JPS596288B2 - 血液等からの抗血友病因子８の回収方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗血友病因子（ＡＨＦ、因子■）を集める方法
に関する。

更に詳しくは本発明は血液又は血漿もしくは血漿分別物
から得られるＡＨＦの収率改良方法に関する。

代表的な血友病Ａは血液中の抗血友病因子（ＡＨＦ）、
即ち因子■が全く又は比較的不足することによって起る
病気である。

この病気を治療する方法は最近までは因子■を含む凍結
血漿又は血液を用いて因子■のレベルを回復させようと
する試みに基づいている。

けれども血漿を大量に必要とするため患者にかなりの負
担を与えない限り、失った蛋白質（ＡＨＦ）を最適レベ
ルに到達させることは不可能であった。

ＡＨＦ濃度を高くするため従来、人又は動物の血液から
ＡＨＦを単離したり、或いはＡＨＦに富む血漿を調製す
るなど種々の方法が提案されている。

実際にはこれらの方法では分別物のＡＨＦ活性が単離中
に消失する傾向があるため信頼性のあるものは少なかっ
た。

実際に、いずれの方法でも血漿から得られるＡＨＦの収
量が低く、従って一般に処理コストが高くなる。

単離におけるこの欠点は因子■が血漿中に痕跡量しか存
在しない不安定な蛋白質であり、他の血漿蛋白、特にフ
ィブリノーゲンから完全に分離することが困難であり、
また熱、凍結及び長期保存により容易に変性することに
よるものである。

血液及び血漿を別個の成分又は濃縮物に分別する方法は
種々知られている。

中でもＡＨＦの単離に有用な方法はクロマトグラフィー
、回分式吸着及び溶出、並びに選択的沈澱である。

こ〜で使用されている沈澱剤としてエタノール、エチル
エーテル、硫酸アルミニウム、リン酸塩〜クエン酸ナト
リウム、アミノ酸、及び凍結沈澱法などがある。

最近、血漿からグリシン沈澱させたＡＨＦ分別物を臨床
に用いることが開示されている。

血友病治療における重要な事実は低温度で凍結血漿を解
凍すると、因子■を多量に含む沈澱物が得られることを
発見したことである。

同様にＡＣＤ（クエン酸〜クエン酸ソーダ〜ブドウ糖混
合物）及びＣＰＤ（クエン酸ソーダ〜リン酸塩〜ブドウ
糖混合物）系凝固防止剤中に集めた血液から作られた凍
結沈澱中に含まれる因子■を抽出する方法も種々知られ
ている。

これらの方法はポリエチレングリコール、グリシン、エ
タノール及びこれらの組合せを用いている。

しかし以上の方法のいずれも、いかなる場合でもＡＨＦ
の回収率が比較的低く、しかも収率が大巾に変化するた
め、ＡＨＦを単離する方法として完全に実用的とは云え
なかった。

この多様性の一つの理由は供血者の血液中に含まれる因
子■の含有量が個人的に相違することによるものであり
、他の理由は集めたり、処理する技術が異なることによ
るものである。

あらゆる変量のうち９０の変量が凍結沈澱中の因子■の
収率な決定することが確認されている（Ｐｏｏｌ、 Ｊ
、Ｇ。

Ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｔａｔｅ Ｑｕａｌｉｔｙ ａｎ
ｄ ５ｕｐｐｌｙＴｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、 １５、
Ａ４．１９７５年７〜８月号ｐ３０５）。

凍結沈澱中のＡＨＦを全量回収するのは理想的な条件下
でさえ不可能であると思われる。

前記文献によれば凍結沈澱中では平均回収率３５〜４５
％、また凍結沈澱の透明液中では１０〜２０％であるが
、平均値が５０％も変化することが報告されている。

一般に凍結沈澱工程では全因子■の活性がかなり失なわ
れる。

ＡＨＦの全活性のうち１０〜４０％は凍結沈澱又は透明
液から回収できないが、これは説明するまでもない。

即ちこの損失は一般に蛋白質が不安定であることと収集
及び保存中、因子■の若干量は破壊されたり変性すると
いう事実によって説明されるだけである。

最近、ＡＨＦの冷時沈澱性は因子■の分子形状によるも
のであることが報告されている。

即ち分子のうち重い形状のものは凍結沈澱するが、軽い
形状のものは凍結沈澱しない。

特に超遠心分離した場合、凍結沈澱活性を有するものは
全て速いか或いは重い分子量のＡＨＦであるが、透明液
中で活性を有するものは遅いか或いは比較的低い分子量
のものであることが見出された因子■の分子構造につい
てはかなり議論されたり、論争されて来た。

この構造の正確な定義はなされていないが、２つの一般
的な考え方が存在している。

第一の考え方は分子量の合計が１０６の高分子量の糖蛋
白質であり、実際に免疫学及び生物学的にいずれも活性
のある分子量１９５０００の同一の複数個の補助単位か
らなるものである。

第二の考え方はこのような高分子の解離能力及び０．２
５ＭのＣａＣｌ２を含有する緩衝液中でアガロースカラ
ムクロマトグラフィーによって分離される能力に依るも
のである。

なおこれらの塩で解離した成分の正確な関係は未だ明ら
かにされていない。

前記低分子量補助単位は０．２５ＭのＣａＣｌ２の不存
在下で再度クロマトグラフィーにかけるとモノマー族と
しての行動を続けることが見出された。

最近、緩衝液からカルシウムを除けばこの小片は自然に
集合するが、０．００２Ｍのカルシウム（即ち生理的濃
度）を加えれば充分これを防止できると報告されている
。

しかし以上の研究からこの分野では一つの事実、即ち因
子■の分子の分子形状を決定する際のカルシウム及び／
又は他のイオンの本質的な役割が明らかである。

前述の如く分子の分子形状は因子■材料の凍結沈澱性及
び恐らくは低分子成分の安定性を決定するものと思われ
る。

従来のＡＨＦ回収法は、血液中のカルシウムイオンをキ
レート化する特にＡＣＤ、ＣＰＤ、ＥＤＴＡ、オキシレ
ート等の標準的なキレート化性凝固防止剤中にまず血液
を集めることに基すいている。

カルシウムのキレート化によってそこからカルシウムイ
オンが有効に除去できるし、またカルシウムは血の塊を
生成するのに必要であるため、血液が塊となるのを防止
する。

本発明はカルシウム及び／又は他のイオンの生理的濃度
を維持することにより血液及び血漿の正常な生理的環境
を防護するようにしたものである。

因子１分子の分子形状、凍結沈澱性及び実際に安定性は
カルシウム及び／又は他のイオンに依存するものとすれ
ば、この（又はこれらの）化合物の正常レベルの維持に
良い結果を与えることが期待される。

従って本発明は血液又は血漿中のカルシウム又ハ他のイ
オンの生理的濃度に影響を与えない非キレート化性凝固
防止剤であるヘパリン中に人の血液又は血漿を直接集め
、ついで得られた抗血友病因子■を公知の回収技術であ
る分別沈澱法（但し沈澱剤としてポリエチレングリコー
ルを使用スるに従って回収することを特徴とする血液又
は血漿からの抗血友病因子■の回収゛方法を提供するも
のである。

本発明に有用なヘパリンは血液凝塊過程の最終段階でプ
ロトロンビンのトロンビンへの転化を防止するこの好ま
しい非キレート化性凝固防止剤ヘパリンの使用量は集め
られた血液の全量に対し０．１〜１０単位／ｍｌの範囲
が好ましい。

ＡＨＦを分別する方法とじ５判１）ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ沈澱剤を用いて新鮮な又は凍結した血漿か
ら分別するか、或いは（２）ＰＥＧ沈澱剤を用いて凍結
沈澱から分別する方法が有用である。

この種の分別はこの分野で周知である。

ＰＥＧ分別については米国特許第３６５２５３０号明細
書（米国赤十字、１９７２年３月２３日）に、またＰＥ
Ｇ−グリシン分別法については米国特許第３６３１０１
８号明細書（Ｂ ａｘｔｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ１９７１年１２月２年目２月２８日れている。

このＰＥＧは一般にエチレンオキシドとエチレングリコ
ール又は水との反応によって得られ、構造式ＨＯ（Ｃ２
Ｈ４０）ｎＣ２Ｈ４ｏＨ（但しｎはオキシエチレン基の
平均数）を有している。

更に分子量約４４０〜約６０００のものが好ましい。

本発明方法では血液中に存在するＡＨＦは事実上すべて
血漿中及び血漿からのＰＥＧ分別物中に回収できる。

同様にきわめて高レベルのＡＨＦも更に凍結沈澱中及び
すべての不溶分を除去する遠心分離又は沢過、或いはカ
ラム又はパッチクロマトグラフィー技術等の公知の方法
により凍結沈澱の精製物中に含まれる。

本方法は人の血液又は血漿から因子■を回収する場合に
適用される。

以下本発明を下記実施例によって説明する。

なお特に記載しない限り部及びパーセントは全て重量で
示す。

実施例 １ 次の方法により血漿及び凍結沈澱中の因子■が高収率で
得られる。

任意の男女供血者の血液をヘパリンソーダを含む標準Ｆ
ｅｎｗ ａ ｌ血液袋中に集める。

血漿は集めた血液の全量に対し７〜８単位／ｒｎｌ使用
した（これは血液に対し約３〜５単位ヘパリン／ｍｌで
ある）。

遠心分離により血漿から赤色細胞を分離し、ついでこの
血漿を標準方法に従って試験用として或いは凍結沈澱の
製造用として集めた。

この方法が通常の集血法と比べて因子■の回収率を向上
させることを示すために、１人の供血者の血液を非キレ
ート化性凝固防止剤としてヘパリンを含む袋の中に集め
、また同じ供血者の血液をキレート化性凝固防止剤とし
てＣＰＤを含む他ノ袋の中に集めた。

これを６人の供血者について夫夫繰返し、またこれら２
つの方法で回収された因子■について比較を行なった。

これら６人の供血者から得られた結果を下記表１に示す
。

表中、血液中の因子■の全活性はカルシウムが存在する
と、ＣＰＤで集めた血液の１７７単位に対し２１５単位
と非常に高いことが判る。

またこのように活性が高いと、凍結沈澱中の回収率は高
くなる。

即ちカルシウムをキレートした場合、７６．３単位に対
し１６６単位であった。

実施例 ２ データの再現性を示すため、１０人の任意の供血者につ
いて実施例１の方法を繰返した。

単独の非キレート化性凝固防止剤としてヘパリンを含む
袋の中に各供血者の血液をいっばい（４５０ｃｃ）に集
めた。

通常の回収法よりも血漿及び凍結沈澱の両者中の因子■
の収率は蓄しく増加した。

実施例 ３ 同じ目的で通常使用される試剤の一つである分子量４０
００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて、更
に血漿又は前記血漿から誘導した凍結沈澱の精製を加え
て実施例１の方法を繰返した。

次の方法でＡＨＦ濃縮物を室温で調製した。

血漿のｐＨを０． Ｉ Ｎ酢酸で６．３に調整し、つい
でＰＥＧを充分加えて最終濃度を約４．５％にした。

ついで混合物を１０分間室温でゆるやかに攪拌後、３２
５０Ｘｆで１５分間遠心分離した。

透明液をデカンテーションし、沈澱を捨てた。

ついで透明液のｐＨを０． Ｉ Ｎ酢酸又は必要あれば
ＮａＯＨで６．０に調整し、またＰＥＧの濃度を約１１
％にした。

混合物をゆるやかに４５分間攪拌した後、２０００ｘｆ
で１０分間遠心分離して沈澱物を沈降せしめた。

透明液をデカンテーションし、ＣＰＤサンプルからの沈
澱はグリシン−クエン酸含有食塩緩衝液中に再溶解した
。

ヘパリンサンプルからの沈降は１ｍｌ当り１単位のヘパ
リンＵ、Ｓ、Ｐを含む同じ緩衝液（ｐＨ７，２）に入れ
た。

これらの分別の結果を表３に示す。

これらの結果からすべての分別物中のＰＥＧ分別後の回
収率はカルシウム環境が維持されると、非常に高くなる
ことが理解できる。

出発血漿からは血漿のＰＥＧ沈澱がカルシウムの存在に
よって２０６．４単位生じ、またそれによって１１１．
５単位除去された。

凍結沈澱からＰＥＧ回収を行なった比較値は１１６．２
及び４６．４単位であった。

これらの値はすべてのレベルで充分意味がある。

カルシウム及び／又は他のイオンの生理的レベルを維持
した場合は表４に示すように比較的収率が向上した。

いずれの場合も因子■の回収率は著しく向上した。

実施例 ４ 本発明によるＡＨＦの安定性は通常のものよりも大巾に
向上する。

血漿及び凍結沈澱からのＰＥＧ沈澱を水中に再度懸濁さ
せた後、室温（２５℃）で２４時間放置した他は実施例
３の方法を繰返した。

８．１８及び２４時間で分析を行なった。

カルシウム及び／又は他のイオンの生理的濃度を維持し
たサンプルの２４時間後の初期ＡＨＦ活性は９８％であ
った。

カルシウムを１ｃＰＤ中に集めることによって除去した
場合は、ＡＨＦ活性は７５％に過ぎなかった。

キレート化性凝固防止剤ＣＰＤ及び非キレート化性凝固
防止剤ヘパリンを組合せた場合について表１と同様なデ
ータを作成した結果を表５に示す。

これら凝固防止剤の組合せはＣＰＤ凝固防止剤単独の場
合よりも因子■に対する回収率は良いが、ヘパリン凝固
防止剤単独の場合程効果的ではない。

ＣＰＤ及びヘパリンを組合せた場合について表３のよう
に作成した結果を表６に示す。

この場合もヘパリン凝固防止剤単独がＣＰＤ単独或いは
：ＣＰＤ及びヘパリンの組合せよりも良い結果を与えて
いる。

実際の向上結果を表６にパーセントで示した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヘパリンよりなる非キレート化性凝固防止剤中に直
   接集められた人の血液又は血漿もしくは血漿分別物から
   抗血友病因子■を、沈澱剤としてポリエチレングリコー
   ルを用いて分別沈澱により回収することを特徴とする血
   液等からの抗血友病因子■回収方法。 ２ 前記凝固防止剤が血液又は血漿の全量に対し０．１
   〜１０単位／ｍｌ使用される特許請求の範囲第１項記載
   の方法。