CN114605519A - 提取h因子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了提取H因子的方法,所述方法包括:步骤1:将含有H因子的血浆级分沉淀溶解于提取液中,得到含有H因子的溶解液;步骤2:将所述含有H因子的溶解液与C7~C9短链脂肪酸和/或其衍生物混合,得到固液混合物;步骤3:将所述固液混合物进行固液分离,收集上清液,得到含有H因子的初提液。利用本发明的提取H因子方法可以高效提取分离H因子,H因子收率高、纯度高,操作简便、用时短,有利于提高血浆的综合利用率,适于产业化生产应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地,本发明涉及提取H因子的方法。
背景技术
H因子是155kDa的可溶性糖蛋白,在调节补体替代途径中起重要作用,防止补体系统对宿主组织的非特异性损伤。H因子属于微量蛋白,血浆中的浓度仅为110-615μg/mL。迄今为止,都没有H因子产品上市,其中一个原因为H因子含量甚微,现有的纯化工艺回收率低,难以实现产业化生产。另一方面,血浆中主要的血浆蛋白制品为人免疫球蛋白、人血白蛋白、纤维蛋白原、凝血酶原复合物等。由于血浆来源的限制,血液制品一直处于供不应求的局面,从血浆中分离更多的血浆蛋白一直是热门研究方向。如何在不降低主要的血浆蛋白制品收率的情况下,分离得到足以满足产业化生产的H因子的问题更加难以解决。
辛酸是一种天然存在的含有8个碳的短链脂肪酸。长期以来,辛酸及其衍生物常用作白蛋白稳定剂、非免疫球蛋白级分沉淀剂和杀菌剂。辛酸对各种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及真菌具有抑制作用。目前,有研究报道了辛酸在获取血浆中免疫球蛋白的应用,具体为辛酸加入血浆中可产生沉淀,上清液中含有免疫球蛋白,以实现分离提取免疫球蛋白的目的,而沉淀中含有杂蛋白以及H因子。
目前,有研究报道血液或血浆组分添加辛酸盐可以沉淀H因子,辛酸沉淀物溶解于缓冲液后,取上清液进行S/D病毒灭活,然后进行阳离子交换层析,进而富集H因子。但是,辛酸沉淀物需要多次溶解和过滤,此过程中沉淀无法完全溶解,并且溶解和过滤过程中所弃去的滤液和滤饼中难以避免地会残留H因子。因此上述方法中的多次溶解和过滤操作会导致H因子这一微量蛋白大量损失、回收率降低,难以产业化生产。
因此,目前由血浆中提取H因子的方法仍有待研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。为此,本发明提出了提取H因子的方法、H因子中间品、提取血浆蛋白的方法和血浆蛋白制品,利用该提取H因子的方法可以高效提取分离H因子,H因子收率高、纯度高,操作简便、用时短,利用该提取血浆蛋白的方法所得血浆蛋白含量收率高、纯度高,适于产业化生产应用。
在本发明的一个方面,本发明提出了一种提取H因子的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:步骤1:将含有H因子的血浆级分沉淀溶解于提取液中,得到含有H因子的溶解液;步骤2:将所述含有H因子的溶解液与C7~C9短链脂肪酸和/或其衍生物混合,得到固液混合物;步骤3:将所述固液混合物进行固液分离,收集上清液,得到含有H因子的初提液。如前所述,目前现有技术主要是将血浆中的H因子完全沉淀出来,然后溶解,从而达到提取目的。但是,这种方法收率低,难以实现工业化生产。进而,发明人尝试尽可能地使非H因子沉淀,而大部分H因子保留在上清液中,从而提高H因子收率。
现有技术都是采用辛酸、PEG等蛋白沉淀剂来沉淀H因子,然后再溶解的方式来获得H因子的初提液。但是该方法需要多次溶解和过滤步骤,由于无法使辛酸沉淀物中的H因子完全溶解出来以及过滤造成损失,使H因子的回收率很低,难以实现产业化生产。为此,发明人尝试简化操作步骤,开发一种从血浆级分沉淀开始仅需一次溶解和过滤就能实现H因子初步纯化的方法,提高H因子的回收率。与现有技术的思路相反,发明人考虑将血浆级分沉淀溶解后采用辛酸来沉淀非H因子蛋白而不是沉淀H因子,保留H因子在上清液,这就能省去H因子沉淀后再溶解的步骤,只需一步溶解和过滤,即可得到H因子的初提液。
根据本发明的实施例,上述提取H因子的方法还可以具有下列附加技术特征:
根据本发明的实施例,根据本发明的实施例,所述提取液的pH值为4.0~5.0。
根据本发明的实施例,所述C7~C9短链脂肪酸和/或其衍生物选自C7~C9脂肪酸、C7~C9脂肪酸盐或C7~C9脂肪酸酯。
根据本发明的实施例,所述C7~C9短链脂肪酸和/或其衍生物的终浓度为不超过10mM。
根据本发明的实施例,所述C7~C9短链脂肪酸和/或其衍生物的终浓度为不超过5mM。
根据本发明的实施例,所述提取液为包含蛋白酶抑制剂的缓冲液。
根据本发明的实施例,所述蛋白酶抑制剂选自下列至少之一:EDTA或其盐、乙二醇四乙酸、苯甲酰胺、苯甲酰胺盐酸盐或其衍生物、赖氨酸或其衍生物、6-氨基己酸或其衍生物、反式-4-(氨甲基)环己酸或其衍生物、4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟或其衍生物、(4-酰胺基-苯基)-甲烷磺酰氟或其衍生物、3,4-二氯异香豆素或其衍生物、亮抑酶肽或其衍生物、抑肽酶或其衍生物。
根据本发明的实施例,所述缓冲液中的缓冲剂选自乙酸盐、柠檬酸盐、Tris-HCl和磷酸盐的至少之一。
根据本发明的实施例,所述提取液包含20~100mM柠檬酸钠、150~320mM氯化钠和5~16mM EDTA或其钠盐。
根据本发明的实施例,所述含有H因子的溶解液的电导率为25~30ms/cm。
根据本发明的实施例,所述含有H因子的血浆级分沉淀的总质量与所述提取液的质量比为1:(2~20)。
根据本发明的实施例,所述含有H因子的血浆级分沉淀为FI+III沉淀。
根据本发明的实施例,步骤1和步骤2均是在搅拌状态下进行的,搅拌的转速为150~600rpm。
根据本发明的实施例,步骤1中,所述溶解的温度为0~20℃,时间为1~5小时;步骤2中,所述混合的时间为1~5小时。
根据本发明的实施例,所述方法进一步包括:在pH3.8~4.5和35~40℃条件下,孵育步骤3中所述含有H因子的初提液。
在本发明的又一方面,本发明提出了一种H因子中间品。根据本发明的实施例,所述H因子中间品是通过前面所述提取H因子的方法所获得的。由此,根据本发明实施例的H因子中间品收率高。
在本发明的又一方面,本发明提出了一种提取血浆蛋白的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:实施前面所述提取H因子的方法中的步骤1和步骤2,得到固液混合物;将所述固液混合物进行过滤或离心,收集沉淀,得到含有血浆蛋白的沉淀物;以及任选的将所述含有血浆蛋白的沉淀物进行纯化处理。由此,利用根据本发明实施例的方法所得血浆蛋白含量收率高、纯度高,适于产业化生产应用。
在本发明的又一方面,本发明提出了一种血浆蛋白制品中间品。根据本发明的实施例,所述血浆蛋白制品中间品是通过前面所述提取血浆蛋白的方法所得到的。由此,根据本发明实施例的血浆蛋白制品中血浆蛋白纯度高。
根据本发明的实施例,所述血浆蛋白制品选自下列至少之一:免疫球蛋白、白蛋白、凝血酶、凝血酶原复合物、纤维蛋白原、抗凝血酶III、α-1蛋白酶抑制剂、C1酯酶抑制剂、载脂蛋白A-Ⅰ、转铁蛋白和丁酰胆碱酯酶。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1显示了根据本发明一个实施例的提取H因子的方法流程示意图;
图2显示了根据本发明一个实施例的FI+III沉淀溶解上清液的SDS-PAGE分析结果;
图3显示了根据本发明一个实施例的FI+III沉淀溶解上清液的Western Blot试验结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
本发明提出了提取H因子的方法、H因子中间品、提取血浆蛋白的方法和血浆蛋白制品,下面将分别对其进行详细描述。
提取H因子的方法
在本发明的一个方面,本发明提出了提取H因子的方法。根据本发明的实施例,参见图1,该方法包括:
S100溶解
在该步骤中,将含有H因子的血浆级分沉淀溶解于提取液中,得到含有H因子的溶解液。由此,以便于将血浆级分沉淀中的H因子溶解于提取液中。
含有H因子的血浆组分是本领域内公知的,主要包括组分I(Fraction I,FI)、组分II(Fraction II,FII)和组分III(Fraction III,FIII)。FI是在许多血浆来源的IgG产品的商业生产过程中形成的第一个乙醇级分沉淀。FI沉淀的主要成分是纤维蛋白原,占沉淀蛋白的50-60%。而工业规模血浆分馏的FI沉淀中的H因子含量约占去冷沉淀血浆原料中总H因子含量的10%。除了H因子和纤维蛋白原,FI的主要成分还包括免疫球蛋白G。研究发现,FII+III沉淀中的因子H占比超过去冷沉淀血浆原料中总H因子含量的80%;其中H因子主要存在于FIII沉淀中,FII为静注人免疫球蛋白的主要原料,H因子含量较少。除了H因子,组分III的主要成分还包括凝血酶原、β-球蛋白、免疫球蛋白M、免疫球蛋白G和纤维蛋白原。组分II的主要成分为免疫球蛋白G。根据本发明实施例,含有H因子的血浆级分沉淀首选FI+III沉淀,由此,能有效沉淀血浆级分溶解液中的非H因子蛋白,上清液中主要为H因子,残留的H因子少,收率高,所得H因子初提液利于后续纯化。
根据本发明的实施例,提取液的pH值为4.0~5.0。发明人经深入研究发现,H因子的等电点为6.8,为了避免H因子产生沉淀,选择体系的pH值远离H因子等电点。进一步地,发明人以pH值小于6和大于7进行研究,发现在pH值为4.0~5.0范围内,可以尽可能地避免H因子发生沉淀,且在C7~C9短链脂肪酸和/或其衍生物作用下,大多数非H因子蛋白均可以产生沉淀,上清液中残留非H因子蛋白相对较少。然而,在其他pH值条件下,C7~C9短链脂肪酸和/或其衍生物虽然可以使得大多蛋白产生沉淀,但是,残留在上清液中的非H因子蛋白较多,并且,也会出现少量H因子产生沉淀,从而导致H因子收率偏低。另外,在pH在4.0~5.0的范围内,沉淀中含有大量血浆蛋白,该沉淀可以用于进一步制备其他血浆蛋白,有利于提高血浆综合利用率。在一些实施例中,提取液的pH值优选4.5~5.0,更优选4.6~4.8。
根据本发明的实施例,提取液为包含蛋白酶抑制剂的缓冲液。通过添加蛋白酶抑制剂可以抑制溶液中的蛋白水解酶活性,防止H因子被降解失活。其中蛋白酶抑制剂选自下列至少之一:EDTA或其盐、乙二醇四乙酸、苯甲酰胺、苯甲酰胺盐酸盐或其衍生物、赖氨酸或其衍生物、6-氨基己酸或其衍生物、反式-4-(氨甲基)环己酸或其衍生物、4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟或其衍生物、(4-酰胺基-苯基)-甲烷磺酰氟或其衍生物、3,4-二氯异香豆素或其衍生物、亮抑酶肽或其衍生物、抑肽酶或其衍生物。其中,配置缓冲液的缓冲液中的缓冲剂选自乙酸盐、柠檬酸盐、Tris-HCl和磷酸盐的至少之一,优选Tris-HCl或柠檬酸钠。采用该提取液可以充分溶解血浆级分沉淀中的H因子。
根据本发明的实施例,提取液包含20~100mM柠檬酸钠、150~320mM氯化钠和5~16mM EDTA或其钠盐。由此,提取液可以充分溶解血浆级分沉淀中的H因子。
根据本发明的实施例,含有H因子的溶解液的电导率为25~30ms/cm。通过控制电导率,来改变蛋白之间的范德华力的相互作用,提高H因子的溶解度。
根据本发明的实施例,含有H因子的血浆级分沉淀的总质量与所述提取液的质量比为1:(2~20)。由此,可以充分溶解H因子。在一些优选实施例中,FI+III沉淀的总质量与提取液的质量比为1:(3~7)。
根据本发明的实施例,FI+III沉淀可以参考《输血疗法与血液制剂》的第四章描述的方法得到,具体地,FI+III沉淀可以通过下列实验条件获得的:将血浆与终浓度为20~22%(体积比)的乙醇溶液混合,并调节pH值至5.0~7.0,过滤,收集沉淀;将沉淀溶解于注射用水中,再与终浓度为14~19%(体积比)的乙醇溶液混合,并调节pH值至5.0~5.4,过滤,收集沉淀,得到FI+III沉淀。由此,所得FI+III沉淀中H因子含量较高。
根据本发明的实施例,步骤S100是在搅拌状态下进行的,搅拌的转速为150~600rpm,溶解的温度为0~20℃(优选15~19℃),时间为1~5小时。由此,以便于充分使H因子溶解于提取液中。
S200混合
在该步骤中,将含有H因子的溶解液与C7~C9短链脂肪酸和/或其衍生物混合,得到固液混合物。由此,在pH值为4.0~5.0的体系中,C7~C9短链脂肪酸和/或其衍生物将溶解液中的大部分非H因子蛋白沉淀,上清液中保留H因子和少量残留非H因子蛋白。
发明人意外发现,在特定的pH值(4.0~5.0)条件下,以辛酸为代表的C7~C9短链脂肪酸和/或其衍生物可以将含有H因子的溶解液中的非H因子血浆蛋白沉淀而保持大部分的H因子在上清液中。此步操作,一方面,非H因子蛋白沉淀完全后,仅需一次固液分离即可完成H因子的初步分离,进而提高H因子的回收率,利于实现H因子的产业化规模生产。另一方面,非H因子的血浆蛋白沉淀可进一步用于制备人免疫球蛋白、人血白蛋白等血液制品,对主要的血浆蛋白制品工艺路线和收率影响较小,从而有利于实现血浆资源的充分利用。
此外,发明人发现,如果在S100溶解后,省去加入辛酸沉淀的步骤,溶液中的蛋白浓度会很高,不利于后续的蛋白纯化。第一,很容易堵塞层析柱;一旦层析柱堵塞后,容易漏液,会造成H因子大量损失并且会污染生产车间,破坏车间的洁净度;而如果在S100溶解后稀释蛋白溶液,又会造成蛋白溶液的体积明显增加,增加层析次数,降低生产效率,增加生产成本。第二,降低S/D病毒灭活效果。因此,加入辛酸沉淀非H因子蛋白,降低总蛋白含量对于整体的工艺路线是非常关键的。
根据本发明的实施例,C7~C9短链脂肪酸和/或其衍生物选自C7~C9脂肪酸、C7~C9脂肪酸盐或C7~C9脂肪酸酯。由此,可以沉淀非H因子血浆蛋白。
根据本发明的实施例,C7~C9短链脂肪酸和/或其衍生物的终浓度为不超过10mM,优选不超过5mM。C7~C9短链脂肪酸的终浓度会影响H因子的沉淀程度,当C7~C9短链脂肪酸的终浓度大于10mM,在C7~C9短链脂肪酸作用下,H因子的溶解度小,容易沉淀,导致H因子收率降低;当C7~C9短链脂肪酸的终浓度不超过10mM时,H因子的溶解度大,不易沉淀,H因子保留在上清液中,H因子收率高,且大部分杂蛋白均可沉淀,上清液中杂质偏少。
更优选地,C7~C9短链脂肪酸和/或其衍生物选自辛酸、辛酸盐或辛酸酯。辛酸容易彻底去除,最终产品不会因辛酸残留产生副作用。此外,辛酸的加入和去除都十分简便,单次处理量大,易于产业化。同时,辛酸还具有灭活脂包膜病毒的效果,可以提高产品病毒安全性。辛酸对各种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及真菌具有抑制作用。大多数细菌、许多霉菌甚至病毒都能产生热原。因此辛酸可以减少细菌滋生和内毒素的产生。
发明人也尝试过采用聚乙二醇(PEG)沉淀蛋白,但是发现存在如下问题:
PEG的分子量虽比蛋白小,但蜷曲的构型使它具有较大的排阻半径,故难用透析或凝胶过滤将其去除。超滤必须用大量的溶剂,但只能将PEG浓度降低若干倍,不能完全去除。常规的层析也无法彻底去除PEG。
由于PEG粘度和分子量都很大,残留的PEG容易导致H因子浓缩物中病毒被包裹在PEG分子中,难以彻底灭活和去除病毒,造成最终产品存在病毒安全性的问题。
PEG的不良反应已有报道:局部用药可能引起过敏反应,包括荨麻疹和延迟性过敏反应;最严重的不良反应有:烧伤病人局部应用聚乙二醇产生高渗性,代谢物酸中毒和肾功能减退。可见PEG对于人体不是完全没有毒性的。因此,制剂中残留的PEG可能会引起一些副作用,增加代谢负担,影响肝功能和肾功能。
另一方面,由于PEG的黏度很高,流动性差,在工业生产中的取用复杂,增加生产过程中的难度。此外,含PEG的生产废液直接排放会造成水体缺氧并且已经超过了水体的自净能力,造成环境污染。
根据本发明的实施例,步骤S200是在搅拌状态下进行的,搅拌的转速为150~600rpm,步骤2中,混合的时间为1~5小时。由此,以便于使除H因子以外的其他大部分蛋白充分沉淀,提高上清液中H因子的纯度。
S300固液分离,收集上清液
在该步骤中,将固液混合物进行固液分离(如过滤或离心),收集上清液,得到含有H因子的初提液。
根据本发明的实施例,提取H因子的方法进一步包括:在pH3.8~4.5和35~40℃条件下,孵育步骤S300中得到的含有H因子的初提液。该步骤可以将含有H因子的初提液中的病毒有效灭活。
H因子中间品
在本发明的又一方面,本发明提出了一种H因子中间品。根据本发明的实施例,所述H因子中间品是通过前面所述提取H因子的方法所获得的。由此,根据本发明实施例的H因子中间品收率高、蛋白水解酶活性低。
本领域技术人员能够理解的是,前面针对提取H因子的方法所描述的特征和优点,同样适用于该H因子中间品,在此不再赘述。
提取血浆蛋白的方法
在本发明的又一方面,本发明提出了一种提取血浆蛋白的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:实施前面所述提取H因子的方法中的步骤1和步骤2,得到固液混合物;将固液混合物进行固液分离(如过滤或离心),收集沉淀,得到含有血浆蛋白的沉淀物。如前所述,利用前面所述提取H因子的方法可以使得除H因子以外的其他大部分蛋白沉淀,该沉淀可以用于进一步制备其他血浆蛋白,有利于提高血浆综合利用率。进一步地,还可以将含有血浆蛋白的沉淀物进行纯化处理,以便进一步提高血浆蛋白纯度。
本领域技术人员能够理解的是,前面针对提取H因子的方法所描述的特征和优点,同样适用于该提取血浆蛋白的方法,在此不再赘述。
血浆蛋白制品中间品
在本发明的又一方面,本发明提出了一种血浆蛋白制品中间品。根据本发明的实施例,血浆蛋白制品中间品是通过前面所述提取血浆蛋白的方法所得到的。由此,根据本发明实施例的血浆蛋白制品中血浆蛋白纯度高,收率高。
根据本发明的实施例,血浆蛋白制品选自下列至少之一:免疫球蛋白、白蛋白、凝血酶、凝血酶原复合物、纤维蛋白原、抗凝血酶III、α-1蛋白酶抑制剂、C1酯酶抑制剂、载脂蛋白A-Ⅰ、转铁蛋白和丁酰胆碱酯酶。
本领域技术人员能够理解的是,前面针对提取血浆蛋白的方法所描述的特征和优点,同样适用于该血浆蛋白制品,在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
采用考马斯亮蓝法检测总蛋白含量;采用ELISA试剂盒(产家Quidel)检测H因子含量。
第一部分 提取液pH、搅拌转速和温度的优化
实施例1(考察提取液pH对总蛋白含量和H因子含量的影响)
取FI+III沉淀,按照FI+III沉淀与提取液(48mM柠檬酸钠、290mM氯化钠和16mMEDTA)为1:5(重量比),分别加入不同pH值的提取液。在15℃,400rpm条件下,搅拌3h。检测FI+III沉淀溶解后上清中的总蛋白含量、H因子含量,用SDS-PAGE和Western Blot分析上清液,结果如表1、图2和图3所示。
表1不同提取液pH对总蛋白和H因子含量的影响
图2和图3中,上方的数字代表提取液的pH值。最左边的泳道为分离量为180Kda-35Kda的标准蛋白Marker,其余的泳道样品为不同pH值提取液得到的FI+III沉淀溶解上清液。图3中的每条泳道180Kda分子量附近的蛋白条带即为H因子。
从表1和图2均可以看出,当pH在4.0~7.0的范围内,随着pH值的降低,总蛋白含量逐渐降低,蛋白种类逐渐减少,即提取液的pH越低,越有利于提高H因子纯化的效果,减少非H因子蛋白的溶解量。从表1中还可以看出,pH在4.5~5.6这一范围内,大部分的H因子被提取出来,而非H因子的其他血浆蛋白含量较少。
实施例2
取FI+III沉淀,按照FI+III沉淀与提取液(48mM柠檬酸钠,320mM氯化钠和13mMEDTA)为1:5(重量比),加入pH 4.27的提取液。在15℃,600rpm条件下,搅拌1h,得到FI+III沉淀溶解液。FI+III沉淀溶解液pH为4.3,电导率为25.56ms/cm;与原料血浆相比,H因子回收率为33.87%。
实施例3
取FI+III沉淀,按照FI+III沉淀与提取液(30mM柠檬酸钠,280mM氯化钠和10mMEDTA)为1:2(重量比),加入pH 4.70的提取液。在15℃,400rpm条件下,搅拌3h,得到FI+III沉淀溶解液。FI+III沉淀溶解液pH为4.83,电导率为27.68ms/cm;与原料血浆相比,H因子回收率为60.46%。
实施例4
取FI+III沉淀,按照FI+III沉淀与提取液(48mM柠檬酸钠,320mM氯化钠和13mMEDTA)为1:5(重量比),加入pH 4.70的提取液。在15℃,600rpm条件下,搅拌1h,得到FI+III沉淀溶解液。FI+III沉淀溶解液pH为4.8,电导率为25.62ms/cm;与原料血浆相比,H因子回收率为49.85%。
对比实施例2和4可以看出,提取液pH为4.70时的H因子回收率优于提取液pH为4.27时的H因子回收率。
实施例5
取FI+III沉淀,按照FI+III沉淀与提取液(27mM柠檬酸钠,320mM氯化钠和8mMEDTA)为1:20(重量比),加入pH 4.00的提取液。在19℃,150rpm条件下,搅拌5h,得到FI+III沉淀溶解液。FI+III沉淀溶解液pH为4.21,电导率为25.34ms/cm。
过滤,滤饼弃去,保留滤液。所得滤液的pH为4.23,电导率为26.48ms/cm;与原料血浆相比,H因子回收率为50.10%。
实施例1-5实验结果表明:当控制提取液pH在4.0-5.0、电导率在25~30ms/cm,从包含FI和/或FIII的血浆级分沉淀中提取H因子,其回收率较高。
第二部分 考察辛酸浓度对H因子含量的影响
实施例6
取FI+III沉淀,按照FI+III沉淀与提取液(50mM柠檬酸钠,200mM氯化钠和15mMEDTA)为1:5(重量比),分别加入pH 4.20、pH 4.70、pH 5.60的不同pH提取液。在15℃,400rpm条件下,各自搅拌3h,得到FI+III沉淀溶解液(pH 4.30)和FI+III沉淀溶解液(pH4.80)。取FI+III沉淀溶解液,分别加入辛酸使其终浓度如表2所示,在15℃,400rpm条件下搅拌3h,过滤,所得滤液为H因子初提液。检测H因子初提液中的H因子含量,结果如表2所示。
从表2和表3中可以看出:
1、当H因子提取液pH为4.20时,总蛋白和H因子含量均较低,说明蛋白未被充分溶解;当pH为4.7时,蛋白被溶解出来。
2、在相同辛酸终浓度的情况下,随着pH的增加,总蛋白含量增加。并且pH5.6的总蛋白含量明显多于pH4.20和4.70的总蛋白含量。当pH为5.60时,总蛋白含量太高,总蛋白和H因子含量的差值达到10mM以上,未达到沉淀非H因子蛋白的作用。这说明当pH5.60以上时,大量的蛋白质都没有沉淀,非H因子蛋白会大量残留在H因子初提液中。
3、当pH为4.70时,随着辛酸终浓度的增加,辛酸浓度为5mM时,H因子初提液中H因子含量最高。
表2不同浓度的辛酸对H因子含量的影响
表3不同浓度的辛酸对总含量的影响
因此,FI+III沉淀溶解液中pH控制在4.0~5.0这一范围内,进一步地,选择不高于10mM的辛酸沉淀非H因子蛋白,可以将H因子从FI+III沉淀中提取出来,而将大部分非H因子的血浆蛋白(比如人免疫球蛋白、人血白蛋白)留在沉淀中。
该沉淀可以用于进一步制备其他血浆蛋白,有利于提高血浆综合利用率。因为样品辛酸含量过高,无法准确测定该步骤辛酸沉淀对人免疫球蛋白、人血白蛋白等血浆蛋白的沉淀效果,但是通过后续色谱纯化效果反推,5mM辛酸对非H因子血浆蛋白沉淀效果明显。
第三部分 “辛酸用于沉淀杂蛋白”与“辛酸用于沉淀H因子”的对比
对比例1(用辛酸沉淀血浆级分沉淀溶解液中的H因子,然后复溶,H因子回收率降低约10%)
向实施例2制得的FI+III沉淀溶解液中加入辛酸至终浓度为40mM,继续在15℃,600rpm条件下搅拌3h,过滤。滤液(C-1)弃去,取滤饼(C-2),按照滤饼(C-2)与溶解液为1:5(重量比)加入pH为4.80的第二溶解液(50mM枸橼酸钠、300mM氯化钠、15mM EDTA.Na2),在15℃,400rpm条件下,搅拌3h,过滤,所得滤液为H因子初提液。
滤饼(C-2)溶解后并且过滤前的溶液中的pH为4.8;与原料血浆相比,H因子回收率为17.64%。
滤饼(C-2)溶解并过滤后的H因子初提液的pH为4.6;与原料血浆相比,H因子回收率为7.08%。
对比滤饼(C-2)溶解液过滤前后的结果,可以看出过滤会导致H因子回收率大约降低10%。
实施例7(辛酸用于沉淀非H因子的杂蛋白)
向实施例3制得的FI+III沉淀溶解液中加入辛酸至终浓度为5mM,继续在15℃,400rpm条件下搅拌3h,过滤。
滤饼弃去,保留滤液,所得滤液为H因子初提液。H因子初提液的pH为4.80,电导率为28.90ms/cm。与原料血浆相比,H因子回收率为35.02%。
与对比例1相比,实施例7的H因子回收率提高了27.94%。
实施例8(辛酸用于沉淀非H因子的杂蛋白)
向实施例4制得的FI+III沉淀溶解液中加入辛酸至终浓度为5mM,继续在15℃,600rpm条件下搅拌3h,过滤。
滤饼弃去,保留滤液,所得滤液为H因子初提液。H因子初提液的pH为4.80,电导率为29.08ms/cm。与原料血浆相比,H因子回收率为43.02%。
实施例9(辛酸用于沉淀非H因子的杂蛋白)
向实施例2制得的FI+III沉淀溶解液中加入辛酸至终浓度为4mM,继续在15℃,600rpm条件下搅拌3h,过滤。
滤饼弃去,保留滤液,所得滤液为H因子初提液。H因子初提液的pH为4.7,电导率为29.01ms/cm。与原料血浆相比,H因子回收率为29.47%。
与对比例1相比,实施例7、实施例8和实施例9的H因子的回收率由7.08%分别大幅度提高至35.02%、43.02%和43.4%。造成对比例1中H因子的回收率低的原因为辛酸沉淀滤饼(C-2)无法完全溶解以及过滤损失等。由此可见多次溶解和过滤会使H因子损失很大。
表3不同辛酸处理方法制备H因子初提液中H因子回收率
辛酸沉淀单步回收率=辛酸沉淀上清液的H因子回收率×100%/FI+III沉淀溶解液的H因子回收率,体现辛酸处理步骤中H因子的损失情况。从表3可以看出,用辛酸沉淀杂蛋白的单步回收率在60~90%左右,而用辛酸沉淀H因子的单步回收率仅为20.9%。因此用辛酸沉淀杂蛋白制备H因子初提液的方法可以避免H因子的大量损失。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种提取H因子的方法,其特征在于,包括:
步骤1:将含有H因子的血浆级分沉淀溶解于提取液中,得到含有H因子的溶解液;
步骤2:将所述含有H因子的溶解液与C7~C9短链脂肪酸和/或其衍生物混合,得到固液混合物;
步骤3:将所述固液混合物进行固液分离,收集上清液,得到含有H因子的初提液。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述提取液的pH值为4.0~5.0;
任选地,所述C7~C9短链脂肪酸和/或其衍生物选自C7~C9脂肪酸、C7~C9脂肪酸盐或C7~C9脂肪酸酯。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述C7~C9短链脂肪酸和/或其衍生物的终浓度为不超过10mM;
任选地,所述C7~C9短链脂肪酸和/或其衍生物的终浓度为不超过5mM。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述提取液为包含蛋白酶抑制剂的缓冲液;
任选地,所述蛋白酶抑制剂选自下列至少之一:EDTA或其盐、乙二醇四乙酸、苯甲酰胺、苯甲酰胺盐酸盐或其衍生物、赖氨酸或其衍生物、6-氨基己酸或其衍生物、反式-4-(氨甲基)环己酸或其衍生物、4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟或其衍生物、(4-酰胺基-苯基)-甲烷磺酰氟或其衍生物、3,4-二氯异香豆素或其衍生物、亮抑酶肽或其衍生物、抑肽酶或其衍生物;
任选地,所述缓冲液中的缓冲剂选自乙酸盐、柠檬酸盐、Tris-HCl和磷酸盐的至少之一;
任选地,所述提取液包含20~100mM柠檬酸钠、150~320mM氯化钠和5~16mM EDTA或其钠盐。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述含有H因子的溶解液的电导率为25~30ms/cm;
任选地,所述含有H因子的血浆级分沉淀的总质量与所述提取液的质量比为1:(2~20);
任选地,所述含有H因子的血浆级分沉淀为FI+III沉淀。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1和步骤2均是在搅拌状态下进行的,搅拌的转速为150~600rpm;
任选地,步骤1中,所述溶解的温度为0~20℃,时间为1~5小时;步骤2中,所述混合的时间为1~5小时。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,进一步包括:
在pH3.8~4.5和35~40℃条件下,孵育步骤3中所述含有H因子的初提液。
8.一种H因子中间品,其特征在于,所述H因子中间品是通过权利要求1~7任一项所述提取H因子的方法所获得的。
9.一种提取血浆蛋白的方法,其特征在于,包括:
实施权利要求1~7任一项所述提取H因子的方法中的步骤1和步骤2,得到固液混合物;
将所述固液混合物进行固液分离,收集沉淀,得到含有血浆蛋白的沉淀物;以及
任选地,将所述含有血浆蛋白的沉淀物进行纯化处理。
10.一种血浆蛋白制品中间品,其特征在于,所述血浆蛋白制品是通过权利要求9所述提取血浆蛋白的方法所得到的;
任选地,所述血浆蛋白制品选自下列至少之一:免疫球蛋白、白蛋白、凝血酶、凝血酶原复合物、纤维蛋白原、抗凝血酶III、α-1蛋白酶抑制剂、C1酯酶抑制剂、载脂蛋白A-Ⅰ、转铁蛋白和丁酰胆碱酯酶。
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