CN106999546A - 角蛋白纳米材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及角蛋白纳米材料,用于获得角蛋白纳米材料的方法,和由角蛋白纳米材料制备的生物材料。具体来说,披露了包含I型单体和II型单体对的角蛋白纳米材料,且披露了用于获得角蛋白纳米材料的方法,所述方法包含获得角蛋白溶液以及使用包含磷酸盐的缓冲溶液通过超滤来处理溶液。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年05月01日提交的美国临时专利申请号61/987,182,和2014年05月02日提交的美国临时专利申请号61/987,855的优先权和权益,以上各文的全部内容通过引用纳入本文。
发明领域
本发明总体涉及角蛋白纳米材料领域,包含角蛋白纳米材料的生物材料,和制备角蛋白纳米材料的方法。具体来说,本发明涉及角蛋白纳米材料的制备和应用,其是包含紧密结合的角蛋白单体的二聚体和四聚体的大分子角蛋白复合物。
发明背景
中间纤维(IF)包含归属于6大类之一的属于α-螺旋蛋白质超家族的亚单位组件。通常,IF蛋白质具有共有二级结构特征,其可概括描述为包含中央α-螺旋结构域(domain)和头部和尾部球状结构域的单体形式。IF蛋白质中的中央α-螺旋结构域是高度保守的,且变化大部分来自头部和尾部结构域中一级结构的差异。为了形成中间纤维,这些单体物质聚合形成具有高度有序超结构的细长大分子复合物。两种主要IF蛋白质包含酸性和碱性角蛋白(分别是I型和II型IF蛋白质分类)。I型和II型角蛋白单体通常在上皮细胞中表达,且I型和II型角蛋白单体自身都不能装配成角蛋白纤维。I型和II型角蛋白单体通常以1:1比例结合来形成异二聚体,其进一步结合以组装成杂聚角蛋白纤维。
角蛋白IF蛋白质可进一步描述为来自“软”上皮亚家族或来自“硬”毛囊细胞(trichocytic)亚家族。约有20种角蛋白(也称作细胞角蛋白)来自“软”亚家族,且由在上皮细胞中组成细胞骨架元件的胞内蛋白质组成。已知约17种角蛋白属于“硬”毛囊细胞亚家族,且这些角蛋白组成结构附加物,如蹄、指甲、毛皮、羽毛和头发纤维。
研究表明蛋白质自组装过程对大分子复合物即二聚体和四聚体中的变化是非常敏感的。此外,仅仅存在损坏的蛋白质片段即可干扰自组装过程和/或打乱已经形成的超结构-对角蛋白蛋白质亦是如此。角蛋白单体形成特别强的大分子复合物,特别是在二聚体和四聚体水平,其不容易变性或分解成其单体单元。但是,使这些复合物变性的问题是,用于分解角蛋白超结构(主要是二硫键)的化学方法以及后续的蛋白质溶剂化技术可导致对角蛋白单体形成显著损坏。这种损坏通常不被觉察,且对角蛋白生物材料的形成、性质和性能是有害的。重组的角蛋白还没有对角蛋白生物材料领域提供任何有希望的替代,因为目前重组蛋白制备较困难和昂贵。到目前为止,整个角蛋白生物材料技术基于从例如头发纤维、羊毛、羽毛等的组织提取角蛋白。
之前描述的角蛋白生物材料由角蛋白单体制成,通常在40-60千道尔顿(kDa)的范围,且没有披露使用纯化的角蛋白纳米材料。Rouse JG,Van Dyke ME.《用于医疗应用的角蛋白基生物材料综述(A review of keratin-based biomaterials for biomedicalapplications)》.《材料(Materials)》2010;3:999-1014;Van Dyke ME.《具有受控的机械、化学和生物性质的水凝胶及其制备方法(Hydrogel with controllable mechanical,chemical,and biological properties and method for making same)》.美国专利号:7,001,987.2006年2月21日;Van Dyke ME,Saul JM,Smith TL,de Guzman R.《受控的递送系统(Controlled delivery system)》.美国专利申请公开号:2011/0217356.2011年03月7日提交。如本文所述,纯化的角蛋白纳米材料包括基本上不含结构损坏和缺陷以及与角蛋白纳米材料结合(即,连接到,粘结到等)的损坏蛋白质和肽的角蛋白。
此外,描述将角蛋白用于制造先前所述的角蛋白生物材料的方法得到不是纯角蛋白纳米材料的分子复合物。甚至如上所述的“纯化角蛋白”包含具有紧密结合的损坏的蛋白质和蛋白质碎片(即肽)的角蛋白复合物,其对自组装过程是有害的,和/或在生物材料超结构形成之后使该生物材料超结构不稳定。Van Dyke ME.《含角蛋白生物材料的愈伤组合物(Wound healing compositions containing keratin biomaterials)》.美国专利号:8,273,702.2012年9月25日。
已使用本领域普通技术人员熟知的方法通过氧化或还原从人类头发纤维提取角蛋白(参见,例如Crewther,W.G.等,《角蛋白化学(The Chemistry of Keratins)》.Anfinsen,C.B.,Jr.等,编者.《蛋白质化学进展(Advances in Protein Chemistry)》1965,学院出版社(Academic Press).纽约:191-346)。《蛋白质化学进展》中的这个章节包括参考了关于角蛋白的多过640篇出版的研究,并描述了提取角蛋白的方法。所述方法通常使用两步法,其中通过氧化或还原分解角蛋白的交联结构。如果使用氧化处理,所得角蛋白称作角质物质(keratose),如果使用还原处理,所得角蛋白称作还原角蛋白。在这些反应中,裂解胱氨酸氨基酸残基中的二硫键,使角蛋白变成可溶解的。因为许多角蛋白仍然保留在角质层的保护性结构之内,通常使用利用变性溶液的第二步骤来实施皮质蛋白质的有效提取。或者,在还原反应的情况下,可组合这些步骤,或者可使用溶液,例如脲、硫脲、磷酸盐、磷酸氢盐、硫酸盐、硫酸氢盐、氰酸酯、硫氰酸酯、碳酸盐、碳酸氢盐、过渡金属氢氧化物、表面活性剂溶液,和/或其组合(例如浓度为0.1-1.0M的三(羟甲基)氨基甲烷的水性溶液,和0.1-10M的脲溶液)。
文献还进一步表征,通过例如等电沉淀、超滤、层析及其组合的各种方法,角质物质和还原角蛋白的粗提取物可进一步精炼成α-角质物质,γ-角质物质,酸性α-角质物质,碱性α-角质物质,酸性γ-角质物质,碱性γ-角质物质,α-还原角蛋白,γ-还原角蛋白,酸性α-还原角蛋白,碱性α-还原角蛋白,酸性γ-还原角蛋白,碱性γ-还原角蛋白,和角蛋白结合的蛋白质(KAP)级分。在粗提取物中,α级分在低于pH 6时开始沉淀,且到pH4.2时基本上完成沉淀。KAP级分通常与α级分共沉淀,由此形成α/KAP混合物。γ级分仍然在溶液中,但可通过添加非溶剂来沉淀。非溶剂是水互溶的,但不溶解角蛋白(例如乙醇)。可通过冷却乙醇且逐滴添加角蛋白溶液而不是将乙醇添加到角蛋白,来辅助γ级分的沉淀。这些分级步骤已在文献中描述且是本技术领域所公知的;但是,这些方法不能形成本文所述的角蛋白纳米材料。
此外,许多蛋白质纯化技术是本技术领域所公知的,且包括分级沉淀到免疫亲和性层析(对于这个主题的更广泛的理解,参见Scopes R.K.(编者).《蛋白纯化:原理和实践(Protein purification:Principles and Practice)》(第三版,施普林格(Springer),纽约.1993);Roe S.,《蛋白质纯化技术:一种可行方法(Protein purification techniques:A practical approach)》.(第二版.牛津大学出版社(Oxford University Press),纽约.2001);或者Hatti-Kaul R.和Mattiasson B.,《蛋白质的分离和纯化(Isolation andpurification of proteins)》.(马赛尔德克公司(Marcel Dekker AG),纽约.2003),通过引用结合于此。例如,Crewther等描述了酸性和碱性角蛋白的亚家族可通过移动结合电泳来分离,但没有广泛描述这些级分或它们的性质(参见Crewther(1965))。已将分离技术应用到角蛋白级分,从而可将它们分离成具有有用性质的子级分,且可重组成具有不同于起始混合物性质的“间-角蛋白(meta keratin)”(参见Richter J.R.等,《衍生自人类头发的变化角蛋白生物材料的结构-性质关系(Structure-property relationships of meta-kerateine biomaterials derived from human hair)》.Acta Biomater.2012;8(1):274-81;Van Dyke,Mark E等,《用于治疗局部缺血的角蛋白生物材料(Keratin biomaterialsfor treatment of ischemia)》.美国专利号:8,545,893.2013年10月1日;以及Nunez F等,《衍生自角蛋白的化合物的血管活性性质(Vasoactive properties of keratin-derivedcompounds)》.《微观循环(Microcirculation)》.2011;18(8):663-9)。在文献中报道了所得纯化角蛋白的凝胶化、结合治疗化合物、机械性质和化学性质以及其它特征;然而,提供的提取和纯化技术不足以提供无损坏和/或污染物的角蛋白和提供本文所述的角蛋白纳米材料。
本领域需要能自组装成生物材料例如水凝胶、膜、泡沫、涂层和纤维的角蛋白纳米材料,以及从含角蛋白的源制备角蛋白纳米材料的方法。
角蛋白纳米材料是以紧密结合的I型单体和II型单体的二聚体,和/或由紧密结合的两个二聚体形成的四聚体形式存在的大分子复合物。本质上,这些大分子复合物是不稳定的,且快速聚合来形成更高的有序结构。现有技术描述的方法不能制备稳定的、纯化角蛋白纳米材料。在本技术领域所公知的强变性溶液例如浓缩的脲溶液存在下,角蛋白纳米材料仍然保持紧密结合。角蛋白纳米材料具有不同于天然发现的角蛋白的组织包含头发纤维、羊毛、羽毛等来源以及如上所述的提取的和纯化角蛋白的化学、物理和生物性质。例如,天然发现的角蛋白的组织具有惰性外层,在头发和毛皮纤维的情况下称作角质层。角蛋白纳米材料不是惰性的,因此可与其它化学化合物、溶剂、细胞和细胞受体等相互作用。此外,从角蛋白纳米材料制备的生物材料具有不同于现有技术中描述的常规角蛋白生物材料的化学、物理和生物性质。例如,因为其高度的自组装,由角蛋白纳米材料制备的生物材料形成的网络结构比常规角蛋白生物材料形成的网络结构更强。这种性质表现在例如角蛋白纳米材料在较低角蛋白浓度下形成水凝胶的能力。此外,因为更高的有序分子结构、分子复合物的稳定性以及不存在可用作降解催化剂的损坏的肽,由角蛋白纳米材料形成的生物材料比常规角蛋白生物材料降解更缓慢。最后,因为不含损坏的肽和因为I型和II型单体的分子复合物的完整的天然结构,由角蛋白纳米材料制成的生物材料的免疫原性较低。
发明内容
本发明的主题是角蛋白纳米材料,用于制备所述角蛋白纳米材料的方法,和由所述角蛋白纳米材料制备的生物材料。从例如羊毛、羽毛、头发纤维等组织提取的角蛋白是本技术领域所公知的;然而,这些方法得到不同角蛋白化合物的络合混合物。甚至当使用复杂的分离和纯化步骤时,现有技术描述的方法最多能制备强力络合到损坏的角蛋白分子的角蛋白和角蛋白分子的剩余物如肽碎片。现有技术描述的方法没有改变这些紧密的相互作用,因此制备了不同于主题角蛋白纳米材料的化学结构。
这样,不像角蛋白纳米材料,常规角蛋白生物材料不具有相同的自组装能力,也得不到相同的网络结构,或具有相似的性质包括网络结构稳定性。最近我们发现只有控制地操控角蛋白提取物的溶解行为,才能获得角蛋白纳米材料。
本文所述的方法有效地分解这些紧密相互作用,并制备不同化学实体;即角蛋白纳米材料。与常规角蛋白生物材料相比,由角蛋白纳米材料制备的生物材料例如凝胶、膜、泡沫、海绵、支架、纤维、油灰(putties)、涂层、和颗粒具有优异的性质。
本发明的目的之一是提供一种或多种角蛋白纳米材料,所述一种或多种角蛋白纳米材料是包含紧密结合的角蛋白单体的二聚体和/或四聚体的大分子角蛋白复合物。
本发明的其它目的是提供用于制备一种或多种角蛋白纳米材料的方法。
本发明的又一目的是提供组合物,所述组合物包括本文所述的角蛋白纳米材料中的一种或多种。
本发明的又一目的是提供一种或多种生物材料,所述一种或多种生物材料包括本文所述的角蛋白纳米材料中的一种或多种。
附图简要说明
图1的示意图显示用本文所述的方法获得的角蛋白纳米材料。
图2A的图形示意图表明在缓冲超滤之前存在角蛋白纳米材料和角蛋白肽。
图2B的图形示意图表明在缓冲超滤之后存在角蛋白纳米材料。
图3A的图形示意图表明在缓冲超滤之前存在角蛋白纳米材料和角蛋白肽。
图3B的图形示意图表明在缓冲超滤之后存在角蛋白纳米材料。
图4A的图形示意图表明在缓冲超滤之前存在角蛋白纳米材料和角蛋白肽。
图4B的图形示意图表明在缓冲超滤之后存在角蛋白纳米材料。
图5A的图形示意图表明在缓冲超滤之前存在角蛋白纳米材料和角蛋白肽。
图5B的图形示意图表明在缓冲超滤之后存在角蛋白纳米材料。
具体描述
定义:
如本文所用,单数形式的“一个”,“一种”和“该”也包括复数形式,除非上下文另有明确说明。
如本文所使用,术语“约”或“大约”可互换使用,且当与所述的数值或范围联用时表示比所述的数值或范围稍微多于或少于至所述数值或范围的±10%范围之内。
如本文所使用,术语“生物相容的”指组合物或制品不对生物系统产生或者产生可容忍的或可接受水平的毒性或伤害影响。
如本文所使用,术语“生物材料(s)”指生物相容的组合物或制品。生物材料可包含不同物理形式的组合物或制品,例如涂层、纤维、膜、泡沫、凝胶、移植物、水凝胶、薄膜、网、支架、片材、海绵或网等。这些制品可包含天然产物、合成产物或其组合。在具体方面中,可将生物材料用于医疗治疗或诊断应用中。
如本文所使用,术语“载体”指可递送角蛋白纳米材料的任何合适的物质。
如本文所使用,术语“主要由……组成”如果所要求保护的组合物的特征没有受到实质影响时,可存在未描述的组分。
如本文所使用,术语“角蛋白”指纤维状结构蛋白质或中间纤维家族。每一I型角蛋白都与特定的II型角蛋白伴侣共表达。角蛋白蛋白质在从I型单体和II型单体的二聚作用开始的一系列组装步骤中形成细丝状聚合物。二聚体组装成四聚体和八聚体,并最终组装成单位长度的细丝,其能进行端部-到-端部退火成长细丝。
如本文所使用,术语“角蛋白纳米材料”指I型单体和II型单体的分子复合物,例如I型单体和II型单体的二聚体,二聚体具有20-75nm的长度、1-5nm的宽度和100-200kDa的分子量,和/或两个这种二聚体的四聚体,四聚体具有50-100nm的长度、5-10nm的宽度和200-600kDa的分子量。
如本文所使用,术语“纯化的”指角蛋白纳米材料不含不想要的或低劣的组分。术语“纯化的”还包括不含来自获得角蛋白纳米材料的源材料的组分的角蛋白纳米材料。角蛋白纳米材料可为“基本上纯的”,即不含来自其中制备角蛋白纳米材料的源材料的其它组分,例如羊毛、羽毛、头发纤维等。在优选的实施方式中,角蛋白纳米材料是至少75%(w/w)纯的,更优选地至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%纯的。在另一优选的实施方式中,角蛋白纳米材料是100%纯的。
如本文所使用,术语“分离物”和“分离的”指从其天然状态取出并将其与天然地与之结合的其它分子分离的材料。
如本文所使用,术语“源材料”指起始材料,例如来自动物或人类来源的角蛋白蛋白质的蛋白来源。
角蛋白纳米材料
如全文所述,角蛋白纳米材料可为任意角蛋白纳米材料。在一些实施方式中,角蛋白纳米材料可衍生自天然源材料、合成源材料或其组合。在特定方面中,角蛋白纳米材料可使用氧化化学、还原化学、重组或其组合来制备。
在具体实施方式中,源材料是蛋白质的角蛋白材料。适用于获得角蛋白纳米材料的蛋白质的角蛋白材料的非限制性例子包含来自动物来源的头发、羊毛、毛皮、皮肤、角、蹄、嘴、羽毛和鳞片(scale)等。在特定方面中,源材料是人类头发。在另一方面中,所述来源是从根部切割的人类头发纤维。又在另一方面中,人类头发是金色人发或用已知方法漂白的有色头发。还又在另一方面中,人类头发不含黑色素,或基本上不含黑色素。在另一特定方面中,源材料是羽毛。又在另一方面中,羽毛是白色羽毛。又在另一方面中,羽毛不含黑色素或基本上不含黑色素。又在另一特定方面中,源材料是羊毛。又在另一方面中,羊毛是白色羊毛。又在另一方面中,羊毛不含黑色素或基本上不含黑色素。源材料可为一种或多种蛋白质的角蛋白材料的组合,例如如上所述的材料中的一种或多种。
在本文提供的一些实施方式中,角蛋白纳米材料包含一种或多种I型单体和II型单体对(例如,至少1种I型单体和II型单体对,至少2种I型单体和II型单体对,至少3种I型单体和II型单体对,至少4种I型单体和II型单体对等)。
在特定方面中,角蛋白纳米材料包含一种或多种I型单体和II型单体的二聚体,一种或多种2个二聚体的四聚体,或其组合。在特定方面中,角蛋白纳米材料包含一种或多种I型单体和II型单体的二聚体。在更具体的方面中,角蛋白纳米材料主要由下述组成:一种或多种I型单体和II型单体的二聚体。在甚至更具体的方面中,角蛋白纳米材料由下述组成:一种或多种I型单体和II型单体的二聚体。在另一方面中,角蛋白材料包含一种或多种2个I型单体和II型单体的二聚体的四聚体。在更具体的方面中,角蛋白纳米材料主要由下述组成:一种或多种2个I型单体和II型单体的二聚体的四聚体。在甚至更具体的方面中,角蛋白纳米材料由下述组成:一种或多种2个I型单体和II型单体的二聚体的四聚体。
如图1所示且如本文所述,角蛋白纳米材料自身没有损坏,且消除或基本上消除不想要的组分,例如结合的(即,连接的、粘结的等)损坏的角蛋白单体或肽和其它污染物。除去结合的损坏的角蛋白单体和肽不能通过本技术领域所公知的方法来实现,且必须使用本文所述的方法来进行。一旦除去这些污染物,就制备稳定的角蛋白纳米材料,其能显著的自组装成具有所需性质的生物材料,包括这样形成的生物材料的更大稳定性。在本文提供的一些实施方式中,角蛋白纳米材料的纯度是约60%-约100%纯(例如,约60%纯,65%纯,70%纯,75%纯,80%纯,85%纯,90%纯,91%纯,92%纯,93%纯,94%纯,95%纯,96%纯,97%纯,98%纯,99%纯,最高达约100%纯)。
此外,如本文提供的角蛋白纳米材料包含具有不同长度和直径的二聚体和四聚体。在一方面中,二聚体的长度是约5nm-约75nm(例如,约5nm长,7.5nm长,10nm长,12.5nm长,15nm长,17.5nm长,20nm长,22.5nm长,25nm长,27.5nm长,30nm长,32.5nm长,35nm长,37.5nm长,40nm长,42.5nm长,45nm长,47.5nm长,50nm长,52.5nm长,55nm长,57.5nm长,60nm长,62.5nm长,65nm长,67.5nm长,70nm长,72.5nm长,最高达约75nm长),且直径是约0.5nm-约10nm(例如,约0.5nm的直径,1nm的直径,1.5nm的直径,2nm的直径,2.5nm的直径,3nm的直径,3.5nm的直径,4nm的直径,5nm的直径,5.5nm的直径,6nm的直径,6.5nm的直径,7nm的直径,7.5nm的直径,8nm的直径,8.5nm的直径,9nm的直径,9.5nm的直径,最高达约10nm的直径)。在特定方面中,二聚体是约50nm长,且具有约2nm的直径。
在一方面中,四聚体的长度是约25nm-约200nm(例如,约25nm长,30nm长,35nm长,40nm长,45nm长,50nm长,55nm长,60nm长,65nm长,70nm长,75nm长,80nm长,85nm长,90nm长,95nm长,100nm长,105nm长,110nm长,115nm长,120nm长,125nm长,130nm长,135nm长,140nm长,145nm长,150nm长,155nm长,160nm长,165nm长,170nm长,175nm长,180nm长,185nm长,190nm长,195nm长,最高达约200nm长),且直径是约1nm-约20nm(例如,约1nm的直径,1.5nm的直径,2nm的直径,2.5nm的直径,3nm的直径,3.5nm的直径,4nm的直径,4.5nm的直径,5nm的直径,5.5nm的直径,6nm的直径,6.5nm的直径,7nm的直径,7.5nm的直径,8nm的直径,8.5nm的直径,9nm的直径,9.5nm的直径,10nm的直径,11nm的直径,11.5nm的直径,12nm的直径,12.5nm的直径,13nm的直径,13.5nm的直径,14nm的直径,14.5nm的直径15nm的直径,15.5nm的直径,16nm的直径,16.5nm的直径,17nm的直径,17.5nm的直径,18nm的直径,18.5nm的直径,19nm的直径,19.5nm的直径,最高达约20nm的直径)。在另一方面中,四聚体以不同的参差构象结合,且可为约50-100nm长,直径可为约5-10nm。
制备角蛋白纳米材料的方法
如全文所提供,所述的角蛋白纳米材料可根据本文所述的方法来获得。根据需要,本文所述的方法步骤可重复许多次,只要制备了角蛋白纳米材料(例如,1次,2次,3次,4次,5次,6次,7次,8次,9次,10次,11次,12次,13次,14次,15次,16次,17次,18次,19次,20次等)。
作为主要步骤,本文所述的方法包含获得可溶性角蛋白的溶液。在特定方面中,溶液是可溶性毛囊细胞角蛋白(trichocytic keratin)、细胞角蛋白及其组合的溶液。在另一特定方面中,溶液是可溶性细胞角蛋白的溶液。又在另一特定方面中,溶液是可溶性毛囊细胞角蛋白的溶液。
可溶性毛囊细胞角蛋白的溶液可使用本技术领域所公知的方法来获得。这种方法包括例如如Crewther等(参见Crewther,1965)所述的二硫键的裂解。具体来说,二硫键可使用氧化性或还原性二硫键裂解来进行裂解。
角蛋白纳米材料可从任何源材料来获得。在一些实施方式中,角蛋白纳米材料可衍生自天然源材料、合成源材料或其组合。在具体实施方式中,源材料是蛋白质的角蛋白材料。适用于获得角蛋白纳米材料的蛋白质的角蛋白材料的非限制性例子包含来自动物来源的头发、羊毛、毛皮、皮肤、角、蹄、嘴、羽毛和鳞片等。在特定方面中,源材料是人类头发。在另一方面中,所述源是从根部切下的人类头发纤维。又在另一方面中,人类头发是金发或已用已知方法漂白的有色头发。还又在另一方面中,人类头发不含黑色素,或基本上不含黑色素。在另一特定方面中,源材料是羽毛。又在另一方面中,羽毛是白色羽毛。又在另一方面中,羽毛不含黑色素或基本上不含黑色素。又在另一特定方面中,源材料是羊毛。又在另一方面中,羊毛是白色羊毛。又在另一方面中,羊毛不含黑色素或基本上不含黑色素。在一些实施方式中,角蛋白纳米材料还可通过常规化学合成技术来获得,或者通过使用重组技术制备角蛋白纳米材料来获得。
在有效裂解二硫键之后,或在键裂解同时,可从组织网络提取角蛋白,并放入合适的溶液。优选的溶液是本技术领域所公知的,且包括例如尿素、硫脲、磷酸盐、磷酸氢盐、硫酸盐、硫酸氢盐、氰酸酯、硫氰酸酯、碳酸盐、碳酸氢盐、过渡金属氢氧化物(如氢氧化钠和氢氧化钾)、氢氧化铵和三(羟甲基)氨基甲烷(碱)。在特定方面中,溶液的浓度是约0.01M-约1.0M(例如,约0.01M,0.05M,0.10M,0.15M,0.20M,0.25M,0.30M,0.35M,0.40M,0.45M,0.50M,0.55M,0.60M,0.65M,0.70M,0.75M,0.80M,0.85M,0.90M,0.91M,0.92M,0.93M,0.94M,0.95M,0.96M,0.97M,0.98M,0.99M,最高达约1.0M)。在特定实施方式中,溶液浓度是约0.1M。
在另一方面中,溶液是碱。在更具体的方面中,碱浓度是约0.01M-约1.0M(例如,约0.01M,0.05M,0.10M,0.15M,0.20M,0.25M,0.30M,0.35M,0.40M,0.45M,0.50M,0.55M,0.60M,0.65M,0.70M,0.75M,0.80M,0.85M,0.90M,0.91M,0.92M,0.93M,0.94M,0.95M,0.96M,0.97M,0.98M,0.99M,最高达约1.0M)。又在更特定实施方式中,碱的浓度是约0.1M。
在一些实施方式中,提取的角蛋白的粗溶液可进行额外的澄清以除去小颗粒材料(例如角质层(cuticle)片),这可通过本技术领域所公知的方法来实现。非限制性例子包括过滤、重力沉降、倾滗、离心、旋流分离等。在特定方面中,其它净化可使用离心来进行。在一方面中,离心速度是约2,500rpm(转/分钟)-约10,000rpm(例如,约2,500rpm,2,750rpm,3,000rpm,3,500rpm,3,570rpm,4,000rpm,4,250rpm,4,500rpm,4,750rpm,5,000rpm,5,250rpm,5,500rpm,5,750rpm,6,000rpm,6,250rpm,6,500rpm,6,750rpm,7,000rpm,7,250rpm,7,500rpm,7,750rpm,8,000rpm,8,250rpm,8,500rpm,8,750rpm,9,000rpm,9,250rpm,9,500rpm,9,750rpm,最高达约10,000rpm)。在更具体的方面中,离心速度是高速离心(例如>5,000rpm)。
在一些实施方式中,净化步骤之后还包括过滤过程。过滤的非限制性例子包含重力过滤、真空过滤、膜过滤等。在特定方面中,过滤方法是膜过滤。在更具体的方面中,用于膜过滤的膜的孔径是约1μm-约50μm(例如,1μm,5μm,10μm,15μm,20μm,25μm,30μm,35μm,40μm,45μm,最高达约50μm)。又在更特定的方面中,过滤方法包含通过具有小于50μm孔径的膜的过滤。
在其它实施方式中,在净化之后,粗角蛋白提取溶液可任选地经历纯化过程来形成角蛋白的亚级分(sub-fraction)。在一些实施方式中,亚级分进一步除去总污染物,并形成更适于用于获得角蛋白纳米材料的角蛋白溶液。亚级分方法是本技术领域所公知的,并包括例如等电沉淀、超滤和各种形式的层析(如柱层析、纸层析、薄层层析、置换层析、气相色谱法、液相色谱法等)。在特定方面中,亚级分使用等电沉淀来进行。在更具体的方面中,等电沉淀方法是酸化。具体来说,在一些实施方式中,将水性酸添加到角蛋白溶液,从而pH到达小于6(例如,pH 1,pH 1.5,pH 2,pH 2.5,pH 3,pH 3.5,pH 4,pH 4.5,pH 5,pH 5.5,最高达pH 6),且获得酸性不可溶解级分的沉淀。在更具体的方面中,酸度范围是约pH 4-约pH6。适用于酸化的酸的非限制性例子包括盐酸、硫酸和乙酸。在特定方面中,所述酸是盐酸。然后,可用本技术领域所公知的方法来分离酸不可溶解和酸可溶解的亚级分。用于分离酸可溶解亚级分的非限制性例子方法包括过滤、重力沉降、倾滗、离心、旋流分离等。在特定方面中,可使用离心来进行进一步净化。在一方面中,离心速度是约2,500rpm-约10,000rpm(例如,约2,500rpm,2,750rpm,3,000rpm,3,500rpm,3,570rpm,4,000rpm,4,250rpm,4,500rpm,4,750rpm,5,000rpm,5,250rpm,5,500rpm,5,750rpm,6,000rpm,6,250rpm,6,500rpm,6,750rpm,7,000rpm,7,250rpm,7,500rpm,7,750rpm,8,000rpm,8,250rpm,8,500rpm,8,750rpm,9,000rpm,9,250rpm,9,500rpm,9,750rpm,最高达约10,000rpm)。在更具体的方面中,离心速度是高速离心(例如>5,000rpm)。
例如,在一些实施方式中,可任选地对角蛋白亚级分溶液进行进一步纯化,例如层析。可使用多种层析来纯化角蛋白溶液,包含尺寸排阻或凝胶过滤层析,亲和性层析,等电聚焦,凝胶电泳,离子交换层析,和免疫亲和性层析。层析技术是本技术领域所熟知的,且能通过分子量、化学官能团、等电点、电荷或者与特殊抗体的相互作用的特征,来分离化合物(包括蛋白质),且可单独地使用或以任意组合地使用,从而影响高的分离程度和所得纯度。在特定方面中,纯化使用离子交换(IEx)层析来进行。因为蛋白质总体上的两性性质且特别是角蛋白,IEx层析特别适用于蛋白质分离。取决于溶液的起始pH和所需的计划用于保留的级分,可使用阳离子或阴离子IEx(分别是CIEx或AIEx)技术。例如,在大于或等于pH 7时,酸可溶解和不可溶解级分都是可溶解的,且取决于它们的等电点,将显示不同的树脂结合特征。虽然无意受限于任何具体理论,但可将角蛋白亚级分溶液滴定到目标pH,并通过CIEx或AIEx树脂。本领域普通技术人员将理解,取决于在目标pH下的净电荷,角蛋白亚级分中包含的分子将与树脂结合或不与树脂结合。结果,通过下述可实现其它亚级分之间的分离:单独地收集通过树脂、然后通过用于除去粘结到树脂的化合物的溶液(例如氯化钠或其它缓冲溶液)的溶液。例如,包含角蛋白纳米材料的级分可使用本技术领域所公知的技术如凝胶电泳、凝胶过滤层析,或尺寸排阻层析层析来确定。
在其它实施方式中,超滤单独地或与上述方法组合地用于粗角蛋白溶液的总分级。超滤可用于分离粗角蛋白溶液或具有不同分子尺寸特征的角蛋白亚级分溶液。虽然无意受限于角蛋白性能的任何具体理论,但认为如上所述的酸不可溶解亚级分具有比酸可溶解亚级分相对更高的分子量。本领域普通技术人员认识到可如何施加例如超滤的方法,以基于蛋白质分子尺寸来影响蛋白质之间的分离,并选择合适的超滤条件。
在特定实施方式中,超滤膜具有下述的标称低分子量截断(cutoff)(NLMWCO):约10kDa-约300kDa(例如,约10kDa,20kDa,30kDa,40kDa,50kDa,60kDa,70kDa,80kDa,90kDa,100kDa,110kDa,120kDa,130kDa,140kDa,150kDa,160kDa,170kDa,180kDa,190kDa,200kDa,210kDa,220kDa,230kDa,240kDa,250kDa,260kDa,270kDa,280kDa,290kDa最高达约300kDa)。在特定方面中,用于分离更高分子量可溶解角蛋白级分的方法是使用具有约30kDa的NLMWCO的膜超滤。又在另一特定方面中,用于分离更高分子量可溶解角蛋白级分的方法是使用具有约100kDa的NLMWCO的膜超滤。
本领域普通技术人员将理解,渗透进入超滤膜的角蛋白也可进行收集,从而还可分离低于某些标称分子量的分子。可依次使用多个超滤步骤,使用不同NLMWCO膜,以分离多个分子量的角蛋白级分。这些步骤可在如上所述的其它分离技术之前或之后使用,可以许多不同的组合使用,从而影响许多分离和纯化策略。
在初始纯化之后,进一步从角蛋白溶液纯化和制备(即,分离)角蛋白纳米材料。通过用缓冲剂处理角蛋白溶液来制备角蛋白纳米材料。适用于处理角蛋白溶液的缓冲剂的非限制性例子包括一价和/或二磷酸盐(如磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾等),硼酸盐(如硼酸钠,硼酸钾等),柠檬酸盐(如柠檬酸钠,柠檬酸二钠等),醋酸盐(如醋酸钠、醋酸钾等),碳酸盐(如碳酸钠、碳酸氢钠等)等。在特定方面中,缓冲剂是一价磷酸盐缓冲剂、二价磷酸盐缓冲剂或其组合。又在更具体的方面中,缓冲剂是磷酸钠缓冲剂、磷酸钾缓冲剂或其组合。
用于处理角蛋白溶液的缓冲剂浓度可为约1mM-约200mM(例如,1mM,5mM,10mM15mM,20mM,25mM 30mM,35mM,40mM,45mM,50mM,55mM,60mM,65mM,70mM,75mM,80mM,85mM,90mM,100mM,105mM,110mM 115mM,120mM,125mM 130mM,135mM,140mM,145mM,150mM,155mM,160mM,165mM,170mM,175mM,180mM,185mM,190mM,最高达约200mM)。在特定实施方式中,缓冲剂浓度是约1mM-100mM。又在更特定实施方式中,缓冲剂浓度是约5mM-约50mM。缓冲溶液的pH也影响纯化。在一些方面中,本文提供的缓冲溶液的pH是约pH 7-约pH 12(例如,约pH7,pH 7.5,pH8,pH 8.5,pH 9,pH 9.5,pH 10,pH 10.5,pH 11,pH 115,最高达约pH 12)。在更具体的方面中,pH是约pH 7-约pH 10。
本文所用的缓冲溶液还可包含其它溶质,例如氯化物盐。氯化物盐的非限制性例子包括例如氯化钠或氯化钾。在特定实施方式中,氯化钠与磷酸钠缓冲剂一起使用,氯化钾与磷酸钾缓冲剂是氯化钾一起使用,或使用它们的组合。在特定方面中,氯化物盐的浓度是约1mM-约1M(例如,约1mM,50mM,100mM,150mM,200mM,250mM,300mM,350mM,400mM,450mM,500mM,550mM,600mM,650mM,700mM,750mM,800mM,850mM,900mM,950mM,最高达约1M)。在更具体的方面中,氯化物盐的浓度是约50mM-约200mM。
虽然无意受限于任何具体理论,但使用本文所述的浓度范围的磷酸盐缓冲剂用于使结合的(即,粘结到)损坏的蛋白质和肽与核角蛋白纳米材料之间的粘结失稳,同时提高角蛋白纳米材料自身的稳定性。在一些实施方式中,将缓冲剂盐添加到角蛋白溶液,并允许在角蛋白纳米材料发生分子重排时静置。在一种实施方式中,允许角蛋白溶液静置约30秒-约30天的时间段。又在其它实施方式中,通过添加补偿(make-up)缓冲液,在超滤过程中添加盐。在特定实施方式中,缓冲剂是磷酸盐缓冲剂,且磷酸盐缓冲剂的浓度是1mM-100mM。在特定方面中,磷酸盐缓冲剂的浓度是5mM-50mM。在其它方面中,用于磷酸盐缓冲溶液的pH范围是pH 7到pH 12。在更具体的方面中,用于磷酸盐缓冲溶液的pH范围是pH 7到pH 10。又在更具体的方面中,用于磷酸盐缓冲溶液的pH是pH 7.4到pH 10。在甚至更具体的实施方式中,磷酸盐缓冲溶液包含一种或多种氯化物盐。在特定方面中,与磷酸钠缓冲剂一起使用的氯化物盐是氯化钠,与磷酸钾缓冲剂一起使用的氯化物盐是氯化钾。在特定方面中,氯化物盐的浓度是10mM-1M,例如50mM-200mM。
在这些分子发生重排之后(或在它们发生重排时),可再次进行超滤,来除去现已解离的损坏的角蛋白和肽分子。在特定实施方式中,使用具有下述NLMWCO的膜来进行切向流动超滤:约10kDa-约300kDa(例如,约10kDa,20kDa,30kDa,40kDa,50kDa,60kDa,70kDa,80kDa,90kDa,100kDa,110kDa,120kDa,130kDa,140kDa,150kDa,160kDa,170kDa,180kDa,190kDa,200kDa,210kDa,220kDa,230kDa,240kDa,250kDa,260kDa,270kDa,280kDa,290kDa最高达约300kDa)。在特定方面中,使用NLMWCO为约30kDa的膜来进行切向流动超滤。又在另一特定方面中,使用NLMWCO为约100kDa的膜来进行切向流动超滤。本领域普通技术人员认识到分子尺寸为约50nm-约100nm的角蛋白纳米材料可利用具有不同NLMWCO数值的超滤膜来进一步分离。
如有需要,在分离之后,可通过如上所述的使用超滤、酸沉淀或其它方法除去缓冲剂盐,来进一步纯化角蛋白纳米材料。在具体实施方式中,用于除去缓冲剂盐的方法是超滤,具体来说,是相对于纯水的超滤。在一些实施方式中,可优选地以不同组合重复缓冲剂超滤和纯水超滤循环,从而应更有利的角蛋白纳米材料纯化。此外,可有益地使用特殊缓冲剂来结束超滤,从而样品是渗透地平衡的。
在纯化完成之后,可用于本技术领域所公知的方法来分离角蛋白纳米材料。这些方法包含浓缩溶液,然后固化。可使用冷冻干燥、临界点干燥、降膜蒸发、喷涂干燥等从溶液获得固体角蛋白纳米材料。在特定方面中,使用例如临界点干燥和冷冻干燥的方法来分离角蛋白纳米材料,在更具体的方面中,使用冷冻干燥来分离角蛋白纳米材料。本领域普通技术人员认识到冷冻干燥的多个参数例如冷冻温度,冷冻速率,干燥温度和干燥速率将影响所得固体角蛋白纳米材料。
冷冻干燥的一种优选的方法是使用受控的冷冻速率和干燥速率。在特定方面中,冷冻速率范围是约0.01℃到10℃/分钟(例如,约0.01℃,0.05℃,0.10℃,0.15℃,0.20℃,0.25℃,0.30℃,0.35℃,0.40℃,0.45℃,0.50℃,0.55℃,0.60℃,0.65℃,0.70℃,0.75℃,0.80℃,0.85℃,0.90℃,0.91℃,0.92℃,0.93℃,0.94℃,0.95℃,0.96℃,0.97℃,0.98℃,0.99℃,1.0℃,1.5℃,2℃,2.5℃,3℃,3.5℃,4℃,4.5℃,5℃,5.5℃,6℃,6.5℃,7℃,7.5℃,8℃,8.5℃,9℃,9.5℃,最高达10℃/分钟)。在特定方面中,冷冻速率几乎是瞬时的,例如可通过在液氮、异丙醇/干冰等中淬冷角蛋白纳米材料溶液。在更具体的方面中,冷冻速率范围是约0.1℃-约1℃/分钟(例如,约0.10℃,0.15℃,0.20℃,0.25℃,0.30℃,0.35℃,0.40℃,0.45℃,0.50℃,0.55℃,0.60℃,0.65℃,0.70℃,0.75℃,0.80℃,0.85℃,0.90℃,0.91℃,0.92℃,0.93℃,0.94℃,0.95℃,0.96℃,0.97℃,0.98℃,0.99℃,最高达约1.0℃/分钟)。
在具体实施方式中,优选的干燥速率是当样品在高真空下且在水的冰点以下获得的干燥速率。在特定实施方式中,真空是约1毫托(millitorr)-约100毫托(例如,约1毫托,5毫托,10毫托,15毫托,20毫托,25毫托,30毫托,35毫托,40毫托,45毫托,50毫托,55毫托,60毫托,65毫托,70毫托,75毫托,80毫托,85毫托,90毫托,95毫托,最高达约100毫托)。在更具体实施方式中,真空是低于100毫托。在甚至更具体的方面中,真空是低于80毫托。
对于冷冻干燥,样品温度或样品所暴露的温度可为约-200℃到约0℃(例如,约-20℃,-19℃,-18℃,-17℃,-16℃,-15℃,-14℃,-13℃,-12℃,-11℃,-12℃,-10℃,-9℃,-8℃,-7℃,-6℃,-5℃,-4℃,-3℃,-2℃,-1℃,最高达约0℃)。在特定方面中,样品温度或样品所暴露的温度低于0℃。在更具体的方面中,样品温度或样品所暴露的温度低于-4℃。本领域普通技术人员将认识到在冷冻干燥过程中可通过下述来从样品除去残留的水:使用样品温度和真空的不同组合来影响升华过程,且最快速有效的那些升华过程是其中优化了升华速率的那些。优选的升华速率是其中样品没有融解从而只通过升华且不通过蒸发来除去水的那些升华速率。
组合物
本发明的组合物包含本文所述的至少一种角蛋白纳米材料。在其它实施方式中,组合物可任选地包含载体。组合物可用于进一步制备角蛋白生物材料。
在一些实施方式中,本文所述的组合物可为下述形式:凝胶、泡沫、固体(例如粉末、细粒、颗粒等)、浆料或液体。在特定方面中,组合物是凝胶形式。在另一特定方面中,组合物是泡沫形式。又在另一特定方面中,组合物是固体(例如粉末、细粒、颗粒等)形式。又在另一特定方面中,组合物是浆料形式。又在另一特定方面中,组合物是液体形式。
载体:
包含载体的组合物将具有用于流变学测量(例如,粘度、屈服值,储存模量和损耗模量)的正确的数值(和数值范围)。本文所述的载体的非限制性例子包括液体、凝胶、泡沫、浆料或固体(包括可润湿粉末或干燥粉末)。
载体材料的选择将取决于预期应用。在具体实施方式中,所述载体是液体。在一方面中,液体可为水性或非水性液体载体。可用作本文所述的方法组合物的载体的液体的非限制性例子包含水、水性溶液(例如,糖水)、非水性液体或非水性溶液。在特定方面中,载体是水。在另一方面中载体是水性溶液。又在另一方面中,载体是非水性液体。
在特定方面中,载体是非水性液体(例如,油等)。非水性液体可为可生物降解的非水性液体。非水性液体可为“低蒸气压挥发性有机化合物(LVP-VOC)”,其是包括下述的化学“化合物”或“化合物的混合物”:(1)20℃下小于0.1mm Hg的蒸气压,(2)包括具有大于12个碳原子的化学化合物,和/或(3)大于216℃的沸点。参见加州空气资源委员会(CARB)提供的LVP-VOC的定义。非水性液体可为可生物降解的LVP-VOC非水性液体。
适于用作本文所述的组合物的载体的非水性液体的非限制性例子包括:硅酮油、石蜡/石蜡油、矿物油、己二醇、甘油、亚油酸、油酸及其任意组合。
在另一种实施方式中,载体是浆料。适用于浆料的液体的非限制性例子可包含水、水性溶液、非水性液体或非水性溶液。在一方面中,浆料可包含粘着剂(sticking agent)、液体或其组合。粘着剂的非限制性例子包含藻酸盐、矿物油、糖浆、阿拉伯树胶、蜂蜜、甲基纤维素、牛奶、墙纸糊料及其组合。
在另一种实施方式中,载体是固体。在一方面中,固体是粉末。在一方面中,粉末是可润湿粉末。在另一方面中,粉末是干燥粉末。又在另一方面中,固体是细粒。可用作本文所述的组合物的载体的固体的非限制性例子包括泥煤、小麦、小麦壳、研磨的小麦秸秆、糠(bran)、蛭石、纤维素、淀粉、土壤(巴氏杀菌或未经巴氏杀菌的)、石膏、滑石、粘土(如高岭土、膨润土、蒙脱土)和硅胶。
角蛋白生物材料
可进一步加工或合成、分离、纯化或以本领域所公知的方法的其它技术来制备角蛋白纳米材料。可将角蛋白纳米材料添加到液体溶液、固体(例如,粉末,可润湿的粉末等)、浆料、半固体、糊料、乳化物(emulsification)等。
在特定实施方式中,可通过将干燥的角蛋白纳米材料研磨(例如粉碎、碾磨等)成粉末,来进一步加工角蛋白纳米材料。碾磨设备是本技术领域所公知的。在优选的实施方式中,使用利用锥和丝网技术的药物磨机来研磨角蛋白纳米材料。更具体来说,是具有锥和丝网磨机,能减少静电电荷的药物磨机。
可从角蛋白纳米材料、包含角蛋白纳米材料的组合物或其组合,来制备角蛋白生物材料。在特定实施方式中,使用加工的角蛋白纳米材料(例如,粉末化角蛋白纳米材料),根据本技术领域所公知的方法,可形成包含角蛋白纳米材料的一种或多种生物材料。包含角蛋白纳米材料的生物材料的非限制性例子包含膜、泡沫、纤维、涂层、凝胶、水凝胶、支架、海绵、颗粒等。在更具体实施方式中,本文提供的包含角蛋白纳米材料的生物材料还包括油灰、胶粘剂、敷料(例如医学敷料或医学敷料的组分)、绷带或绷带组分、药物递送装置、细胞递送装置等。
又在更具体实施方式中,本文提供的包含角蛋白纳米材料的生物材料还包括在医疗装置上的涂层、包括含有治疗细胞(如干细胞)的细胞的水凝胶颗粒、包含治疗剂如药物或生物分子如生长因子的固体颗粒、用作组织工程支架的海绵和/或泡沫、如复苏液和/或用于器官保护液体的液体、如伤口敷料的敷料、如真皮填充物的软组织膨胀剂以及在化妆品和个人护理产品中的添加剂。
实施例
提供下面的实施例仅仅是为了阐述的目的,而不是为了限制如本文所要求保护的本发明的范围。本领域普通技术人员可进行的示例性实施例中的任何变化都预期落入本发明的范围之内。
实施例1:制备氧化角蛋白纳米材料
从商业供应商获得中国人头发的样品,并未经处理直接使用。将100g的头发纤维放置进入2升2重量/体积百分比过乙酸中,并在37℃下在150rpm下振摇8小时。通过筛子回收氧化的头发,并通过在37℃下在150rpm下振摇15小时使用4升100mM的Tris碱来提取氧化的头发。通过筛子回收头发,保留提取物溶液,且通过在37℃下在150rpm下振摇2小时使用4升的纯水来进一步提取头发纤维。用筛子回收头发并丢弃,保留提取物溶液。组合两种提取物溶液来形成粗角蛋白提取物的溶液,其通过下述来净化颗粒物质:通过在40000rpm下运行的固体分离器的离心,随后通过具有20-25微米平均孔径的膜的过滤。通过使用100kDaNLMWCO聚砜,螺旋缠绕过滤器滤筒的超滤,从这个粗溶液获得角蛋白纳米材料。所用的缓冲剂由在pH 7.5下的5mM磷酸氢二钠和150mM氯化钠组成,且超滤进行5体积洗涤。超滤的第二阶段使用纯水的5体积洗涤来进行。浓缩纯化的角蛋白纳米材料溶液,滴定到pH 7.4,冷冻,并进行冷冻干燥来制备角蛋白纳米材料粉末。使用纯水在10,8和5重量百分数下,重建粉末。所有3个样品形成粘性、自支持的水凝胶,其在自身重力下不流动。
在缓冲剂超滤之前和之后,通过尺寸排阻层析(SEC)分析角蛋白纳米材料样品来测定其分子量分布。在包含Ultimate 3000四元分析泵、具有20微升螺旋环(loop)的Rheodyne手动注射器和Ultimate 3000UV/Vis检测器的Dionex SEC色谱系统上分析样品。以1毫升/分钟的速度流动的流动相是pH 7.5的15mM磷酸氢二钠/150mM氯化钠。在280nm下检测,且使用运行Chromeleon v6.8色谱软件的笔记本电脑来进行数据收集。将样品制备为0.2毫克/毫升在流动相缓冲剂中的溶液。
结果表明在缓冲剂超滤之前(图2A),主要是角蛋白多肽和其它低分子量化合物。在缓冲剂超滤之后,清楚地存在大量角蛋白纳米材料(图2B)。
实施例2:制备氧化角蛋白纳米材料
从商业供应商获得中国人头发的样品,并未经处理直接使用。将200g的头发纤维放置进入4升2重量/体积百分比过乙酸中,并在37℃下在125rpm下振摇8小时。通过筛子回收氧化的头发,并通过在37℃下在125rpm下振摇14小时使用8升100mM的Tris碱来提取氧化的头发。通过筛子回收头发,保留提取物溶液,且通过在37℃下在125rpm下振摇2小时使用8升的纯水来进一步提取头发纤维。用筛子回收头发并丢弃,保留提取物溶液。组合两种提取物溶液来形成粗角蛋白提取物的溶液,其通过下述来净化颗粒物质:通过在43,000rpm下运行的固体分离器的离心,随后通过具有20-25微米平均孔径的膜的过滤。通过使用100kDaNLMWCO聚砜,螺旋缠绕过滤器滤筒的超滤,从这个粗溶液获得角蛋白纳米材料。所用的缓冲剂由在约pH 9.1下的10mM磷酸氢二钠和100mM氯化钠组成,且超滤进行12体积洗涤。超滤的第二阶段使用纯水的4体积洗涤来进行。浓缩纯化的角蛋白纳米材料溶液,滴定到pH 7.4,冷冻,并进行冷冻干燥来制备角蛋白纳米材料粉末。在缓冲剂超滤之前和之后,通过尺寸排阻层析(SEC)分析角蛋白纳米材料样品来测定其分子量分布。
在包含Ultimate 3000四元分析泵、具有20微升螺旋环(loop)的Rheodyne手动注射器和Ultimate 3000UV/Vis检测器的Dionex SEC上分析样品。流动相以1毫升/分钟的速度流动,且是在pH 7.5下的10mM磷酸氢二钠/100mM氯化钠。在280nm下检测,且使用运行Chromeleon v6.8色谱软件的笔记本电脑来进行数据收集。将角蛋白纳米材料和常规角质物质的样品制备成0.2毫克/毫升在流动相缓冲剂中的溶液,并分析分子量。
结果表明使用常规的水超滤时(图3A),主要是角蛋白多肽和其它低分子量化合物。使用缓冲剂超滤时,清楚地存在大量角蛋白纳米材料(图3B)。
实施例3:制备还原角蛋白纳米材料
从商业供应商获得中国人头发的样品,并未经处理直接使用。通过如下所述的多步还原工艺来实现角蛋白的提取:将100克的头发放入pH调节到为10.5的2升的0.5M巯基乙酸(TGA)溶液中,并在37℃下在150rpm下振摇15小时。用筛子回收头发,并保留提取溶液。然后,将头发纤维放入4升100mM Tris的溶液中,并在37℃下在150rpm下振摇2小时。保留所得提取溶液,将头发放入4升的纯水中,并在37℃下在150rpm下振摇2小时。用筛子回收头发,将头发放入新鲜制备的pH调节到为10.5的1升的0.5M TGA溶液中,并在37℃下在150rpm下振摇15小时。用筛子回收头发,并保留提取溶液。然后,将头发放入2升100mM Tris的溶液中,并在37℃下在150rpm下振摇2小时。保留所得提取溶液,然后将头发放入2升的纯水中,并在37℃下在150rpm下振摇2小时。用筛子回收头发并丢弃。保留提取溶液,并与在之前步骤中获得的提取溶液合并,以形成粗角蛋白提取物的溶液。所述提取物通过下述来净化颗粒物质:通过在30000rpm下运行的固体分离器的离心,随后通过具有20-25微米平均孔径的膜的过滤。通过使用100kDa NLMWCO聚砜,螺旋缠绕过滤器滤筒的超滤,从该净化的粗角蛋白提取物获得角蛋白纳米材料。使用相对于缓冲剂的10体积洗涤、随后相对于纯水的3体积洗涤来进行超滤,所述缓冲剂由在pH 9.1下的5mM磷酸氢二钠和150mM氯化钠组成。浓缩纯化的角蛋白纳米材料溶液,滴定到pH 8.5,冷冻,并进行冷冻干燥来制备角蛋白纳米材料粉末。
使用SEC分析在超滤之前和之后收集的样品,以测定角蛋白纳米材料的相对分子量分布。在具有20微升螺旋环的Dionex手动注射器和设定在280nm下的Ultimate 3000UV/Vis检测器上分析样品。使用Chromeleon v6.8色谱软件来进行数据收集。
所得色谱图表明在超滤之前(图4A)在角蛋白提取物中主要存在角蛋白多肽和其它低分子量化合物,而在超滤之后(图4B)收集的样品清楚地显示存在角蛋白纳米材料。
实施例4:角蛋白样品的尺寸排阻层析
从商业供应商获得中国人头发的样品,并未经处理直接使用。通过如下所述的多步还原工艺来实现角蛋白的提取:将50克的头发放入pH调节到为10.5的1升的0.5M TGA溶液中,并在37℃下在150rpm下振摇15小时。在保温之后,用筛子回收头发,并保留提取溶液。然后,将头发纤维放入2升100mM Tris的溶液中,并在37℃下在150rpm下振摇2小时。保留所得提取溶液,将头发放入2升的纯水溶液中,并在37℃下在150rpm下振摇2小时。用筛子回收头发,将头发放入新鲜制备的pH调节到为10.5的0.5升的0.5M TGA溶液中,并在37℃下在150rpm下振摇15小时。用筛子回收头发,并保留提取溶液。然后,将头发放入1升100mM Tris的溶液中,并在37℃下在150rpm下振摇2小时。保留所得提取溶液,然后将头发放入1升的纯水溶液中,并在37℃下在150rpm下振摇2小时。用筛子回收头发并丢弃。保留提取溶液,并与在之前步骤中获得的提取溶液合并,以形成粗角蛋白提取物的溶液。所述提取物通过下述来净化颗粒物质:通过在30000rpm下运行的固体分离器的离心,随后通过具有20-25微米平均孔径的膜的过滤。通过使用100kDa NLMWCO聚砜,螺旋缠绕过滤器滤筒的超滤,从该净化的粗角蛋白提取物获得角蛋白纳米材料。使用相对于缓冲剂的8体积洗涤、随后相对于纯水的3体积洗涤来进行超滤,所述缓冲剂由在pH 9.1下的5mM磷酸氢二钠和150mM氯化钠组成。浓缩纯化的角蛋白纳米材料溶液,滴定到pH 8.5,冷冻,并进行冷冻干燥来制备角蛋白纳米材料粉末。
使用SEC来分析来自缓冲剂超滤和使用常规水超滤的重复提取过程的样品,以评估纯化角蛋白纳米材料的存在。在具有20微升螺旋环的Dionex手动注射器和设定在280nm下的Ultimate 3000UV/Vis检测器上分析样品。使用Chromeleon v6.8色谱软件来进行数据收集。
SEC色谱图表明使用常规水超滤主要得到低分子量多肽(图5A),而缓冲剂超滤得到纯化的角蛋白纳米材料(图5B)。
实施例5:通过Na2S/脲的还原溶液提取的角蛋白样品的尺寸排阻层析
从商业供应商获得中国人头发的样品,并未经处理直接使用。将100克的头发放入4升0.042M硫化钠和1M脲(pH 12.6)溶液中,并在37℃下在150rpm下振摇1.5小时。在保温之后,用筛子回收头发,并保留提取溶液。然后,通过在37℃下在150rpm下振摇30分钟,来用1升纯水进一步提取头发纤维。用筛子回收头发并丢弃,同时保留并混合提取溶液。然后,粗角蛋白提取物通过下述来净化颗粒物质:通过在30000rpm下运行的固体分离器的离心,随后通过具有20-25微米平均孔径的膜的过滤。通过使用100kDa NLMWCO聚砜,螺旋缠绕过滤器滤筒的超滤,从这个净化的粗角蛋白提取物获得角蛋白纳米材料。使用用于10体积洗涤的在pH 9.1下的由5mM磷酸氢二钠和150mM硫化钠组成的缓冲剂,和随后相对于纯水的3体积洗涤,在一半的提取物上进行超滤。浓缩纯化的角蛋白纳米材料溶液,滴定到pH 8.5,冷冻,并进行冷冻干燥来制备角蛋白纳米材料粉末。利用角蛋白纳米材料粉末来形成稳定的水凝胶和支架。
使用SEC来分析来自缓冲剂超滤和使用常规水超滤的重复提取过程的样品,以评估纯化角蛋白纳米材料的存在。在具有20微升螺旋环的Dionex手动注射器和设定在280nm下的Ultimate 3000UV/Vis检测器上分析样品。使用Chromeleon v6.8色谱软件来进行数据收集。SEC色谱图表明与所用的提取过程无关,使用常规的水超滤主要得到低分子量多肽,而缓冲剂超滤得到纯化的角蛋白纳米材料。
实施例6:制备角蛋白纳米材料水凝胶
从商业供应商获得中国人头发的样品,并未经处理直接使用。将100g的头发纤维放置进入2升2重量/体积百分比过乙酸中,并在37℃下在150rpm下振摇8小时。通过筛子回收氧化的头发,并通过在37℃下在150rpm下振摇16小时使用4升100mM的Tris碱来提取氧化的头发。通过筛子回收头发,保留提取物溶液,且通过在37℃下在150rpm下振摇2小时使用4升的纯水来进一步提取头发纤维。用筛子回收头发并丢弃,并保留提取物溶液。组合两种提取物溶液来形成粗角蛋白提取物的溶液,其通过下述来净化颗粒物质:通过在40000rpm下运行的固体分离器的离心,随后通过具有20-25微米平均孔径的膜的过滤。通过使用100千道尔顿(kilo Dalton)NLMWCO聚砜,螺旋缠绕过滤器滤筒的超滤,从该粗溶液获得角蛋白纳米材料。所用的缓冲剂由在约pH 7.4下的10mM磷酸氢二钠和100mM氯化钠组成,超滤进行5体积洗涤。超滤的第二阶段使用纯水的5体积洗涤来进行。浓缩纯化的角蛋白纳米材料溶液,滴定到pH 7.4,冷冻,并进行冷冻干燥来制备角蛋白纳米材料粉末。在10、8和5重量/重量百分比角蛋白和纯水下,将干燥的角蛋白纳米材料粉末重组成粘性水凝胶。全部3个水凝胶都不流动,且在于37℃下保温24小时之后是完整的。
应理解,说明书和实施例阐述本发明的实施方式,且对于本领域普通技术人员而言暗示了在所要求保护的实施方式的精神和范围之内的其它实施方式。虽然结合具体的形式及其实施方式描述了本发明,应理解在不偏离如在所附权利要求所限定的实施方式的精神或范围的情况下,可诉诸于除了如上所述的那些以外的各种修改。例如,可取代那些具体描述的等同物,且在一些情况下,步骤的具体应用可颠倒或插入,全部不偏离如在所附权利要求所限定的本发明的实施方式的精神或范围。此外,本领域技术人员会认识到本发明的特征可基于给定的应用或设计的要求和特点单独使用、以任意组合使用或省略。当实施方式指“包括”某些特征时,应理解该实施方式可替代的“由所述特征中的任意一种或多种组成”或“主要由所述特征中的任意一种或多种组成”。
特别要指出的是,在本说明书中提供数值范围时,还具体披露了在该范围的上限和下限之间的每一数值。且在该范围中可独立地包括或排除这些较小范围的上限和下限。此外,本发明中引用的参考文献各自单独地通过全文引用结合于此,这样用于提供有效的补充实现本发明披露的方式,以及用于提供细化本领域普通技术人员水平的背景。
Claims (93)
1.一种角蛋白纳米材料。
2.如权利要求1所述的角蛋白纳米材料,其特征在于,使用还原化学来制备所述角蛋白纳米材料。
3.如权利要求1所述的角蛋白纳米材料,其特征在于,使用氧化化学来制备所述角蛋白纳米材料。
4.如权利要求1所述的角蛋白纳米材料,其特征在于,其包含I型单体和II型单体对。
5.如权利要求1所述的角蛋白纳米材料,其特征在于,其包含两(2)对I型单体和II型单体对。
6.如权利要求1所述的角蛋白纳米材料,其特征在于,其包含二聚体和四聚体的混合物。
7.如权利要求1所述的角蛋白纳米材料,其特征在于,其包含分子复合物,所述分子复合物基本上不含其它蛋白质和/或肽。
8.如权利要求1所述的角蛋白纳米材料,其特征在于,所述纳米材料具有大于100kDa的分子量。
9.如权利要求1所述的角蛋白纳米材料,其特征在于,所述纳米材料具有大于200kDa的分子量。
10.如权利要求1所述的角蛋白纳米材料,其特征在于,所述纳米材料具有约50nm的长度和约1nm-5nm的直径的分子尺寸。
11.如权利要求1所述的角蛋白纳米材料,其特征在于,所述纳米材料具有约50nm-100nm的长度和约5nm-10nm的直径的分子尺寸。
12.如权利要求1所述的角蛋白纳米材料,其特征在于,由可溶性角蛋白的溶液来制备所述纳米材料。
13.如权利要求12所述的角蛋白纳米材料,其特征在于,所述可溶性角蛋白的溶液主要包含氧化角蛋白。
14.如权利要求12所述的角蛋白纳米材料,其特征在于,所述可溶性角蛋白的溶液主要包含还原角蛋白。
15.如权利要求12所述的角蛋白纳米材料,其特征在于,从含角蛋白的材料提取所述可溶性角蛋白的溶液。
16.如权利要求15所述的角蛋白纳米材料,其特征在于,所述含角蛋白的材料选自下组:头发、毛皮、羽毛、羊毛、蹄、嘴、角、爪、鳞片及其组合。
17.由至少一种角蛋白纳米材料制备的一种生物材料。
18.如权利要求17所述的生物材料,其特征在于,所述角蛋白纳米材料不含或基本上不含结合的蛋白质,且其中所述结合的蛋白质是损坏的或角蛋白蛋白质的片段。
19.如权利要求17所述的生物材料,其特征在于,所述角蛋白纳米材料是还原的。
20.如权利要求17所述的生物材料,其特征在于,所述角蛋白纳米材料是氧化的。
21.如权利要求17或18所述的生物材料,其特征在于,所述角蛋白纳米材料是还原的纳米材料和氧化的纳米材料的组合。
22.如权利要求17所述的生物材料,其特征在于,所述角蛋白纳米材料是分子量大于100kDa的二聚体,分子量大于200kDa的四聚体,或其组合。
23.如权利要求17所述的生物材料,其特征在于,所述角蛋白纳米材料是具有约50nm的长度和约5nm的直径的二聚体,具有约50nm-100nm的长度和约10nm的直径的四聚体,或其组合。
24.如权利要求17所述的生物材料,其特征在于,所述生物材料是水凝胶。
25.如权利要求17所述的生物材料,其特征在于,所述生物材料是涂层。
26.如权利要求17所述的生物材料,其特征在于,所述生物材料是膜。
27.如权利要求17所述的生物材料,其特征在于,所述生物材料是海绵。
28.如权利要求17所述的生物材料,其特征在于,所述生物材料是泡沫。
29.如权利要求17所述的生物材料,其特征在于,所述生物材料是支架。
30.如权利要求17所述的生物材料,其特征在于,所述生物材料是油灰。
31.如权利要求17所述的生物材料,其特征在于,所述生物材料是胶粘剂。
32.如权利要求17所述的生物材料,其特征在于,所述生物材料是纤维。
33.如权利要求17所述的生物材料,其特征在于,所述生物材料是颗粒。
34.如权利要求17所述的生物材料,其特征在于,所述生物材料是溶液。
35.如权利要求17所述的生物材料,其特征在于,所述生物材料是敷料或敷料的组分。
36.如权利要求17所述的生物材料,其特征在于,所述生物材料是绷带或绷带的组分。
37.如权利要求17所述的生物材料,其特征在于,所述生物材料是药物递送装置。
38.如权利要求17所述的生物材料,其特征在于,所述生物材料是细胞递送装置。
39.一种用于获得角蛋白纳米材料的方法,所述方法包括下述步骤:
a.获得角蛋白溶液;和
b.使用包含磷酸盐的缓冲溶液通过超滤来处理所述角蛋白溶液。
40.如权利要求39所述的方法,其特征在于,所述角蛋白溶液主要由氧化角蛋白组成。
41.如权利要求39所述的方法,其特征在于,所述角蛋白溶液主要由还原角蛋白组成。
42.如权利要求39所述的方法,其特征在于,使用具有30kDa的NLMWCO膜来进行所述超滤。
43.如权利要求39所述的方法,其特征在于,使用具有100kDa的NLMWCO膜来进行所述超滤。
44.如权利要求39所述的方法,其特征在于,使用具有200kDa的NLMWCO膜来进行所述超滤。
45.如权利要求39所述的方法,其特征在于,使用具有300kDa的NLMWCO膜来进行所述超滤。
46.如权利要求39所述的方法,其特征在于,所述包含磷酸盐的缓冲溶液包含磷酸钠。
47.如权利要求39所述的方法,其特征在于,所述包含磷酸盐的缓冲溶液包含磷酸二氢钠。
48.如权利要求39所述的方法,其特征在于,所述包含磷酸盐的缓冲溶液包含磷酸氢二钠。
49.如权利要求39所述的方法,其特征在于,所述包含磷酸盐的缓冲溶液包含磷酸钾。
50.如权利要求39所述的方法,其特征在于,所述包含磷酸盐的缓冲溶液包含磷酸二氢钾。
51.如权利要求39所述的方法,其特征在于,所述包含磷酸盐的缓冲溶液包含磷酸氢二钾。
52.如权利要求39所述的方法,其特征在于,所述包含磷酸盐的缓冲溶液包含浓度为1mM-100mM的磷酸盐。
53.如权利要求39所述的方法,其特征在于,所述包含磷酸盐的缓冲溶液包含浓度为5mM-50mM的磷酸盐。
54.如权利要求46所述的方法,其特征在于,所述磷酸钠浓度是1mM-100mM。
55.如权利要求46所述的方法,其特征在于,所述磷酸钠浓度是5mM-50mM。
56.如权利要求47所述的方法,其特征在于,所述磷酸二氢钠浓度是1mM-100mM。
57.如权利要求47所述的方法,其特征在于,所述磷酸二氢钠浓度是5mM-50mM。
58.如权利要求48所述的方法,其特征在于,所述磷酸氢二钠浓度是1mM-100mM。
59.如权利要求48所述的方法,其特征在于,所述磷酸氢二钠浓度是5mM-50mM。
60.如权利要求49所述的方法,其特征在于,所述磷酸钾浓度是1mM-100mM。
61.如权利要求49所述的方法,其特征在于,所述磷酸钾浓度是5mM-50mM。
62.如权利要求50所述的方法,其特征在于,所述磷酸二氢钾浓度是1mM-100mM。
63.如权利要求50所述的方法,其特征在于,所述磷酸二氢钾浓度是5mM-50mM。
64.如权利要求51所述的方法,其特征在于,所述磷酸氢二钾浓度是1mM-100mM。
65.如权利要求51所述的方法,其特征在于,所述磷酸氢二钾浓度是5mM-50mM。
66.如权利要求39和46-65中任一项所述的方法,其特征在于,所述缓冲溶液还包含氯化物盐。
67.如权利要求39,46-48和52-59中任一项所述的方法,其特征在于,所述缓冲溶液还包含氯化钠。
68.如权利要求39,49-53和60-65中任一项所述的方法,其特征在于,所述缓冲溶液还包含氯化钾。
69.如权利要求66所述的方法,其特征在于,所述氯化物盐浓度是10mM-1000mM。
70.如权利要求66所述的方法,其特征在于,所述氯化物盐浓度是50mM-200mM。
71.如权利要求67所述的方法,其特征在于,所述氯化钠浓度是10mM-1000mM。
72.如权利要求67所述的方法,其特征在于,所述氯化钠浓度是50mM-200mM。
73.如权利要求68所述的方法,其特征在于,所述氯化钾浓度是10mM-1000mM。
74.如权利要求68所述的方法,其特征在于,所述氯化钾浓度是50mM-200mM。
75.如权利要求77所述的方法,其特征在于,所述磷酸盐缓冲剂是磷酸钠和磷酸钾的混合物。
76.如权利要求75所述的方法,其特征在于,所述磷酸盐缓冲剂混合物的总浓度是1mM-100mM。
77.如权利要求75所述的方法,其特征在于,所述磷酸盐缓冲剂混合物的总浓度是5mM-50mM。
78.如权利要求75-77中任一项所述的方法,其特征在于,所述缓冲溶液还包含氯化物盐。
79.如权利要求78所述的方法,其特征在于,所述氯化物盐是氯化钠、氯化钾或其组合。
80.如权利要求78所述的方法,其特征在于,所述氯化物盐总浓度是10mM-1000mM。
81.如权利要求78所述的方法,其特征在于,所述氯化物盐总浓度是50mM-200mM。
82.一种角蛋白纳米材料,所述角蛋白纳米材料主要由I型单体和II型单体对组成。
83.如权利要求82所述的角蛋白纳米材料,其特征在于,所述角蛋白纳米材料是I型单体和II型单体的二聚体和四聚体的混合物。
84.如权利要求82所述的角蛋白纳米材料,其特征在于,所述角蛋白纳米材料具有50nm-100nm的长度和5nm-10nm的直径。
85.如权利要求83所述的角蛋白纳米材料,其特征在于,所述角蛋白纳米材料具有50nm-100nm的长度和5nm-10nm的直径。
86.一种角蛋白纳米材料,所述角蛋白纳米材料由I型单体和II型单体对组成。
87.如权利要求86所述的角蛋白纳米材料,其特征在于,所述角蛋白纳米材料是I型单体和II型单体的二聚体和四聚体的混合物。
88.如权利要求86所述的角蛋白纳米材料,其特征在于,所述角蛋白纳米材料具有50nm-100nm的长度和5nm-10nm的直径。
89.如权利要求87所述的角蛋白纳米材料,其特征在于,所述角蛋白纳米材料具有50nm-100nm的长度和5nm-10nm的直径。
90.一种生物材料,所述生物材料包含如权利要求82-89中任一项所述的角蛋白纳米材料。
91.如权利要求90所述的生物材料,其特征在于,所述生物材料是水凝胶、凝胶、涂层、膜、海绵、泡沫、支架、油灰、胶粘剂、纤维、颗粒、溶液、医疗敷料、绷带、药物递送装置或细胞递送装置。
92.一种组合物,所述组合物包括至少一个载体和如权利要求82-89中任一项所述的角蛋白纳米材料。
93.如权利要求92所述的组合物,其特征在于,所述组合物是液体、悬浮液、凝胶、软膏、固体、半固体、糊料、浆料或粉末的形式。
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