Tris-HCl pH 7,1 až vykáže promývací roztok optikou hustotu při 280 nm (OD280) menší než 0,01. Výsledky jsou v tabulce VIII.

-8CZ 286885 B6

Tabulka VIII

Afinitní chromatografie anti-tetanového toxoidu se suspenzí NB

Gel

Tetanus toxoid N placebo

Celkové naplnění:
protein	1334 mg	1334 mg
IgG	333 mg	333 mg
anti-TT IgG	0,509 mg	0,509 mg
Průběh:
anti-TT IgG	0,213 mg	0,213 mg
Eluát:
IgG	0,35 mg	0,004 mg
anti-TT IgG	0,091 mg	0,003 mg

Příklad 7

Obdobně jako podle příkladu 2 se suspenduje sraženina B. Po filtraci (1,2 pm) se 115 ml této suspenze zředí 200 ml PBS, hodnota pH se nastaví na 7,1 a rychlostí 5 ml/h se během 165 hodin přečerpá napřed přes placebo-sepharosu tak, že po okamžitě následujícím průtoku sloupcem TTsepharosy se dostane zpět do zásobní nádrže. Sloupce se promývají jednotlivě napřed PBS a pak 0,5M chloridu sodného, 50 mM Tris-HCl pH 7,1 až vykáže promývací roztok optickou hustotu při 280 nm (OD₂8o) menší než 0,01. Výsledky jsou v tabulce IX.

Tabulka IX

Afinitní chromatografie anti-HBsAg a anti-tetanového toxoidu se suspenzí NB

Gel	HBsAg	Tetanus toxoid
Celkové naplnění:
protein	1334 mg	1334 mg
IgG	333 mg	333 mg
anti-HBsAg	945 mlU	945 mlU
anti-TT IgG	0,509 mg	0,509 mg
Průběh:
anti-HBsAg	536 mlU	536 mlU
anti-TT IgG	0,265 mg	0,265 mg
Eluát:
IgG	0,13 mg	0,25 mg
anti-HBsAg	1152 mlU
anti-TT IgG		0,18 mg

Příklad 8 kg sraženiny B z frakcí podle Kistler-Nitschmanna (šarže č. 5.043.303) se suspenduje přes noc při teplotě 4 °C vibračním mísičem ve 45 litrech 0,1 M kyseliny citrónové s hodnotou pH 4,0, s 0,25 % Tritonu X-100, 10 mM NEM, 1 mM PMSF. Po oddělení nerozpustných složek přidáním pomocných filtračních činidel a po filtraci (velikost pórů 1,2 pm) se přidá při neutrální

-9CZ 286885 B6 hodnotě pH k delipidaci a k inaktivaci virů podle Horowitze 1 % tri-n-butylfosfátu a 1 % Tritonu X-100 a směs se inkubuje za míchání přes noc při teplotě 37 °C. Nato se přes noc při teplotě 37 °C fáze oddělí, čirý podklad se odčerpá, zfíltruje se přes filtr 0,45 pm a uskladní se při teplotě 4 °C.

Hodnota pH 40 litrů této NB suspenze se upraví louhem sodným na 7,1 a při teplotě 4 °C se přečerpá přes HBsAg a přes Affiprep-sloupec Tetanus toxoidu tak, že po průtoku sloupci se suspenze vrátí do zásobní nádrže. Affiprep-sloupce (50x13 mm) se připraví kopulací 250 mg rekombinantních HBsAg případně Tetanus toxoidu na 250 ml Affíprepgel (BooRad Lab. Inc. Hercules CA 94547). Průtočná rychlost je 6 1/h po dobu 62 hodin. NS-suspenze se tak celkově přečerpá třikrát přes sloupce. Po ukončeném zaplnění se sloupce promývají jednotlivě napřed PBS a pak 500 mM chloridu sodného, 50 mM Tris-HCl pH 7,4 až vykáže promývací roztok optickou hustotu při 270 nm (OD₂so) menší než 0,01. Vázané proteiny se uvolní systémem 200 mM glycin-kyselina chlorovodíková, pH 2,5, a hodnota pH frakcí se okamžitě nastaví na 5,2. Výsledky jsou uvedeny v tabulce X. Příprava imunoglobulinů na stabilní preparáty se provede spojením frakcí obsahujících IgG, diafiltrací a koncentrací se 20 mM chloridu sodného na roztoky lOOlU/ml, případně 2,5 mg anti-TT-IgG/ml. Přidá se 10% sacharózy a roztoky v jednotkách po 200 1U, případně 5 mg anti-TT-IgG se lyofilizují.

Příklad 9

V 500 ml vody se suspenduje 50 g sraženiny IV z plazmové frakcionace podle KistlerNitschmanna. Kyselinou citrónovou se upraví hodnota pH na 5,0 a vodivost se nastaví chloridem sodným na 13 mS. Po míchání přes noc při teplotě 4 °C se dosáhne odstředěním během 30 minut při 30 000 g a 4 °C vyčeření a částečné delipidace. Zjistí se obsah rozpuštěných proteinů, IgM, IgA, IgG, transferinu a caeruloplazminu v suspenzi. Obsahy jsou v tabulce XI.

Tabulka X

Afínitní chromatografie anti-HBsAg a anti-tetanového toxoidu se suspenzí NB

Gel	HBsAg	Tetanus toxoid
Celkové naplnění:
protein	448 g	448 g
IgG	204 g	204 g
anti-HBs IgG	1120 1U	11201U
anti-TT IgG	317 mg	317 mg
Průběh:
anti-HBs IgG	221 1U	221 1U
anti-TT IgG	172 mg	172 mg
Eluát:
IgG	39,8 mg	171 mg
anti-HBs IgG	1368 1U
anti-TT IgG		89 mg

-10CZ 286885 B6

Tabulka XI
Suspenze ze sraženiny	IV (všechny údaje v mg/ml)
Proteiny celkem	IgM IgA	IgG	Transferin	Caeruloplazmin
5,5	0,063 0,628	0,488	2,582	0,09

Příklad 10 g sraženiny B z frakcí podle Kistler-Nitschmanna (šarže č. 4.030.204.0) se míchá přes noc ve 100 mM citrónové kyseliny při různých hodnotách pH při teplotě 4 °C, vyčeří se ultraodstředěním při 100 000 g a 4 °C v průběhu tří hodin a částečně se delipiduje. Čirá střední fáze se odebere a stanoví se její obsah rozpuštěných proteinů IgM, IgA, IgG, transferinu a caeruloplazminu (tabulka ΧΠ).

Tabulka XII

Suspenze ze sraženiny B (všechny údaje v mg/ml); <NG: pod mezí průkaznosti

	Proteiny celkem	IgM	IgA	IgG	Transferin	Caeruloplazmin
pH 4,0	4,9	1,2	1,3	1,9	<NG	0,06
pH 5,0	6,1	L2	1,0	2,1	<NG	<NG

Stanoví se titr IgG vůči určitým virovým (tabulka XIII) a bakteriálním (tabulka XIV) antigenům a porovná se s titry výchozí plazmy a existujících imunoglobulinových preparátů.

Tabulka XIII

Protivirové IgG v souborech plazmy, v SAGL a v NB-suspenzích

	plazma 102	plazma 103	SAGL	NB pH 4,0	NB pH 5,0
anti-HBsAg	0,02	0,05	0,01	0,05	0,05	lU/mglgG
anti-CMV	0,28	0,16	0,30	0,52	0,34	PElE/mglgG
anti-VZV	0,08	0,09	n.b.	0,21	0,10	lU/mg IgG
anti-spalničky	0,9	0,20	0,02	2,10	0,81	lU/mg IgG
anti-HSVl	1037	n.b.	n.b.	2317	749	AU/mg IgG

Plazma 102/103: plazmové soubory; SAGL: Sandoglobulin; NB pH 4,0/5,0; suspenze ze sraženiny B při pH 4,0, resp. 5,0; IU: mezinárodní jednotky; PEIE: jednotky institutu Paul Ehrlicha; AU: arbitrální jednotky; n.b.: nestanoveno

-11CZ 286885 B6

Tabulka XIV

Protibakteriální IgG v souborech plazmy, v SAGL a v NB-suspenzích

	plazma 102	plazma 103	SAGL	NB4A	NB 14 pH 4,0
anti-HIBOAg	162	286	436	100	283	Mg/g IgG
anti-TT	1855	4159	2740	2928	2923	Mg/g IgG
anti-SEB	412	689	783	918	670	AU/glgG

Plazma 102/103: plazmové souboiy; SAGL: Sandoglobulin^R; NB 4A suspenze ze sraženiny B při pH 4,0; NB 14 pH 4,0; suspenze ze sraženiny B při pH 4,0 saktivizací viru; HIBOAg: oligosacharidový antigen Haemophilius influenza Β; TT: Tetanus Toxoid SEB; Staphylococcus enterotoxin B; AU: arbitrální jednotky.

Průmyslová využitelnost

Způsob přípravy imunoglobulinového preparátu s vysokým titrem z frakcí, kterých se při dnes běžné frakcionaci plazmy k výrobě klinických preparátů nepoužívá, nebo které alespoň nepřipadají v úvahu při výrobě imunoglobulinových preparátů.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy imunoglobulinového preparátu s vysokým titrem, zejména s obsahem imunoglobulinu G, v y z n a č u j í c í se tím, že se provádějí postupně následující operace:

a) frakcionuje se krevní plazma ze souboru plazmy od různých dárců, přičemž se oddělí alespoň jedna průmyslově zhodnotitelná frakce obsahující zejména polyklonální imunoglobulin G, za získání alespoň jedné zbytkové frakce,

b) připraví se proteinový roztok z proteinových složek získaných ze zbytkové frakce podle odstavce a) nebo z jejích podfrakcí,

c) výsledný roztok proteinů se podrobuje alespoň jednou afinitní chromatografii s imobilizovanými ligandy alespoň jednoho ligandového typu, přičemž se specifické proteiny plazmy vážou na ligandy a uvolňují se vázané proteiny plazmy, které se převádějí jako aktivní složky do imunoglobulinového preparátu s vysokým titrem.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se frakcionace krevní plazmy provádí v průmyslovém měřítku, přičemž je zbytková frakce frakcí odpadní.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že zbytkovou frakcí podle stupně a) je sraženina nebo filtrační koláč a proteinové složky se z nich uvádějí do roztoku, přičemž se sraženina nebo filtrační koláč zpracovává vodným pufrovým roztokem s iontovou silou <5M a s hodnotou pH 3,0 až 9,0 za vytváření roztoku nebo suspenze.

-12CZ 286885 B6
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že pufrovým roztokem je fosfátový pufr, pufr Tris-HCl nebo citrátový pufr.
5. Způsob podle nároku 3 nebo 4, vyznačující se tím, že pufrový roztok obsahuje detergent, alespoň jeden inhibitor proteáz a/nebo sůl.
6. Způsob podle nároků 3až5, vyznačující se tím, že roztok nebo suspenze se filtruje nebo předběžně zpracovává adsorbentem jako je hydroxid hlinitý nebo adsorbentem, který obsahuje skupiny DEAE.
7. Způsob podle nároků 3až 5, vyznačující se tím, že roztok nebo suspenze se za vytváření sraženiny směšuje se síranem amonným, polyethylenglykolem nebo ethanolem a kapalina nebo sraženina se dále zpracovává.
8. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že zbytkovou frakcí podle odstavce a) je kapalina a roztok proteinů se vyrábí filtrací a koncentrací, zejména diafiltrací.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že se kapalina předem filtruje nebo se předem zpracovává adsorbentem jako je hydroxid hlinitý nebo s adsorbentem, který obsahuje skupiny DEAE.
10. Způsob podle nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že mobilizovanými ligandy jsou přírodní nebo rekombinantní virové, bakteriové nebo buněčné antigeny.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že ligandy jsou voleny ze souboru antigenových determinantů zejména Tetanus toxinu, Hepatitis B virus, virus Varizella Zoster, Cytomegalo virus, Herpes Simplex virus 1, Herpes Simplex virus 2.
12. Způsob podle nároku 10 nebo 11, vyznačující se tím, že ligandy se modifikují mutagenezí nebo chemickými nebo fyzikálními způsoby.
13. Způsob podle nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že získaný vysokotitrový preparát imunoglobulinu sestává pouze z imunoglobulinů třídy G nebo A nebo M nebo z jejich libovolné kombinace.