RO117921B1

RO117921B1 - Procedeu pentru obtinerea unui preparat imunoglobulinic cu titru ridicat

Info

Publication number: RO117921B1
Application number: RO96-01839A
Authority: RO
Inventors: Hanspeter Amstutz; Peter G Lerch; Jean Jacques Morgenthaler
Original assignee: Rotkreuzstiftung Zentrallab
Priority date: 1995-09-22
Filing date: 1996-09-19
Publication date: 2002-09-30
Also published as: ES2170788T3; JP2952572B2; BR9603826A; HU9602570D0; NO963952L; AU6572596A; KR100236762B1; HUP9602570A2; DE59509979D1; KR970015745A; AU715427B2; EP0764658B1; JPH09124508A; PL316126A1; FI963719A0; CZ274896A3; CN1089609C; NO963952D0; CZ286885B6; HUP9602570A3

Abstract

Inventia descrie un procedeu pentru obtinerea unui preparat imunoglobulinic cu titru ridicat, din fractiuni de plasma sanguina, nevalorificate in procedeele conventionale cunoscute, folosind tehnica cromatografiei de afinitate.

Description

Invenția se referă la un procedeu pentru obținerea unui preparat imunoglobulinic cu titru ridicat, cu aplicabilitate în industria produselor terapeutice.

Este știut că, în plasma de sânge uman, se găsesc peste o sută de proteine diferite. Unele din ele se pot purifica din rezervele de plasmă ale donatorilor, prin fracționare, și se pot folosi ca produse terapeutice. Se cunosc următoarele exemple: albumina se folosește la echilibrarea unui deficit oncotic la hipoproteinemie sau la hipovolemie. Factorul de coagulare a sângelui VIII, respectiv IX, se administrează în profilaxia și terapia de sângerări la hemofilia A, respectiv B. Imunoglobulinele se aplică la boli cu lipsă de anticorpi, pentru profilaxia și terapia infecțiilor precum și la purpură idiopatică trombocitopenică. Imunoglobulinele de la donatori selectați cu titru ridicat în imunoglobuline specifice se folosesc ca preparate de hiperimunoglobulină, pentru profilaxia și tratarea infecțiilor specifice, cum ar fi, de exemplu, hepatita A sau B.

Sunt cunoscute metode de fracționare cu etanol, pentru izolarea proteinei plasmatice, utilizabile terapeutic (Cohn, E.G., și colab. J. Am. Chem. Soc. 68, 459, 1946, precum și Kistler P. și Nitschmann H, Vox. Sang., 74141962). Cu ajutorul ambelor procedee, se pot izola cantități mari de proteine funcționale din plasmă, cum ar fi albumina sau imunoglobulina, care se pot folosi clinic în formulări adecvate, aducând mari foloase. Dar la prelucrarea conform acestor metode, se formează precipitate, respectiv, supernatanți, care nu pot fi folosiți la prelucrarea convențională. Compoziția acestor fracțiuni este foarte diversă.

Pe când, de exemplu, se poate găsi apolipoproteină umană A-1 (Apo A-1) la precipitarea plasmei de sânge cu etanol 19% la o valoare pH de 5,8 în părți aproximativ egale în supernatantul a (cca 50% din plasma-ApoA-1) și în precipitatul A (circa 40%), aceeași proteină se găsește în treptele următoare de fracționare, după Kistler și Nitschmann, apoi în acele fracțiuni care nu s-au utilizat comercial până acum: precipitatul IV și precipitatul B (câte circa 40%) ((Lerch și colab., Protides of the Biologica! Fluids, 38, 409, 1989).

Un model de repartiție, asemănător, rezultă la proteina de transport a cuprului, caeruloplasmina. După fracționare, se găsește 20% din materialul inițial în precipitatul IV și 40% în precipitatul B.

Transferrina este un exemplu pentru o proteină din plasmă, care se îmbogățește până la, practic, 100% și în precipitatul IV, pe când albumina se îmbogățește până la 80% în precipitatul C folosit azi.

Imunoglobulinele se pot obține, prin fracționarea Kistler-Nitschmann sau cu cea a lui Cohn, la 50-60% în precipitatul GG. Restul de 30-40% se repartizează conform acestor procedee între precipitatul IV (5%), precipitatul B (30%) și filtratul GG (5%).

Cifrele procentuale menționate mai sus au drept scop ilustrarea ordinului de mărime al repartiției și nu trebuie înțelese ca o limitare; ele sunt variabile, în funcție de condițiile și metodele utilizate.

Aceste exemple arată că, parțial, cantități însemnate de proteine utile din punct de vedere terapeutic se pot găsi în fracțiunile de precipitat IV, precipitat B, supernatant c și supernatant GG sau în fracțiunile corespunzătoare ale fracționării plasmei, după Cohn (Fracțiunea IV-1, fracțiunea II + III, supernatantul V și supernatantul 11-1,2). Din motive etice, dar și din cauza lipsei, la nivel mondial, a plasmei din sânge și a anumitor componente ale plasmei, trebuie să se caute o îmbunătățire a randamentului actual, în imunoglobuline. care nu este destul de mare în prezent.

Este cunoscut că imunoglobulinele joacă un rol primordial în apărarea împotriva infecțiilor. Fie că anticorpii neutralizanți, specifici virușilor, blochează adsorbția virușilor pe receptorii celulari și împiedică, în acest fel, producerea unei infecții, fie că anticorpii specifici bacteriilor se opun excitanților și dau posibilitatea eliminării lor și omorârii lor prin neutrofili și macrofagi.

RO 117921 Β1

Rezervele de plasmă de la mai multe mii de donatori conțin imunoglobuline de diferite spe- 50 cificități, iar preparatele de imunoglobuline din astfel de rezerve conțin, ca urmare, și titruri măsurabile în imunoglobuline, care sunt îndreptate împotriva epitopilor de viruși, bacterii, toxine, dar și împotriva autoantigenilor. De aceea aceste preparate de imunoglobulină sunt eficiente împotriva multor infecții și în cele mai diferite stări patologice. în anumite condiții, este însă de dorit să se folosească un preparat de imunoglobulină cu titru ridicat de anticorpi 55 specifici, un așa-numit preparat de hiperimunoglobulină. Până acum, s-au obținut asemenea preparate cu cheltuială mare și costuri ridicate, din rezerve speciale de plasmă de la donatori, cu titruri ridicate în anticorpi specifici. Acest lucru este legat, din diferite motive, de dificultăți. In cazul în care se găsesc anumite procedee de vaccinare recunoscute, ca la un preparat anti-hepatită B, trebuie ca donatorii să fie vaccinați, aleși și sângele donat să fie 60 prelucrat separat. La multe alte indicații, nu poate avea loc, însă, o imunizare a donatorilor, din motive etice. Numai rar este posibil ca, prin selectarea costisitoare a donatorilor (de exemplu, după trecerea lor printr-o boală specifică) să se obțină sânge cu titru ridicat și prin prelucrarea acestuia să se obțină un preparat.

Problema pe care o rezolvă invenția este de a pune la dispoziție un procedeu care 65 să permită obținerea de preparate valoroase de imunoglobulină din fracțiunile menționate mai sus, valorificate puțin, până acum, din fracțiunile și precipitatele care rezultă la procedeele industriale de fracționare a plasmei, și care se pot izola, devenind accesibile.

Procedeul pentru obținerea unui preparat imunoglobulinic cu titru ridicat, conform invenției, cuprinde: 70

- fracționarea plasmei sanguine dintr-o rezervă de plasmă, pentru separarea a cel puțin unei fracțiuni valorificabile industrial, care conține, în principal, imunoglobulină policlonală G și cel puțin o fracțiune reziduală;

- prepararea unei soluții de proteină din componentele proteice, care sunt conținute în fracțiunea reziduală, obținută, sau în subfracțiuni din aceasta; 75

- purificarea soluției proteice, rezultate cel puțin o dată prin cromatografie de afinitate cu liganzi imobilizați, aleși dintre cel puțin un tip de liganzi, care leagă proteinele specifice din plasmă, care se desprind apoi și constituie componente active într-un preparat imunoglobulinic, cu titru ridicat.

Prin aplicarea invenției, se obțin următoarele avantaje: 80

- se obțin preparate de hiperimunoglobuline cu activități specifice mult mai ridicate decât ale celor obținute prin metodele clasice;

- se obțin preparate hiperimunoglobulinice, care pot fi ușor prelucrate, în vederea utilizării lor în vaccinuri;

- se valorifică fracțiuni reziduale de plasmă sanguină. 85

- se creează posibilitatea aplicării metodelor de purificare prin cromatografie de afinitate.

în procedeul conform invenției, se prelucrează, mai întâi, o fracțiune obținută printr-un procedeu de fracționare a plasmei, mai ales o fracțiune reziduală, în așa fel încât ea poate fi utilizată în cromatografia de afinitate. în funcție de sursa fracțiunii, această prelucrare 90 poate fi foarte diferită. Astfel, de exemplu, supernatantul GG poate fi concentrat, dializat față de un tampon adecvat și filtrat. In schimb, precipitatele sau turtele de filtrare (lista de exemple pentru astfel de materiale inițiale este prezentată în tabelele 1 și 2) trebuie să fie, mai întâi, trecute în suspensie, în mod potrivit, adică de exemplu prin variația tăriei ionice, a pH, a temperaturii, prin adaos de detergenți și săruri, în mod controlat, astfel încât imunoglo- 95 bulinele să treacă în soluție. De exemplu, suspensiile se pot limpezi într-un domeniu de pH de 3,0-9,0, la o conductibilitate de 5-20 mS/cm, la 4°C și agitare peste noapte și apoi prin centrifugare și/sau filtrare.

RO 117921 Β1 în această treaptă atât supernatanții, cât și suspensiile se pot supune unui procedeu de activare a virusurilor, după metoda solvent/detergent a lui Horowitz (Thrombosis and Haemostatis, 65, 1163, 1991), după metoda cu albastru de metilen (Mohr și colab., Infusionsther. Infusions med. 20, 19/1993/) sau după altă metodă. Imunoglobulinele pot fi supuse după suspendare și unei pre-purificări, prin pre-adsorbție la matricea coloanei sau prin tratarea cu un adjuvant de filtrare sau adsorbant, ca de exemplu, hidroxid de aluminiu, la o cromatografie peste proteină A sau G pentru îmbogățire sau la una sau mai multe precipitări cu metodele uzuale: precipitare cu sulfat de amoniu, polietilenglicoi sau etanol sau combinații ale acestora, pentru îmbogățirea, concentrarea sau sărăcirea în componente nedorite.

Tabelul 1

Exemple pentru materiale inițiale posibile, care rezultă din fracționarea conform Kistler și Nitschmann sau din alte trepte de prelucrare, care se formează la obținerea de produse din plasmă stabile, suportabile i.v.

Supernatanți	Precipitate și reziduuri
Supernatant C Supernatant GG	Precipitat B Precipitat IV Reziduu după tratarea DEAE Reziduu după tratarea cu hidroxid de aluminiu Reziduuri după filtrarea de limpezire l,ll și III

Tabelul 2

Exemple pentru materiale inițiale posibile, care provin din fracționarea după Cohn sau din alte trepte de prelucrare, care se formează la obținerea produselor din plasmă stabile, suportabile i. v.

Supernatanți	Precipitate și reziduuri
Supernatant V Supernatant 11-1,2	Precipitat II + III Precipitat IV-1 Reziduu după tratarea DEAE Reziduu după tratarea cu hidroxid de aluminiu Reziduuri după filtrarea de limpezire I, II și III

în lista care urmează, sunt date exemple de liganzi posibili pentru cromatografie de afinitate, conform invenției: Antigeni determinanți de la

Haemophilus influenza b

Staphylococcus aureus

Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus agalactiae

Staphylococcus pneumoniae

Staphylococcus pyogenes și alte tulpini de bacterii patogene

Tetanus Toxin

Staphylococcus aureus toxic shock Toxin și alte bacterii sau alte toxine patogene,

RO 117921 Β1

Virus de hepatită A

Virus de hepatită B

Virus de hepatită C

Virus de Varicella Zoster

Virus Cytomegalo Respiratory Syncytial Virus Parvovirus B19

Herpes Simplex Virus 1

Herpes Simplex Virus 2 Virus de turbare și alți viruși patogeni

CD2, CD3, CD4,

140

145

150

CD5, CD28, CD40, CD72

ICAM, LFA-1, LFA-3,

AND și alți autoantigeni umani, potențiali.

După ce s-au preparat geluri de afinitate, prin imobilizarea liganzilor modificați sau 155 nemodificați (exemple de astfel de liganzi sunt indicate în lista de mai sus) cu ajutorul unor metode cunoscute, ele se încarcă cu supernatanții și suspensiile preparate sub formă concentrată sau diluată, dacă este necesar chiar și prin aplicarea repetată a scurgerii. Dacă se dorește, se pot încărca diferite geluri de afinitate, în mod succesiv, cu aceleași suspensii.

Gelurile se spală apoi în așa fel, încât să se îndepărteze proteinele de legătură nespecifice 160 în mod preponderent sau într-o măsură suficientă. Acest lucru se poate realiza, de exemplu, prin mărirea concentrației de sare, prin adăugarea unui detergent și/sau prin deplasarea valorii pH în soluția de spălare. Acum proteinele legate se desprind de liganzi, de exemplu prin eluare la pH redus sau ridicat, prin adaos de soluții de sare chaotrope, cum ar fi tiocianatul de sodiu sau clorură de magneziu, agenți denaturanți ca SDS sau uree, solvenți cum 165 ar fi etilenglicol, prin modificarea temperaturii sau prin combinații ale acestor măsuri.

în anumite împrejurări poate fi de dorit ca liganzii care trebuie imobilizați să fie modificați în așa fel, prin mutageneză sau prin metode chimice sau fizice, încât imunoglobulinele să se poată lega chiar la epitopii lor, dar cu afinitate micșorată, astfel încât eluția poate avea loc în condiții mai blânde decât cu liganzi nemodificați. O modificare a liganzilor 170 mai poate avea loc pentru a înlesni imobilizarea lor și/sau prezentarea de epitopi și pentru a o îmbunătăți. Amănunte tehnice și bazele procedeului de cromatografie de afinitate, în general, sunt descrise în Cuatrecasas P. și Anfinsen, C.B. /1971/ Ann. Rev. Biochem. 40, 259; Kull, F.C. and Cuatrecasas. P. /1981/ J. Immun. 126, 1279; Liebing și colab. /1994/ Vox

Sang. 67,177. 175

Imunoglobulinele desprinse, specifice, se prelucrează și printr-o filtrare suplimentară, pentru eliminarea virusurilor, obținându-se un produs final, care se poate aplica, de preferință, i.v., și care este lipsit de pirogeni, sigur împotriva virusurilor și care este stabil, cu sau fără adaos de stabilizatori, cum ar fi albumină, amino acizi sau hidrați de carbon, în formă lichidă sau liofilizată. Dar se mai pot folosi și formulări care dau posibilitatea unei 180 aplicări i.m. sau topice.

Se dau, în continuare, 10 exemple în legătură cu invenția.

Exemplul 1. Se prepară HbsAg-Sefaroză, imobilizând 5 mg antigen de suprafață al virusului hepatitei B (HbsAg, Abbott Diagnostics), prin cuplarea grupelor amino primare la 1 ml CH-sefaroză, conform recomandării furnizorului (Pharmacia Biotech., Uppsala, 185 Suedia). Sefaroza “Placebo” se prepară prin efectuarea aceluiași procedeu de cuplare cu un alt alicot de gel, dar fără adaos de HbsAg. Depozitarea gelurilor finite a avut loc în PBS cu 0,02% NaN₃ la 4°C.

RO 117921 Β1 g de precipitat B de la fracționarea plasmei conform Kistler-Nitschmann (lot NB 4030216) se suspendă în 210 ml acid citric 100 mM, pH 4,0, 0,25% Triton X-100, 10 mM Netil-maleilimidă (NEM), 1mM fluorură de fenilmetilsulfonil 8PMSF), peste noapte la 4°C pe un aparat RotaryMix. După separarea componentelor insolubile prin centrifugare (5000 g, 4°C, 10 min.) și filtrare (mărimea porilor 1,2 pm) se adăugă la pH neutru conform Horowitz și colab. (Thrombosis and Haemostatis, 65, 1163, 1991) 1% tri-n-fosfat de butii (Merk, Darmstadt, Germania) și 1% Triton X-100 și se incubează sub amestecare timp de 4 h. Apoi se efectuează, la 37°C, peste noapte, o separare a fazelor, supernatantul se separă și se filtrează printr-un filtru cu ochiuri de 0,45 pm și se depozitează.

130 ml dintr-o astfel de suspensie NB se diluează cu 280 ml PBS (soluție de sare tamponată cu fosfat: 150 mM NaCI, 10MM fosfat de sodiu, pH 7,1) și se pompează în așa fel, peste coloana Placebo și apoi peste coloana de HbsAg-Sefaroză, încât scurgerea prin coloană să ajungă, din nou, în vasul de rezervă. Viteza de scurgere este de 8 ml/h, timp de 144 h. Suspensia de NB se pompează, în total, de trei ori peste ambele coloane. După 90 h, încărcarea este întreruptă și coloanele sunt spălate, în mod individual, mai întâi cu PBS și apoi cu 200 mM NaCI, 50 mM Tris-HCL pH 7,4, până când soluția de spălare are o densitate optică la 280 nm (OD₂₈₀), care este mai mică decât 0,01. După terminarea încărcării, se spală din nou cu PBS și 200 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI pH 7,4. Proteinele legate se desprind cu 5 ml 200 mM glicină-NaCI pH 2,5, se neutralizează imediat și se prelucrează. Rezultatele se trec în tabelul 3.

Tabelul 3

Cromatografia de afinitate anti-HBsAg cu suspensie NB

Gel	HBsAg	Placebo
încărcarea totală: Proteină IgG Anti-HBsIgG	1775 mg 450 mg 4560 m UI	1775 mg 450 mg 4560 m UI
Trecere: Anti-HBsIgG	1140 m UI	1140 m UI
Eluat: IgG Anti-HBsIgG	0,13 mg 5603 m UI	0,08 mg 114 m UI

Exemplul 2. Se efectuează, pornind de la fracțiunea II + III (în loc de plasmă de sânge ca material inițial) a lui Cohn, o fracționare după Kistler-Nitschmann. 70 g de precipitat B (lot NB 4044488) din această fracționare după Kistler-Nitschmann se suspendă în 210 ml de 100mM acid citric, pH 4,0, 0,25% Triton-X-100,10 mM NEM, 1 mM PMSF, peste noapte, la 4°C pe un aparat RotaryMix. După limpezire și delipidizare parțială prin ultracentrifugare (100'000 g, 3 h, 4°C: faza limpede este preluată prin înțeparea laterală a capilarului cu o canulă) suspensia se filtrează (0,45 pm) și se depozitează, la 4°C.

125 ml din această suspensie NB se diluează cu 375 ml PBS, pH se reglează cu 0,1

M NaOH la 7,1, se filtrează și se pompează cu 14,5 ml/h, în mod analog cu exemplul 1, mai întâi peste gelul Placebo și apoi peste gel de HbsAg-Sefaroză, care se obține, în mod analog cu exemplul 3. Apoi gelurile se spală separat cu PBS și cu 200 mM NaCI, 50 mM frvs-HCI pH 7,4. Proteinele legate se desprind cu 5 ml 200 mM glicină-HCI, pH 2,5. Tabelul 4 prezintă o alcătuire a datelor rezultate.

RO 117921 Β1

235

Tabelul 4

Cromatografia de afinitate anti-HBsAg cu suspensie NB (Cohn ll+lll)

Gel	HBsAg	Placebo
încărcarea totală: Proteină IgG Anti-HBs	1400 mg 619 mg 10 UI	1400 mg 619 mg 10 UI
Trecerea: Anti-HBs IgG	5 UI	5 UI
Eluat: IgG Anti-HBs IgG	0,18 mg 3,3 UI	0,35 mg 0,08 UI

240

245

Exemplul 3. 30 I supernatant GG (lot nr.X95.31.286.1) se diafiltrează în PBS și se concentrează la 500 ml. Corespunzător exemplului 1 concentratul se pompează cu 21 ml/h, timp de 118 h, peste coloana placebo și peste coloana de HbsAg. Spălarea coloanelor și desprinderea proteinei legate are loc tot analog cu exemplul 1, dar se efectuează o treaptă de spălare suplimentară, cu 500 mM NaCI, 50 mM fris-HCI pH=7,4. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 5.

Tabelul 5

250

255

Cromatografia de afinitate antiHBs cu supernatant concentrat CG NG: limita de determinare, de detectare

Gel	HBsAg	Placebo
încărcarea totală: Proteină IgG Anti-HBs IgG	8800 mg 320 mg 5000 UI	8800 mg 320 mg 5000 UI
Trecerea: Anti-HBs IgG	<NG	<NG
Eluat: IgG Anti-HBs IgG	0,05 mg 3035 m UI	0,14 mg 7 m UI

260

265

Exemplul 4. 17,5 g turtă de filtrare DEAE (lot 4.422.006.0) se suspendă în 52,5 ml de tampon de suspensie conform exemplului 1 și se prelucrează 40 ml de suspensie se diluează cu 160 ml de PBS, pH se reglează la 7,1 și apoi se filtrează. Corespunzător exemplului 3, suspensia se pompează cu 21 ml/h, timp de 97 h, prin coloana Placebo și prin coloana HbsAg. Spălarea coloanelor și desprinderea proteinei legate are loc, tot în mod analog cu exemplul 1. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 6.

270

RO 117921 Β1

Tabelul 6

Cromatografia de afinitate anti-HBsAg cu turtă de filtrare DEAE în suspensie

NG: limita de detectare

Gel	HBsAg	Placebo
încărcarea totală: Proteină IgG Anti-HBs IgG	548,0 mg 280 mg 400 m UI	548,0 mg 280 mg 400 m UI
Trecerea: Anti-HBs IgG	<NG	<NG
Eluat: IgG Anti-HBs IgG	0,07 mg 331 m UI	0,11 mg 14 m UI

Exemplul 5. S-a preparat Tetanus Toxoid-C-Sefaroză imobilizând 11,5 mg Tetanus Toxoid (TT), prin cuplarea grupelor carboxi la 1 ml de EAH-Sefaroză (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suedia) cu ajutorul a 0,1 M N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimid-HCL după prescripția furnizorului. Depozitarea gelului finit are loc în PBS, cu 0,02% NaN₃, la 4°C.

Un concentrat din supematantul GG s-a prelucrat analog cu exemplul 3 și se utilizează pentru cromatografia de afinitate cu TT Sefaroză, în mod analog cu exemplul 2. încărcarea are loc cu 23,5 ml/h, timp de 159 h, la 4°C. Rezultatele se prezintă în tabelul 7.

Tabelul 7

Cromatografia de afinitate anti-Tetanus Toxoid cu supernatant GG în concentrat

Gel	Tetanus Toxoid C
încărcarea totală:
Proteină	15000 mg
IgG	320 mg
Anti-TT IgG	36 pg
Trecerea: Anti-TT IgG	16 pg
Eluat:
IgG	0,16 mg
Anti-TT IgG	76 pg

Exemplul 6. Se obține Tetanus Toxoid-N-Sefaroză, imobilizând 11,5 mg Tetanus Toxoid (TT) purificat prin cuplarea grupelor amino primare la 1 ml CH-Sefaroză activată, conform prescripției furnizorului (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suedia). Se obține placeboSefaroză, prin efectuarea aceluiași procedeu de cuplare, cu un alt alicot de gel, dar fără adaos de TT. Depozitarea gelurilor finite are loc în PBS, cu 0,02% NaN₃, la 4°C.

Precipitatul B se suspendă conform exemplului 2. După filtrare (1,2 pm), se diluează

115 ml din această suspensie cu 200 ml PBS, pH se regleazp la 7,1 și se pompează cu

3,5 ml/h timp de 165 h, în așa fel, mai întâi peste Placebo-Sefaroză, încât trecerea să se facă imediat, apoi peste coloana de TT-N-Sefaroză și apoi, din nou, în vasul de rezervă.

RO 117921 Β1

Coloanele se spală separat cu PBS și apoi cu 0,5 M NaCI, 50 m M Tris-HCI pH=7,1, până 320 când OD₂₈₀ al trecerii a fost mai mic deât 0,01. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 8.

Tabelul 8

Cromatografia de afinitate anti-Tetanus Toxoid cu suspensie NB

Gel	Tetanus Toxoid N	Placebo
încărcarea totală: Proteină IgG Anti-TT IgG	1334 mg 333 mg 0,509 pg	1334 mg 333 mg 0,509 pg
Trecerea: Anti-TT IgG	0,213 pg	0,213 pg
Eluat: IgG Anti-TT IgG	0,35 mg 0,091 pg	0,004 mg 0,003 mg

335

Exemplul 7. Precipitatul B se suspendă ca în exemplul 2. După filtrare (1,2 pm), 115 ml din această suspensie se diluează cu 200 ml PBS, pH a fost reglat la 7,1 și se pompează cu 5 ml/h, timp de 165 h, mai întâi peste HbsAg-Sefaroză, încât trecerea să ajungă direct, apoi peste coloana de TT-Sefaroză și apoi, iarăși în recipientul de rezervă. Coloanele se spală separat cu PBS și apoi cu 0,5 M NaCI, 50 mM tr/s-HCI pH 7,1 până când OD₂₈₀ al 340 trecerii este mai mic decât 0,01. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 9.

Tabelul 9

Gel	HBsAg	Tetanus Toxoid
încărcarea totală: Proteină IgG Anti-HBsAg Anti-TT IgG	1334 mg 333 mg 945 UI 0,509 mg	1334 mg 333 mg 945 UI 0,509 pg
Trecerea: Anti-HBsAg Anti-TT IgG	536 UI 0,265 pg	536 UI 0,265 mg
Eluat: IgG Anti-HBsAg Anti-TT IgG	0,13 mg 1152 UI	0,25 mg 0,18 mg

Exemplul 8.15 kg precipitat B din fracționarea după Kistler-Nitschmann (Lot Nr. 5.043.303) se suspendă în 45 I 0,1 M acid citric, pH 4,0, 0,25% Triton X-100, 10 mM NEM, 1 mM PMSF, la 4°C, peste noapte, cu un amestecător vibrator. După separarea compo- 360 nentelor insolubile, prin adaos de agenți ajutători de filtrare și filtrare (mărimea porilor 1,2 pm), se adaugă la pH neutru, pentru delipidizare și inactivarea virusurilor după Horowitz, 1 % t/7-n-butilfosfat și 1% Triton X-100 și s-a incubat la 30°C, sub amestecare timp de 4 h. Apoi se efectuează o separare de faze, la 37°C, peste noapte, subnatantul limpede se pompează, se trece printr-un filtru cu pori de 0,45 pM și se depozitează la 4°C. 365

RO 117921 Β1

Valoarea pH a 40 I din această suspensie NB se aduce cu NaOH la o valoare de 7,1 și se pompează astfel, peste o coloană HbsAg și peste o coloană Tetanus Toxoid-Affprep., încât trecerea prin coloane să ajungă, din nou, în vasul de rezervă. Coloanele Affiprep. (50 x 13 mm) s-au obținut prin cuplarea a 250 mg HbsAg recombinant respectiv Tetanus Toxoid cu 25 ml Affiprep.-Gel (BioRad Lab. Inc. Hercules CA 94547). Viteza de trecere este de 6 l/h, timp de 62 h. Suspensia NB este pompată astfel în totalitate, de trei ori peste coloanele respective. După terminarea încărcării, coloanele sunt spălate separat, mai întâi cu PBS și apoi cu 500 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI pH 7,4, până când soluțiile de spălare prezintă o densitate optică la 280 nm (OD₂₈₀) mai mică decât 0,01. Proteinele legate sunt desprinse cu 200 mM glicină-HCI, pH 2,5 și valoarea pH este reglată în fracțiuni, imediat, la 5,2. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 10. Prelucrarea imunoglobulinelor pentru obținerea de preparate stabile are loc prin acumularea fracțiunilor conținând IgG, diafiltrare și concentrare cu 20 mM NaCI obținându-se soluții de 100 Ul/ml respectiv 2,5 mg anti-TT-lgG/ml. Se adaugă zaharoză și soluțiile sunt liofilizate la unități de 200 I respectiv 5 mg anti-TT-lgG.

Exemplul 9. 50 g de precipitat IV din fracționarea plasmei conform KistlerNitschmann se suspendă în 500 ml apă. Valoarea pH se reglează cu acid citric la 5,0 și conductibilitatea cu NaCI, la 13 mS. După agitare peste noapte, la 4°C, se obține, prin centrifugare timp de 30 min, la 30.000 g și 4°C o limpezire și o delipidizare parțială. Se efectuează o determinare a conținutului din suspensie a proteinelor dizolvate, IgM, IgA, IgG, transferină și ca eruloplasmină și se prezintă în tabelul 11.

Tabelul 10

Cromatografia de afinitate anti-HBsAg și Anti-Tetanus Toxoid cu suspensii NB

Gel	HBsAg	Tetanus Toxoid
încărcarea totală: Proteină	448 g	448 g
IgG	204 g	204 g
Anti-HBsAg	1120 UI	1120 UI
Anti-TT IgG	317 mg	317 mg
Trecerea: Anti-HBsAg	221 UI	221 UI
Anti-TT IgG	172 mg	172 mg
Eluat: IgG	39,8 mg	171 mg
Anti-HBsAg	1368 UI
Anti-TT IgG		89 mg
Anti-TT IgG

Tabelul 11

Suspensia din precipitat IV (toate indicațiile în mg/ml)

Total proteină	IgM	IgM	IgG	Transferină	Caeruloplasmină
5,5	0,063	0,628	0,488	2,582	0,09

Exemplul 10. 50 g de precipitat B din fracționarea plasmei, după KistlerNitschmann (lot 4.030.240.0), se agită în 100 mm acid citric la diferite valori pH, la 4°C, peste noapte, prin ultracentrifugare la 100.000 g și 4°C, se limpezește și se delipidizează, parțial, la 4°C,

RO 117921 Β1 timp de 3 h. Faza medie limpede se scoate și se determină conținutul ei în proteine dizolvate, IgM, IgA, IgG, transferină și caeruloplasmină (tabelul 12).

Tabelul 12

415

Suspensia din precipitatul B (toate indicațiile în mg/ml);

>NG: sub limita de detectare

Total proteină	IgM	IgA	IgG	Transferină	Caeruloplasmină
pH 4,0 4,9	1,2	1,3	1,9	<NG	0,06
pH 5,0 6,1	1,2	1,0	2,1	<NG	<NG

420

Titrul IgG față de anumiți antigeni virali (tabelul 13) și bacterieni (tabelul 14) s-a determinat și s-a comparat cu acela din plasma inițială și din preparatele existente de imunoglobulină.

Tabelul 13

425

IgG antivirali în rezerve de plasmă, SAGL și suspensii NB

	Plasma 102	Plasma 103	SAGL	NB pH 4,0	NBpH 5,0
Anti-HBsAg	0,02	0,05	0,01	0,05	0,05	Ul/mg IGG
Anti-CMV	0,28	0,16	0,3	0,52	0,34	PEIE/mg IgG
Anti-VZ V	0,08	0,09	n.b .	0,21	0,1	Ul/mg IgG
Anti-pojar	0,9	0,2	0,02	2,1	0,81	Ul/mg IgG
AntiHSVI	1037	n.b.	n.b.	2317	749	AU/mg IgG

430

Plasma 102/103: rezerve de plasmă; SAGL: sandoglobulină: NB pH 4,0/5,0: Suspensie din precipitatul B la pH 4,0 resp. 5,0; UI: unități internaționale; PEIE: Unități Institut Paul Ehrlich; AU: unități arbitrare; n.b.: nedeterminat.

Tabelul 14

435

IgG antibacterian în rezerve de plasmă, SAGL și suspensii NB

	Plasma 102	Plasma 103	SAGL	NB4A	NB 14 pH 4,0
antiHiBOAg anti-TT	162 1855	286 4159	436 2740	100 2928	283 2923	pg/g igG pg/g igG

440

Plasma 102/103: rezerve de plasmă; SAGL: Sandoglobulină^R; NB 4A: suspensie din precipitat B la pH=4,0; NB 14 pH 4,0 suspensie din precipitat B la pH=4,0 cu inactivarea virusului; HiBOAg: Haemophilius influenza B-Oligosaccharid-Antigen; TT: Tetanus Toxoid; SEB: Staphylococcus Enterotoxin B; AU: unități arbitrare.

Claims

Revendicări

450

1. Procedeu pentru obținerea unui preparat imunoglobulinic, cu titru ridicat caracterizat prin aceea că acesta cuprinde:

- fracționarea plasmei sanguine dintr-o rezervă de plasmă, pentru separarea cel puțin a unei fracțiuni valorificabile industrial, care conține, în principal, imunoglobulină policlonală G și cel puțin o fracțiune reziduală; 455

RO 117921 Β1

- prepararea unei soluții de proteină din componentele proteice care sunt conținute în fracțiunea reziduală, obținută, sau în subfracțiuni din aceasta;

- purificarea soluției proteice rezultate cel puțin o dată, prin cromatografie de afinitate cu liganzi imobilizați, aleși dintre cel puțin un tip de liganzi care leagă proteinele specifice din plasmă, care se desprind apoi și constituie componente active într-un preparat imunoglobulinic cu titru ridicat.
2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că fracțiunea reziduală este sub formă de precipitat sau turtă de filtrare.
3. Procedeu conform revendicărilor 1 și 2, caracterizat prin aceea că precipitatul sau turta de filtrare se tratează cu o soluție tampon apoasă, având o tărie ionică de până la 5M și un pH cuprins între 3 și 9, pentru a se obține o soluție sau o suspensie în care să se găsească preponderent componentele proteice din fracțiunea reziduală.
4. Procedeu conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că soluția tampon este aleasă dintre tampon fosfat, tampon Tris-HCI și tampon citrat.
5. Procedeu conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că soluția tampon conține un detergent, un inhibitor de proteaze și/sau o sare.
6. Procedeu conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că soluția sau suspensia se supune filtrării sau se pretratează cu un adsorbant, ales dintre hidroxid de aluminiu și un compus cu grupare dietilaminoetil.
7. Procedeu conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că soluția sau suspensia se precipită prin tratare cu un compus ales dintre sulfat de amoniu polietilenglicol și etanol, iar supernatantul sau precipitatul se prelucrează în continuare.
8. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că fracțiunea reziduală este un supernatant, iar prepararea soluției de proteină are loc prin filtrare și concentrare, de preferință, prin diafiltrare.
9. Procedeu conform revendicării 8, caracterizat prin aceea că supernatantul se filtrează sau se pretratează cu un adsorbant, ales dintre hidroxidul de aluminiu și un compus cu grupare dietilaminoetil.
10. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că liganzii imobilizați sunt antigeni naturali sau recombinanți, virali, bacterieni sau celulari.
11. Procedeu conform revendicării 10, caracterizat prin aceea că liganzii sunt aleși din grupa determinanților antigeni ai Haemophilus influenza B, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Staphylococcus agalactiae, Streptococcus pneomoniae, Streptococcus pyogenes, Tetanus Toxin, Staphylococcus aureus toxic shock toxin, Virusul Hepatitei A, Virusul Hepatitei B, Virusul Hepatitei C, Varicella Zoster Virus, Cytomegalo Virus, Respiratory Syncytial Virus, Parvovirus B19, Herpes Simplex Virus 1 și 2, Virusul turbării, precum și din grupa autoantigenilor umani potențiali CD2, CD3, CD4, CD5, CD28, CD40, CD72, CD72 ICAM, LFA-1, LFA-3, DNA și fosfolipide.
12. Procedeu conform revendicării 10, caracterizat prin aceea că liganzii sunt modificați prin mutageneză sau metode chimice sau fizice.
13. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că preparatul imunoglobulinic cu titru ridicat, obținut, conține numai imunoglobuline din clasa G sau A sau N sau combinații ale acestora.
14. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că preparatul imunoglobulinic cu titru ridicat, obținut, se supune unei operații de inactivare a virusurilor și se stabilizează prin tratare cu un stabilizator ales dintre albumină, aminoacizi și hidrați de carbon sau prin liofilizare.
15. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că preparatul imunoglobulinic cu titru ridicat, obținut, se transformă într-un produs acceptabil din punct de vedere farmaceutic, administrabil intravenos, intramuscular sau topic.