CN103153333A - 补体因子h的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
一种从含有补体因子H的来源物中纯化补体因子H的方法,所述来源物例如是血液或血浆,特别是含因子H来源物的辛酸盐沉淀物,该辛酸盐沉淀物例如是通过向血液或血浆组分添加辛酸盐离子获得的,所述方法包括:a)提供含因子H来源物,特别是重构辛酸盐沉淀物以提供含有补体因子H的溶液;b)进行阳离子交换色谱,特别是作为第一次色谱分析步骤;c)进行阴离子交换色谱;d)进行羟基磷灰石色谱;e)随后进行超滤/渗滤以获得补体因子H浓缩物。
Description
本发明提供一种从含有因子H的物料中纯化高纯度和高生物活性的补体因子H的方法。获得的血浆补体因子H浓缩物可以在病理条件下被用作治疗性补体抑制剂,特别是在涉及替代性补体系统的异常活化的条件下。
背景技术
补体因子H是主要肝源的血浆糖蛋白,首先由Nilsson和Mueller-Eberhard发现(1965, J Exp Med, 122, 277-298)。它由20个短共有重复序列(short consensus repeats, SRC)的重复序列构成或由补体控制蛋白(complement control proteins, CCP)的重复序列构成,其中每个由60个氨基酸组成。由SCR模块构成的蛋白被认为是结构稳定的分子。将补体因子H暴露于不同的苛刻的化学和物理条件下并不会使其失活(Kask et al. (2004) Protein Sci. 13, 1356-1364)。
它通过多个分子机制,成为补体旁路的必要调节因素。首先,补体因子H作为因子I介导的激活的补体成分3b(C3b)剪切的必要辅因子。其次,它与因子B片段Bb竞争结合至C3b,从而抑制含有C3b和Bb的复合物的C3转化酶的形成,进而抑制补体扩增的发生。
再者,在补体因子H的分子结构中存在数个不同的结合域,用于结合不同的短共有重复序列(SCR)上的配体,这使得能够通过不同的结合亲和性来区分宿主和非宿主。换句话说,通过向带有足够配体的表面提供足够的结合亲和性,补体因子H能够区分在哪个表面阻止补体活化(宿主),而在哪个表面不阻止(例如,病原体)(Meri and Pangburn (1990) PNAS 87, 3982-3986)。
已经被证明的是,补体因子H与含有补体旁路异常活化的多种病理生理学病症有关,即膜增生性II型肾小球肾炎(也被称为致密物沉积病;在Pickering and Cook, Clin Exp Immunol (2008), 151, 210-230中被讨论)、非典型溶血尿毒综合症(在Noris and Remuzzi, Clin Exp Immunol (2008), 151, 199-20中被讨论)以及重要的年龄相关性黄斑变性(Hageman et al. (2005) PNAS 102, 7227-7232)。
有证据表明,在补体因子H的402位点的酪氨酸至组氨酸的氨基酸替换(Y402H)(在健康的西方人中有30%的显著的杂合子患病率),使个体易患年龄相关性黄斑变性(AMD)(Hageman, G. S. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 102, 7227-7232, (2005); Edwards, A. O.et al., Science 308, 421-424, (2005); Klein, R. J.et al., Science 308, 385-389, (2005); Haines, J. L. et al., Science 308, 419-421, (2005))。补体因子H 402H风险变种增大了发展AMD的风险(对杂合子个体为2-4倍,对纯合子个体为5-7倍)。已发现Y402H多态性会使补体因子H功能失调具体表现为在损伤部位的减少的结合能力(Clark, S.J. et al., Biochem Soc Trans., 2010, 38, 1342-8; Kelly, U. et al., J Immunol., 2010, 185, 5486-94)和补充调节(Lauer, N. et al., J Immunol., 2011)。鉴于AMD病理-病因中补体的重大影响(Anderson, D.H. et al., Prog Retin Eye Res., 2010, 29, 95-112),研究纯化的CFH在AMD病人的治疗中作为治疗性补体抑制剂的价值是非常吸引人的,特别是在表达CFH风险变种的个体中。
进一步地,流形实验数据(manifold experimental data)证明在某些病理中涉及补体旁路,这强烈表明使用补体抑制剂来有效地调节潜在的被消除的补体活化。被讨论由补体抑制剂治疗的病理包括缺血再灌注损伤(Huang et al. (2008) J Immunol 181, 8068-8076; Stahl et al. (2003) J Pathol 162, 449-455)、由在近端肾小管中带有异常补体活化的蛋白尿导致的慢性肾病(He et al. (2005) J Immunol 174, 5750-5757; Abbate et al. (2008) J Am Soc Nephrol 19, 1158-1167)或自身免疫性脑脊髓炎(Griffiths et al. (2009) J Immunol 182, 4368-4377)。
根据经验,对患有非典型溶血尿毒综合症的病人的治疗由血浆处理(血浆输注或血浆取出)组成,其基本原理是修正病人的功能性补体因子H模块的缺乏(Noris and Remuzzi, Clin Exp Immunol (2008), 151, 210-230)。但是,这种治疗伴有某些缺点,给予适量的功能性因子H需要大量的血浆。
关于人类致密物沉积病的报道非常少(Licht C et al. (2006) Kidney Int., 70, 42-50)。近期,出现了关于补体因子H在致密物沉积病的小鼠模型中充当治疗性手段的活体内证据(Fakhouri et al. (2010) Kidney Int., 1-8)。在其中,由多步骤层析制得的血浆补体因子H浓缩物,完全改善了由补体因子H的完全缺失所引起的肾脏病变,最终这些作者认为它是在致密物沉积病患者中进行血浆治疗的有效替代疗法。
迄今为止,没有对干性年龄相关性黄斑变性(老年人法定失明的世界性首要原因)的治疗方法。患有早发性黄斑变性的人群中,约90%临床证明是非新生血管性干性,其特征是视网膜色素上皮细胞萎缩和黄斑区光受体缺失(Klein et al. (2004) Am J Ophthalmol. 137, 486-495)。在约30%的人群中可以发现杂合子态的补体因子H基因的某个单倍体型,在患有干性年龄相关性黄斑变性的病人中超过50%发现带有这种单体型(Hageman et al. (2005) PNAS 102, 7227-7232)。补体因子H基因中的这一单核苷酸多态性在蛋白的402位点(Y402H)将酪氨酸替换为组氨酸,使得补体因子H对聚阴离子和其他天然配体的结合能力降低(Laine et al. (2007) J Immunol 178, 3831-3836)。因此,Y402H的纯合子携带者10%的患病率反映出,正常人群中每三人就有一位患年龄相关性黄斑变性的风险增加3倍,而每十人就有一位患病风险增加8倍。此外,近期的数据证实了构成细胞外视网膜沉积物(称为玻璃膜疣)的不可分割的一部分的多种补体成分和抑制剂在玻璃膜疣额形成中起到关键作用(Anderson et al. (2010) Prog Ret Eye Res 29, 95-112)。因此,补体在年龄相关性黄斑变性(AMD)发病机制中的重要作用强烈地显示出补体调节剂的医疗用途。特别地,天然内源性补体调节剂在受感染的视网膜组织(RPE和布鲁赫膜)中的缺失以及局部视网膜补体系统在AMD发病机制中已确定出的作用表明补体因子H作为干性形式AMD的治疗手段的潜在用途。因此,补体因子H的这种用途可以表明优选通过定期的眼内注射或静脉内注射来实现。
这种单核苷酸多态性对于因子H的功能的影响尚在研究中,但是非常可能影响其在几种疾病状态中的调节功能。因此,对这样的患者(但不限于此)施用功能性的因子H很可能对治愈疾病有帮助。
当前,任何商业上可获得的补体因子H的药物组合物都是用来为患有补体因子H缺陷相关的疾病的患者给药的,这些疾病的例子已在上文讨论。因此,本发明的一个目的在于提供因子H浓缩物以及相应的从合适的因子H来源制备因子H浓缩物的方法,所述因子H来源选自血液或血浆及它们衍生部分、重组生产的因子H(优选通过人类细胞系(如人胚肾细胞(HEK))来生产,或转基因表达的蛋白质)。
用于补体因子H浓缩物的纯化的一种可能的来源是人血浆,其含有丰富的补体因子H,浓度为约500 μg/ml。
Carron et al., Biochimica et Biophysica Acta, General Subjects (1996), 1289(3), 305-11公开了一种因子H纯化方法,它通过使用凝血酶活化人血小板,再将上清液进行凝胶纯化以除去纤连蛋白和肝素琼脂糖凝胶来实现。因子H的洗脱通过0.3M NaCl缓冲液实现,并进一步通过DEAE-色谱来纯化。另一种途径是血浆依次进行L-赖氨酸-Sepharose色谱、DEAE-Sephagel色谱和选择性因子H-抗体亲和色谱。
Lundwall et al., Journal of Immunological Methods (1985), 81(1), 147-60描述了分离因子H的方法,该方法为在血浆中悬浮QAE-Sephadex两次,将一次悬浮的QAE-Sephadex覆盖在已填充的QAE-Sepadex柱上,再洗脱含有因子H的组分。该组分随后被加样到SP-Sephadex柱上,再进行最后的DEAE-Sephacel色谱,以获得补体因子H。血纤维蛋白溶酶和/或血纤维蛋白溶酶原被认为是可能存在的杂质。
US 2008/318841 A1公开了从血浆冷沉淀物的上清液中纯化因子H。上清液首先进行阴离子交换色谱,随后将未保留组分进行第一次肝素亲和色谱。未结合的因子H再进行结合条件下的第二次肝素亲和色谱,洗脱后,再进行第一次阴离子交换色谱。因子H洗脱后,再进行第二次阴离子交换色谱,最后浓缩因子H。
WO 2008/113589 A1涉及通过多种方法纯化因子H,这些方法包括一个或多个层析步骤,包括肝素亲和色谱、疏水相互作用色谱(HIC)、阴离子交换色谱(AEC)、阳离子交换色谱、羟基磷灰石色谱(HAC)或免疫亲和色谱。
Nagasawa S.等在Journal of Immunology, Vol. 125, No. 2, 1980, 第578 -582页报道了通过补体C3b灭活剂剪切补体C4b以生产缺口形式的补体C4b,补体C4b作为补体C3b灭活剂的补体C4b的中间剪切产物。所公开的从血浆中纯化补体C3b灭活剂(即人补体因子I)的方法包括阳离子交换色谱、阴离子交换色谱,随后为肝素色谱。
Mhatre A.等在Veterinary Immunology and Immunopathology, Vol. 14, No. 4, 第357-375页公开了牛补体因子H的分离方法,其报道了从血清中分离出牛补体因子H。该分离方法包括PEG沉淀,随后为阴离子交换色谱、阳离子交换色谱以及超离心浓缩。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种从含因子H来源物中纯化因子H的方法。另一个目的在于提供特别用于医药目的的因子H浓缩物。
本发明公开一种从含有补体因子H的来源物中纯化出补体因子H的方法,所述来源物例如是血液或血浆,特别是含有因子H的来源物的辛酸盐沉淀,它是通过例如向血液或血浆组分中添加辛酸盐离子来获得,该方法包括以下步骤:
a)提供含因子H来源物,特别是重构辛酸盐沉淀以提供含有补体因子H的溶液;
b)进行阳离子交换色谱,特别是作为第一次色谱分析步骤;
c)进行阴离子交换色谱;
d)进行烃基磷灰石色谱;
e)其后进行超滤/渗滤以获得补体因子H浓缩物。
根据本发明的一个实施方式,还进行了肝素亲和色谱。
在本发明的方法的另一个实施方式中,本发明还包括用于病原体去除和/或灭活的至少一种以下方法:
a)溶剂/洗涤剂处理;
b)巴氏灭菌;
c)蒸汽热处理;
d)干燥热处理;
e)纳滤。
在本发明的方法的另一个实施方式中,补体因子H浓缩物被冻干,任选地与药学上可接受的用于形成制剂的物质一起被冻干。
在另一个实施方式中,本发明涉及可由本发明的方法获得的补体因子H。该因子H的特征是高纯度和高活性。
特别地,本发明的补体因子H可通过包含以下步骤的方法获得:
a)重构辛酸盐沉淀以提供含有补体因子H的溶液;
b)通过溶剂/洗涤剂处理(S/D处理)进行病毒灭活;
c)在下述条件下进行阳离子交换色谱的色谱分析步骤:
将补体因子H结合至磺丙基型强阳离子交换树脂,使用包含20mM柠檬酸钠、pH 6.0的缓冲液洗涤,并用包含20mM柠檬酸钠、0.2 M NaCl、pH 6.0的洗脱缓冲液洗脱补体因子H;
d)在下述条件下进行阴离子交换色谱分析步骤:
将含有补体因子H的溶液(电导率0.1-0.5 mS/cm)施加于季铵型强阴离子交换树脂,使用包含20 mM Tris、pH 8.6的缓冲液洗涤,并用包含20 mM Tris、0.2M NaCl、pH 8.6的洗脱缓冲液洗脱补体因子H;
e)通过在陶瓷羟基磷灰石上加样步骤d)的组分进行陶瓷羟基磷灰石色谱,任选地在步骤d)的缓冲液交换已进行之后进行,并且用最高为1 M NaCl的氯化钠线性梯度来洗脱,并且收集在缓冲液的电导率为70 – 100 mS/cm时洗脱的组分;
f)任选地在下述条件下进行肝素亲和色谱分析步骤:将含有补体因子H的溶液施用于表面固定有肝素的树脂,使用含20mM柠檬酸钠、pH 6.0 缓冲液洗涤,并用含20 mM柠檬酸钠、0.2M NaCl、pH 6.0的洗脱缓冲液洗脱补体因子H;
g)随后通过超滤/渗滤获得补体因子H浓缩物,任选地,可提供纳滤步骤并且可用作病毒去除步骤。
本发明的补体因子H的进一步特点是为液体或冻干制剂。
在本发明的另一个实施方式中,本发明的补体因子H可被用来治疗补体因子H缺陷或活性异常相关疾病。特别地,所述疾病选自膜增生性肾小球肾炎、致密物沉积病、溶血尿毒综合症、非典型溶血尿毒综合症或年龄相关性黄斑变性。此外,本发明的补体因子H可被用来制造治疗缺血再灌注损伤、慢性肾病或自身免疫性脑脊髓炎的药物。
附图说明
图1展示了4-20% TRIS-甘氨酸梯度SDS-Page,每个泳道施加5μg不同蛋白质并银染。
图2A-2D展示了图1的泳道1和3以及标记物泳道的密度测试。通过银染SDS-Page可以观察到痕量的蛋白质,但无法观察到峰值的密度定量。密度测量的目的是改善杂质的可视性(纯为定性原因),因为图1的重印可能导致信息丢失。
要澄清的是,用在本申请中的词语“包含”应被理解为也包括“由…组成”的意思。
具体实施方式
本发明提供从任何因子H来源物,优选从血浆分离物组分中纯化补体因子H的方法。这种组分的例子为重构的组分I+II+III沉淀和组分I+III沉淀(由重构的组分I+II+III沉淀获得),并且是指通过冷乙醇分离过程获得的组分。这些过程,例如Cohn、Kistler- Nitschmann以及它们的变化形式为本领域技术人员所熟知。
令人惊讶的是,通过辛酸盐沉淀法获得的沉淀物含有功能性因子H,所述辛酸盐沉淀法例如在WO 2005/082937中所描述的那样进行,即,将Cohn组分I+II+III或组分II+III溶解在水中,使用乙酸调节pH至约4.9,并通过添加辛酸盐来沉淀同时保持pH不变,并且令人惊讶的是可从该中间物获得高纯度因子H的活性浓缩物。本领域技术人员要理解的,等同的中间物也是合适的,例如从Kistler-Nitschmann或Hink分离程序或它们的变化形式获得的中间物。本发明的纯化过程还具有至少一种有效且专门的病原体去除、减少或灭活方法,例如巴氏灭菌、蒸汽热处理、溶剂-洗涤剂处理(特别是Triton/TnBP)或纳滤(特别是通过<35 nm孔径的过滤器,最优选≤20 nm)。本文所使用的术语“病原体”是指,但不限于,病毒(例如HIV、细小病毒或各种形式的肝炎病毒)、真菌、细菌和/或蛋白质(例如PrPSc)。此外,可进行冻干因子H浓缩物的最终容器干燥加热,可结合进行所描述的灭活和/或去除步骤。
因子H纯化方法的起始物料是来自血浆分离过程的组分。一种可能的富含因子H的血浆蛋白组分是来自Cohn分离程序的重构的组分I+II+III沉淀。组分I+II+III沉淀是通过使来自新鲜冷冻血浆的常规冷沉淀上清液进行冷乙醇沉淀来获得的。除免疫球蛋白外,Cohn法的组分I+II+III还含有几种脂蛋白、纤维蛋白原和几种涉及溶解纤维蛋白系统的蛋白质以及各种少量成分。
通过辛酸盐沉淀由组分I+II+III或组分II+III可获得膏状物,如WO 2005/082937 A1 (以上简短地进行了描述) 或EP 0 893 450 A1所描述的,组分I+II+III或组分II+III在pH 3.8-4.5时重构,其后添加辛酸盐和/或辛酸,从而导致pH改变成5.0-5.2以及蛋白质的沉淀。
根据WO 2005/082937A1或EP 0893 450 A1制备的沉淀物是可被有利地用作功能性因子H浓缩物的纯化的起始物料的辛酸盐沉淀的例子。
其他可用的辛酸盐沉淀的起始物料的例子有Cohn组分I+III、Kistler-Nitschmann法的等同组分(例如沉淀物B)、Cohn-Oncley法的等同组分、Hink法的等同组分、含有重组法生产的因子H的溶液(优选通过人细胞系表达,如人胚肾细胞(HEK),或转基因表达的蛋白质)。
本发明与现有技术比较的主要优点是利用很少的色谱分析步骤的组合完成迄今未达到的活性和纯度的补体因子H制剂的生产。与商业上获得的补体因子H(来自Complement Technology Inc. (CompTech)的A137;以及Calbiochem)制剂相比,蛋白质(通常伴随有血浆性补体因子H制剂)的蛋白分解产物通过此方法可被保持在最低,表明天然的、完全糖基化的补体因子H产率最大化。由本方法获得的最终的补体因子H浓缩物在补体因子H的体内活性分析中产生出完全的生物学上的功能性蛋白。
本文使用的术语“功能性补体因子H”是指任何测试的富含补体因子H的组分剂量依赖性地抑制与无补体因子H血清一起培养的羊红细胞的补体介导的溶血的能力。
含因子H的辛酸盐沉淀物在约4℃被溶解在包含20-50mM柠檬酸钠、20-120mM甘氨酸、5-20mM乙二胺四乙酸(EDTA)、5-20mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、pH 6.0-7.5的缓冲液中,特别是pH 7.4、由20mM柠檬酸钠、60mM甘氨酸、10mM EDTA、10mM EGTA构成的缓冲液。4℃离心20分钟(5000 – 10000 rpm),以从上清液中分离出未溶解的物质。
所产生的上清液随后被进行溶剂/洗涤剂(S/D)处理。其中,上清液被与0.3% (w/w)磷酸三正丁酯(TnBP)和1% (w/w) Triton? X-100(聚乙二醇p- (1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚)混合至少40分钟至12小时(取决于温度),特别是在室温下50分钟至在4℃时4小时。
该溶液用0.3N HCl调节pH至约6.0,并在20-25℃下稀释至电导率为4.4至5.2 mS/cm,并用0.45μm膜过滤。过滤后的溶液随后被施加至用于阳离子交换色谱(CEX)的凝胶/树脂,例如但不限于,基质材料上经由连接基团附接有羧甲基或磺酸基的色谱材料,特别是强阳离子交换树脂,例如Tosho的Toyopearl? SP-650M,即,磺丙基连接至羟基化的聚丙烯酸基质。在样品在室温下施加至色谱材料后,通过使用几倍柱体积的平衡缓冲液洗涤来从凝胶中除去弱吸附的蛋白质,所述平衡缓冲液包含20mM柠檬酸钠、pH 6.0、电导率在20-25℃的温度时为约4.8 ms/cm。所述洗涤步骤后为未结合蛋白质组分的逐步梯度洗脱,这是通过在相同缓冲液中逐步增加氯化钠(NaCl)浓度(0.1 M; 0.2 M;和1M NaCl)来实现的。通过额外含有0.2M NaCl的平衡缓冲液从CEX凝胶中洗脱出的组分被收集,并且该缓冲液被替换为20mM Tris-HCL缓冲液(pH为8.5-8.7,电导率在20-25℃温度下为0.1至 0.5 mS/cm)。
所获得的溶液进行阴离子交换色谱(AEX)。用于这种类型色谱的树脂是熟知的,并且由(但不限于)连接有各种氨基、季铵基或甲基磺酸盐的基质材料构成,基质材料例如是葡聚糖、琼脂糖、丙烯酸聚合物或聚苯乙烯,特别是强阴离子交换树脂,例如是Q-Sepharose? XL(季铵基连接至琼脂糖)。
在用由20mM TRIS构成的缓冲液(pH 8.6)洗涤吸附至AEX树脂的因子H之后,通过增加在该缓冲液中的NaCl浓度进行逐步梯度洗脱。通过包含20mM TRIS-HCl和0.25M NaCl、pH 6.8的洗脱缓冲液从阴离子交换凝胶中洗脱出因子H,而用含有20mM Tris-HCl和至多0.2M NaCl的缓冲液洗脱的组分被丢弃。
含因子H的组分被超滤/渗滤,用于缓冲液更换。五倍样品体积被用包含5mM磷酸二氢钠(NaH2PO4*2 H20)、pH 6.50、电导率0.5至0.7 mS/cm(20-25℃)的缓冲液更换。该溶液被进行陶瓷羟基磷灰石色谱(CHA)。陶瓷羟基磷灰石在其表面上具有羟基和磷酸基以及钙作为功能基团,因此是一种混合模式的色谱材料,其陶瓷特性(即与晶型羟基磷灰石相比的高孔隙率)是由其生产过程获得的,并且由于更高的比表面积而提供更好的分离性质。使用10mM磷酸二氢钠(NaH2PO4*2 H20)、pH 6.50、电导率约1.1 mS/cm(20-25℃)的缓冲液平衡动态载量>12.5 mg溶菌酶/g、最小孔径为800-1000埃(即80-100nm)的陶瓷羟基磷灰石(例如来自Bio-Rad?的CHT? II型40μm)。使用浓度至多为1M NaCl的平衡缓冲液进行线性梯度洗脱。收集在导电率为70-100 mS/cm(20-25℃)洗脱的组分用于超滤/渗滤。
作为选择,可在纯化方法中在此时进行亲和色谱,特别是使用肝素连接至基质的树脂。如果进行肝素亲和色谱,来自陶瓷羟基磷灰石色谱的含有补体因子H的溶液被超滤/渗滤,以用于与包含20mM柠檬酸钠、pH 6.0、电导率4.5-4.7 mS/cm(20-25℃)的缓冲液进行缓冲液更换,并且被加样至可用于肝素亲和色谱的凝胶上,例如连接有肝素的琼脂糖。这种树脂的一个例子是GE Healthcare的Heparin Sepharose? 6 FF。在用5倍柱体积的平衡缓冲液(即用于之前缓冲液更换的相同平衡缓冲液)洗涤凝胶和吸附的补体因子H后,通过在相同缓冲液中添加0.2M NaCl来洗脱补体因子H。
从陶瓷羟基磷灰石色谱或任选的肝素亲和色谱中获得的因子H溶液被浓缩并通过超滤/渗滤以期望的制剂缓冲液(例如pH约7.4的磷酸缓冲液)来配制成期望的最终浓度,以获得至少10mg/ml的配制成的因子H浓缩物,例如约50 mg/ml,特别是10-300 mg/ml。
为了改善病原体安全性,也可以在浓缩/配制步骤之前或之后引入纳滤,通过孔隙小于35nm的纳滤器进行,例如10-30 nm孔隙的纳滤器,特别是20nm或15nm孔隙的纳滤器。在浓缩和配制时进行的超滤/渗滤之后,或在任选的纳滤(其发生在用于浓缩和配制目的的超滤/渗滤之后)之后,含有因子H的浓缩物被无菌过滤并填充到最终容器中。
为了除提供液体产物外还提供冻干产物,游戏要在最终生产步骤中对已经填充在最终容器中的因子H浓缩物进行冻干。根据本发明的方法制造的补体因子H的产率良好,并且具有迄今为止不存在的纯度和活性。
测试补体因子H活性的实验
测试原理
测试补体因子H的生物学活性是通过体内实验来实现的,该实验利用活羊红血细胞作为补体激活剂表面。这些羊红细胞与无补体因子H血清一起培养以提供完整的血清补体成分同时缺少补体旁路的这种重要的调节剂。为保证只有旁路补体激活发生,这些试剂被用含有镁离子和EGTA的Veronal Buffered Saline (VBS)一起孵育。
重构补体因子H的来源物保护羊红细胞免受补体介导的溶血。溶血的程度可通过测定胞质外血红蛋白在414nm波长下的吸收峰来确定。样品的特定活性通过与标准曲线的比较而计算得出,标准曲线是通过添加商业上获得的纯的补体因子H的浓缩物而获得的。本实验的一个例子显示在图1和2中,其测试了本发明的第三纯化步骤获得的补体因子H洗脱物。
补体因子H活性测试的描述
首先,使用10 ml新鲜的Alsever氏溶液(4.2g/L NaCl、8g/L柠檬酸钠*2H2O、0.55g/L柠檬酸*H2O和20.5g/L D-葡萄糖)洗涤并以2300 RPM在室温下离心5分钟。在分光光度计中测量上清液在280nm波长处的吸收峰以监控其中的蛋白质释放。连续洗涤三次直到OD在280nm不再增加。
包含羊红细胞的团块被溶解,以产生在Alsever氏溶液中的33%的溶液。
其次,将10μl的33%的羊红细胞溶液与20μl无补体因子H的血清(A337, Complement Technology Inc.)在500μl小瓶中在4℃混合,并在4℃预培养15分钟。预培养后,添加不同剂量的标准补体因子H(A137, Complement Technology Inc.)和富含补体因子H的样品,添加20μl的体积。为了使所有样品和标准稀释液等同,剩余体积用0.9% NaCl溶液填补。
随后,向所有小瓶中快速添加30μl的Veronal Buffered Saline (VBS) (2.5mM巴比妥钠, 144mM NaCl, 10mM乙二醇四乙酸 (EGTA), 30mM MgCl2, pH 7.4),以开始反应(最终反应体积为80μl)。小瓶在37℃以450 RPM培养30分钟。
向所有小瓶中添加220μl的冰冷2.5mM巴比妥钠, 144mM NaCl和10mM乙二胺四乙酸 (EDTA), 30mM MgCl2, pH 7.4以终止反应,终体积为每瓶300μl。所有样品在室温下在Microfuge (Eppendorf)中以20000g离心5分钟,以从上清液中分离出细胞团块。
100μl上清液被加入到96孔微孔板(Nunc)(2份),并用分光光度计测量在414nm的吸收值(溶液中胞质外血红蛋白的消光度)。从每个样品中减去本底溶解作为VBS缓冲液和羊红细胞的吸收值。评价吸收值和补体因子H浓度的图表可获得补体因子H活性。
特定样品的活性的特异性可通过将该样品稀释液与已知可阻断蛋白功能的对补体因子H特异的合适抗体(例如,A100, Quidel,鼠抗人补体因子H单克隆抗体)一起培养来测定。
实施例
实施例1
含因子H的辛酸盐沉淀物被在约4℃在缓冲液中溶解,该缓冲液包含20mM柠檬酸钠、60mM甘氨酸、10mM乙二胺四乙酸(EDTA)、10mM乙二醇四乙酸(EGTA)、pH7.4。在4℃以约5050rpm(即约8000g)离心20分钟,将未溶解物质从上清液中分离出去。
所产生的上清液随后进行溶剂/洗涤剂(S/D)处理。其中,上清液被与0.3% (w/w)磷酸三正丁酯(TnBP)和1% (w/w) Triton? X-100(聚乙二醇p- (1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚)在室温下混合60分钟。
该溶液用0.3N HCl调节pH至6.0,并在23℃温度下稀释至电导率为4.8 mS/cm,并用0.45μm膜过滤。过滤后的溶液随后被施加至Tosho的Toyopearl? SP-650M。在样品在室温下施加至色谱材料后,通过使用几倍柱体积的平衡缓冲液洗涤来从凝胶中除去弱吸附的蛋白质,所述平衡缓冲液包含20mM柠檬酸钠、pH 6.0、电导率在23℃的温度时为约4.8 ms/cm。所述洗涤步骤后为未结合蛋白质组分的逐步梯度洗脱,这是通过在相同缓冲液中逐步增加氯化钠(NaCl)浓度(0.1 M; 0.2 M;和1M NaCl)来实现的。通过额外含有0.2M NaCl的平衡缓冲液从CEX凝胶中洗脱出的组分被收集,并且该缓冲液被替换为20mM Tris-HCL缓冲液(pH为8.6,电导率在24℃温度下为0.4 mS/cm)。
所获得的溶液在Q-Sepharose? XL上进行阴离子交换色谱。在用包含20mM TRIS的缓冲液(pH 8.6)洗涤吸附至AEX树脂的因子H之后,通过增加在该缓冲液中的NaCl浓度进行逐步梯度洗脱。通过包含20mM TRIS-HCl和0.25M NaCl、pH 6.8的洗脱缓冲液从阴离子交换凝胶中洗脱出因子H,而用含有20mM Tris-HCl和至多0.2M NaCl的缓冲液洗脱的组分被丢弃。
含因子H的组分被超滤/渗滤,用于缓冲液更换。五倍样品体积被用包含5mM磷酸二氢钠(NaH2PO4*2 H20)、pH 6.50、电导率0.6 mS/cm的缓冲液更换。该溶液被进行陶瓷羟基磷灰石色谱(CHA)。
使用10mM磷酸二氢钠(NaH2PO4*2 H20)、pH 6.5、电导率约1.1 mS/cm(22℃)的缓冲液平衡陶瓷羟基磷灰石(来自Bio-Rad?的CHT? II型40μm)。使用浓度至多为1M NaCl的平衡缓冲液进行线性梯度洗脱。收集在导电率为70-100 mS/cm(20-25℃)洗脱的组分用于超滤/渗滤。
所获得的因子H溶液被浓缩至20mg/ml并被配制在pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液中。
实施例2
进行与实施例1中显示的基本相同的过程,仅仅是在温度上差别1-2℃,以及在3 mg/ml的因子H浓度时引入20nm纳滤,因为过滤器没有被阻塞,更高浓度的纳滤明显是可能的且是期望的。
实施例3:
实施例3与实施例1基本相同,只是使用不同的S/D处理,即在4℃混合4小时,并且在陶瓷羟基磷灰石色谱后引入肝素亲和色谱。来自陶瓷羟基磷灰石色谱的含有补体因子H的溶液被超滤/渗滤,以用于与包含20mM柠檬酸钠、pH 6.0、电导率4.6 mS/cm(23℃)的缓冲液进行缓冲液更换,并且被加样至Heparin Sepharose? 6 FF。在用5倍柱体积的平衡缓冲液(即用于之前缓冲液更换的相同平衡缓冲液)洗涤凝胶和吸附的补体因子H后,通过在相同缓冲液中添加0.2M NaCl来洗脱补体因子H。用该洗脱缓冲液洗脱的组分被配置和浓缩至50 mg/ml。
对比实施例
对比实施例1(US 2008/0318841 A1; [0098]至[0109]段; LFB):
1.阴离子交换色谱,2.(非结合)肝素亲和色谱;3.(结合)肝素亲和色谱,4.第一次阳离子交换色谱,5.第二次阳离子交换色谱
按所给出的信息进行试验,但是仅公开了树脂和某些pH值,详细地按照这些进行。因为该申请没有公开缓冲液组分和浓度,决定使用20mM柠檬酸钠缓冲液,以NaCl和HCl调节至所给出的pH值,估算出并控制离子强度以实现所给出的性质。仅有的不同是使用冷上清(cryopoor)血浆作为起始物料,其是作为一种冷沉淀上清液引入的。
对比实施例2(WO 2008/113 589 A1的优选实施方式,第38页;ZLB Behring):
1.肝素亲和色谱(肝素固定在HW-65-Toyopearl?上),2.PEG沉淀,3.阴离子交换色谱(Q-Sepharose? XL),4.疏水相互作用色谱(Butyl-Sepharose? FF)。
详细地根据所公开的树脂进行试验。
对比实施例3(Mhatre et al. 方法)
1.第一次PEG沉淀,2.第二次PEG沉淀,3.阴离子交换色谱(DEAE-Sephacel?),4.阴离子交换色谱(CM-Sepadex?),5.尺寸排除色谱(Sephadex? G-200)。
血清通过冷上清血浆的复钙和离心来制备。使用所描述的条件,但使用DEAE-Sepharose? FF替代DEAE-Sephacel?,使用CM-Sepharose? FF替代CM-Sephadex?,以及使用Superdex?-200替代Sephadex? G-200。所使用的树脂具有所公开的相同官能基团,但具有某些不同的载体材料。
对比实施例4(Lundwall et al.方法)
1.在阴离子交换树脂(QAE-Sephadex?)上的批量吸附,2.在阴离子交换树脂(QAE-Sephadex?)上的第二次批量吸附,3.阳离子交换色谱(SP-Sephadex?),4.阳离子交换色谱(DEAE-Sepharose?FF)。
严格根据过程中的步骤和条件进行试验,仅有一个不同:SP-650M-Toyopearl?用于阳离子交换色谱,以替代SP-Sephadex?。
图1的说明
图1展示4-20% TRIS-甘氨酸梯度SDS-Page(预制凝胶, Invitrogen?),每个泳道添加5μg蛋白质,并根据制造商手册进行银染(PlusOne Silver Staining Kit, Protein by GE Healthcare ?,4分钟显影)
泳道1:商业上获得的因子H(CompTech, A137)
最明显的杂质发现在75 kDa、约105kDa和约200kDa。
泳道2:本发明,4个色谱分析步骤
仅在150kD区域发现有关因子H的唯一条带。在较低分子量区域(即从因子H至10kDa及之外)以及较高分子量范围内(即250kDa及之外,一直到上样点)都未发现杂质。
泳道3:本发明,3个色谱分析步骤
在150 kDa区域发现主条带并且为因子H。在低分子量范围(即从因子H到10kDa及以外)未发现杂质。
泳道4:根据US 2008/0318841 A1的实施例的因子H
在较低分子量范围内可见几个杂质,特别是从100kDa至55kDa,在55kDa和100kDa处更明显。在较高分子量范围内(即从约200kDa至加样点)发现另外的杂质。
泳道5:WO 2008/113 589 A1的优选实施方式
在较低分子量区域可见几个杂质,特别是约110kDa 至约60kDa范围内,在约100kDa处的浓度高些。在较高分子量区域(即约180kDa至加样点)发现额外的主要杂质,特别是在约180kDa处,在约300kDa处有2个条带,并且在250kDa和加样点半途有2个条带。
泳道6:Mhatre et al.
在较低分子量区域可见两种杂质,一条在约55kDa处,虽微弱但明显可见,另一个浓度较高的在100kDa处。在较高分子量区域发现额外的杂质,在约180kDa至接近加样点处具有明显可见的条带区域,浓度最大的条带位于该区域接近中央处。
泳道7:Lundwall et al.
从50kDa至加样点处随处可见蛋白质,最强信号为因子H的条带,但很难说它是主要条带。
泳道8:商业上获得的因子H(Calbiochem)
最明显的杂质出现在75 kDa、约105kDa和约200kDa。杂质显得与CompTech因子H的杂质相同,但浓度更大些。
以相当的条件对这些样品进行Western杂交,即4-20% TRIS-甘氨酸梯度,每个泳道加样5μg蛋白质,并且来源于羊的多克隆抗人因子H抗体(CompTech, A237)确认了因子H的身份,但没有显示出各样品之间的显著区别。
图2A的描述(坐标上的值为任意单位):图2A展示了图1的标记物泳道的密度测量。
图2B的描述:图2B展示了图1的泳道1的密度测量,在数据点约400和约480处明显地显示出杂质,其对应于105kDa和75kDa处的杂质。
图2C和图2D的描述:图2C和图2D展示了图1中的泳道2和泳道3的密度测量,在小于110kDa的分子量范围内没有蛋白杂质。
Claims (11)
1.一种从含有补体因子H的来源物中纯化补体因子H的方法,所述来源物例如是血液或血浆,特别是含因子H来源物的辛酸盐沉淀物,该辛酸盐沉淀物例如是通过向血液或血浆组分添加辛酸盐离子获得的,所述方法包括:
a)提供含因子H来源物,特别是重构辛酸盐沉淀物以提供含有补体因子H的溶液;
b)进行阳离子交换色谱,特别是作为第一次色谱分析步骤;
c)进行阴离子交换色谱;
d)进行羟基磷灰石色谱;
e)随后进行超滤/渗滤以获得补体因子H浓缩物。
2.根据权利要求1所述的方法,其中进行肝素亲和色谱。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述方法包括用于病原体去除和/或灭活的至少一种以下方法:
a)溶剂/洗涤剂处理;
b)巴氏灭菌;
c)蒸汽热处理;
d)干燥热处理;或
e)纳滤。
4..根据权利要求1至3所述的方法,其中所述补体因子H浓缩物被冻干。
5.权利要求1至4的任何一项的方法获得的补体因子H。
6.根据权利要求5所述的补体因子H,其可通过包含以下步骤的方法获得:
a)重构辛酸盐沉淀以提供含有补体因子H的溶液;
b)通过溶剂/洗涤剂处理(S/D处理)进行病毒灭活;
c)在下述条件下进行阳离子交换色谱的色谱分析步骤:
将补体因子H结合至磺丙基型强阳离子交换树脂,使用包含20mM柠檬酸钠、pH 6.0的缓冲液洗涤,并用包含20mM柠檬酸钠、0.2 M NaCl、pH 6.0的洗脱缓冲液洗脱补体因子H;
d)在下述条件下进行阴离子交换色谱分析步骤:
将含有补体因子H的溶液(电导率0.1-0.5 mS/cm)施加于季铵型强阴离子交换树脂,使用包含20 mM Tris、pH 8.6的缓冲液洗涤,并用包含20 mM Tris、0.2M NaCl、pH 8.6的洗脱缓冲液洗脱补体因子H;
e)通过在陶瓷羟基磷灰石上加样步骤d)的组分进行陶瓷羟基磷灰石色谱,任选地在步骤d)的缓冲液交换已进行之后进行,并且用最高为1 M NaCl的氯化钠线性梯度来洗脱,并且收集在缓冲液的电导率为70 – 100 mS/cm时洗脱的组分;
f)任选地在下述条件下进行肝素亲和色谱分析步骤:将含有补体因子H的溶液施用于表面固定有肝素的树脂,使用含20mM柠檬酸钠、pH 6.0 缓冲液洗涤,并用含20 mM柠檬酸钠、0.2M NaCl、pH 6.0的洗脱缓冲液洗脱补体因子H;
g)随后通过超滤/渗滤获得补体因子H浓缩物。
7.根据权利要求5或6所述的补体因子H,其特征在于通过纳滤进行病毒减少步骤。
8.根据权利要求5至7的任何一项所述的补体因子H,其特征在于,所述补体因子H为液体或冻干制剂。
9.根据权利要求5至8的任何一项的补体因子H用来治疗与补体因子H缺陷或活性异常相关的疾病。
10.根据权利要求9的补体因子H,其中所述疾病选自膜增生性肾小球肾炎、致密物沉积病、溶血尿毒综合症、非典型溶血尿毒综合症或年龄相关性黄斑变性。
11.根据权利要求5至10的任何一项的补体因子H用来治疗缺血再灌注损伤、慢性肾病或自身免疫性脑脊髓炎。
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