CN112745383A - 一种重组人源角蛋白混合溶液的制备方法及应用 - Google Patents

一种重组人源角蛋白混合溶液的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物材料领域，用于提高正常皮肤表皮的防护能力以及对皮肤表皮角质层损伤后的修补作用，具体涉及一种重组人源角蛋白混合溶液的制备及应用。其中重组人源角蛋白混合溶液为II型碱性细胞角蛋白K1与I型酸性细胞角蛋白K10按照1：1比例聚合而成四聚体结构的溶液。上述两种角蛋白的制备方法：分别克隆人源角蛋白K1和K10基因序列，构建重组载体，转化进入大肠杆菌，诱导表达并进行纯化后，即得角蛋白K1和K10。本发明运用基因重组技术，及相关工艺使两种角蛋白相互结合形成角蛋白四聚体纤维微丝，模拟人体表皮中K1/K10的自然形态及功能，具有优异的吸水性和耐磨性,阻菌、减少表皮吸收毒害物质等特性。本发明的重组人源角蛋白混合溶液是一种新型的生物材料，用于人体时无不良反应，使用安全，因此在化妆品、美容及生物医学领域具有广泛的应用前景。

Description

一种重组人源角蛋白混合溶液的制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物材料领域，用于提高正常皮肤表皮的防护能力以及对皮肤表皮角质层损伤后的修补作用，具体涉及一种重组人源角蛋白混合溶液的制备及应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，被覆于整个人体表面，与外界环境直接接触，既是解剖学和生理学的重要器官，又是人体美的主要载体。皮肤是由表皮、真皮及皮下组织构成。表皮的厚度因解剖部位而异，介于0.04（眼睑）-1.6mm（足跖）之间，平均约0.1mm。人的表皮20岁最厚，当皮肤过厚，特别是角质层和颗粒层过厚，透光性差，就会影响皮肤的颜色，导致皮肤发黄。而皮肤太薄，对外界环境的抵抗力减弱，则导致皮肤敏感性增加。表皮位于皮肤的最外层，它直接体现出皮肤的外观及健康状态，并赋予了皮肤质感，参与皮肤的保湿和肤色的形成，是皮肤美容的重要载体。表皮属于复层鳞状上皮，主要是由角质层形成细胞构成。角质形成细胞是表皮的主要组成成分，约占表皮细胞的95%以上，细胞与细胞之间通过桥粒粘连。角质形成细胞在分化和成熟的不同阶段，其形态、大小及排列均有变化，最终在角质层形成了富含角蛋白的死亡角质细胞，最后脱落。角质形成细胞中始终含有表达不同的角蛋白。角蛋白的有序排列是皮肤抵抗外界物理、化学、微生物损害的重要因素，表皮角蛋白是表皮细胞的主要结构蛋白，呈纤维状，直径约10nm，属于中间丝家族。根据角蛋白基因核酸系列的同源性将其分为两性，I型酸性细胞角蛋白（K9-K20），相对配对角蛋白分子量较小，II型碱性细胞角蛋白（K1-K8)，其配对角蛋白分子量较大。I型角蛋白通常比配对的II型角蛋白小9KD。角蛋白K19是个例外。成熟的角蛋白纤维是有两种类型按照1：1比例聚合而成四聚体结构。表皮中形成的角蛋白表达在表皮细胞的不同阶段是不同的，基底表达角蛋白是K5/K14,分化迁移到棘层出现了K1/K10的成对表达，在细胞进一步分化过程中，K1/K10的表达逐渐增高，最终在将脱落的角质层死亡细胞中全表达为K1/K10。角质层的完整结构对维持皮肤障碍功能起了重要作用。角质层的完整性还影响化妆品、药物的渗透吸收。角质层还是皮肤吸收外界物质的主要部位、占皮肤全部吸收能力的90%。
角质层与皮肤锁水关系最为密切，正常情况下皮肤角质层含水量为10%-20%，如果低于10%皮肤就会干燥、脱屑，因此保持良好的皮肤屏障功能，防止水分丢失，使角质层的重要功能对皮肤健康以及美观非常重要，正常情况下角质层保持，经表皮水分流失量为2~5克（/H/cm2），但角质层受损害时经表皮水分丢失将增加，如果角质层全层剥离脱落，水分经皮肤外渗可增加30倍。当外界温度下降到零点以下时，水分会从表皮蒸发直至角质层表皮与外界环境形成新的平衡为止，温度降低时角质层的水分含量也降低，所以寒冷干燥的天气水分容易开裂，皮肤容易开裂，由于如果细胞膜受损，摩擦过度，过多使用去污剂和脂溶剂，即使在良好的环境下，水分也会从细胞中散失，因此影响角质层细胞的皮肤疾病，如银屑病，湿疹，皮炎等由于皮肤屏障功能减弱，皮损处水分弥散加速，皮肤更加干燥，角质层还对外界紫外线微生物，理化因素等具有防御作用，角质层的厚薄迎接影响了皮肤外观，因为光线在厚薄不一的皮肤中上色后，表皮的颜色会发生变化，如含光滑含水较多的角质层中，有规则的反射可以使皮肤明亮而光泽，而干燥有鳞屑的角质层，以非棱镜面反射的形式反射光线，使得皮肤灰暗，因此角质层过后皮肤会显得粗糙，昏暗无光，角质层过薄如过度去死皮换肤，等脚皮肤的防御功能减弱，容易使受到外界容易受到外界不良因素的侵害，出现皮肤问题，如皮肤潮红，毛细血管扩张，色素沉着，皮肤老化以及其他皮肤疾病。
根据角质形成细胞各分化阶段的细胞特征，将表皮分为5层及基底层、棘层、颗粒层、透明层、角质层，从棘层底部移至颗粒层最上层约需14天，再移行至角质层表面又需14天，共约28天，称表皮的通过时间和更替时间。正常表皮细胞分化维持在适度比例，使新的细胞已脱落，细胞保持平衡，从而维持表皮的正常厚度。人体表皮正常代谢脱落细胞的补充及外伤手术后如美容面部磨消磨术，其新生的细胞来源主要靠基底层细胞。
角质层是表皮的最外层，一般位于由一般部位由5~15层扁平无核的角质细胞及和角质磷脂组成细胞和嵌排成板状结构，非常坚韧能够抵抗外界摩擦，防止病菌微生物侵入，对一些理化因素，如酸碱紫外线有一定耐受，从而构成人体很重要的保护层。
在现实生活中很多人由于种种原因导致角质层损失如（过多使用去角质产品、美容剥脱术、美容激光等）或者有些人天生角质层较薄，由于皮肤屏障防护能力低，导致过敏等皮肤疾病。另外在日常生活中过度频繁的摩擦面部肌肤，过度清洗，长期长时间化妆、卸妆不彻底等情况，也导致相关的皮肤疾病。
角蛋白是一类具有结缔和保护功能的纤维状动物蛋白质，是外胚层细胞的结构蛋白，广泛存在于动物的毛发、羽毛和蹄中。目前国内外可溶性角蛋白的获得主要采用化学提取的方式使角蛋白中二硫键断裂衍生成磺酸基，使其成为可溶性角蛋白片段混合物。此类工艺均以动物毛发或人头发为原材料，采用酸、碱、氧化、还原等复杂的化学提取工艺，不可避免对角蛋白的天然结构造成破坏，从而带来产品的质量及安全性风险，同时带来环境安全风险。
本发明通过基因重组技术，利用生物发酵工艺，分别表达人源角蛋白K1和K10，纯化后分别得到单一的角蛋白K1和K10，并以一定比例混合，使得两种角蛋白相互结合形成角蛋白四聚体纤维微丝。该纤维细丝二硫键形成网状铰链，同时具有相互吸附形成生理膜的特性，与其在人体天然形成的结构一致，从而易于吸附在动物表皮角质层，有优异的吸水性和耐磨性,阻菌、减少表皮吸收等特性。只需要将含该纤维溶液涂抹于损伤角质层处或者整体涂抹。
本发明通过基因重组技术，得到单一的角蛋白K1和K10，相较于传统提取工艺，是一种较为绿色环保的制备方法，同时由于最终获得的蛋白较纯，其安全性和稳定性大大的提高，功能性也更加明确，因此在化妆品、美容及生物医学领域具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种含人源角蛋白K1/K10的混合溶液的制备方法。
本发明的目的之二是提供上述混合溶液对于提高正常皮肤表皮防护能力的应用。
本发明的目的之三是提供上述混合溶液对于皮肤表皮角质层损伤后修补的应用。
本发明的第一个方面，人源角蛋白K1和K10的基因序列来源于GenBank，分别为：人源角蛋白K1（SEQ ID NO: 1 所示），人源角蛋白K10（SEQ ID NO: 2 所示）。通过基因重组技术，利用生物发酵工艺，分别表达人源角蛋白K1和K10，纯化后分别得到单一的角蛋白K1和K10，并以一定比例混合，使得两种角蛋白相互结合形成角蛋白四聚体纤维微丝。其混合比例范围是其混合比例范围是K1:K10=0.5:1-1:2，优选比例为1:1。
本发明的第二个方面，提供上述混合溶液对于提高正常皮肤表皮防护能力的应用。通过对豚鼠皮肤进行急性损伤实验，在涂抹含有上述角蛋白混合溶液后，豚鼠的皮肤几乎没有损伤，说明了此角蛋白混合溶液能较好的提高正常皮肤表皮的防护能力。
本发明的第三个方面，提供上述混合溶液对于皮肤表皮角质层损伤后修补的应用。在上述实验中有皮肤损伤的豚鼠背部损伤处涂抹上述角蛋白混合溶液，能有效减少豚鼠对受损皮肤的不适感和抓挠现象，加快伤口愈合。
现阶段市面上解决角质层受损的修复方法仅仅是加速表皮细胞新陈代谢，让表皮细胞在短时间内增殖，并从基底层或者其他层分化到角质层，形成新的角质层。该修复方法确实是有效的，但是达到修复效果时间较长，最少需要一到两周，而在修复期间，存在诸多不便，因为角质层的损伤，皮肤暂时失去了屏障或者屏障受损，极易受到外界因素带来的损伤，稍有不慎就可以引发更严重的皮肤疾病或者其他疾病。本发明第一可以临时性迅速增加角质层厚度，起到角质层在修复期间的保护作用；第二可以起到增强皮肤角质层防护作用，同时在外观上，触觉上，及舒适度上与原皮肤一致。
附图说明
图1是K1和K10的质粒分别用BamHⅠ和NdeⅠ双酶切后的琼脂糖凝胶电泳检测结果图
1是K1重组质粒双酶切鉴定结果，2是K10重组质粒双酶切鉴定结果
图2是K1和K10的菌种分别表达后的SDS-PAGE电泳结果图
1是K1诱导前，2是K1诱导后表达图，3-5是K10诱导后表达图，M是蛋白Marker
图3是豚鼠皮肤急性损伤实验结果图
图4是脚部干裂使用角蛋白混合液前后对比图
图5是面部敏感肌修复图
具体实施方式
实例1 人源角蛋白K1/K10的混合溶液的制备方法
（1）根据上述基因序列送上海生工全基因合成分别合成得到基因片段K1和K10；
（2）合成的目的基因片段分别用BamHⅠ和NdeⅠ双酶切、胶回收后与同样双酶切、胶回收的表达载体pET-3a用T4-DNA连接酶连接，得到表达质粒，分别标为：pET-3a-K1和pET-3a-K10；
（3）将两种连接液分别采用热激法转化进TOP10克隆菌，再分别涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的固体培养板上，37℃静置培养过夜。从长出的菌落中，分别挑取单克隆培养，提取质粒并双酶切鉴定（如图1）和测序确认阳性克隆；
（4）将测序正确的两种质粒分别转化表达菌BL21(DE3)，并分别涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的固体培养板上，37℃静置培养过夜。从各自长出的菌落中，分别挑取单克隆培养，生长至OD600=0.6时用0.5mM IPTG诱导，筛选出高表达菌株并保存菌种。
（5）将已保种的K1和K10的高表达菌株分别进行发酵表达，在37℃下发酵罐中培养至OD600=10时，加入0.5mM IPTG诱导，诱导3h后下罐离心，并取样进行SDS-PAGE电泳检测表达结果（如图2），离心后菌体4℃保存备用。
（6）取上述收集的沉淀菌体细胞50g，用100mlTris缓冲液重悬，缓冲液中50mMTris (pH 8 .0) ，均质机破碎2次，10000rpm 4℃离心10min，由于目的蛋白存在于包涵体中，所以收集沉淀备用。
（7）将收集的沉淀用40ml变性buffer(50mM Tris(pH 8 .0) ,8M尿素，余量为去离子水)重悬溶解。充分溶解后，10000rpm离心10min取上清液，再将上清液转入亲和柱中，洗脱后得到含尿素高盐条件下的目的蛋白。
（8）用去离子水透析过夜即得到较纯的目的蛋白。
（9）将较纯的角蛋白K1和K10以1:1的比例进行混合，即可得到权利要求1所述的重组人源角蛋白混合溶液。
实例2 人源角蛋白K1/K10的混合溶液对于提高正常皮肤表皮防护能力的应用
将16只小鼠分为A、B两组各8只，每组雌雄各半，将A组小鼠背部去毛后涂抹上述角蛋白混合溶液，待自然干燥后，将B组背部去毛，然后两组同时涂抹30%的水杨酸。涂抹24h后，A组均比较正常，B组均出现皮肤损伤。（如图3）
实例3 人源角蛋白K1/K10的混合溶液对于皮肤表皮角质层损伤后修补的应用
将实例2中背部有损伤的豚鼠单独放置，并在其中一半豚鼠的损伤处涂抹上述角蛋白混合溶液，另一半不做任何处理。观察发现涂抹角蛋白混合溶液的豚鼠均比较安静，且较少会有抓挠现象，恢复的较快；而另一半未做处理的则显得较为烦躁，且不时会抓挠损伤处，造成新的伤口，恢复的较慢。
实例4人源角蛋白K1/K10的混合溶液对于皮肤干裂修复的应用
秋冬季节气候干燥，部分皮肤干燥的人手脚部角质层较厚的区域会干裂，甚至出血，且伤口反复不能愈合，疼痛难忍。将脚部干裂伤口清洁后，用人源角蛋白K1/K10的混合溶液均匀涂抹于患处，每日一次，三天后，伤口明显愈合，七天后改善皮肤干燥情况，持续使用可确保不复发。（如图4）
实例5人源角蛋白K1/K10的混合溶液对于敏感肌修复的应用
使用化妆品如刷酸导致角质层屏障破坏，出现敏感肌等情况。长期表皮慢性损伤导致色素沉积，并出现红肿等情况。前期通过欧泊皮肤检测仪拍下皮肤屏障受损照片，用人源角蛋白K1/K10的混合溶液均匀涂抹于面部，每日1-2次，一周后再次使用欧泊皮肤检测仪进行检测，可以发现皮肤屏障基本修复（如图5）。
序列表
<110> 重庆佰奥肯健康科技有限公司
<120> 一种重组人源角蛋白混合溶液的制备方法及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 643
<212> PRT
<213> 角蛋白K1(Keratin)
<400> 1
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Ser Ser Thr Ala Ala Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ser Ser Cys
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50 55 60
Ser Leu Val Ala Leu Gly Gly Ser Leu Ser Ile Ser Ile Ser Val Ala
65 70 75 80
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Leu Gly Pro Leu Ala Val Gly Ile Ala Pro Gly Ile Gly Leu Val Leu
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Pro Ile Ala Leu Val Ala Pro Leu Gly Gly Gly Ala Gly Val Leu Gly
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210 215 220
Ala Leu Gly Pro Thr Pro Gly Ser Pro Ile Ala Ala Leu Ala Ala Ala
225 230 235 240
Val Ala Gly Leu Leu Ser Ala Gly Ser Ala Leu Ala Ser Gly Leu Leu
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275 280 285
Gly Met Leu Ala Leu Ala Ala Val Ser Thr Gly Ala Val Ala Val Gly
290 295 300
Met Ala Ala Ala Pro Gly Val Ala Leu Thr Gly Leu Leu Ala Ala Met
305 310 315 320
Ala Ser Gly Thr Gly Gly Leu Ala Gly Gly Ala Ala Leu Ala Ala Gly
325 330 335
Ala Thr Pro Ala Gly Leu Ser Leu Gly Leu Thr Thr Gly Ile Ala Ala
340 345 350
Ala Ile Gly Gly Ile Ser Ser Thr Leu Ser Gly Ile Thr Gly Leu Ala
355 360 365
Ala Ala Val Gly Ala Leu Gly Ile Gly Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu
370 375 380
Leu Gly Ser Leu Gly Ala Ser Leu Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Cys
385 390 395 400
Val Gly Leu Ser Gly Ile Gly Ala Gly Ile Ser Ala Leu Gly Gly Gly
405 410 415
Leu Gly Gly Ile Ala Ala Gly Thr Gly Cys Gly Ala Thr Gly Thr Gly
420 425 430
Gly Leu Leu Ala Ile Leu Ile Ala Leu Gly Ala Gly Ile Gly Thr Thr
435 440 445
Ala Ser Leu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ala Gly
450 455 460
Gly Gly Ser Pro Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly
465 470 475 480
Ser Ser Gly Gly Gly His Gly Gly Gly His Gly Gly Ser Ser Gly Gly
485 490 495
Gly Thr Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Thr
500 505 510
Gly Gly Gly Ser Ser Ser Gly Gly His Gly Gly Ser Ser Ser Gly Gly
515 520 525
Thr Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly
530 535 540
Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Ser Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Ser
545 550 555 560
Ser Ser Gly Gly His Leu Ser Ser Ser Ser Gly Ser Val Gly Gly Ser
565 570 575
Ser Ser Leu Gly Pro Ala Thr
580

Claims (8)

1.一种重组人源角蛋白混合溶液,包含II碱性细胞型角蛋白K1(其氨基酸序列为:NO:1)与I型酸性细胞角蛋白K10(其氨基酸序列为:NO:2).其混合比例范围是K1:K10=0.5:1-1:2。
2.权利要求1所述的重组人源角蛋白混合溶液对提高正常皮肤表皮防护作用的用途。
3.权利要求1所述的重组人源角蛋白混合溶液对皮肤表皮角质层损伤后修补的用途。
4.权利要求1所述的重组人源角蛋白混合溶液的制备方法，包括以下步骤：
根据上述基因序列分别合成基因片段K1和K10；
合成的目的基因片段经双酶切、胶回收后与同样双酶切、胶回收的表达载体pET-3a连接，分别标为：pET-3a-K1和pET-3a-K10；
将两种连接液分别采用热激法转化进TOP10克隆菌，再分别涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的固体培养板上，37℃静置培养过夜。
5.从长出的菌落中，分别挑取单克隆培养，提取质粒并双酶切鉴定和测序确认阳性克隆；
将测序正确的两种质粒分别转化表达菌BL21(DE3)，并分别涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的固体培养板上，37℃静置培养过夜。
6.从各自长出的菌落中，分别挑取单克隆培养并用IPTG诱导，筛选高表达菌株。
7.将K1和K10的高表达菌株分别进行发酵并纯化，得到较纯的两种角蛋白。
8.将较纯的角蛋白K1和K10以1:1的比例进行混合，即可得到权利要求1所述的重组人源角蛋白混合溶液。
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