SE448945B - Forfarande for rening och /eller koncentrering av faktor viii-komplexet - Google Patents

Description

L". 10 15 30 448 945 2 nent svarar för komplexets koagulationsaktivitet i den visade reaktionskedjan. Denna komponent anses innehålla det antigen, som påvisas med antikroppar, vilka utvecklas hos vissa blödar- sjuka och vilka hämmar koagulationsaktiviteten hos faktor VIII:C.

Antigonet benämnas F VlIl:CAG. Den andra komponenten har be- nämnts faktor VIII-RAG eller F VIII-relaterat antigen. Detta antigen är skilt från antigenet F VIII:CAG. Faktor VIII:C och (antigenet) faktor VIlI:CAG saknas vid blödarsjuka typ A i svår form. Vid denna sjukdom finnes en normal halt av faktor VIII:RAG.

Vid v. Willebrands sjukdom föreligger en brist på faktor VlII:RAG i blodet och en därmed motsvarande brist på faktor VIII:C. Hos personer med en svår form av v. Willebrands sjukdom är bristen på faktor VIII:RAG i det närmaste total och halten av faktorn VIII:C ligger vid ungefär 5 % av den normala halten. Vid v. Willcbrands sjukdom är aktiviteten hos s k faktor VIII:RCF starkt minskad. Denna aktivitet är ett uttryck för en komponent i plasma, som i närvaro av antíbiotikumet "Ristocetin" för- orsakar agglutination av trombocyter. Det anses nu, att aktivi- teten av faktor VlII:RCF är ett uttryck för den eller de kompo- nenter i plasma, som har det faktor VIII-relaterade antigenet (faktor VIII:RAG). Bristen på faktor VIII:RCF vid v. Willebrands sjukdom har visat sig vara korrelerad till den förlängda kapil- lära blödningstid, som finnes vid denna sjukdom och som är ett uttryck för bristfällig trombocytfunktion. Vid hämofili typ A är denna funktion normal, medan däremot koagulationstiden hos blodet är förlängd på grund av den minskade halten av faktor VII[:C. Vid v. Willebrands sjukdom är koagulationstiden ävenledes förlängd, eftersom vid denna sjukdom, speciellt i svåra former därav, brist på faktor VIII:C även finnes. Bristen pâ faktor VIIl:C vid v. Wíllebrands sjukdom anses vara en följd av bristen pa faktor VllI:RAG/RCF, vilken synes fungera såsom bärarmolekyl för faktor Vl[[:C. I enlighet med de värden, som föreligger, kan man schomatiskt åskådliggöra faktor VIII-komplexet på föl- jnnde sätt: F VIII:RAG/RCF = = F VIII:C/CAG _ Ett flertal metoder är för närvarande kända för framställ- ning av plasmakoncentrat för kliniskt bruk, vilka innehåller fak- tor VIII-komplexet eller delar därav. Komplexet kan utfällas från Cohns fraktion I med alkohol. Ytterligare koncentrering ry 'Lt 10 l5 30 10 448 945 av komplexet kan ske genom extraktion av inert protein med cirka l M glycinlösning i kyla. Fraktíonering av plasma med eter eller garvsyra har även använts för framställning av faktor VIII- koncentrat. Koncentrat framställda genom utfällning i kyla av faktor VIII-komplexet har fått vidsträckt användning på grund av metodens enkelhet. Polyetylenglykol har i vissa fall använts för utfällníng av faktor Vlll-komplexet. Varianter av glycin- metoden, vid vilka antingen andra aminosyror än glycin använts eller glycin använts för utfällning av faktor VIII-komplexet, är även kända.

Koncentrat, som framställts enligt glycinmetoden, innehål- ler alla faktorer i faktor VlII~komplexet, men den specifika aktiviteten är låg, varför stora volymer lösning måste injiceras vid behandling av blödarsjuka. Preparat med hög specifik aktivi tet har ofta visat sig sakna den faktor, som korrigerar den för- längda blödningstiden vid v. Willebrands sjukdom.

Vad beträffar utbytet av den koagulationsaktiva delen (F VIHEC) är detta vid de flesta framställningsmetoderna lågt l eller i bästa fall mellan ZU och 30 l.

Vid behandling av blödarsjuka är det av stor betydelse att använda koncentrat av F VIII-komplexet med hög specifik aktiví_ tet av alla de i komplexet ingående faktorerna. Med ett Sådant koncentrat kan såväl hämofili A som v. Willebrands sjukdom be- handlas. En specifik aktivitet, som är 200-300 gånger större än den i plasma, tillåter även preparatberedningar, som innehål- ler den nödvändiga terapeutiska dosen i en ringa volym (5-10 ml).

Detta underlättar behandlingen, enär dosen kan administreras i en injektionsspruta. Detta möjliggör även, att behandlingen ut- föres, t ex i hemmet, av den sjuke själv, såsom är vanligt vid behandlingen av sockersjuka med insulin.

Blodförsörjningen är i de flesta länder otillfredsställan- de vad beträffar möjligheterna att ur tillgängliga blodvolymer framställa tillräckliga mängder faktor VIII-komplex för behand- ling av blödarsjuka. Denna situation skulle avsevärt förbätt- ras, om det procentuella utbytet av faktor VIII-komplexet vid lramställning ur blod kunde höjas.

Det har nu visat sig möjligt att framställa ett fullgott faktor VIII-komplex med en specifik aktivitet, som är cirka 150- 250 gånger större än den i plasma, medan utbytet håller sig mêllün 40 0Ch 60 %. Förfarandct enligt uppfinningen kännetecknas 10 15 30 35 40 448 945 4 därav, att preparatet löses i en glycinlösning med en koncentration av minst 1,5 M och upp till mättad lösning vid en temperatur i inter- vallet +15°C till +40°C, ett pH av 6,3-7,8 och en jonstyrka av 0,1-0,5, beräknat såsom buffertsalter, varvid en fällning av inert protein bildas, och att överskiktad vätska utvinnes. Den erhållna produkten (faktor VIII-komplex) innohällvr den antihäm0fi1n faktor (lnkíor Vlllzfl/CAC) och den komponent (faktor VIIl:RAG/RCF), som saknas vid v. Willcbrands sjukdom.

Det på i och för sig känt sätt erhållna utgångspreparatet kan framställas genom kryoprecipitering eller fraktionering av plasma med alkohol. Genom förfarandet enligt uppfinningen utfälles därefter föroreningar i glycinlösning vid och omkring rumstem- peratur och vid neutralt pH. Vid tidigare kända förfaranden har glycinlösningar använts vid låg temperatur för utlösning av föroreningar från utfällt faktor VIII-komplex. Glycin vid en koncentration av cirka 2 M har även använts för utfällning av faktor VIII-komplexet ur en proteinlösning vid låg temperatur.

Enligt uppfinningen behandlas nu preparatet av faktor VIII- komplex vid en temperatur av minst TSOC, lämpligen vid en tempe-- on- av- 15-3701; t ex zo-3s°c, förorrsmesvis vid cirka :so°c.

Härvid förblir faktor VIII-komplexet i lösning, medan förorenande protein utfälles. pH är 6,3 - 7,8, dvs. ungefär neu- tralt. Jonstyrkan i lösningen är mellan 0,1 och 0,5, då den räknas såsom buffertsalter. Glycínkoncentrationen vid utfällningen av för- oreningarna kan variera mellan 1,5 M och mättad lösning och är lämpligen 1,6-2,3 M, t ex 1,8-2,2 M, företrädesvis cirka 2,0 M.

Genom denna utfällning av i föreliggande sammanhang inert protein ökas den specifika aktiviteten i den överskiktade vätskan Z-7 gånger och utbytet ligger mellan 80 och 100 %.

Uppfinníngen beskrives närmare i följande exempel under . hänvisning till dess användning vid fraktionering av blodplasma.

I exemplen hänvisas till bifogade ritning, på vilken fig 1 visar protein och aktivitet i den överskiktade vätskan och den specifi- ka aktiviteten såsom funktion av glycinlösningens molaritet.

Pig 2 visar aktiviteten i överskiktad vätska och i fällning samt protein i den överskiktade vätskan såsom funktion av temperatu- ren. l fig 3 och 4 visas samma storheter såsom funktion av pH resp jonstyrka.

Exempel 1. lösning i en mängd av 50 ml citratlösning per 450 ml blod.

Blod uppsamlas i citratfosfat-dextros-adenin- Blodceller avlägsnas genom centrifugering och plasma av- 10 15 20 25 40 448 945 suges. Plasmat fraktioneras enligt Cohns fraktioneringsmetod med alkohol. kvarvarande fällningen, benämnd fraktion I-0, innehåller faktor Fraktion I tvättas i kyla med glycinlösning. Den VIII-komplex och löses i 0,055 M natriumcitratlösning (pH 6,8) Till 4 delar av denna lösning sättes vid rumstemperatur 8 delar av en buffert med pH 6,8 innehållande varierande mängder glycin, 0,125 M NaCl och 0,025 M imídazol. ning genom centrifugering vid omgivningstemperatur. till en proteinkoncentration av cirka 2 %.

Efter omröring i 15 min avlägsnas bildad fäll- Fällningen löses i cítratlösning. Såväl fällning som överskiktad vätska analyseras med avseende pâ aktivitet för faktor VlII:C (normali- soring av koagulationstiden av plasma från personer med hämofili efter rekalcificering) eller med kommersiellt reagens (IMCO AB, Stockholm). ten av detta försök framgår av fig 1.

Totalprotein bestämmes med Lowrys metod. Resulta- Såsom visas i fig utfäl~ les avsevärda mängder inert protein ur lösningen av fraktion I-O vid glycinkoncentrationer av 1,1-2,2 M. När glycinhalten ökar över 2,2, sker ytterligare utfällning av inert protein, men be- tydande förluster av faktor VIII:C kan ske från den överskiktade vätskan. Vid en glycinhalt av 1,5-2,0 M är utbytet av faktor VlII:C i den överskiktade vätskan högt, medan halten protein däri är betydligt lägre än i ursprungslösningen. Den specifika aktiviteten hos den överskiktade vätskan är vid en glycinkoncent ration av 2 M cirka 5 gånger högre än i ursprungslösningen.

Exempel 2. Blod och plasma beredes på det i exempel 1 beskrivna sättet. En motsvarighet till fraktion I-0 framställes genom ut- frysning av faktor VIII-komplexet genom att till plasmat sättes polyetylenglykol 4000 i en mängd av 1 %. Blandningen nedfryses vid -7o°c. smält, en fällning som benämnes kryofällning. Denna innehåller mellan 60 och 90 % löses i 0,055 M natriumcitratlösning (pH 6,8) till en protein- Vid långsam tining till +4°C kvarstår, när all is av plasmats faktor VIII-komplex. Fällningen halt av cirka 3 %. Till 5 delar av denna lösning sättes vid 10ø, 200, 300 resp 37OC 10 delar av en buffert innehållande 3,0 M glycin, 0,125 M NaCl och 0,025 M imidazol (pH 6,8). nu bringas i jämvikt vid de olika temperaturerna under omröring Blandningar- i 15 min. Den bildade fällningen avlägsnas genom centrifugering.

Fällning och överskiktad vätska analyseras såsom i exempel 1.

Såsom framgår av fig 2, är separationen av faktor VIII- komplexet från inert protein i hög grad beroende av temperaturen ,,,.,_.. _.,__._...._q__...._...__._.-..-.... .._-.._.. __ .m A 10 15 l\) irl (A in 40 448 945 6 i glycin~proteinblandningen. Vid temperaturer över 15°C åter- finnes huvuddelen av faktor VIII-komplexet i den överskiktade vätskan, medan vid lägre temperaturer huvuddelen finnes i fäll- ningen.

Exempel 3. Kryofällningen (se exempel 2) löses i 0,055 M citrat- Till 4 delar av denna lösning sättes droppvis vid 30°C 8 delar buffert inne- hållande 3 M glycin, 0,125 M NaCl och 0,025 M imidazol, vars pH inställts på 6,3; 6,8; 7,3 resp 7,8. 3000 avlägsnas den bildade fällningen genom centrifugering och lösning (pH 6,8) till en proteinhalt av cirka 5 %.

Efter 15 min omröring vid löses i citratlösning (pH 6,8). Overskiktad vätska och fällning analyseras enligt exempel 1.

Såsom framgår av fig 3, är Skillnaderna i aktivitet och utbyte vid olika pH relativt små. Optimal separation av fak- tor VIII-komplexet till förmån för överskiktad vätska erhålles vid ungefär neutralt pH.

Exempel 4._ 3) försättes droppvis vid SOOC med 10 delar glycin-imidazol- Sammansättningen av de S delar lösning av kryofällningen (se exempel Z och lösning med varierande halt koksalt. olika tíllsatslösningarna är följande: a) 3 M glycín, 0,025 M imidazol, pH 6,8; 2) 3 M glycin, 0,025 M imidazol, 0,3 M NaCl, pH 6,& 3) 3 M glycin, 0,025 M imidazol, 0,6 M NaC1, pH 6,8.

Efter åstadkommande av jämvikt vid 3000 under 15 min av- lägsnas erhållna fällningar genom centrifugering. Overskiktad vätska och fällning analyseras enligt exempel 1.

Resultaten visas i fíg 4. Variationen i jonstyrka mellan 0,1 och 0,5 har endast ringa verkan på fördelningen av faktor VIII-komplexet i överskíktad vätska och fällning.

Exempel 5. Fraktion I-0 löses i citratlösning (se exempel 1) till en proteinhalt av cirka 2 %. Till 5 delar av erhållen lös- ning sättes vid ZOOC 10 delar 3 M glycin innehållande 0,125 M NaCl och 0,025 M imidazol, pH 6,8. lägsnas fällningen (F I) genom centrifugering.

Efter omröring vid ZOOC av- Overskiktad Härefter till- sättas vattcnhaltig, 30-procentig polyetylenglykol 6000 till en vätska (ovanvätska = Ovanv I] nedkyles till 4°C. slutlig koncentration av 10 %. Efter omröring i 30 min vid 4°C avlägsnas fällningen (F II) från överskiktad vätska (ovanvätska = Ovanv II) genom centrifugering. Alla överskiktade vätskor och fällningar analyseras pâ det i exempel 1 beskrivna sättet. 7 448 945 Fördelningen av protein och faktor VIII-komplex i de olika fraktionerna framgår av följande tabell 1. Såsom framgår av tabellen är fraktion I-0 lämplig såsom utgângsmateríal för fraktionering. Resultaten visar, vilket är viktigast, att faktor VIII-komplexet i den överskíktade vätskan efter utfäll- ning av ínert protein med glycín kan koncentreras genom utfäll- ning med polyetylenglykol. ..._.__._.._._...._.-......._....., . V _ ___....__... W _..........._.._ .. 448 945 w._m O « «@.m NN É Ém Ü m @.<~ ~.@_ <_,@ - - - wß HH >n@>o @.,~ m.@ mäns m__@ @_~ m“_~ Q. H L @.ßß =.mm @@.o 1 - - cm H >wm>@ o@_ m.~« @m.~ Co_ “mm w.@~ w. @\M m w U HE\w w wa HE\wš HE za* u~HHH> .wok u"HHH> .ucuz .uoæ zflouoha ~o> f<;p 4Am: . _....._.. .___ww-._..._:_____._......_.- I UI U b! 448 945 (1 E§gmnel_Q. F11! 5 delar lösning av kryoprecipitatet (se exempel 4) süttes vid iüufl 10 delar lösning ínnehullande 3 M glycin, 0,125 M Nnßl och 0,025 M lmíduzol vid pH 0,8. Efter omröríng i IU min avlägsnas bildad fällning (F I) genom centrifugerínfi.

Den övcrskiktudc vätskan (Ovanv I) kyles till 4°C, varefter dr«ppvis tillsättes en 30-procentig vuttenlösning av polyetylen- glvkul 0000 tllí un koncentration av 6 %. Efter omröríng i Su min avlägsnas fällníngen (F Il) från den överskiktade vätskan [üranv II) genom centrifugering. Alla fraktioner analyseras på beskrivet sätt.

Resultaten av försöket framgår av tabell 2. Av denna frumgnr att kryoprecipitat likaväl som fraktion I-O är lämp- ligt för denna typ av fraktionering. Försöket visar även, att Faktor VIII-komplenct, som enligt uppfinningen erhållits i den överskiktude vätskan, kan koncentreras genom utfällníng med polyetylenglykol. 448 945 10 HH H m.<@ N HHXN HH.H @._H N.w~xN H.H m.w Hav HH H - H.m w.~ HN @@.o - 1 - HH HH >n@>o Hann @.H_ H.HH m@.@ H.«« HHN @.@ m.HN H H - m.mH ~._@ NH.. - - - mm H >=fl>o ~.; :GH @.H@H HH.m QOH www fnøu H.wH OHHH wEH.. w u. fin» M.. mä Tämä HH: HH@.=m U H_H> .HQH U HHH> .HOHH .How =H@H0HH H@> HflHH m Hamn/i.

I0 15 20 448 9045 11 Qšemgel 7. Kryofällníng (se exempel 2) löses i 0,0SÉ M citrat- Till 1 del av denna lösning sättes 3,3 delar av en lösning innehållande 2,6_M -v lösning, pH 6,8, till en koncentration av J %. glycín och 0,025 M imidazol, pH 7,3. brlngus samtidigt till 70C.

Blandníngens temperatur Efter tillsatsen bríngas bland- ningen i jämvikt under omröring vid TOC i IS min. En fällning Den överskikta- Fällníngen löses i (P I) bildas och avlägsnas genom centrifugering. de vätskan (Ovanv I) sparas för analys. 0,055 M cítratlösnlng, pH 6,8, vid 30°C till ungefär samma volym som den ursprungliga kryofällningen, varefter tillsättes 3,3 volymer av en lösning innehållande 2,6 M glycín, 0,3 M NaCl och 0,025 M imidazol, pH 6,8.

Bildad Eällning (F II) avlägsnas genom centrifugering.

Omrörlng sker vid SOOC i 20 min.

Den över- skíktnde vätskan (üvanv Il) inställes på pH 7,5 med svag natrium- hydroxidlösning efter nedkylning till 400. “Därefter tillsättes droppvis en 30-proeentig vattenlösning av polyetylenglykol 6000 till en koncentration av 6,5 %. Blandningen omröres vid 400 under 30 min, varefter bildad fällning avlägsnas genom centrífu- geting. Fällningen (F III) löses i 0,055 M natriumcitratlösning innehållande 0,055 M imidazol, pH 7,40. (0vanv III) sparas för analys.

Uverskiktad vätska Alla fraktionerna analyseras pà det í exempel 1 beskrivna sättet och resultaten framgår av Följande tnholl 3. 448 945 HHH L. ß=.~ h._~ ~ßF w.ßN m.4 mw 4.m_ w.@ _ - m.w w 40.0 1 - - w@_ HHH >=~>o ~=.= m.@ m. @<.o «._« men m.mN om HH L - @.ß@ m@_ ~@.Q - - - æ@_ HH >==>o æm.= ~.@@ www @@.m @.@4 wfiw w._~ Q? H u « w.m~ Nm mN.= - - - m~N H >:«>o 4~.@ oo. QQN @~.« COW mom" 4.om Qm 0»»« æëïw w w Éšw .w . wa Tämä HE p¿@.@m U HH~> .MOR U H_H> .yoga .H04 qmwuohm ~0> Mmhm r- Aqmmíw , ..._._..,.-...._..>..... _._.. . ,.. -. .A.._.......,- . 10 448 945 lo §š§mpel_§. I tidigare exempel har analyserna av faktor VIII- I följande tabell 4 visas analyser av ett faktor VIII-komplex, vilket isolerats i komplexet endast omfattat faktor VII1:C. huvudsak på det i exempel 7 beskrivna sättet. 'mßmrt 4 Frakrion Pmt. vmzc vImcAG F vILnRAc vnlmcr füfíïïfitet :ey-O 100 100 100 100 100 0,15 r n: 4 es 61 79 48 2,1 Anm. Faktor V1II:C kan bestämmas enligt Nilsson et al: Acta Mod. Scan. låg, 35 (1953) eller enligt Savidge et al: Thromb. Res. lg, 355 (1979). Faktor VlIl:CAG kan bestäm- Invest 62, 1048 (1978). mas enligt Lazarchick och Hoyer, J.Clin. __ Av tabellen framgår att komplexet, uttryckt i procent, 1nnehü11er samma halt av kongnlationsfuktor VIII:C som av faktor VIII:CAG. Halten av faktor VIII:RAG är något högre och halten av faktor VIll:RCF (som saknas vid v. Willebrands sjuk- dom) är något lägre än av faktor Vlll:C/CAG.

Det är tydligt, att man vid fraktionering med glycin en- ligt uppfinningen i kombination med andra fraktíoneringsför- Earanden kan erhålla produkter med hög specifik aktivitet och hög löslighet i gott utbyte. Vidare innehåller dessa preparat alla de aktiviteter som utöver F VIII:C är förknippade med faktor VIII-komplexet.

VlII:C-aktivitet är ungefär 0,014 E/mg) blir den specifika akti- viteten hos produkten 150-250 gånger större, varvid utbytet från I jämförelse med plasma (vars specifika ll plasma under optimala betingelser är 40-on 0.

Claims (5)

448 945 14 Patentkrav

1. I. Förfarande för rening och/eller koncentrering av fak- tor VIII-komplexet, varvid man utgår från ett på känt sätt på faktor VIII-komplexet anrikat och erhållet preparat, oftast i form av fällning, k ä n n e t e c k n a t därav, att prepa- ratet löses i en glycinlösning med en koncentration av minst 1,5 M och upp till mättad lösning vid en temperatur i inter- vallet +15°C till +40°C, ett pH av 6,3-7,8 och en jonstyrka av 0,1~0,5, beräknat såsom buffcrtsalter, varvid en fällning av inert protein bildas, och att överskiktad vätska utvinnes.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att man utgår från kryoprecipitat eller Cohns fraktion I-O. 7

3. Förfarande enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att temperaturen är mellan 20 och 40°C, lämpligen 25-37°C.

4. Förfarande enligt något av krav 1-3, k ä n n e t e c k- n a t därav, att pH ínställes på 6,5-7,5, företrädesvis cirka 0,8, före utfällningen av ínert protein med glycinlösning.

5. Förfarande enligt något av krav 1-4, k ä n n e t e c k- n a t därav, att glycinlösningen utgöres av en 1,8-2,2 M lösning, t ex en cirka 2,0 M lösning.