DE69735295T2

DE69735295T2 - Verfahren zur Aufkonzentrierung von Antikörperlösungen

Info

Publication number: DE69735295T2
Application number: DE69735295T
Authority: DE
Inventors: Julian Marcus Glaxo Wellcome plc. Beckenham RELTON
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1996-05-24
Filing date: 1997-05-22
Publication date: 2006-10-05
Anticipated expiration: 2017-05-23
Also published as: KR20000015935A; ES2258277T3; PL330111A1; GB9610992D0; ATE318146T1; JP3338060B2; AP9801392A0; BR9709267A; AU731950B2; IS4892A; NO985464L; YU53098A; CO4850562A1; US6252055B1; IL126940A0; NZ332625A; EA199800946A1; DE69735295D1; TR199802423T2; ZA974486B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine konzentrierte Antikörperzubereitung, eine pharmazeutische Formulierung, die eine solche Zubereitung enthält, ihre Verwendung bei der Therapie beim Menschen und Verfahren für ihre Zubereitung.
Die meisten kommerziell verfügbaren Immunglobuline, die mit einer hohen Konzentration produziert werden, sind von menschlichem Serum abgeleitet und werden von der Blutprodukteindustrie produziert. Die erste gereinigte menschliche Immunglobulin G (IgG)-Zubereitung, die klinisch verwendet wurde, war Immunserumglobulin, das in den 1940-ern hergestellt wurde (Cohn, E.J. et al 'Preparation and properties of serum and plasma proteins'. J. Am. Chem. Soc. pg. 68, 459–475 (1946) und Oncley, J.L. et al 'The separation of antibodies, isoagglutinins, prothrombin, plasminogen and β-lipoproteins into sub-fractions of human plasma.' J. Am. Chem. Soc. 71, 541–550 (1949)).
Die nächste Generation von gereinigten IgG's wurde in den 1960-ern entwickelt und fokussierte sich auf Zubereitungen, die für die intravenöse Verabreichung geeignet sind (Barandun, S. et al 'Intravenous administration of human γ-globulin.' Vox. Sang. 7, 157–174 (1962)). Die erste von diesen intravenösen IgG-Zubereitungen (Gamimune^®, Cutter Biological) wurde als eine 5%-ige (50 mg/ml) IgG-Lösung in 0,2 M Glycin, 10% Maltose, pH 6,8, formuliert. Diese Lösung war bei 5°C mindestens 2,5 Jahre stabil. Die Hauptkriterien für die Akzeptanz von intravenösen IgG (IVIG)-Produkten waren, daß das IgG wenig Fragmentierung erlitten hatte und daß keine Aggregate mit hohem Molekulargewicht anwesend waren.
Heute sind therapeutische Immunglobulin-Produkte für den Menschen für die intramuskuläre (IMIG) oder intravenöse (IVIG) Verabreichung verfügbar. IMIG werden prinzipiell für die Hepatatis A-Prophylaxe und manchmal für die Behandlung von agammaglobulinämischen Patienten verwendet. IVIG werden bei der Behandlung von primären Immundefekten und idiopathischer thrombocytopenischer Purpura so wie für sekundäre Immundefekte, verschiedene Infektionen, hämatologische und andere Autoimmunkrankheiten verwendet. Im Allgemeinen werden IMIG-Produkte als 16%-ige (Gew./Vol.) (160 mg/ml) Lösungen und IVIG-Produkte als 5%-ige (Gew./Vol.) Lösungen (50 mg/ml) vermarket.
Die Erfahrung der Hersteller mit IVIG zeigte, daß diese Zubereitungen in relativ verdünnten Lösungen (< 10% (Gew./Vol.)) instabil sind und die Instabilität manifestiert sich in der Bildung von unlöslichen Partikeln durch einen Prozeß, der als 'Shedding' bekannt ist, wenn das Material bei Raumtemperatur aufbewahrt wird (Fernandes, P.M. und Lundband, J.L. 'Preparation of a stable intravenous gammaglobulin: process design and scale up.' Vox. Sang. 39, 101–112 (1980)). Kommerziell verfügbares 16,5%-iges γ-Globulin wird üblicherweise in einer gepufferten Glycin-Kochsalzlösung stabilisiert. Es wurde gezeigt, daß die Verwendung von Maltose mit 5–10% als Stabilisator beim Schutz von 5%-igem IVIG vor der Partikelbildung wirksam ist (Fernandes et al vorstehend).
Zusätzlich zum Shedding haben konzentrierte (16,5%) Lösungen von IVIG bei der Langzeitlagerung eine Tendenz zur Aggregation. Bis zu 10–30% (Gew./Gew.) der IVIG-Lösung könnten als Aggregate enthalten sein (Gronski, P. et al, 'On the nature of IgG dimers. I. Dimers in human polyclonal IgG preparations : kinetic studies.' Behring Inst. Mitt. 82. 127–143 (1988)).
Die Mehrheit dieser Aggregate sind Dimere, die durch Komplexe von idiotypischen und anti-idiotypischen Antikörpern produziert werden. Da monoclonale Antikörper, die aus Überständen von Gewebekultur gewonnen werden, keine anti-idiotypischen Antikörper enthalten, fehlt diese Art von Dimeren. Die Dimerenbildung bei diesen Zubereitungen kann jedoch durch die Komplexierung zwischen partiell denaturierten monomeren Antikörpermolekülen verursacht werden. Der mechanische Streß, wie derjenige, der während der Tangentialfluss-Ultrafiltration auftritt, die für die Konzentration von Antikörperzubereitungen verwendet wird, kann auch zu einer Erhöhung der Aggregation führen (Wang, Y.-C.J. und Hanson, M.A. 'Parenteral formulations of proteins and peptides : stability and stabilisers.' J. Parenteral Sci. Technol. 42, Suppl. S3–S26 (1988)).
Konzentrierte (>100 mg/ml) Zubereitungen von Immunglobulinen sind daher verfügbar, aber bisher sind sie polyclonale Antikörperzubereitungen, die von der Blutverarbeitungsindustrie stammen und die durch die Zugabe verschiedener Träger wie Glycin und Maltose stabilisiert werden.
Es ist daher überraschend, daß in Abwesenheit von Trägern und ohne einen gleichzeitigen Anstieg von Aggregaten Zubereitungen von monoclonalen Antikörpern mit einer Konzentration von >100 mg/ml erhalten wurden.
Der Derwent Abstract der JP01268646A (AN89-359879) berichtet, daß die Anmeldung eine Zubereitung eines monoclonalen IgG₃-Antikörpers für die Injektion beschreibt, der eine Konzentration von 0,1 μg bis 100 mg/ml hat. Der in diesen Publikationen offenbarte Sachverhalt ist außerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
In der WO94/15640 wird ein Verfahren für die Beschichtung von Geweben und Biomaterialien mit dem vollständigen Repertoire an Immunglobulinen (Ig) offenbart. Sie zeiht Ig-Konzentrationen von bis zu 200 mg/ml in Erwägung, obwohl es in der Offenbarung kein Beispiel gibt, wie man das erreichen kann.
In Velez. Biotech. Bioengin. Bd. 33, S. 938–940 (1989) wird die Verwendung der Tangentialfluss-Filtration bei der Perfusions-Vermehrung von Hybridomzellen für die Produktion von monoclonalem Antikörper offenbart.
In der EP 0661060-A wird eine hoch konzentrierte Ig-Zubereitung offenbart, die eine Konzentration an Ig zwischen 13,5 und 17,5 % (Gew./Vol.) hat. Es gibt keine Offenbarung bezüglich monoclonaler Antikörper.
In der CH684164 wird eine Ig-Lösung für die intravenöse Verwendung offenbart, die eine Konzentration von 120 bis 180 mg/ml hat. Es gibt keine Offenbarung bezüglich monoclonaler Antikörper.
In der EP 0064210 wird ein orales Arzneimittel offenbart, das Immunglobulin enthält. Die angegebene Ig-Konzentration ist 5 bis 20 g/100 ml, obwohl es keine Offenbarung bezüglich monoclonaler Antikörper in dieser Anmeldung gibt.
Die DE4211169C1 offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung für die in vitro-Produktion von hoch konzentrierten monoclonalen Antikörpern. Die Vorrichtung besteht aus einer Taumelrotation-Dialysekammer. In Dialyseschläuchen werden Zellen gezüchtet, die in der Lage sind, einen monoclonalen Antikörper zu sezernieren. Die maximal erreichte Konzentration an monoclonalem Antikörper scheint etwa 10 mg/ml zu sein.
In der gleichzeitig anhängigen Anmeldung WO97/04801 wird eine stabile isotonische lyophilisierte Proteinformulierung offenbart. Ein solches Protein kann ein monoclonaler Antikörper sein, der unter Verwendung von herkömmlichen Reinigungsverfahren für Immunglobuline aus Kulturmedium gereinigt wurde. Die exemplarische maximale Antikörperkonzentration ist 102 mg/ml.
Die vorliegenden Offenbarung stellt daher die Zubereitung eines monoclonalen Antikörpers für die Verabreichung an den Menschen bereit, die dadurch gekennzeichnet ist, daß der Antikörper in der besagten Zubereitung mit einer Konzentration von 100 mg/ml oder höher vorliegt, vorzugsweise mehr als 100 mg/ml. Oberhalb einer Konzentration von 350 mg/ml kann die Zubereitung sehr viskos sein und die Ausbeuten werden unakzeptabel niedrig. Die ideale Konzentration ist zwischen 100 und 300 mg/ml.
Die Zubereitungen gemäß der Offenbarung sind im Wesentlichen frei von Aggregaten. Akzeptable Niveaus an Aggregatverunreinigungen wären weniger als 5%, idealerweise weniger als 2%. So niedrige Niveaus wie 0,2% lassen sich erreichen, obwohl etwa 1 % üblicher ist. Die Zubereitung ist vorzugsweise auch frei von Trägern, die üblicherweise verwendet werden, um polyclonale Formulierungen zu stabilisieren, zum Beispiel Glycin und/oder Maltose.
Die vorliegende Offenbarung stellt daher eine Zubereitung eines monoclonalen Antikörpers für die Verabreichung an den Menschen bereit, die dadurch gekennzeichnet ist, daß der Antikörper in der besagten Zubereitung mit einer Konzentration von 100 mg/ml oder höher vorliegt, vorzugsweise mehr als 100 mg/ml, und die Zubereitung im Wesentlichen frei von Aggregaten ist.
Rekombinante Antikörper werden entsprechenden ihrer Natur in einer synthetischen und unnatürlichen Zellkulturumgebung produziert. Die Expressionssysteme, die zur Gewinnung ausreichender Mengen des Proteins für die Kommerzialisierung verwendet werden, basieren routinemäßig auf Myelomwirtszellen oder Wirtszellen des Eierstocks des chinesischen Hamsters (CHO).
Um solche Zellen zu züchten, wurden komplexe synthetische Medien entworfen, die ohne verunreinigende tierische Proteine sind, die in Glycosylierungsmustern des Proteins resultieren, von denen man nicht vermutet, daß sie in der Natur auftreten. Es ist daher um so überraschender, daß ein komplexes Glycoprotein, das unter solchen synthetischen Bedingungen produziert wurde, mit Konzentrationen hergestellt werden kann, die mehrfach höher sind, als sie in normalem menschlichem Serum mit allen seinen Pufferungskapazitäten auftreten würden.
Die vorliegende Offenbarung stellt somit eine Zubereitung von monoclonalem Antikörper für die Verabreichung an einen Menschen bereit, die dadurch gekennzeichnet ist, daß der Antikörper in der besagten Zubereitung ein rekombinanter Antikörper ist und mit einer Konzentration von 100 mg/ml oder höher vorliegt, vorzugsweise mehr als 100 mg/ml. Die Zubereitung ist vorzugsweise im Wesentlichen frei von Aggregaten.
Während der Produktion von gereinigten Antikörpern für die therapeutische oder diagnostische Verwendung ist es wichtig, daß der Antikörper bei der Lagerung hinreichend stabil ist und verschiedene chemische Verbindungen können einen nachteiligen Effekt auf die Stabilität des Antikörpers haben. Zum Beispiel ist von Spurenmengen von Kupfer (Cu++) bekannt, daß sie bei Lagerung einen destabilisierenden Effekt auf Immunglobulinmoleküle haben (WO93/08837), und daß dieser Effekt durch die Formulierung des Immunglobulinmoleküls mit einem geeigneten Chelator für Kupferionen, z.B. EDTA oder Citrationen, eliminiert werden kann.
Die vorliegende Erfindung ist auf die Zubereitung von Immunglobulinen aller Klassen anwendbar, d.h. IgM, IgG, IgA, IgE und IgD und erstreckt sich auch auf die Zubereitung von Fab-Fragmenten und bispezifischen Antikörpern. Die Erfindung wird vorzugsweise bei der Zubereitung von Immunglobulinen der Klasse IgG angewendet, welche die Subklassen IgG₁ IgG₂, IgG₃ und IgG₄ umfaßt. Mehr bevorzugt wird die Erfindung auf die Zubereitung von Immunglobulinen der Klasse IgG₄ und IgG angewendet, am meisten bevorzugt IgG.
Die Erfindung findet ihre besondere Anwendung bei der Zubereitung von rekombinanten Antikörpern, insbesondere chimäre oder humanisierte (CDR-transplantierte) Antikörper. Besondere Beispiele davon umfassen chimäre oder humanisierte Antikörper gegen das CD2-, CD3-, CD4-, CD5-, CD7-, CD8-, CD11a-, CD11b-, CD18-, CD19-, CD23-, CD25-, CD33-, CD54- und CDw52-Antigen. Weitere Beispiele umfassen chimäre oder humanisierte Antikörper gegen verschiedene Tumorzellmarker, z.B. 40kd (J. Cell Biol. 125 (2) (1994)) oder die Antigene von infektiösen Mitteln wie Hepatitis B oder menschliches Cytomegalovirus. Insbesondere bevorzugte Beispiele umfassen chimäre oder humanisierte Antikörper gegen das CDw52-, CD4- und CD23-Antigen.
Immunglobuline, die für die therapeutische Verwendung gedacht sind, werden dem Patienten im Allgemeinen in der Form einer pharmazeutischen Formulierung verabreicht. Solche Formulierungen umfassen bevorzugt zusätzlich zu dem Immunglobulin einen physiologisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel, möglicherweise in Beimischung mit einem oder mehreren anderen Mitteln, wie andere Immunglobuline oder Arzneistoffe, wie ein Antibiotikum. Geeignete Träger umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, physiologische Salzlösung, phosphatgepufferte Salzlösung, Glucose und gepufferte Kochsalzlösung, citratgepufferte Kochsalzlösung, Citronensäure/Natriumcitratpuffer, Maleatpuffer, zum Beispiel Maleinsäure/Natriumhydroxid-Puffer, Succinatpuffer, zum Beispiel Bernsteinsäure/Natriumhydroxid-Puffer, Acetatpuffer, zum Beispiel Natriumacetat/Essigsäure-Puffer oder Phosphatpuffer, zum Beispiel Kaliumdihydrogenorthophosphat/Dinatriumhydrogenorthophosphat-Puffer. Gegebenenfalls enthält die Formulierung Polysorbat für die Stabilisierung des Antikörpers. Alternativ kann das Immunglobulin lyophilisiert (gefriergetrocknet) und für die Anwendung wiederhergestellt werden, wenn es gebraucht wird, durch die Zugabe von Wasser und/oder einer wäßrigen gepufferten Lösung, wie vorstehend beschrieben.
Der bevorzugte pH-Wert der pharmazeutischen Formulierung wird von dem speziellen Verabreichungsweg abhängen. Um jedoch die Löslichkeit des Antikörpers in der konzentrierten Lösung zu maximieren sollte der pH-Wert der Lösung verschieden vom isoelektrischen Punkt des Antikörpers sein.
Somit stellt die Offenbarung gemäß einem weiteren Aspekt eine Zubereitung eines monoclonalen Antikörpers für die Verabreichung an einen Menschen bereit, die dadurch gekennzeichnet ist, daß der Antikörper in der besagten Zubereitung mit einer Konzentration von 100 mg/ml oder höher vorliegt und der pH-Wert der Zubereitung verschieden vom isoelektrischen Punkt des Antikörpers ist.
Die Verabreichungswege sind routinemäßig die parenterale, einschließlich intravenöse, intramuskuläre und intraperitoneale Injektion oder Zuführung. Die Zubereitung ist jedoch speziell von Nutzen bei der Herstellung von subkutanen Formulierungen, die ein geringes Volumen haben müssen, zum Beispiel etwa 1 ml Volumen pro Dosis. Um sicher zu stellen, daß bei einer solchen Formulierung eine therapeutische Dosierung erreicht werden kann, wird unweigerlich eine konzentrierte Zubereitung erforderlich sein. Bevorzugte Konzentrationen für subkutane Zubereitungen sind zum Beispiel im Bereich von 100 mg/ml bis 200 mg/ml, zum Beispiel 150 mg/ml bis 200 mg/ml. Eine subkutane Zubereitung hat den Vorteil, daß sie selbst verabreicht werden kann, womit die Hospitalisierung für die intravenöse Verabreichung vermieden wird.
Vorzugsweise sind die subkutanen Formulierungen gemäß der Erfindung isotonisch und werden zu einem speziellen pH-Wert gepuffert. Der bevorzugte pH-Bereich für eine subkutane Formulierung wird im Allgemeinen im Bereich von pH 4 bis pH 9 liegen. Der bevorzugte pH-Wert und damit Puffer wird von dem isoelektrischen Punkt des betreffenden Antikörpers abhängen, wie vorstehend diskutiert. Somit wird im Falle von subkutanen Zubereitungen, die Anti-CD4-Antikörper enthalten, der pH-Wert vorzugsweise im Bereich von pH 4 bis pH 5,5 sein, zum Beispiel pH 5,0 bis pH 5,5, z.B. pH 5,5, und im Falle von Anti-CD23-Antikörpern im Bereich von pH 4 bis pH 6,5 sein. Somit sind bevorzugte Puffer für die Verwendung bei subkutanen Formulierungen, die Anti-CD4-Antikörper enthalten, Maleat-, Succinat-, Acetat- oder mehr bevorzugt Phospatpuffer. Puffer werden im Allgemeinen bei einer Konzentration von 50 mM bis 100 mM verwendet.
Subkutane Formulierungen können auch gegebenenfalls Natriumchlorid enthalten, um die Tonizität der Lösung einzustellen.
Somit stellt die Offenbarung gemäß einem weiteren Aspekt die Zubereitung eines monoclonalen Antikörpers für die subkutane Verabreichung an einen Menschen bereit, die dadurch gekennzeichnet ist, daß der Antikörper in der besagten Zubereitung mit einer Konzentration von 100 mg/ml oder höher vorliegt und der pH-Wert der Zubereitung verschieden vom pH-Wert des isoelektrischen Punkts des Antikörpers ist.
In einem weiteren Aspekt der Offenbarung ist die monoclonale Zubereitung gedacht für die Verwendung bei der Therapie des Menschen. Es können verschiedene menschliche Störungen behandelt werden, wie Krebs oder Infektionserkrankungen, zum Beispiel diejenigen, die vorstehend erwähnt wurden, und Immunfehlfunktionen, wie T-Zell-vermittelte Erkrankungen wie schwere Vasculitis, rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus, auch Autoimmunerkrankungen wie multiple Sklerose, Transplantat gegen Wirt-Erkrankung, Psoriasis, jugendliche Diabetes, Sjogren's Erkrankung, Schilddrüsenerkrankungen, Myasthenia gravis, Transplantatabstoßung, entzündliche Darmerkrankung und Asthma.
Die Offenbarung stellt somit die Verwendung einer konzentrierten Zubereitung eines monoclonalen Antikörpers, wie hier beschrieben, bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung jeder der vorstehend erwähnten Störungen bereit. Ebenso bereit gestellt wird ein Verfahren zur Behandlung eines Menschen, der eine solche Störung hat, welches die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zubereitung gemäß der Erfindung an das besagte Individuum umfaßt.
Die Dosierungen solcher Antikörperzubereitungen werden mit dem zu behandelnden Zustand und dem Empfänger der Behandlung variieren, werden aber im Bereich von 50 bis etwa 2000 mg für einen erwachsenen Patienten sein, vorzugsweise 100–1000 mg, die für einen Zeitraum von 1 bis 30 Tage täglich oder wöchentlich verabreicht werden und wiederholt werden, falls erforderlich. Die Dosen können als Einzel- oder Mehrfach-Dosen verabreicht werden.
Eine Antikörperzubereitung kann durch eine Vielzahl an Wegen konzentriert werden, wie Kreuzfluß- (tangentiale) oder gerührte Ultrafiltration, der bevorzugte Weg ist die Tangentialfluss-Ultrafiltration. Niedrige Ausbeuteraten und Niederschlagbildung können bei der Konzentration eines Antikörpers ein Problem sein. Die vorliegende Erfindung löst dieses spezielle Problem durch ein Verfahren der Konzentration, das die Reduktion des Scherstresses der Kreuzflußultrafiltration bei hohen Zirkulationsraten (500 ml/min) involviert. Die Reduktion der Rezirkulation auf zum Beispiel 250 ml/min führt zu einer erfolgreichen Konzentration von Antikörper auf >150 mg/ml und zu einer hohen Ausbeute an Material.
Die Erfindung stellt somit ein Verfahren für die Zubereitung einer konzentrierten Antikörperzubereitung wie hier beschrieben bereit. Die Ausbeute an Antikörper in der konzentrierten Zubereitung ist vorzugsweise höher als 70%, ist aber routinemäßig höher als 90%.
Konzentrierte Antikörperzubereitungen gemäß dem vorstehenden Verfahren können zusätzliche Zutaten wie Puffer, Salze, Polysorbat und/oder EDTA enthalten. Diese zusätzlichen Mittel können für die pharmazeutische Endformulierung nicht erforderlich sein, in welchem Fall sie unter Verwendung der Diafiltration gemäß herkömmlicher, im Stand der Technik bekannter Verfahren entfernt oder ausgetauscht werden können. Zum Beispiel können unter Verwendung dieses Verfahrens konzentrierte Antikörperzubereitungen, die Citratpuffer und EDTA enthalten, in konzentrierte Antikörperzubereitungen umgewandelt werden, die Phosphat- oder Maleatpuffer enthalten.
Die Offenbarung stellt auch eine neue konzentrierte Antikörperzubereitung bereit, die durch solche Verfahren gewonnen werden kann.
Das Folgende sind nicht einschränkende Beispiele der Offenbarung.
Beispiel 1
Konzentration von Campath 1H
Der Minitan-Ultrafiltrationsaufbau (Minitan XX42 ASY MT Ultrafiltration System, Millipore) wurde mit 2 Polysulphon 30K-NMWCO-Filterplatten (Minitan PTTK 30K NMWCO, Millipore) versehen und die Schläuche und Platten wurden 30 min mit 0,1 M NaOH gemäß den Vorschriften des Herstellers (Minitan Ultrafiltration Systems; Assembly, Operation, Maintenance Instructions, Millipore Corporation, P15076) sterilisiert. Das Sterilisationsmittel wurde durch Spülen mit 1–2 Liter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2, entfernt.
Campath-1H (ein humanisierter Antikörper gegen das CDw52-Antigen: Reichmann et al Nature, 332, 323–327 (1988) (2200 ml mit 16,4 mg/ml in 50 mM Natriumcitrat, pH 6,0) wurde mit einer Flußrate von 600 ml/min bei einem Gegendruck von 2–2,5 bar durch die Retentatseite der Membranen zirkuliert. Der Gegendruck wurde während des restlichen Experiments bei diesem Wert gehalten und die Flußrate des Permeats wurde zu verschiedenen Zeitabständen gemessen. Von dem Retentatgefäß wurden zu verschiedenen Zeitpunkten Proben von Antikörper entnommen und auf die Antikörperkonzentration, die Trübung, % Aggregate und Viskosität getestet.
Weil die Filtrationsrate bei diesem Experiment so langsam war, war es notwendig, die Konzentration über drei Tage durchzuführen. Das System wurde mit PBS ausgespült und das Konzentrat übernacht bei 4°C gelagert. Nach dem Tag 2 wurden vor der Lagerung übernacht 0,01 % (Gew./Vol.) Thiomersal zu dem Konzentrat zugegeben, um eine mikrobielle Verunreinigung zu verhindern. Am Ende der Konzentration wurde das System mit 500 ml PBS ausgespült, dann wurde eine weitere Spülung von 500 ml PBS 30 min um die Retentatseite der Membranen rezirkuliert. Die Konzentration an Antikörper in diesen Spülungen wurde durch Messung der Absorption bei 280 nm bestimmt.
Die Gesamtzeit, die benötigt wurde, um Campath-1H unter Verwendung von nur 2 Platten in der Minitan von 16,4 mg/ml auf 257 mg/ml zu konzentrieren, war 17,25 Stunden. Die Tabelle 1(a) zeigt die Veränderungen bei der Konzentration von Campath-1H mit der Zeit. Die Konzentration erhöhte sich in einer exponentiellen
Tabelle 1(a)
Weise, um nach 17 Stunden bei 300 mg/ml ein Maximum zu erreichen. Die Endkonzentration war geringfügig niedriger als dieses Maximalwert; die Diskrepanz resultiert wahrscheinlich aus der Schwierigkeit der Gewinnung einer repräsentativen Probe aus einer sehr viskosen Flüssigkeit. Die Tabelle 1(b) zeigt, daß die Konzentration von Campath-1H von einem reziproken Abfall der Flußrate des Permeats begleitet war. Diese Tabelle zeigt auch das dramatische Ansteigen der Vikosität des verbleibenden Konzentrats über einen Konzentrationswert von 189 mg/ml.
Tabelle 1(b)
Die Tabelle 1(c) zeigt, daß die Ausbeute bis zu einer Konzentration von 190 mg/ml hoch war, oberhalb dieser Konzentration aber deutlich abzufallen begann, da der Anstieg der Viskosität zu einem Anhaften des Materials an den Glasgefäßen und den Schläuchen führte und zu einem Verlust beim Spülen vor der Lagerung übernacht. Die endgültige Ausbeute von 257 mg/ml Material (ausschließlich des
Tabelle 1(c) Materials, das bei der Probennahme entnommen wurde und beim Waschen verloren ging) war 63,4 %. Weitere 14,6 % wurden in der ersten PBS-Waschung des Systems gewonnen und 0,5 % in der zweiten, rezirkulierten PBS-Waschung. Insgesamt wurden deshalb am Ende des Experiments 78,5 % des ursprünglichen Materials gewonnen (ausschließlich des Materials, das bei der Probennahme entnommen wurde und beim Waschen verloren ging), es verbleibt ein Verlust von 21,5 %, hauptsächlich wegen des Anhaftens von viskosem Material an Glasgefäßen und Plastik.
Die Trübung der Campath-1H-Lösung während der Konzentration wurde berechnet. Die Absorption von in geeigneter Weise verdünnten Teilvolumen von 1,0 ml von Antikörperproben bei 650 nm wurde als Maß für die Trübung verwendet. Die Tabelle 1(d) zeigt, daß es keine Erhöhung gab.
Tabelle 1(d)
Die Proben für die Bestimmung des Aggregats wurden unter Verwendung von PBS auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml verdünnt und Teilvolumen von 50 μl oder 100 μl wurden in eine TSK-GEL G3000SW_XL-Größenausschluß-HPLC-Säule injiziert. Die Säule wurde mit 0,05 %-igem NaN₃ und 0,1 M Na₂SO₄ in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,7, bei einer Flußrate von 1,0 ml/min entwickelt. Die Menge an Aggregat wurde durch Integration der Absorptionspeaks bei 280 nm bestimmt und es wurde gefunden, daß sie durchgängig bei etwa 1 % blieb.
Beispiel 2
Konzentration von Anti-CD4-Antikörper – Verfahren A
Der Minitan-Ultrafiltrationsaufbau wurde wie in Beispiel 1 zusammengebaut und sterilisiert, außer daß 8 Polysulphon 30K-NMWCO-Filterplatten anstelle von 2 verwendet wurden und der gesamte Aufbau in einen sterilen Abzug plaziert wurde. Der Anti-CD4-Antikörper (2412 ml mit 13,9 mg/ml in 50 mM Natriumcitrat, pH 6,0) wurde mit einer Flußrate von 190 ml/min bei einem Gegendruck von 2–2,5 bar durch die Retentatseite der Membranen zirkuliert. Der Gegendruck wurde während des restlichen Experiments bei diesem Wert gehalten und die Flußrate des Permeats wurde zu verschiedenen Zeitabständen gemessen. Von dem Retentatgefäß wurden zu verschiedenen Zeitpunkten Proben von Antikörper entnommen und auf die Antikörperkonzentration, die CD4-Bindung, die Trübung, % Aggregate und Viskosität getestet.
Am Ende des Experiments wurde das Retentat aus dem Minitan-Aufbau herausgepumpt und die Retentatseite der Membranen wurde mit 500 ml 50 mM Natriumcitrat, 0,05 mM EDTA, pH 6,0 gespült und Fraktionen von 50 ml des Spülmittels wurden gesammelt. Am Ende wurde das System 30 min durch Rezirkulation mit 500 ml 50 mM Natriumcitrat, 0,05 mM EDTA, pH 6,0 um die Retentatseite der Membran gespült. Die Konzentration an Antikörper in den Spülfraktionen wurde durch Messung der Absorption bei 280 nm bestimmt.
Die Ergebnisse werden in den Tabellen 2(a)–(d) gezeigt. Die Erhöhung bei der Zahl an Platten, die für die Konzentration verwendet wurden, führte zu einer Verminderung der Zeit, die benötigt wurde, um eine Konzentration von 250 μg/ml– 250 mg/ml zu erreichen, auf 6 Std. im Vergleich zu 17,25 Std. bei der Campath-1-Konzentration (vgl. Tabelle 2(a)). Tabelle 2(a) zeigt auch, daß die Viskosität des Anti-CD4-Antikörpers sich nicht meßbar erhöhte, bis eine Konzentration von 113 mg/ml erreicht war. Oberhalb dieser Konzentration erhöhte sich die Viskosität dramatisch.
Tabelle 2(a)
Bei Konzentrationen von mehr als 83 mg/ml gab es eine merkliche Opaleszenz in dem konzentrierten Material, und dies verursachte die Bildung eines Niederschlags, wenn die Konzentration sich oberhalb dieses Wertes erhöhte. Dies führte zu einer Erniedrigung bei den Flußraten des Permeats, gezeigt in der Tabelle 2(b), und auch zu einem Anstieg der Trübung, gezeigt in der Tabelle 2(c). Das Niveau an Aggregaten blieb bei allen Konzentrationen sehr niedrig und war durchgängig weniger als 0,2 % (vgl. Tabelle 2(c)). Die Tabelle 2(b) zeigt, daß die Ausbeuten hoch waren, bis sich die Viskosität erhöhte und der Niederschlag auftrat, wenn sie dramatisch abfielen bis zu einer endgültigen Ausbeute in dem Retentat nach der Entfernung von dem Aufbau von 50 %.
Tabelle 2(b)
Tabelle 2(c)
Diese schlechte Ausbeute war verursacht durch die hohe Viskosität des konzentrierten Anti-CD4-Antikörpers, die ihn an den Schläuchen und Membranen des Ultrafiltrationssystems haften ließ. Der gesamte Anti-CD4-Antikörper, der auf diese Weise verloren ging, konnte anschließend durch Ausspülen des Systems mit Puffer wiedergewonnen werden. Die Tabelle 2(d) zeigt die Wiedergewinnung des Anti-CD4-Antikörpers in aufeinanderfolgenden Waschfraktionen von 50 ml während des Ausspülens des Minitan-Aufbaus am Ende des Experiments. Die erste Fraktion enthält 11,7 g an Anti-CD4-Antikörper mit einer Konzentration von 235 mg/ml, somit konnte diese mit den 12,6 g an Konzentrat vereint werden, die zuerst mit 252 mg/ml aus dem Aufbau gewonnen worden waren, ohne die Gesamtkonzentration signifikant zu verdünnen. Die verbleibenden Waschfraktionen enthielten insgesamt 5,1 g an Anti-CD4-Antikörper, dies war aber bei einer Konzentration von weniger als 57 mg/ml und konnte so nicht mit dem konzentrierten Material vereint werden. Die Gesamtausbeute in dem Konzentrat und der ersten Waschfraktion war 90 %. Es wurde festgestellt, daß nach der Lagerung des endgültigen konzentrierten Anti-CD4-Antikörpers übernacht bei 4°C zu einer Wiederauflösung von etwas Niederschlag führte.
Tabelle 2(d)
Es wurde daher ein Experiment durchgeführt, um die Konzentration zu bestimmen, bei der der ausgefallene Anti-CD4-Antikörper vollständig wieder löslich geworden war. Ein Teilvolumen von 10 ml von Anti-CD4-Antikörper mit 250 mg/ml wurde durch Zugabe von 50 mM Natriumcitrat, 0,05 mM EDTA, pH 6,0, fortschreitend verdünnt. Die Absorption von in geeigneter Weise verdünnten Teilvolumina von 1,0 ml von Antikörperproben bei 650 nm wurde als Maß der Trübung verwendet. Die Resultate sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Der Niederschlag löste sich wieder auf, aber die Trübung und Opaleszenz verschwand nicht vollständig, bis eine Konzentration an Anti-CD4-Antikörper von etwa 80 mg/ml erreicht war. Oberhalb dieser Konzentration wurde während der Konzentration zunächst die Opaleszenz beobachtet, somit scheint der Niederschlag reversibel und von der Konzentration abhängig zu sein.
Beispiel 3
Konzentration von Anti-CD4-Antikörper – Verfahren B
Pufferanpassung bei Anti-CD4-Antikörper
Der Anti-CD4-Antikörper (1460 ml; 24 g) wurde in 50 mM Natriumcitrat, 0,05 mM EDTA, pH 6,0 zubereitet. Dieser Puffer wurde durch Zugabe von fester Citronensäure zu der Antikörperzubereitung und Einstellen des pH-Werts auf 6,0 mit NaOH auf ~100 mM Natriumcitrat, 0,05 mM EDTA, pH 6,0, gebracht. Die resultierende Zubereitung wurde durch ein Filter von 0,22 μm sterilfiltriert und in zwei Teilmengen von ~12 g aufbewahrt.
Konzentration von Anti-CD4-Antikörper in der Filtron-Ultrasette
Die Filtron-Mini-Ultrasette und Watson-Marlow-Pumpe wurden in einen Kälteraum gestellt. Die Mini-Ultrasette (30K Ausschluß-Kreuzfluß-Ultrafilter Filtron) wurde mit Wasser gespült, dann mit 0,1 M NaOH gemäß den Angaben des Herstellers (Mini Ultrasette Tangential Flow Device Operating Instructions. & Mini Ultrasette Care and Use Manual., Filtron Technology Corporation) 30 min sterilisiert. Das Sterilisationsmittel wurde durch Spülen mit sterilem Wasser entfernt, gefolgt von 1–2 Litern sterilem PBS, pH 7,2, bis der pH-Wert des Spülmittels 7,2 war. Anti-CD4 wurde mit einer Flußrate von durchgängig 250 ml/min durch die Retentatseite der Membranen zirkuliert.
Nach der Konzentration des Anti-CD4-Antikörpers auf ~150 mg/ml wurde das Retentat aus der Mini-Ultrasette herausgepumpt und die Retentatseite der Membranen wurde mit 3 × 20 ml 50 mM Natriumcitrat, 0,05 mM EDTA, pH 6,0, gespült und jede Fraktionen von 20 ml der Spülung wurde gesammelt. Die Antikörperkonzentration der Spülfraktionen wurde durch Messung der Absorption bei 280 nm gemessen, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die Resultate legten nahe, daß die Reduktion der Flußrate des Retentats ein Verfahren für die Konzentration von Anti-CD4 auf ~150 mg/ml mittels Kreuzfluß-Ultrafiltration und Vermeidung jeglichen Niederschlags bereitstellen kann. Dies wurde unter Verwendung der Filtron-Mini-Ultrasette und einer Zirkulationsrate des Retentats von 250 ml/min getestet.
Ein geeigneter isotonischer Puffer für diese Arbeit war 100 mM Natriumcitrat, 0,05 mM EDTA, pH 6,0. Deshalb wurden die verbleibenden 1460 ml von Anti-CD4 in 50 mM Natriumcitrat, 0,05 mM EDTA, pH 6,0, durch Zugabe von 16,8 g Citronensäure neu formuliert und der pH-Wert der endgültigen Lösung wurde mit NaOH eingestellt. Dieses Material wurde sterilfiltriert und in 2 gleiche Teilvolumina aufgeteilt, die dann separat unter Verwendung einer Rezirkulationsrate von 250 ml/min in der Filtron-Ultrafiltrationseinheit konzentriert wurden. Die Resultate sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4: Konzentration von Anti-CD4 auf mehr als 100 mg/ml in einer Kreuzfluß-Ultrafiltrationszelle bei einer Rezirkulationsrate von 250 ml/min

*Aggregatanalyse durch Größenausschluß-HPLC

Die Proben für die Aggregatbestimmung wurde unter Verwendung von PBS auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml verdünnt und Teilvolumina von 50 μl oder 100 μl wurden in eine TSK-GEL G3000SW_XL-Größenausschluß-HPLC-Säule injiziert. Die Säule wurde mit 0,05 %-igem NaN₃ und 0,1 M Na₂SO₄ in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,7, bei einer Flußrate von 1,0 ml/min entwickelt. Die Menge an Aggregat wurde durch Integration der Absorptionspeaks bei 280 nm bestimmt.
Beide Konzentrationen erreichten eine maximale Konzentration von >150 mg/ml in dem Ultrafiltrationsapparat ohne nachteilige Wirkungen auf die Löslichkeit des Antikörpers. Die Konzentrationen dauerten 9–11 Std. Die Endkonzentrationen von ~100 mg/ml waren ein Resultat der Verdünnung mit den Waschlösungen, die erforderlich waren, um die Ausbeute aus dem Ultrafiltrationsapparat zu maximieren. Die Gesamtausbeuten waren 90–95 % und es waren kein sichtbarer Niederschlag oder eine Erhöhung der Niveaus an Aggregat zu beobachten. Das leichte Anwachsen bei der Trübung nach der Konzentration, gemessen durch die Absorption bei 650 nm, verursachte eine leichte Opazität des endgültigen Konzentrats, dies wurde jedoch bei der Formulierung mit Polysorbat 80 und Sterilfiltration beseitigt und wurde nicht als bedeutsam angesehen.
Die Bindungsaktivität von CD4 bei der Konzentration 1 war fast 100 mg/ml, wie erwartet, für die Konzentration 2 wurde jedoch ein viel niedriger Wert erhalten. Die endgültige Osmolalität des vereinten Materials von den Konzentrationen 1 und 2 war etwa 297 mOs/kg, und die vereinte Lösung war klar und hell, die leicht durch ein steriles Filter von 0,2 μm passieren konnte.
Konzentration von Anti-CD4-Antikörper in einer gerührten Zelle
Ein Teilvolumen von 330 ml von Anti-CD4-Antikörper (wie vorstehend) wurde bei 5°C durch Anwendung eines Drucks von 1,5 bar unter Verwendung von Stickstoffgas in einer gerührten Ultrafiltrationszelle von Amicon (ausgestattet mit der YM30-Membran von Amicon) bis zu einer endgültigen Konzentration von 170 mg/ml konzentriert. Von dem Anti-CD4-Antikörper in der Ultrafiltrationszelle wurden in Zeitabständen Proben entnommen und die Konzentration wurde durch Messung der Absorption bei 280 nm bestimmt und die Trübung durch Messung der Absorption bei 650 nm. Am Ende des Experiments wurde das konzentrierte Material aus der Ultrafiltrationszelle entfernt und durch ein Filter von 0,22 μm sterilfiltriert.
Um die hohen Scherkräfte zu überwinden, die bei einer Kreuzfluß-Ultrafiltrationsapparatur von Filtron erzeugt werden, wurde die Konzentration in einer gerührten Ultrafiltrationszelle unter Verwendung von 50 mM Natriumcitrat, 0,05 mM EDTA, pH 6,0, als Puffer durchgeführt. Tabelle 5 zeigt die Resultate von diesem Experiment. Tabelle 5: Konzentration von Anti-CD4 durch Ultrafiltration in einer gerührten Zelle von Amicon

* Die aktuelle Konzentration bestimmt durch Messung der Absorption bei 280 nm.

Insgesamt dauerte die Konzentration etwa 2,5 Tage und die Flußrate nahm rasch ab, wenn die Viskosität des konzentrierten Antikörpers zunahm. Ohne ersichtlichen Niederschlag wurde erfolgreich eine endgültige Konzentration von 171 mg/ml erreicht. Dieses Material wurde aus der Ultrafiltrationszelle entfernt und die Membran mit ausreichend 50 mM Natriumcitrat, 0,05 mM EDTA, pH 6,0, gewaschen, um bei der Vereinigung mit dem Konzentrat eine endgültige Konzentration von 100 mg/ml zu ergeben.
Dieses Material passierte leicht durch ein steriles Filter von 0,2 μm. Die aktuell gemessene Konzentration dieses vereinten Materials war 94,3 mg/ml in einem Volumen von 46 ml. Dies entspricht einer Ausbeute von 79 % über den Ultrafiltrationsschritt hinweg.

Dieses Experiment lieferte deshalb den Beweis, daß 50 mM Natriumcitrat, 0,05 mM EDTA, pH 6,0, ein geeigneter Puffer für die Konzentration von Anti-CD4 bis mindestens 171 mg/ml war und daß es wahrscheinlich die hohen Scherkräfte waren, die den Niederschlag bei den ursprünglichen Kreuzfluß-Ultrafiltrationsexperimenten bei der Minitan und der Filtron-Mini-Ultrasette verursachten, der vorstehend bemerkt wurde. Beispiel 4 Subkutane Formulierungen für Anti-CD4- und Anti-CD23-Antikörper

a) Anti-CD4- oder Anti-CD23-Antikörper	0,15 g
Kaliumdihydrogenorthophosphat, KH₂PO₄ (wasserfrei) Dinatriumhydrogenorthophosphat,	0,0656 g
Na₂HPO4·12 H₂O	0,0673 g
NaCl	0,6263 g
Polysorbat 80 (% des gesamten Formulierungsgewichts)	0,01
Wasser	auf 100 g
b) Anti-CD4- oder Anti-CD23-Antikörper	0,15 g
Na-Acetat	3,674 g
Eisessig, 10 %-ige Lösung	0,315 g
NaCl	0,630 g
Polysorbat 80 (% des gesamten Formulierungsgewichts)	0,01
Wasser	auf 100 g
c) Anti-CD4- oder Anti-CD23-Antikörper	0,15 g
Maleinsäure	0,227 g
0,5 M NaOH	6,09 g
NaCl	0,777 g
Polysorbat 80 (% des gesamten Formulierungsgewichts)	0,01
Wasser	auf 100 g

d) Anti-CD4- oder Anti-CD23-Antikörper	0,15 g
Bernsteinsäure	0,203 g
0,5 M NaOH	6,54 g
NaCl	0,779 g
Polysorbat 80 (% des gesamten Formulierungsgewichts)	0,01
Wasser	auf 100 g

NB. Jede der Formulierungen a), b), c) oder d) kann gegebenenfalls 0,05 mM EDTA enthalten

Claims

Verfahren zum Aufkonzentrieren einer Antikörper-Zubereitung, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Unterwerfen einer Antikörper-Zubereitung der Tangentialfluss-Ultrafiltration mit einer Rezirkulationsrate von 250 ml/min, worin die Antikörper-Zubereitung durch eine 30K Membran filtriert wird, (b) Gewinnen einer endgültigen Antikörper-Zubereitung aus Schritt (a).
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die endgültige Antikörper-Zubereitung > 150 mg/ml aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin der Antikörper IgG ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, worin der Antikörper ein anti-CD4-Antikörper ist.