KR20150115639A - 치료용 면역글로불린 제제 제조에 사용되는 산성 완충액, 이를 이용한 치료용 면역글로불린 제제 제조방법 및 이 제조방법으로 제조된 치료용 면역글로불린 제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 치료용 면역글로불린 제제 제조에 사용되는 산성 완충액, 이를 이용한 치료용 면역글로불린 제제 제조방법 및 이 제조방법으로 제조된 면역글로불린 제제에 관한 것으로서, 본 발명은 면역글로불린 흡착 레진으로부터 면역글로불린 단백질을 용출하기 위한 산성 완충액으로 사용되는 산성의 5mM에서 50mM의 sodium citrate 용액으로 이루어진 것을 특징으로 하는 치료용 면역글로불린 제제 제조에 사용되는 산성 완충액을 제공하며, 제조방법으로는 ⅰ) 면역글로불린 흡착 레진에 포유동물의 혈장 혹은 면역글로불린 단백질이 포함된 세포배양액을 접촉시켜 면역글로불린 흡착 레진에 면역글로불린 단백질을 흡착시키는 흡착단계; ⅱ) 상기 흡착단계가 종료된 후 면역글로불린 흡착 레진으로 세척액을 통과시켜 면역글로불린 흡착 레진에 흡착된 면역글로불린 단백질 이외의 다른 물질들을 세척하여 제거시키는 세척단계; 및 ⅲ) 상기 세척단계가 종료된 후 면역글로불린 흡착 레진으로 5mM에서 50mM의 sodium citrate 용액으로 이루어진 산성 완충액을 통과시켜서 면역글로불린 흡착 레진에 흡착된 면역글로불린 단백질을 용출시켜 최종 치료용 면역글로불린 제제를 제조하는 용출단계의 3 단계로 구성된 치료용 면역글로불린 제제의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 면역글로불린 단백질과 5mM에서 50mM의 sodium citrate 용액을 포함하는 치료용 면역글로불린 제제를 제공한다.

Description

치료용 면역글로불린 제제 제조에 사용되는 산성 완충액, 이를 이용한 치료용 면역글로불린 제제 제조방법 및 이 제조방법으로 제조된 치료용 면역글로불린 제제{An acidic buffer solution for manufacturing therapeutic immunoglobulin preparation, manufacturing method of therapeutic immunoglobulin preparation using the acidic buffer solution and therapeutic immunoglobulin preparation maid by this method}

본 발명은 치료용 면역글로불린 제제 제조에 사용되는 산성 완충액, 이를 이용한 치료용 면역글로불린 제제 제조방법 및 이 제조방법으로 제조된 치료용 면역글로불린 제제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 포유동물의 혈액 혹은 포유동물세포의 배양액으로부터 정맥주사, 피하주사, 근육주사, 진피 내 투여 등의 비 경구 경로로 투여할 수 있는 무 오염 및/또는 무독성 상태로 면역글로불린을 분리하여 치료용 면역글로불린 제제를 제조하기 위한 제조방법과 이 제조방법에서 사용되는 특정한 산성 완충액, 그리고 상기한 제조방법에 의해서 제조된 치료용 면역글로불린 제제에 관한 것이다.

최근 들어 알레르기질환, 자가면역질환, 감염성 질환, 악성종양 질환 등의 다양한 질환들을 예방하거나 치료하기 위해 다양한 면역글로불린 제제들이 사용되고 있다.

상기 면역글로불린은 항염증, 항알레르기, 항세균 및 항바이러스 효과, 항종양 또는 항암효과 등을 지니고 있어, 난치성의 알레르기 질환, 자가면역질환, 만성염증성 질환, 악성종양 질환 또는 감염성 질환 등을 앓고 있는 포유동물 또는 건강한 정상 포유동물에게 주사 경로(피하, 근육, 정맥 주사 등)로 투여할 경우 상기 질환들에 대한 치료 또는 예방효과를 나타낸다.

하지만, 현재 사용되고 있는 치료용 면역글로불린 제제는 1) 다수의 건강한 혈액 공여자부터 얻어진 혈장으로부터 침전법 혹은 크로마토그래피를 이용하여 분리하거나, 또는 2) 유전자재조합법을 이용하여 특정 면역글로불린 유전자를 세균, 효모, 혹은 포유동물의 세포에 주입한 후에 이들을 배양한 후에 배양액으로 분비되는 면역글로불린을 크로마토그래피로 분리하여 치료용 면역글로불린 제제를 제조하고 있다.

현재 포유동물의 질병 치료 혹은 질병 예방을 목적으로 사용되는 면역글로불린 제제는 주로 근육주사, 피하주사 또는 정맥주사를 포함한 비 경구 경로로 투여되고 있으므로, 면역글로불린 제제를 투여 시에 포유동물에게 독성을 최소화하기 위해서 제조과정에서 감염성 물질이나 독성물질의 오염을 방지하기 위한 매우 복잡하고, 다양하고 엄격한 제조공정들이 요구되고 있다. 따라서 현재까지 치료용 면역글로불린의 제조를 위해서는 대형화된 여러 가지의 무 오염의 면역글로불린 단백질 분획 장치와 면역글로불린 단백질 분리 정제장치를 이용하여 오염이 최소화된 시설과 공간에서 제조되고 있으므로, 대규모의 공간 및 시설과 다수의 기술 인력들을 필요로 하는 문제점이 있다.

최근 치료용 유전자재조합 면역글로불린 제제들의 경우 대부분 면역글로불린이 포함된 혼합액 원료로부터 흡착크로마토그래피로 분리 정제되어 제조되고 있다. 상기한 흡착크로마토그래피 과정은 구체적으로는 이온교환수지 혹은 Protein A 또는 Protein G가 부착된 레진을 이용하여 이루어질 수 있다. 현재는 치료용 유전자재조합 면역글로불린 제제의 제조 시에는 Protein A를 이용한 흡착크로마토그래피가 가장 흔하게 사용되고 있는 실정이다. 현재 면역글로불린 분리정제 시에 통상적으로 이루어지고 있는 Protein A 혹은 Protein G 레진을 이용한 흡착크로마토그래피 과정을 구체적으로 설명하자면 1) 혈장 혹은 면역글로불린 단백질을 포함한 세포 배양액을 Protein A 혹은 Protein G 등을 포함한 면역글로불린 흡착 레진이 부착된 고형물질(solid-phase; 예, agarose bead, glass bead, silica 등)에 접촉시켜 면역글로불린 단백질이 면역글로불린 흡착 레진에 특이적으로 흡착되도록 하고, 2) 상기 흡착 레진에 면역글로불린 단백질 이외의 비 특이적으로 붙은 기타 물질들을 세척액(예, 생리식염수 등)을 이용하여 세척하여 제거하고, 3) 최종적으로 산성 완충액 (예, 0.1M sodium citrate buffer, pH 3.5 혹은 0.1M glycine-HCl, pH 2.8, 등)을 면역글로불린 흡착 레진에 통과시켜서 상기 레진으로부터 면역글로불린 단백질을 산성 완충액에 포함되도록 분리시킨 후, 4) 면역글로불린 단백질이 포함된 산성 완충액에 알칼리 완충액을 첨가하여 산성도를 중화시킨 후, 5) 중화된 면역글로불린 단백질 용액을 최종적으로 포유동물에게 투여할 경우 포유동물에게 안전한 최종 완충액으로 완충액 조성을 변경시키는 과정 [투석(dialysis), 투석-여과(diafiltration), 탈염 (desalting), 혹은 농축 (concentration) 과정, 등]들을 거쳐서 최종 치료용 면역글로불린 제제로 제조되고 있다.

이렇게 복잡한 단계들을 거쳐서 치료용 면역글로불린 제제의 제조가 이루어지므로 제조 과정에서 상당한 노력과 비용이 소요되어 최종적으로 생산된 치료용 면역글로불린 제제의 비용이 높게 책정될 수밖에 없는 상황이다.

통상적으로 상기한 면역글로불린 흡착 레진을 이용한 흡착크로마토그래피 과정에서 면역글로불린 단백질을 면역글로불린 흡착 레진으로부터 용출시키는 단계(상기한 3단계 과정)에서 사용되는 산성 완충액은 pH 가 3.5인 0.1M의 구연산나트륨(sodium citrate) 이거나, pH 가 2.8인 0.1M 글리신(glycine)이 사용된다.

하지만, 상기 면역글로불린 흡착 레진을 이용한 흡착크로마토그래피를 통한 치료용 면역글로불린 제제 제조 과정의 5단계 과정 중에서 3단계의 산성 완충액들로 용출된 면역글로불린 단백질을 포함한 용액은 지나친 강산성으로 인하여 그 상태 그대로 포유동물에게 비 경구 경로로 투여 시에는 포유동물세포에 독성을 유발할 수 있으므로 이 용액을 치료용 면역글로불린 제제로 바로 사용하는 것은 매우 어렵다. 이에 따라서 산성 완충용액으로 용출된 면역글로불린 단백질이 포함된 용액을 추가로 알칼리 용액을 추가하여 pH 를 상승시키는 산도 중화단계와 이후에 포유동물에 비 경구 경로로 투여 시에 독성이 적은 최종 제제용 완충액으로 투석(dialysis)이나 여과(filtration)과정 등을 거쳐서 완충액 조성을 변경시키는 단계를 거쳐서 치료용 면역글로불린 제제가 제조되게 된다.

또한, 치료용 면역글로불린 제제의 경우 장기간 보관 시에 치료효과를 최대한 보존하고 치료용 면역글로불린 단백질의 응집(aggregation)으로 인한 수용성 면역글로불린 단백질의 손실과 포유동물에 투여 시의 독성(다량체 생성 등을 통한 보체활성화에 의한 독성)의 발생을 최소화하기 위해서는, 저온에서 액상의 치료용 면역글로불린 제제에 포함된 면역글로불린 단백질이 응집이 일어나지 않은 상태로 존재하여야하므로 최종 치료용 면역글로불린 제제 제조 단계에서 적정한 pH 와 적정한 염도가 되도록 면역글로불린 단백질이 포함된 완충액의 조성이 변경될 필요가 있다.

따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 기존의 제조방법에 비해서 분리정제 과정이 단순화되고 축약되어 제조시간이 축소되고, 제조과정이 쉬워지고, 관련 소모품의 사용이 줄어 비용이 저렴해진 진보된 형태의 혈액 혹은 세포 배양액으로부터 면역글로불린 단백질을 분리 정제하여 치료용 면역글로불린 제제를 제조하는 방법과 이 방법으로 제조된 치료용 면역글로불린 제제 및 치료용 면역글로불린 제제의 제조를 위한 산성 완충액을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은

면역글로불린 흡착 레진으로부터 면역글로불린 단백질을 용출시키기 위한 산성 완충액으로 사용되는 산성의 5mM에서 50mM의 sodium citrate 용액으로 이루어진 것을 특징으로 하는 치료용 면역글로불린 제제 제조에 사용되는 산성 완충액을 제공한다.

상기 다른 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은

ⅰ) 면역글로불린 흡착 레진에 포유동물의 혈장 혹은 면역글로불린 단백질이 포함된 세포배양액을 접촉시켜 면역글로불린 흡착 레진에 면역글로불린 단백질을 흡착시키는 흡착단계;

ⅱ) 상기 흡착단계가 종료된 후 면역글로불린 흡착 레진으로 세척액을 통과시켜 면역글로불린 흡착 레진에 흡착된 면역글로불린 단백질 이외의 다른 물질들을 세척하여 제거시키는 세척단계;

ⅲ) 상기 세척단계가 종료된 후 면역글로불린 흡착 레진으로 5mM에서 50mM의 sodium citrate 용액으로 이루어진 산성 완충액을 통과시켜서 면역글로불린 흡착 레진에 흡착된 면역글로불린 단백질을 용출시켜 치료용 면역글로불린 제제를 제조하는 단계를 포함하는 치료용 면역글로불린 제제의 제조방법을 제공한다.

상기 또 다른 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은

면역글로불린 단백질과 5mM에서 50mM의 sodium citrate 용액을 포함하는 치료용 면역글로불린 제제를 제공한다.

현재 치료용 면역글로불린 제제를 제조하기 위해서 혈액 혹은 세포배양액으로부터 면역글로불린 단백질을 분리정제 하는 흡착 크로마토그래피 방법에서 통상적으로 적용되고 있는 상기한 5단계의 분리 정제과정 중에서 면역글로불린 흡착 레진으로부터 면역글로불린 단백질을 산성 완충액을 이용하여 용출하는 3단계와 용출된 면역글로불린이 포함된 산성 완충액에 알칼리 완충액을 첨가하여 산도를 중화시키는 4단계, 그리고 중화된 면역글로불린 단백질 용액을 투석(dialysis), 투석-여과(diafiltration) 등을 이용하여 최종적으로 포유동물에 투여할 경우 포유동물에게 안전한 최종 완충액으로 완충액 조성을 변경하는 5단계 과정을 최대한 단축하기 위해서 본 발명에서는 상기한 최종 3, 4, 5단계의 3단계를 1단계로 축약하였다.

즉 본 발명은 면역글로불린 단백질이 부착된 면역글로불린 흡착 레진으로부터 면역글로불린 단백질을 용출하여 분리시키는 과정에서 사용될 산성 완충액의 조성을 1) 포유동물 세포에 대한 독성반응이 최소화되고, 2) 적절한 양의 면역글로불린 단백질을 면역글로불린 흡착 레진으로부터 분리시켜 얻을 수 있고, 3) 보관 시에 온도변화에 따른 면역글로불린 단백질의 응집과 이로 인한 손실을 최소화할 수 있도록 적정시켜서, 본 발명의 산성 완충액을 이용하여 면역글로불린 단백질을 면역글로불린 흡착 레진으로부터 용출 분리한 후에 다음 단계(상기한 4, 5단계)인 알칼리성 용액을 이용하여 면역글로불린 단백질이 포함된 산성 완충액을 중화시키는 과정과 최종 치료용 면역글로불린 제제에 해당하는 완충액으로 완충액을 변환시키는 단계를 생략하고 바로 치료용 면역글로불린 제제로 제조하는 방법을 새롭게 제시한다. 이에 따라 본 발명은 기존의 방법보다 현저하게 단순화된 이에 따라서 제조비용, 제조시간, 그리고 제조에 들어가는 노력을 현저하게 줄일 수 있는 혈액 혹은 세포 배양액으로부터 면역글로불린 단백질을 분리 정제하여 치료용 면역글로불린 제제를 제조하는 새로운 제조방법과 이 방법으로 제조된 치료용 면역글로불린 제제 및 치료용 면역글로불린 제제의 제조를 위한 산성 완충액을 제공한다.

따라서 발명자들은 면역글로불린 흡착 레진으로부터 하나의 단계로 포유동물에 비 경구 투여가 가능한 치료용 면역글로불린 제제를 용출시킬 수 있도록 1) 적정한 면역글로불린 단백질 회수율을 가지면서, 2) 포유동물에게 비 경구 경로로 투여 시에 포유동물 세포에 대한 독성이 최소화되고, 3) 장기간 보관과 온도 변화에 의한 면역글로불린 단백질의 변성과 응집에 따른 손실을 최소화할 수 있는 3 가지 조건을 적절하게 만족시킬 수 있는 산성 완충액의 적정한 조건을 찾아서 본 발명의 치료용 면역글로불린 제제 제조방법과 이 제조방법으로 제조된 치료용 면역글로불린 제제를 완성하였다.

특히 면역글로불린 흡착 레진으로부터 면역글로불린 단백질을 용출시키는 1단계의 과정만으로 최종 면역글로불린 제제를 제조하기 위해서는 면역글로불린 이외에 첨가되는 염이 인체에 대한 안전성이 확립된 염이 포함된 산성 완충액을 면역글로불린 용출과정에 사용하는 것이 바람직하며, 이에 따라 산성의 sodium citrate의 경우 오랜 기간 동안 헌혈용 수혈 백에 미리 포함된 상태로 헌혈 시에 얻어진 정맥혈과 혼합되어 혈액 세포가 응집되지 않도록 하기 위한 목적의 항응고제로서 사용되어 오고 있으며, 원심분리에 의해서 적혈구농축액과 혈장으로 분리된 후에도 혈장 안에 포함되어 수혈 과정에서 정맥을 통해서 사람에 투여될 경우에 인체에 안전함이 임상적으로 입증된 상태이다. 발명자들은 이에 착안하여 본 발명에서 면역글로불린 흡착 레진으로부터 면역글로불린 단백질을 용출을 시켜서 치료용 면역글로불린 제제로 사용할 수 있도록 본 발명의 산성의 sodium citrate 용액을 적정한 산도와 염도를 갖도록 최적화하였다.

도 1은 본 발명에 따른 치료용 면역글로불린 제제 제조방법에 따라서 혈장으로부터 면역글로불린을 분리한 경우와 기존의 면역글로불린 제제 제조방법에 따라서 분리한 경우의 면역글로불린 단백질 회수율을 비교하여 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 제조방법에 따라서 제조된 치료용 면역글로불린 제제의 포유동물세포에 대한 세포독성(세포사멸%)을 나타낸 도면이다(A: 사람 상피세포 (BEAS-2B 세포주)에 대한 세포독성, B: 원숭이 섬유아세포 (COS-7 세포주)에 대한 세포독성).
도 3은 본 발명에 따른 치료용 면역글로불린 제제 제조방법에서 면역글로불린 흡착레진(Protein A 레진)으로부터 면역글로불린 단백질을 용출시키기 위해서 사용될 산성 완충액의 산도와 sodium citrate 농도의 변화에 따라서 포유동물세포에 대한 직접적인 세포독성의 정도(세포사멸%)의 변화를 나타낸 도면이다(A: 사람 상피세포 (BEAS-2B 세포주)에 대한 세포독성, B: 원숭이 섬유아세포 (COS-7 세포주)에 대한 세포독성).
도 4는 본 발명에 따른 치료용 면역글로불린 제제 제조방법에서 치료용 면역글로불린 제제를 제조하는 과정에서 사용되는 산성 완충액의 sodium citrate 농도와 pH 범위에 따라서 사람의 혈장으로부터 Protein A를 이용한 흡착크로마토그래피로 분리되어 회수되는 면역글로불린 단백질 총량(mg)의 변화를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에 따라 제조된 치료용 면역글로불린 제제들을 장시간 보관 시 온도 변화에 따른 단백질의 안전성을 확인하기 위해서 냉동 후 해동한 경우에 냉동 전에 비해서 면역글로불린 단백질이 보존되는 정도를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.

이하 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명은 ⅰ) 포유동물의 혈장 혹은 면역글로불린 단백질이 포함된 세포배양액을 면역글로불린 흡착 레진에 접촉시켜서 면역글로불린 흡착 레진에 면역글로불린 단백질을 흡착시키는 흡착단계; ⅱ) 상기 흡착단계가 종료된 후 면역글로불린 흡착 레진에 세척액을 통과시켜 면역글로불린 흡착 레진에 흡착된 면역글로불린 단백질 이외의 다른 물질들을 세척하여 제거시키는 세척단계; ⅲ) 상기 세척단계가 종료된 후 면역글로불린 흡착 레진에 본 발명의 산성 완충액을 통과시켜 면역글로불린 흡착 레진에 흡착된 면역글로불린 단백질을 용출시키는 용출 단계로 구성된 치료용 면역글로불린 제제를 제조하는 방법을 제공한다.

상술한 본 발명에 따라 제조된 치료용 면역글로블린 제제는 치료용으로 바로 사용할 수 있다. 즉 상술한 3개의 단계만으로 치료용 면역글로블린 제제의 제조가 완료될 수 있다는 의미이다. 물론 필요에 따라 최종 치료용을 만들기 위하여 부수적인 단계가 포함될 수는 있다.

본 발명에 따른 치료용 면역글로불린 제제 제조방법은 혈액, 혈장 또는 면역글로불린 단백질이 포함된 세포배양용액으로부터 면역글로불린 단백질을 분리하여 치료용 면역글로불린 제제를 오염되지 않은 무균 및/또는 무독성 상태로 제조하기 위한 것으로서, 이러한 목적을 갖는 면역글로불린 제제 제조방법이라면 특별히 한정되지 않는다.

특히, 본 발명에 따른 치료용 면역글로불린 제제 제조방법은 질병 치료를 목적으로 환자 자신의 혈액, 혈장 또는 소수의 특정 포유동물로부터 얻어진 혈액, 예를 들면 소량의 혈액으로부터 면역글로불린을 분리하여 질환 치료 혹은 예방을 위한 주사제 형태의 치료용 면역글로불린 제제를 제조하기 위해서 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 치료용 면역글로불린 제제 제조방법은 질병 치료 혹은 질병 예방을 위한 목적으로 사용하기 위해서 다발성 골수종 세포 혹은 유전자 재조합법으로 변형시킨 포유동물의 세포, 대장균, 효모 등의 세포로부터 생산된 면역글로불린을 포함하는 배양액으로부터 면역글로불린 단백질을 분리하여 주사제의 형태의 치료용 면역글로불린 제제의 제조를 위해서 사용될 수 있다.

하지만, 상기 방법으로 제조된 치료용 면역글로불린 제제는 주사 경로(피하주사, 근육주사, 정맥주사 등)로 투여되는 제제로 한정되는 것이 아니라, 이 외에도 포유동물에 질병의 예방 및/또는 치료 목적으로 경구 및/또는 비 경구 투여 경로(경피 투여, 기도 내, 복강 내, 안구 내 등)로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 면역글로불린은 포유동물의 혈액 및/또는 혈장으로부터 면역글로불린 단백질을 분리 정제하기 위해 사용되는 통상적인 방법 예를 들면, 침전법, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등을 이용하여 분리된 IgG, IgA, IgM, IgD,및 IgE를 포함하는 면역글로불린 단백질일 수 있으며 혹은 면역글로불린 단백질의 일부 부분 절편일 수도 있다.

본 발명에 따른 면역글로불린은 면역글로불린 단백질을 포함하는 세포배양액으로부터 면역글로불린 단백질을 분리 정제하기 위해 사용되는 통상적인 방법 예를 들면, 침전법, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등을 이용하여 분리된 IgG, IgA, IgM, IgD,및 IgE를 포함하는 면역글로불린 단백질일 수 있으며 혹은 면역글로불린 단백질의 일부 부분 절편일 수도 있다.

또한, 본 발명에 따른 면역글로불린은 포유동물의 혈액 혹은 혈장으로부터 분리된 면역글로불린 G(IgG)일 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 치료용 면역글로불린 제제는 알레르기질환, 자가면역질환, 만성염증성 질환, 감염성 질환 및/또는 악성 종양성 질환 등의 다양한 질환들을 예방 및/또는 치료하기 위해 사용된다.

또한, 상기 치료용 면역글로불린 제제의 제조방법은 외부로부터 오염 없이 치료용 면역글로불린 제제를 제조할 수 있도록 전체 구성이 외부와 격리된 밀폐형으로 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 면역글로불린 흡착 레진은 포유동물의 혈액 혹은 면역글로불린 단백질이 포함된 세포배양액으로부터 면역글로불린 단백질을 흡착시키기 위한 것으로서, 이러한 목적을 갖는 면역글로불린 흡착 레진이라면 어떠한 것을 사용하여도 무방하다.

상기 면역글로불린 흡착 레진은 고체형의 매트릭스(solid-phase matrix)로 구성되어 혈액, 혈장 및/또는 혈청 혹은 세포배양액에 존재하는 면역글로불린이 흡착되도록 하는 흡착물질(ligand)을 포함한다. 이때, 상기 혈액, 혈장 및/또는 혈청은 본 발명의 용이한 설명을 위해 혈액으로 통칭할 수 있다.

상기 면역글로불린 흡착 레진은 흡착 크로마토그래피(affinity chromatography)법으로 면역글로불린을 분리하기 위해 통상적으로 사용되는 면역글로불린 흡착물질, 예를 들면 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 L, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite), 면역글로불린을 흡착할 수 있는 항-면역글로불린 항체 단백질, 항원-특이 면역글로불린이 흡착되거나 반응할 수 있는 항원-단백질, 알레르겐 또는 이들 중 선택된 하나 이상일 수 있다.

또한, 상기 면역글로불린 흡착 레진은 이온교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography)법으로 면역글로불린을 분리하기 위해 사용되는 이온교환수지, 예를 들면 양이온 수지, 음이온 수지, 디에틸아미노에틸(diethylaminoethyl; DEAE), 디에틸아민(diethylamine), 쿼터너리 암모늄(quaternary amonium) 또는 이들 중에서 선택된 적어도 하나 이상일 수 있다.

일 양태로서, 상기 흡착물질로 사용되는 이온교환수지 등은 고체형의 매트릭스(solid-phase matrix)에 부착된 형태로 면역글로불린 흡착 레진을 구성할 수 있다.

이때, 상기 고체형의 매트릭스는 아가로스(agarose), 실리카 (silica), 셀룰로오스(cellulose), 아크릴아마이드 등의 성분으로 이루어진 멤브레인(membrane), 비드(bead), 글래스(glass), 또는 필터(filter) 등의 형태일 수 있다.

이때, 상기 세척액은 면역글로불린 흡착 레진을 세척할 수 있는 당 업계에서 통상적으로 사용되는 세척액을 사용한다.

특정 양태로서, 상기 세척액은 약 1.5M의 글리신-수산화나트륨(glycine-NaOH)과 3M의 염화나트륨(NaCl)이 혼합된 액으로서, pH 가 9.0을 이루는 것이거나, 100mM Tris 완충액으로서, pH 가 8.0인 것일 수 있다. 혹은 상기 세척액은 단순하게 주사용 생리식염수(normal saline for injection) 혹은 인산염 완충식염수(phosphate buffered saline) 혹은 트리스 완충식염수 (tris buffered saline)일 수 있다.

본 발명은 면역글로불린 흡착 레진으로부터 면역글로불린 단백질을 용출시켜 최종 치료용 면역글로불린 제제를 제조하기 위한 목적으로 사용되는 산성 완충액을 제공한다.

본 발명에 따른 산성 완충액은 면역글로불린 흡착 레진과 반응시킴으로써 면역글로불린 흡착 레진에 흡착된 면역글로불린을 용출시켜 분리하기 위한 것이다.

본 발명의 상기 산성 완충액은 5mM에서 50mM의 구연산나트륨(sodium citrate) 용액을 사용할 수 있다.

즉, 본 발명은 면역글로불린 흡착 레진으로부터 면역글로불린 단백질을 용출시켜 최종 치료용 면역글로불린 제제를 제조하기 위한 목적으로 사용되는 산성의 5mM에서 50mM의 sodium citrate 용액으로 이루어진 것을 특징으로 하는 치료용 면역글로불린 제제 제조에 사용되는 산성 완충액을 제공한다.

본 발명의 상기 산성 완충액은 pH 가 2.0에서 5.0인 5mM에서 50mM의 구연산나트륨(sodium citrate) 용액을 사용할 수 있다.

본 발명의 치료용 면역글로불린 제제는 상기한 본 발명의 산성 완충액에 포함된 단백질 농도가 1mg/㎖에서 50mg/㎖의 면역글로불린 단백질을 포함하는 제제일 수 있다.

본 발명의 치료용 면역글로불린 제제는 5mM에서 50mM의 구연산 나트륨(sodium citrate)이 포함된 1mg/㎖에서 50mg/㎖ 농도의 면역글로불린 단백질을 포함하는 제제 용액의 산도(pH )가 3.9에서 6.3인 제제일 수 있다.

상기한 산성 완충액에 의해서 면역글로불린 흡착 레진으로부터 용출된 면역글로불린 단백질은 질병의 예방 및/또는 치료를 위해서 포유동물에게 투여되는 치료용 면역글로불린 제제로 곧 바로 사용될 수 있으며, 또한 사용자의 선택에 따라 적절한 무균상태의 주사용 완충액(예, 주사용 증류수 혹은 주사용 식염수, 등)을 사용하여 농축하거나 희석하여 사용될 수도 있다.

또한, 본 발명에 따른 치료용 면역글로불린 제제 제조방법에 따르면 면역글로불린 흡착 레진으로부터 본 발명의 산성 완충액을 이용하여 면역글로불린 단백질을 용출시킬 경우 본 발명의 산성 완충액은 포유동물에게 직접 주사 경로를 포함한 비 경구 경로로 투여할 경우 발생할 수 있는 포유동물세포에 대한 독성반응을 최소화시킬 수 있도록 최적화된 산성 완충액이므로 본 발명의 산성 완충액으로 용출된 면역글로불린 단백질을 추가적인 처리 과정 없이 곧바로 포유동물에게 투여 시에 독성반응의 발생가능성이 적은 안전한 형태의 치료용 면역글로불린 제제를 제조할 수도 있다.

이하에서 실시양태를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명하기로 한다. 그러나 하기의 실시양태는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로 이들 실시 양태에 의해 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시양태 1: 흡착크로마토그래피를 이용한 치료용 면역글로불린 제제 제조 시 산성 완충액 내의 sodium citrate 농도의 변화에 따른 면역글로불린 단백질 회수율 변화 분석

본 발명에 따른 치료용 면역글로불린 제제 제조방법에 따라서 혈장으로부터 면역글로불린을 분리한 경우 기존의 면역글로불린 제제 제조방법에 따라서 분리한 경우와 면역글로불린 단백질 회수량 (mg)과 회수율(%)의 차이를 비교하여 도 1 및 표 1에 나타냈다.

도 1의 data는 각각의 조건에서 4회 반복 실험한 결과의 평균 ± 표준편차로 나타낸 것이고. * 표식은 음성대조인 증류수로 용출한 경우의 면역글로불린 단백질 평균 회수율과 비교해서 특정 조건에 의한 면역글로불린 평균회수율이 통계적으로 유의한 차이를 보이는 경우를 표시한 것이다(independent sample t-test 통계 분석 기법, 본 명세서에서는 줄여서 t-test로 약칭함, *p<0.05).

용출 완충액 (산도: pH )	100mM sodium citrate (pH 3.23)	50mM sodium citrate (pH 3.16)	25mM sodium citrate (pH 3.13)	10mM sodium citrate (pH 3.19)	5mM sodium citrate (pH 3.18)	1mM sodium citrate (pH 3.39)	0.1mM sodium citrate (pH 3.84)	증류수 (pH 4.44)
회수된 면역글로불린 단백질량 (mg)	5.25±0.19	4.93±0.05	4.81±0.16	4.76±0.05	3.35±0.30	0.61±0.12	0.37±0.01	0.44±0.08
면역글로불린 회수율 (%)*	100 ±3.58	94.0 ±0.9	91.6 ±3.1	90.8 ±1.0	63.9 ±5.7	11.5 ±2.3	7.1 ±0.3	8.3±1.6
회수된 면역글로불린 용액의 최종 산도 (pH )	3.76	3.9	4.08	4.39	4.8	6.7	6.8	6.9

상기 표 1에 표시된 측정치 data는 하나의 조건으로 4회 반복 실험한 결과(quadruplicated data)의 평균 ± 표준편차로 나타낸 것이고. 상기 표 1에서 * 표시된 면역글로불린 회수율(%)은 10OmM sodium citrate, pH 3.23 완충액으로 회수한 면역글로불린 단백질의 총량(mg)과 비교하여 백분율로 표시한 것이다.

도 1 및 표 1을 참조하여 본 발명에 따른 치료용 면역글로불린 제제 제조방법과 이에 사용되는 산성 완충액의 종류 그리고 이를 이용하여 제조된 면역글로불린 단백질 회수율(생산율)을 기존의 면역글로불린 제제 제조방법과 비교하여 설명하면 다음과 같다.

1) 사람의 혈장 100㎖를 Protein A 레진 (Protein A coupled silica bead) 10㎖에 접촉시켜서 혈장 안에 존재하는 면역글로불린 단백질을 Protein A레진에 흡착시킴. 2) 혈장과 접촉하여 상기 면역글로불린 단백질을 흡착시킨 Protein A 레진에 주사용 생리식염수(normal saline, 0.9% NaCl solution)를 충분한 양을 통과시켜서 면역글로불린 단백질 이외에 비 특이적으로 Protein A 레진에 부착된 다른 물질들을 세척하여 제거함. 3) 상기 면역글로불린 단백질이 흡착된 Protein A 레진을 0.2㎖씩 분주하여 하단에 mesh가 장착되어 레진이 빠지지 않도록 구조화된 plastic mini-column (Bio-rad, U.S.A.)에 넣은 후에 상기 Protein A 레진으로부터 면역글로불린 단백질을 용출시키기 위해서 산성 완충용액으로 10OmM sodium citrate (pH 3.23) 용액, 50mM sodium citrate (pH 3.16), 25mM sodium citrate (pH 3.13), 10mM sodium citrate (pH 3.19), 5mM sodium citrate (pH 3.18), 1mM sodium citrate (pH 3.39), 0.1mM sodium citrate (pH 3.84), 그리고 음성대조로 증류수 (distilled water, pH 4.44)를 각각 1㎖씩 10분 동안 반응시킨 후에 column하부로 배출시켜서 배출된 산성 완충액 혹은 증류수를 각각 1㎖씩 회수하였다. 4) 상기에서 회수한 산성 완충액 혹은 증류수 내에 포함된 면역글로불린 단백질 농도를 bradford 방법으로 정량하고, 기존의 방법인 100mM sodium citrate (pH 3.23)용액으로 용출한 면역글로불린 단백질 용액 안에 포함된 면역글로불린 단백질의 총량(mg)을 100%로 하여 각각의 산성 완충액들에 의해 용출한 면역글로불린 단백질의 총량들을 비교하여 회수율(%)들을 비교하였다.

각각의 산성 완충액을 이용한 면역글로불린 단백질 회수율을 비교한 결과 50mM sodium citrate 용액, 25mM sodium citrate 용액, 10mM sodium citrate 용액, 그리고 5mM sodium citrate 용액으로 용출한 경우 기존의 100mM sodium citrate 용액에 의해서 용출한 경우에 비교해서 면역글로불린 단백질의 평균 회수율은 각각 94.0%, 91.6%, 90.8%, 63.9%로 1mM sodium citrate 용액, 0.1mM sodium citrate 용액, 혹은 증류수로 용출한 경우의 각각의 면역글로불린 단백질 평균 회수율인 11.5%, 7.1%, 8.3%에 비해서 유의하게 높은 회수율을 보였다 (t-test, p < 0.05). 도 1에 표시된 * 표식은 음성대조인 증류수로 용출한 경우의 면역글로불린 단백질 평균 회수율과 비교해서 특정 조건에 의한 면역글로불린 평균회수율이 통계적으로 유의한 차이를 보이는 경우를 표시한 것이다(t-test, p<0.05).

이에 따라서 발명자들은 기존에 Protein A 흡착 크로마토그래피에서 Protein A레진으로부터 면역글로불린 단백질을 용출하기 위해서 사용되어 왔던 산성 완충액인 100mM sodium citrate 용액에 포함된 sodium citrate의 농도를 5mM에서 50mM 범위로 감소시켜도 상당한 양의 면역글로불린 단백질을 Protein A 레진으로부터 용출시켜 치료용 면역글로불린 제제를 얻을 수 있음을 확인하였다.

또한, 상기한 5mM에서 50mM sodium citrate 산성 완충액으로 용출시킨 면역글로불린 단백질 용액 (즉 본 발명의 치료용 면역글로불린 제제)의 pH 값이 3.9 - 4.8 사이의 값을 나타내었다 (상기 표 1 참조). 이러한 pH 값은 면역글로불린 G의 응집이 일어나기 쉽다고 알려진 pH 값(즉 isoelectric point 값; 약자로 PI값)인 6.4 - 9.0 값보다 낮아서 면역글로불린 단백질이 용액상태에서 응집이 최소화되어 안정되게 존재할 수 있는 산성도 값에 해당하여 치료용 면역글로불린 제제를 구성하는 용액으로서 가장 적절한 pH 범위에 해당하였다.

실시양태 2: 본 발명의 다양한 sodium citrate 농도의 산성 완충액으로 제조된 치료용 면역글로불린 제제의 포유동물세포에 대한 세포독성 분석

본 발명에 따른 치료용 면역글로불린 제제 제조과정 중 면역글로불린 흡착레진(Protein A 등)에 부착된 면역글로불린 단백질을 용출하는 과정에서 사용되는 본 발명의 다양한 sodium citrate 염도의 산성 완충액들에 의해서 제조된 치료용 면역글로불린 제제 조성물들의 포유동물 세포들(사람 상피세포와 원숭이 섬유아세포)에 대한 세포독성(세포사멸 %로 표현함)을 비교하여 표 2 및 도 2에 나타냈다. 표 2와 도 2는 본 발명의 치료용 면역글로불린 제제들의 포유동물 세포들에 대한 독성을 측정한 결과 (세포사멸 %의 평균 ± 표준편차)이다.

표 2와 도 2의 data는 각각의 조건에서 4회 반복 실험한 결과측정치(quadruplicated data)의 평균 ± 표준편차로 나타낸 것이고. * 표식은 음성대조로 상업화된 근육주사용 사람 면역글로불린 G(감마글로불린, 녹십자, 한국; IgG 165 mg/㎖) 용액을 처치한 경우의 평균 세포사멸 %와 비교해서 특정 완충액으로 제조한 치료용 면역글로불린 제제에 의한 평균 세포사멸 %가 통계적으로 유의한 차이를 보이는 경우를 표시한 것이다(t-test, * p<0.05 compared to gamma globulin).

사람 상피세포 (BEAS-2B 세포주)에 대한 세포독성
면역글로불린이 포함된 완충액의 종류와 산도	20% SDS	조건 1 아래의 완충액에 포함된 면역글로불린 G (100 microgram)					조건 2
		100mM Sodium citrate (pH 3.76)	50mM Sodium citrate (pH 3.9)	25mM Sodium citrate (pH 4.08)	10mM Sodium citrate (pH 4.39)	5mM Sodium citrate (pH 4.8)	배양액으로 희석한 면역글로불린 G (150㎍)	생리 식염수
세포사멸 (%)	79.1±6.3	51.7 ±6.3	17.4±12.8	18.6 ±22.4	9.2 ±19.4	-1.5 ±15.0	10.1 ±16.6	19.7±12.1
원숭이 섬유아세포 (COS-7 세포주)에 대한 세포독성
면역글로불린이 포함된 완충액의 종류와 산도	20% SDS	조건 1 아래의 완충액에 포함된 면역글로불린 G (150 microgram)					조건 2
		100mM Sodium citrate (pH 3.69)	50mM Sodium citrate (pH 4.20)	25mM Sodium citrate (pH 4.32)	10mM Sodium citrate (pH 4.96)	5mM Sodium citrate (pH 5.39)	배양액으로 희석한 면역글로불린 G (150㎍)	생리 식염수
세포사멸 (%)	89.9±0.9	60.5 ±3.9	52.3 ±7.9	45.6 ±9.5	42.7 ±12.7	23.0 ±3.2	38.7 ±15.9	22.6±7.2

도 2와 표 2를 참조하여 본 발명에 따른 치료용 면역글로불린 제제의 제조방법과 이에 사용되는 산성 완충액의 종류에 따라서 제조된 치료용 면역글로불린 제제 조성물의 포유동물 세포에 대한 세포독성을 비교하여 설명하면 다음과 같다.

상기 실시양태 1의 방법에 따라 제조된 치료용 면역글로불린 제제를 실험실 조건(in vitro)에서 96 well culture plate에 배양된 사람 상피세포(BEAS-2B 세포주, ATCC) 그리고 배양된 원숭이 섬유아세포(COS-7 세포주, ATCC)에 4시간 동안 처치한 후, 살아있는 세포에 주로 uptake되는 성질에 따라서 세포의 활성도를 측정하기 위해서 현재 흔하게 사용되고 있는 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipH enyltetrazolium bromide (MTT) 염료를 이용한 표준적인 세포독성 측정방법인 MTT assay 법에 따라서 측정된 세포독성 분석 결과를 % 세포사멸(% cell death)로 표현하여 표 2 및 도 2로 나타냈다.

이때, 상기한 치료용 면역글로불린 제제를 배양된 사람 상피세포(BEAS-2B 세포주)에 처치할 경우, 배양된 세포가 부착된 well 당 세포 배양액 용액 100㎕와 실시양태 1의 방법에 따라 제조된 치료용 면역글로불린 제제를 배양액으로 1mg/㎖ 농도가 되도록 희석한 용액 100㎕를 혼합하여 4 시간 동안 처치(well 당 100 microgram의 IgG)될 수 있도록 하였으며, 이에 따라서 배양된 사람 상피세포가 노출되는 최종 면역글로불린 농도가 0.5mg/㎖ 농도가 되도록 하였다.

또한, 상기한 치료용 면역글로불린 제제에 의한 사람 상피세포(BEAS-2B)에 대한 세포독성실험 시에 음성 대조실험으로서 배양된 사람 상피세포가 부착된 well 당 상업화된 근육주사용 사람 면역글로불린 G(감마글로불린, 녹십자, 한국; IgG 165 mg/㎖) 용액을 세포 배양액으로 희석한 용액 100㎕와 세포 배양액 100㎕를 혼합하여 배양된 사람 세포가 노출되는 최종 면역글로불린 농도가 0.5mg/㎖가 되도록 하여 배양된 세포에 처치하였다. 또한 추가적인 음성 대조실험으로서 배양된 세포가 부착된 well 당 주사용 생리식염수 (normal saline; 표와 도면들에서 saline으로 약칭함) 100㎕와 세포 배양액 100㎕를 혼합하여 배양된 세포에 상기한 실험과 동일한 시간과 조건에서 처치하여 음성대조 실험을 진행하였다.

또한, 치료용 면역글로불린 제제를 배양된 원숭이 섬유아세포(COS-7 세포주)에 처치할 경우, 배양된 세포가 부착된 well 당 세포 배양액 용액 100㎕와 실시양태 1에 따라 제조된 치료용 면역글로불린 제제를 배양액으로 1.5mg/㎖ 농도가 되도록 희석한 용액 100㎕를 혼합하여 4 시간 동안 처치(well 당 150 microgram의 IgG)될 수 있도록 하였으며, 이에 따라서 배양된 원숭이 섬유아세포가 노출되는 최종 면역글로불린 농도가 0.75mg/㎖ 농도가 되도록 하였다.

또한, 상기한 원숭이 섬유아세포(COS-7)에 대한 치료용 면역글로불린 제제에 의한 세포독성 실험 시에 음성대조 실험으로서 배양된 원숭이 섬유아세포가 부착된 well 당 상업화된 근육주사용 사람 면역글로불린 G(감마글로불린, 녹십자, 한국; IgG 165 mg/㎖) 용액을 세포 배양액으로 1.5mg/㎖ 농도로 희석한 용액 100㎕와 세포 배양액 100㎕를 혼합하여 배양된 원숭이 섬유아세포가 노출되는 최종 면역글로불린 농도가 0.75mg/㎖ (즉 well 당 150 microgram의 IgG)가 되도록 하여 배양된 세포에 동일한 시간과 조건으로 처치하였다. 또한 추가적인 음성 대조실험으로서 배양된 세포가 부착된 well 당 주사용 생리식염수 (normal saline) 100㎕와 세포 배양액 100㎕를 혼합하여 배양된 세포에 처치하였다.

이때, 상기한 여러 종류의 희석액에 포함된 치료용 면역글로불린 제제를 배양된 세포에 처리할 경우 특정한 한 가지 조건으로 4 개의 다른 세포배양 well들에 동시에 처리하여 세포독성 실험 결과들(quadruplicated data)을 얻은 후에 각각의 조건들에 의한 세포독성의 평균값들이 통계적으로 의미 있는 차이가 있는지를 t-test로 비교 분석하였다.

또한, MTT assay에 의해서 본 발명의 치료용 면역글로불린 제제의 세포독성을 측정 시에 세포배양액만을 처리한 경우의 세포독성을 0%로 하여 여러 종류의 치료용 면역글로불린 제제들의 포유동물 세포에 대한 세포독성의 정도를 % 세포사멸로 계산하였다. 이론적으로 MTT 시약은 살아서 기능을 하는 세포에 의해서 흡광도를 나타내는 물질을 더 많이 만들게 되므로 세포배양액만을 처리한 경우의 흡광도 값이 가장 높았으며, 양성 대조실험으로 사용한 배양된 세포 Well 당 20% sodium dodecyl sulfate (SDS) 용액 100㎕와 배양액 100㎕를 혼합하여 4시간 처치한 경우의 흡광도 값이 가장 낮아서 높은 세포사멸의 정도(%)를 보였다. 이에 세포독성의 정도는 아래의 공식으로 세포사멸 %로 표현하였다.

세포사멸% (% cell death ) =

[(배양액만을 처리한 well 들의 평균 흡광도 - 특정 조건을 처리한 well 의 흡광도)/배양액만을 처리한 well 들의 평균흡광도] x 100

도 2와 표 2에서 표시된 바와 같이, 기존에 면역글로불린 제제를 분리하기 위하여 통상적인 방법에 따라 이용된 100mM sodium citrate 사용하여 Protein A 레진으로부터 흡착크로마토그래피 방법으로 면역글로불린 단백질을 용출시켜 제조된 면역글로불린 제제 조성물을 사람 상피세포 혹은 원숭이 섬유아세포에 각각 4시간 동안 반응시켜 처리한 경우, 음성대조인 현재 시판되어 사람에게 사용 중인 치료용 면역글로불린 주사제(감마글로불린, 녹십자사, 한국)와 비교하여 유의하게 높은 세포독성을 나타내었다(t-test, *p < 0.05, 도 2).

그러나 본 발명의 실시양태 1에서와 같이 본 발명의 면역글로불린 제제 제조방법에 따라서 5mM sodium citrate, 10mM sodium citrate, 25mM sodium citrate, 50mM sodium citrate 용액을 이용하여 Protien A 레진으로부터 면역글로불린 단백질을 용출시켜서 제조한 치료용 면역글로불린 제제 조성물들의 경우는 현재 시판되어 사람에게 사용 중인 치료용 면역글로불린 주사제(감마글로불린, 녹십자사, 한국)와 비교하여 상기한 두 종류의 포유동물 세포들에 대해서 세포독성에 유의한 차이가 없었다 (t-test, p > 0.05, 도 2).

또한, 추가적인 음성대조로 사용된 생리식염수에 의한 세포독성 정도의 평균치와 치료용 면역글로불린 주사제인 감마글로불린에 의한 세포독성의 정도의 평균치 간에 유의한 차이가 없었다 (t-test, p > 0.05, 도 2).

도 2에 표시된 * 표식은 음성대조인 시판중인 치료용 면역글로불린 주사제(감마글로불린)만을 처치한 경우의 세포독성 정도의 평균치(평균 세포사멸 %)와 비교해서 특정 완충액으로 제조한 치료용 면역글로불린 제제에 의한 세포독성의 평균치(평균 세포사멸 %)가 통계적으로 유의한 차이를 보이는 경우를 표시한 것이다(t-test, * p<0.05).

즉, 본 발명의 산성 완충액과 이를 이용한 면역글로불린 제제 제조방법에 의해서 제조된 치료용 면역글로불린 제제들은 현재 사람이나 포유동물에게 치료목적으로 주사로 투여되어 사용되는 치료용 면역글로불린 제제와 비교하여 포유동물 세포에 대한 세포독성 정도가 유의한 차이가 없으므로 포유동물에게 투여 시에 세포 독성을 유발하지 않아서 포유동물에게 질병의 예방 또는 치료목적으로 안전하게 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시양태 3: 본 발명의 산성 완충액의 산성도( pH ) 수치와 sodium citrate 농도에 따른 포유동물세포에 대한 직접적인 세포 독성 측정 분석

본 발명에 따른 치료용 면역글로불린 제제 제조방법에서 면역글로불린흡착레진(Protein A 레진)으로부터 면역글로불린 단백질을 용출시키기 위해서 사용될 산성 완충액의 산도와 sodium citrate의 농도에 따른 사람 상피세포와 원숭이 섬유아세포에 대한 직접적인 세포독성의 정도(세포사멸 %)를 측정 분석하여 도 3 및 표 3에 나타냈다.

도 3 및 표 3의 결과는 배양액만을 첨가한 경우의 세포활성도를 100% (세포독성이 없는 상태; 즉 세포독성 0%)로 간주하여 본 발명의 산성 완충액 조성물을 첨가한 경우의 세포활성도를 실시양태 2에서와 같이 MTT assay로 측정한 후에 세포독성의 정도를 세포사멸 %로 계산하여 표시하여 각각의 조건마다 4 번 반복적으로 실험한 측정치(quadruplicated data)의 평균값으로 표현한 결과이다. 즉, 도 3과 표 3은 치료용 면역글로불린 제제를 제조하기 위한 본 발명의 산성 완충액들에 의한 포유동물 세포들에 대한 직접적인 세포독성을 측정 분석한 결과 (세포사멸 %의 평균 ± 표준편차)이다. * 표식은 각각의 산성 완충액들의 특정한 산성도 (pH value) 에서 다양한 sodium citrate 농도의 산성 완충액에 의한 세포독성의 정도(평균 세포사멸 %)를 동일한 산도의 100mM sodium citrate에 대한 세포독성의 정도(평균 세포사멸 %)와 비교해서 통계적으로 유의한 차이를 보이는 경우를 표시하였으며(t-test, * p<0.05 compared to 100mM sodium citrate), † 표식은 음성대조인 생리식염수만을 처치한 경우의 세포독성의 정도(평균 세포사멸 %)와 비교해서 특정 완충액을 처치한 경우의 세포독성의 정도(평균 세포사멸 %)가 통계적으로 유의한 차이를 보이는 경우를 표시한 것이다(t-test, † p<0.05 compared to saline).

사람 상피세포 (A549 세포주)에 대한 세포독성
pH	3	4	5	6
100mM sodium citrate	103.6 ± 2.0	96.1 ± 0.7	77.2 ± 1.4	36.0 ± 3.4
50mM sodium citrate	89.4 ± 2.1	61.6 ± 6.0	36.1 ± 3.2	15.1 ± 5.4
10mM sodium citrate	32.6 ± 4.5	20.1 ± 3.1	19.4 ± 2.9	6.1 ± 5.9
5mM sodium citrate	29.1 ± 2.6	16.5 ± 4.1	17.6 ± 2.3	14.2 ± 4.1
20% SDS	106.4 ± 0.3
Normal saline	28.0 ± 2.1
원숭이 섬유아세포 (COS-7 세포주)에 대한 세포독성
pH	3	4	5	6
100mM sodium citrate	96.2 ± 0.5	72.0 ± 2.5	49.1 ± 1.7	36.6 ± 2.5
50mM sodium citrate	43.1 ± 3.4	26.6 ± 1.6	6.8 ± 11.3	14.9 ± 4.1
10mM sodium citrate	15.7 ± 3.0	15.6 ± 3.1	14.6 ± 1.5	13.7 ± 3.2
5mM sodium citrate	6.7 ± 4.6	7.9 ± 7.5	2.9 ± 3.6	13.0 ± 2.8
20% SDS	91.7 ± 0.2
Normal saline	9.9 ± 2.9

상기 표 3에 표시된 측정치 data는 각각의 조건의 완충액들의 세포독성 실험결과(세포사멸 %)를 하나의 조건에서 4회 반복 실험한 결과의 평균 ± 표준편차로 나타낸 것이다.

도 3과 표 3을 참조하여 본 발명에 따른 치료용 면역글로불린 제제 제조방법과 이에 사용되는 산성 완충액을 직접 포유동물 세포에 투여한 경우의 세포독성을 비교하여 설명하면 다음과 같다.

실험실 조건(in vitro)에서 96 well culture plate에 배양된 사람 상피세포(A549 세포주, ATCC) 또는 원숭이 섬유아세포(COS-7 세포주)에 4시간 동안 본 발명의 산성 완충액이 포함된 다양한 산성 완충액을 처치한 후 발생되는 세포독성 정도를 % 세포사멸(% cell death)로 표현하여 표 3과 도 3으로 나타낸 것이다.

이때, 본 발명의 산성 완충액이 포함된 다양한 종류의 산성 완충액의 상기한 두 종류의 포유동물 세포들에 대한 직접적인 세포독성의 정도를 측정 분석하기 위해서 배양된 사람 상피세포들(A549 세포주)이 부착된 well 당 세포 배양액 용액 100㎕와 함께 산성 완충액들, 양성대조용액으로 20% SDS 용액, 주사용 생리식염수(normal saline), 혹은 음성대조로 배양액만을 각각 25㎕ 씩 혼합하여 4 시간 동안 처치(즉 반응)시켰으며, 배양된 원숭이 섬유아세포들(COS-7 세포주)이 부착된 well 당 세포 배양액 용액 100㎕와 산성 완충액들, 20% SDS 용액, 주사용 생리식염수(normal saline), 혹은 음성대조로 배양액만을 각각 30㎕ 씩 혼합하여 4 시간 동안 처치(즉 반응) 시켰다. 상기와 같이 다양한 종류의 완충액들을 처치한 이후에 각각의 완충액들에 의한 세포독성의 정도를 % 세포사멸로 표현하였다 (도 3 및 표).

이때, 상기한 여러 종류의 산성 완충액들을 배양된 세포에 처리할 경우 한 가지 조건으로 4 개의 다른 세포배양 well들에 동시에 처리하여 얻은 실험 결과들(quadruplicated data)을 얻은 후에 각각의 조건들에 의한 세포독성의 평균값들간에 통계적으로 의미 있는 차이가 있는지를 비교 분석하였다(t-test).

사람 상피세포에 대한 본 발명의 산성 완충액에 의한 세포 독성실험에서 표 3과 도 3에서 표시(*)된 바와 같이 pH 3에서 6의 5mM sodium citrate, 10mM sodium citrate, 50 mM sodium citrate 용액만을 배양된 사람 상피세포에 처치한 경우는 pH 3에서 6의 100mM sodium citrate에 비해서 유의하게 낮은 세포독성을 보임을 확인할 수 있었다 (t-test, *p <0.05 compared to 100mM sodium citrate).

상기한 실시양태 3의 실험결과들에 의해서 본 발명의 치료용 면역글로불린 제제 제조용 산성 완충액들은 기존의 면역글로불린 흡착레진으로부터 면역글로불린을 용출하여 분리하기 위해서 사용되는 100mM sodium citrate 용액에 비해서 포유동물세포에 대한 세포독성이 유의하게 낮은 안전한 산성 완충액임을 확인할 수 있었다.

또한, 상기한 사람 상피세포에 대한 세포독성 실험에서 표3 및 도 3(A)에 표시(†)된 바와 같이 pH 3에서 6의 100mM sodium citrate 용액과 pH 3에서 5의 50mM sodium citrate 용액은 음성대조인 생리식염수에 비해서 통계적으로 유의하게 높은 세포독성을 보이지만 (t-test, †p < 0.05 compared to saline), pH 3에서 6의 5mM sodium citrate 용액 혹은 10mM sodium citrate 용액과 pH 6의 50mM sodium citrate 용액의 경우는 음성대조인 생리식염수에 비교해서 세포독성 정도가 유의한 차이가 없거나 (t-test, p > 0.05) 더 낮은 세포독성(t-test, †p < 0.05)을 보여서 포유동물세포에 대한 세포독성이 매우 적음을 확인할 수 있었다.

또한, 원숭이 섬유아세포에 대한 본 발명의 산성 완충액에 의한 세포 독성실험에서 표 3 및 도 3에서 표시(*)된 바와 같이 pH 3에서 6의 5mM에서 50mM sodium citrate 용액들을 배양된 섬유아세포에 처치한 경우는 pH 3에서 6의 100mM sodium citrate 용액들에 비해서 유의하게 낮은 세포독성을 보임을 확인할 수 있었다 (t-test, *p <0.05 compared to 100mM sodium citrate).

또한, 상기한 원숭이 섬유아세포에 대한 독성 실험에서 도 3에서 표시(†)된 바와 같이 pH 3에서 6의 100mM sodium citrate 용액과 pH 3에서 4의 50mM sodium citrate는 음성대조인 생리식염수에 비해서 통계적으로 유의하게 높은 세포독성을 보이지만 (t-test, †p <0.05 compared to saline), pH 3에서 6의 5mM에서 10mM sodium citrate 용액들, 혹은 pH 5에서 6의 50mM sodium citrate 용액들의 경우는 음성대조인 생리식염수에 비교해서 세포독성 정도가 유의한 차이가 없어서 (t-test, p > 0.05 compared to saline) 포유동물세포에 대한 세포독성이 매우 적음을 확인할 수 있었다.

즉, 상기한 실시양태 3의 실험결과들에 의해서 본 발명의 치료용 면역글로불린 제제 제조용 산성 완충액은 포유동물 세포들에 대한 세포독성의 정도가, 기존의 통상적인 제조방법에서 면역글로불린 흡착 레진으로부터 면역글로불린 단백질 용출을 위해서 사용되었던 기존의 산성 완충액에 비해서 현저하게 낮은 세포독성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

또한, 상기한 실시양태 3의 실험결과들에 의해서 본 발명의 치료용 면역글로불린 제제 제조용 산성 완충액들은 생리식염수와 유의한 차이가 없을 정도로 포유동물세포에 대해서 독성이 매우 낮은 안전한 산성 완충액임을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 산성 완충액을 사용하여 면역글로불린 흡착 레진에 부착된 면역글로불린을 직접 용출시켜서 치료용 면역글로불린 제제로 제조하여 사용할 경우 면역글로불린 단백질 자체가 가지는 산성도에 대한 중화작용(이러한 작용은 본 발명의 실시양태의 표 1에서 확인됨)을 고려하였을 때에 실제로 상기 산성 완충액으로 면역글로불린 흡착레진으로부터 용출되어 제조된 치료용 면역글로불린 제제 조성물의 산성도는 본 발명의 실시양태 1과 실시양태 4에서 표시된 바와 같이 산도가 좀 더 알칼리성에 더 가깝게 조성이 될 것이 명확하며, 실제로 포유동물에 비 경구 경로로 투여하였을 때에 기존에 동일 목적으로 사용된 산성 완충액에 비해서 포유동물세포에 대한 독성이 적어서 안전성이 더욱 뛰어날 것임이 명확하다.

이러한 본 발명의 산성 완충액이 포유동물세포들에 대한 독성이 적다는 안전성으로 인한 장점은 현재의 치료용 면역글로불린 제조과정의 단계를 단축시켜서 치료용 면역글로불린 제제 제조에 필요한 시간, 노력과 비용을 감소시켜 관련 산업의 발전에 기여할 수 있다고 판단된다.

실시양태 4: 치료용 면역글로불린 제제 제조를 위한 흡착크로마토그래피 과정에 사용되는 본 발명의 산성 완충액의 sodium citrate 농도와 산도( pH )의 변화에 따른 면역글로불린 회수효율의 변화분석

본 발명에 따른 치료용 면역글로불린 제제 제조방법에 의해서 치료용 면역글로불린 제제를 제조하는 과정에서 사용되는 산성 완충액의 sodium citrate의 농도와 pH 범위에 따라서 사람의 혈장으로부터 Protein A를 이용한 흡착크로마토그래피로 분리된 면역글로불린 단백질 총량(mg)을 측정하여 비교분석한 결과를 도 4 및 표 4에 나타냈다.

도 4 및 표 4의 결과는 4회 반복 실험한 결과의 평균 (± 표준편차) 값이며, * 표식은 양성대조인 100mM sodium citrate 완충액에 의한 면역글로불린 단백질 회수량의 평균치와 동일한 산도를 가진 특정 농도의 sodium citrate 완충액에 의한 면역글로불린 단백질 회수량의 평균치가 통계적으로 유의한 차이를 보이는 경우를 표시한 것이다(t-test, p<0.05). 또한 표 4에서는 치료용 면역글로불린 제제들의 최종 pH 값을 괄호 안에 표시하였다.

pH	2	3	4	5
100mM sodium citrate	7.31 ± 0.21 (pH 2.6)	7.34 ± 0.14 (pH 4.6)	3.98 ± 0.12 (pH 4.9)	1.53 ± 0.07 (pH 5.8)
50mM sodium citrate	7.57 ± 0.05 (pH 5.0)	7.51 ± 0.26 (pH 5.4)	3.61 ± 0.15 (pH 5.5)	1.00 ± 0.05 (pH 5.3)
10mM sodium citrate	7.69 ± 0.21 (pH 4.7)	7.94 ± 0.26 (pH 5.4)	3.64 ± 0.12 (pH 6.0)	0.43 ± 0.06 (pH 5.9)
5mM sodium citrate	7.69 ± 0.29 (pH 4.6)	7.45 ± 0.06 (pH 5.5)	3.90 ± 0.12 (pH 6.1)	0.35 ± 0.03 (pH 6.3)

도 4와 표 4를 참조하여 본 발명에 따른 치료용 면역글로불린 제제 제조방법과 이에 사용되는 산성 완충액의 종류 (다양한 sodium citrate 농도와 pH 범위) 그리고 이를 이용하여 제조된 면역글로불린 단백질 회수량(mg)들을 기존의 면역글로불린 제제 제조방법과 비교하여 설명하면 다음과 같다.

1) 사람의 혈장 80㎖을 Protein A 레진 (Protein A coupled silica bead) 13㎖에 접촉시켜서 혈장 안에 존재하는 면역글로불린 단백질과 Protein A레진에 흡착시킴. 2) 혈장과 접촉하여 상기 면역글로불린 단백질을 흡착시킨 Protein A 레진에 주사용 생리식염수( normal saline, 0.9% NaCl solution)을 충분한 양을 통과시켜서 Protein A레진에 면역글로불린 단백질 이외에 비 특이적으로 흡착된 다른 물질들을 세척해서 제거함. 3) 상기 면역글로불린 단백질이 흡착된 Protein A레진을 0.2㎖씩 분주하여 하단에 mesh가 장착되어 레진이 빠지지 않도록 된 구조를 가진 plastic mini-column (Bio-rad, U.S.A.)에 넣은 후에 상기 Protein A 레진으로부터 면역글로불린 단백질을 용출시키기 위해서 산성 완충용액으로 10OmM sodium citrate (pH 2, pH 3, pH 4, pH 5) 용액, 50mM sodium citrate (pH 2, pH 3, pH 4, pH 5), 10mM sodium citrate (pH 2, pH 3, pH 4, pH 5), 5mM sodium citrate (pH 2, pH 3, pH 4, pH 5)를 1㎖과 10분 동안 반응시킨 후에 column하부로 배출시켜서 배출된 산성 완충액 1㎖을 회수하였다. 4) 상기에서 회수한 산성 완충액에 포함된 면역글로불린 단백질의 농도를 bradford 방법으로 정량하고, 각각의 산성 완충액들에 의해서 용출된 면역글로불린 단백질 총량(mg)들을 비교분석하였다.

각각의 산성 완충액을 이용하여 회수한 면역글로불린 단백질 총량(mg)을 비교한 결과 pH 2, pH 3의 10mM의 sodium citrate 용액으로 용출한 경우의 면역글로불린 단백질 회수량의 평균치가 pH 2 혹은 pH 3의 100mM sodium citrate 용액에 의해서 용출한 경우의 면역글로불린 단백질 회수량의 평균치에 비해서 통계적으로 유의하게 높음을 확인하여 본 발명의 산성 완충액을 이용한 면역글로불린 단백질 회수량이 기존에 면역글로불린 단백질의 용출을 위해서 통상적으로 사용되어온 100mM sodium citrate 용액에 의한 면역글로불린 단백질 회수량에 비해서 더 높음을 확인할 수 있었다(표 4, 도 4, t-test, p < 0.05).

이에 따라서 발명자들은 기존에 Protein A 흡착 크로마토그래피에서 Protein A레진으로부터 면역글로불린 단백질을 용출하기 위해서 사용되어 왔던 산성 완충액인 100mM sodium citrate 용액에 포함된 sodium citrate의 농도를 5mM에서 50mM 범위로 감소시키고 pH 값을 2에서 5 사이의 범위로 변화시켜도 기존의 산성 완충용액과 비교하여 의미 있는 차이가 없거나 혹은 더 많은 양의 면역글로불린 단백질을 Protein A 레진도 4와 표 4를 참조하여 본 발명에 따른 치료용 면역글로불린 제제 제조방법과 이에 사용되는 산성 완충액의 종류 (다양한 sodium citrate 농도와 pH 범위) 그리고 이를 이용하여 제조된 면역글로불린 단백질 회수량(mg)들을 기존의 면역글로불린 제제 제조방법과 비교하여 설명하면 다음과 같다.

1) 사람의 혈장 80㎖을 Protein A 레진 (Protein A coupled silica bead) 13㎖에 접촉시켜서 혈장 안에 존재하는 면역글로불린 단백질과 Protein A레진에 흡착시킴. 2) 혈장과 접촉하여 상기 면역글로불린 단백질을 흡착시킨 Protein A 레진에 주사용 생리식염수( normal saline, 0.9% NaCl solution)을 충분한 양을 통과시켜서 Protein A레진에서 면역글로불린 단백질 이외에 비 특이적으로 흡착된 다른 물질들을 세척해서 제거함. 3) 상기 면역글로불린 단백질이 흡착된 Protein A레진을 0.2㎖씩 분주하여 하단에 mesh가 장착되어 레진이 빠지지 않도록 된 구조를 가진 plastic mini-column (Bio-rad, U.S.A.)에 넣은 후에 상기 Protein A 레진으로부터 면역글로불린 단백질을 용출시키기 위해서 산성 완충용액으로 10OmM sodium citrate (pH 2, pH 3, pH 4, pH 5) 용액, 50mM sodium citrate (pH 2, pH 3, pH 4, pH 5) 용액, 10mM sodium citrate (pH 2, pH 3, pH 4, pH 5) 용액, 5mM sodium citrate (pH 2, pH 3, pH 4, pH 5) 용액 각각 1㎖과 10분 동안 반응시킨 후에 column하부로 배출시켜서 배출된 산성 완충액 1㎖을 회수하였다. 4) 상기에서 회수한 산성 완충액에 포함된 면역글로불린 단백질의 농도를 bradford 방법으로 정량하고, 각각의 산성 완충액들에 의해서 용출된 면역글로불린 단백질 총량(mg)들을 비교분석하였다.

각각의 산성 완충액을 이용하여 회수한 면역글로불린 단백질 총량(mg)을 비교한 결과 pH 2, pH 3의 10mM의 sodium citrate 용액으로 용출한 경우의 면역글로불린 단백질 회수량의 평균치가 pH 2 혹은 pH 3의 100mM sodium citrate 용액에 의해서 용출한 경우의 면역글로불린 단백질 회수량의 평균치에 비해서 통계적으로 유의하게 높음을 확인하여 본 발명의 산성 완충액을 이용한 면역글로불린 단백질 회수량이 기존에 면역글로불린 단백질의 용출을 위해서 통상적으로 사용되어온 100mM sodium citrate 용액에 의한 면역글로불린 단백질 회수량에 비해서 더 높음을 확인할 수 있었다(표 4, 도 4, t-test, p < 0.05).

이에 따라서 발명자들은 기존에 Protein A 흡착 크로마토그래피에서 Protein A레진으로부터 면역글로불린 단백질을 용출하기 위해서 사용되어 왔던 산성 완충액인 100mM sodium citrate 용액에 포함된 sodium citrate의 농도를 5mM에서 50mM 범위로 감소시키고 pH 값을 2에서 5 사이의 범위로 변화시켜도 기존의 산성 완충용액과 비교하여 의미 있는 차이가 없거나 혹은 더 많은 양의 면역글로불린 단백질을 Protein A 레진으로부터 용출시켜 치료용 면역글로불린 제제를 얻을 수 있음을 확인하였다.

또한, 상기한 본 발명의 pH 2에서 pH 5 사이의 5mM에서 50mM사이의 sodium citrate 완충액으로 용출시킨 면역글로불린 단백질 용액, 즉 본 발명의 치료용 면역글로불린 제제의 pH 값이 4.6 - 6.3 사이의 값을 나타내었다(상기 표 4 참조). 이러한 pH 값은 면역글로불린 G의 응집이 일어나기 쉽다고 알려진 pH 값(즉 isoelectric point 값; 약자로 PI값; 즉 특정 단백질의 전하가 중성이 되는 pH 값)인 6.4 - 9.0 값보다 낮아 면역글로불린 단백질이 용액상태에서 응집 없이 안정되게 존재할 수 있는 산성도 값에 해당하여 치료용 면역글로불린 제제를 이루는 용액으로서 가장 적절한 pH 범위에 해당하였다.

실시양태 5: 본 발명의 치료용 면역글로불린 제제의 저온 보관 시의 단백질의 안정성 분석

본 발명에 의하여 제조된 액상의 치료용 면역글로불린 제제의 장기간의 안정적인 보관을 위해서 가장 많이 사용되는 저온 보관 시의 온도 변화에 따른 단백질의 안정성을 확인하기 위해서 상기한 실시양태 4에서 각각의 조건의 산성 완충액을 이용하여 제조된 치료용 면역글로불린 제제를 16시간 동안 -20℃에서 냉동 보관하였다가 실온에서 해동한 후에 원심분리한 상층액에서 단백질 농도와 총량(mg)를 정량하여 상기한 산성 완충액을 이용하여 면역글로불린 흡착 레진으로부터 분리 제조한 치료용 면역글로불린 제제를 당일에 원심분리한 상층액에서 측정한 면역글로불린 단백질 농도 및 총량(mg)과 비교하여 면역글로불린 단백질의 보존 정도를 비교분석한 결과를 도 5 및 표 5에 나타냈다. 상기한 방법에서 원심분리는 실온에서 9,700g로 10분 동안 시행하였다.

도 5는 각각의 조건마다 4회 반복 실험한 결과의 평균± 표준편차 값을 bar 그래프로 표시한 결과이며, * 표식은 양성대조인 100mM sodium citrate 완충액에 의해서 용출된 후에 보관된 면역글로불린 단백질 용액의 단백질 보존율(냉동 전과 비교해서 해동 후에 원심분리 상층액에 존재하는 단백질 총량의 비율%)의 평균치와 비교하여 특정 농도의 sodium citrate 완충액에 의해서 용출된 후에 보관된 면역글로불린 단백질 용액의 단백질 보존율의 평균치가 유의한 차이를 보이는 경우를 표시한 것이다(t-test, p<0.05). 또한, 표 5의 경우도 각각의 조건의 면역글로불린이 포함된 산성완충액을 최초로 분리한 직후와 16시간 -20℃ 냉동고에 얼려서 보관 후 실온에서 해동한 후에 원심분리한 상층액에 존재하는 면역글로불린의 단백질 양을 4번 반복 측정한 결과 값을 평균± 표준편차로 나타낸 것이다.

pH	염의 농도	회수된 면역글로불린 단백질량 (mg)		냉동과 해동 후의 단백질 회수율(%)
		최초 분리 직후	16시간 -20℃냉동 후 실온에서 해동한 경우
2	100mM sodium citrate	7.31 ± 0.21	5.80 ± 0.20	79.3 ± 1.7
	50mM sodium citrate	7.57 ± 0.05	7.86 ± 0.18	103.8 ± 3.0
	10mM sodium citrate	7.69 ± 0.21	7.68 ± 0.45	99.9 ± 6.9
	5mM sodium citrate	7.69 ± 0.29	7.51 ± 0.36	97.8 ± 7.1
3	100mM sodium citrate	7.34 ± 0.14	6.81 ± 0.07	92.8 ± 1.2
	50mM sodium citrate	7.51 ± 0.26	7.51 ± 0.24	100.1 ± 4.9
	10mM sodium citrate	7.94 ± 0.26	7.58 ± 0.35	95.5 ± 4.9
	5mM sodium citrate	7.45 ± 0.06	6.30 ± 0.35	84.6 ± 4.5
4	100mM sodium citrate	3.98 ± 0.12	3.95 ± 0.12	99.5 ± 5.6
	50mM sodium citrate	3.61 ± 0.15	3.64 ± 0.06	101.1 ± 5.1
	10mM sodium citrate	3.64 ± 0.12	3.62 ± 0.21	99.3 ± 4.3
	5mM sodium citrate	3.90 ± 0.12	3.25 ± 0.05	83.5 ± 3.6
5	100mM sodium citrate	1.53 ± 0.07	1.46 ± 0.07	95.5 ± 5.5
	50mM sodium citrate	1.00 ± 0.05	1.16 ± 0.06	116.2 ± 10.9
	10mM sodium citrate	0.43 ± 0.06	0.30 ± 0.01	70.5 ± 10.0
	5mM sodium citrate	0.35 ± 0.03	0.31 ± 0.07	90.3 ± 14.5

도 5와 표 5에서와 같이 분석한 결과 pH 2의 100mM sodium citrate 용액으로 용출한 후에 냉동 보관 후 해동된 치료용 면역글로불린 제제에 비해서 본 발명의 산성 완충액에 해당하는 pH 2의 5mM, 10mM, 혹은 50mM Sodium citrate용액으로 용출한 후 냉동 보관한 후 해동된 치료용 면역글로불린 제제의 면역글로불린 단백질 보존율의 평균치가 유의하게 더 높았다(표 5, 도 5; t-test, p<0.05).

또한, pH 3의 100mM sodium citrate용액으로 용출한 후에 냉동 보관 후 해동된 치료용 면역글로불린 제제에 비해서 본 발명의 산성 완충액에 해당하는 pH 3의 50mM Sodium citrate용액으로 용출한 후 냉동 보관한 후 해동한 치료용 면역글로불린 제제의 면역글로불린 단백질 보존율의 평균치가 유의하게 더 높았다(표 5, 도 5; t-test, p<0.05). 즉, 치료용 면역글로불린 제제를 제조 시에 제제 내에 염도가 너무 높을 경우 면역글로불린 단백질의 보존율이 감소할 수 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 100mM sodium citrate라는 염의 농도가 면역글로불린 단백질을 보존하기에는 너무 높아서 용액상태에 존재하는 면역글로불린 단백질의 응집현상 (protein aggregation 혹은 polymer 형성)을 유도하여 원심분리 상층액에 존재하는 수용성의 면역글로불린 단백질(monomer 상태를 포함)의 양이 감소해서 이러한 현상이 발생하였다고 판단된다.

상기한 실시양태 4와 실시양태 5에서의 분석결과 기존의 산성 완충액인 100mM sodium citrate, pH 3.0 용액으로 용출된 면역글로불린 단백질 용액보다도 본 발명의 pH 2에서 pH 5 범위의 5mM에서 50mM의 sodium citrate 산성 완충액이 사람의 혈장으로부터 치료용 면역글로불린 단백질을 분리하여 제조하는 데 있어서 면역글로불린 단백질의 회수율 측면과 저온에서 보존하는 경우에 단백질 보존율의 측면에서 더욱 우수함을 확인할 수 있었다.

상술한 실시양태들에서 Protein A를 이용한 흡착크로마토그래피 방법을 이용한 면역글로불린 흡착 크로마토그래피 방법을 예로 들어 설명하였지만 프로테인 G, 프로테인 L, 면역글로불린을 흡착할 수 있는 항-면역글로불린 항체 단백질, 이온교환수지(음이온 수지, 양이온 수지), 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite), 항원-특이 면역글로불린이 흡착되거나 반응할 수 있는 항원-단백질, 알레르겐, 디에틸아미노에틸, 디에틸아민 또는 쿼터러니 암모늄 등 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려져 있는 면역글로불린 흡착 방식은 어떠한 것을 사용한 경우도 본 발명에 따른 산성 완충액을 이용하는 경우 최종적으로 면역글로불린을 면역글로불린 흡착 레진으로부터 용출시키는 원리가 동일하고 그에 의해 달성되는 효과 또한 동일하기 때문에 본 발명의 보호범위 속하는 것은 당연하다.

상술한 바와 같은 내용을 통하여 알 수 있듯이, 본 발명은 면역글로불린 흡착 레진으로부터 하나의 단계로 면역글로불린 단백질을 용출시켜서 포유동물에 비 경구 투여가 가능한 치료용 면역글로불린 제제를 제조할 수 있도록 1) 적정한 면역글로불린 단백질 회수율을 가지면서, 2) 포유동물에게 비 경구 경로로 투여 시에 포유동물 세포에 대한 독성이 최소화되고, 3) 보관 시에 온도 변화에 따른 면역글로불린 단백질의 손실을 최소화할 수 있는 3가지 조건들을 적절하게 만족시키는 치료용 면역글로불린 제제를 제조하기 위한 산성 완충액의 조건을 찾았으며, 이를 통해서 본 발명의 치료용 면역글로불린 제제 제조방법과 이를 이용하여 제조된 치료용 면역글로불린 제제를 완성하였다.

한편, 본 발명의 실시양태에서는 사람의 혈장으로부터 면역글로불린 단백질을 흡착크로마토그래피로 채취하는 것에 대해서 설명하였지만, 이는 하나의 실시양태를 나타내기 위한 것으로, 본 발명은 치료를 위한 사람 본인의 자가 혈액뿐만 아니라, 다른 사람의 혈액 또는 다른 포유동물의 혈액으로부터도 치료용 면역글로불린 단백질을 얻을 수도 있다. 또한, 유전자재조합법을 이용하여 면역글로불린 유전자를 주입한 세균, 효모, 바이러스, 포유동물세포로부터 생산된 면역글로불린 단백질이 포함된 배양액으로부터 치료용 면역글로불린 단백질 제제를 제조하는 과정에도 본 발명이 사용될 수 있다. 또한, 본 발명을 이용하여 알레르기질환, 자가면역질환, 만성염증성 질환, 감염성 질환, 악성 질환 등의 질환들을 앓고 있거나 또는 상기한 질환들로부터 회복되어 면역력을 획득한 인간 또는 포유동물의 혈액으로부터 기존의 방법보다 쉽고 간단하게 치료용 면역글로불린 제제를 제조할 수 있다.

Claims (12)

1. 면역글로불린 흡착 레진으로부터 면역글로불린 단백질을 용출시키기 위한 목적으로 사용되는 산성의 5mM에서 50mM의 sodium citrate 용액으로 이루어진 것을 특징으로 하는 치료용 면역글로불린 제제 제조에 사용되는 산성 완충액.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 산성 완충액은 산도(pH)가 2.0에서 5.0인 것을 특징으로 하는 치료용 면역글로불린 제제 제조에 사용되는 산성 완충액.
3. ⅰ) 면역글로불린 흡착 레진에 포유동물의 혈장 혹은 면역글로불린 단백질이 포함된 세포배양액을 접촉시켜 면역글로불린 흡착 레진에 면역글로불린 단백질을 흡착시키는 흡착단계;
   ⅱ) 상기 흡착단계가 종료된 후 면역글로불린 흡착 레진으로 세척액을 통과시켜 면역글로불린 흡착 레진에 흡착된 면역글로불린 단백질 이외의 다른 물질들을 세척하여 제거시키는 세척단계;
   ⅲ) 상기 세척단계가 종료된 후 면역글로불린 흡착 레진으로 5mM에서 50mM의 sodium citrate 용액으로 이루어진 산성 완충액을 통과시켜서 면역글로불린 흡착 레진에 흡착된 면역글로불린 단백질을 용출시켜 면역글로불린 제제를 제조하는 단계를 포함하는 치료용 면역글로불린 제제의 제조방법.
4. 제 3항에 있어서,
   상기 산성 완충액의 산도(pH)가 2.0에서 5.0인 것을 특징으로 하는 치료용 면역글로불린 제제 제조방법.
5. 제 3항에 있어서,
   상기 치료용 면역글로불린 제제 제조방법의 면역글로불린 단백질이 immunoglobulin G 인 것을 특징으로 하는 치료용 면역글로불린 제제 제조방법.
6. 제 3항에 있어서,
   상기 면역글로불린 흡착 레진이 면역글로불린을 흡착하는 흡착물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 치료용 면역글로불린 제제 제조방법.
7. 제 6항에 있어서,
   상기 흡착물질이 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 L, 면역글로불린을 흡착할 수 있는 항-면역글로불린 항체 단백질, 이온교환수지(음이온 수지, 양이온 수지), 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite), 항원-특이 면역글로불린이 흡착되거나 반응할 수 있는 항원-단백질, 알레르겐, 디에틸아미노에틸, 디에틸아민 또는 쿼터러니 암모늄 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 치료용 면역글로불린 제제 제조방법.
8. 제 7항에 있어서,
   상기 흡착물질이 아가로스(agarose), 셀룰로오스(cellulose), 아크릴아마이드, 실리카 (silica), 비드(bead), 글래스(glass) 중 어느 하나에 부착된 상태로 존재하는 것을 특징으로 하는 치료용 면역글로불린 제제 제조방법.
9. 제 3항에 있어서,
   상기 치료용 면역글로불린 제제의 구성성분으로 면역글로불린 단백질과 5mM에서 50mM의 sodium citrate용액으로 이루어지며 최종 산도(pH)가 3.9에서 6.3인 것을 특징으로 하는 치료용 면역글로불린 제제인 제조방법.
10. 면역글로불린 단백질과 5mM에서 50mM의 sodium citrate 용액을 포함하는 치료용 면역글로불린 제제.
11. 제 10항에 있어서,
    상기 제제의 산도(pH)가 3.9에서 6.3인 것을 특징으로 하는 치료용 면역글로불린 제제.
12. 제 10항 또는 제 11항에 있어서,
    상기 면역글로불린 단백질의 농도가 1mg/㎖에서 50mg/㎖인 것을 특징으로 하는 치료용 면역글로불린 제제.

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