CN111202868A - 用于制备角蛋白凝胶敷料的组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于制备角蛋白凝胶敷料的组合物及凝胶敷料产品以及制备方法和应用。该组合物由0.01‑5重量份角蛋白和80‑500重量份辅料以及水介质组成。发明制备的凝胶敷料可有效止血，加速伤口愈合，隔绝细菌感染且没有毒副作用。并且该产品会挥发吸收，避免了再次处理该药物的环节，在实际重复使用过程中只需适量涂抹在创口上，所以对创口不会因为处理残留药物而对伤口造成再次伤害且避免过多的疼痛感。本发明还提供了根据组合物组分制备凝胶敷料的方法，制备或者生成的工序也不复杂，有利于药物生产加工。

Description

用于制备角蛋白凝胶敷料的组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于制备角蛋白凝胶敷料的组合物及其制备方法和应用。

背景技术

角蛋白作为一种无毒性天然生物材料，已经成功应用于组织修复，因其含有丰富半胱氨酸残基，具有自发组装和聚合的性质，可以制成各种类型的伤口敷料。作为人类的蛋白质来源，优异的生物相容性和良好的生物可降解性进一步拓宽了其在再生医学的应用。传统的人发角蛋白大多是采用化学或酶提取方法获得的提取物。因此其具有组分复杂和质量难控制的问题。人的头发不仅包含角蛋白，还包括丰富的角蛋白相关蛋白和中间丝蛋白等。使用传统的提取方法很难获得单一的角蛋白产品。重组表达是提高角蛋白纯度、质量的重要途径。因此，使用重组表达方法获得单一的重组角蛋白可以更明确地了解其在创面修复过程中的作用途径。

凝胶敷料由于其具有保持伤口周围的局部湿润环境，良好的透气性，保护伤口免受微生物感染，防止伤口干燥，换药时简便舒适，有助于减轻伤口疼痛，还可以减轻医务人员的工作量等特点已成为最为常用的伤口敷料。此外，凝胶敷料可以负载药物从而使药物在伤口表面达到持续释放，以促进伤口的快速愈合。因此有必要提供一种角蛋白凝胶敷料应用于创面修复，对临床治疗方面具有重要意义。

中国发明(CN201610935369.0)中有公开角蛋白、壳聚糖复合医用敷料，敷料的原料成分以及各种成分的质量百分比为：角蛋白：4％～6％；羧甲基纤维素钠：0.8％～0.9％；壳聚糖：0.6％～0.7％；甘油：7％；余量为水。角蛋白、壳聚糖复合医用敷料的制备方法：

S1：制备角蛋白；

S2：按比例称取各种成分，然后将角蛋白和羧甲基纤维素钠加入水中得初溶液；

S3：将壳聚糖和甘油加入至步骤S2所述的初溶液中，混合均匀后进行第一次冷冻干燥；

S4：经过步骤S3的第一次冷冻干燥后依次放入CaCl 2溶液和NaOH溶液中浸泡，浸泡完毕再进行第二次冷冻干燥；

S5：经过步骤S4的第二次冷冻干燥后再在甘油水溶液中浸泡，浸泡完毕再进行第三次冷冻干燥，即得到角蛋白、壳聚糖复合医用敷料。

其制备角蛋白的原料来源于毛发，利用毛发进行角蛋白的提取。而本发明的角蛋白可来源于基因工程，通过构建含重组角蛋白目的基因片段的重组质粒，将重组质粒转于大肠杆菌中得到重组角蛋白。该技术优势在于得到的角蛋白含量较单一，相较而言纯度较高，省去一些提纯去杂的步骤，也利于利用角蛋白为原料生产高纯度药物，利于药物生产。而本发明提供的制备敷料凝胶的成分和制备方法，其组分和步骤简单，涉及的仪器不多，对于生产加工制备角蛋白产品提供了更为便利的方法。

发明内容

本发明目的之一是提供一种用于制备角蛋白凝胶敷料的组合物组分，该组合物用于制备凝胶敷料产品。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种用于制备凝胶敷料的组合物，该组合物由0.01-5重量份主料和80-500重量份辅料以及适量水介质组成；所述主料为角蛋白。

进一步的，所述角蛋白制得方式为：构建含重组角蛋白目的基因片段的重组质粒，将重组质粒转于大肠杆菌培养表达纯化而得。

进一步的，所述主料角蛋白为0.05-2重量份；所述辅料为107-430重量份。

再进一步的，所述辅料由6-60重量份凝胶基质、50-150重量份保湿剂、1-20重量份防腐助溶剂和50-200重量份山梨醇组成。

再进一步的，所述凝胶基质由卡波姆、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、聚乙烯聚吡咯烷酮、聚乙烯醇组成；所述保湿剂由甘油、丙二醇、硅烷类组成；所述防腐助溶剂为苯氧乙醇。

具体的，所述凝胶基质由1-10重量份羧甲基纤维素钠和5-50重量份羟甲基纤维素组成；所述保湿剂由50-150重量份甘油组成；所述防腐助溶剂由1-20重量份苯氧乙醇组成。

具体的，所述组合物由0.05-2重量份重组角蛋白、1-10重量份羧甲基纤维素钠、5-50重量份羟乙基纤维素、50-150重量份甘油、1-20重量份苯氧乙醇、50-200重量份山梨醇以及水介质组成。

本发明目的之二是提供一种将该组合物制备成凝胶敷料产品的方法，该方法操作简单便利。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种将所述的组合物制成凝胶敷料的方法，其特征在于，所述方法的步骤为：

重组角蛋白的制备:

构建含重组角蛋白目的基因片段的重组质粒，将重组质粒转于大肠杆菌BL21，接种培养，提取纯化角蛋白。

角蛋白凝胶敷料的制备：将羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素比例用水溶解，静置过夜，使其自然溶胀，搅拌均匀；取角蛋白混悬于水中，加到上述液体中搅拌均匀，取山梨醇加入适量水溶解加入至上液中搅拌，再依次加入甘油、苯氧乙醇溶液，最后加水至最终容量，搅拌均匀即得。

本发明目的之三是提供一种凝胶敷料，该凝胶敷料会促进细胞增殖及创口愈合。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

根据上述所述的组合物：0.05-2重量份重组角蛋白、1-10重量份羧甲基纤维素钠、5-50重量份羟乙基纤维素、50-150重量份甘油、1-20重量份苯氧乙醇、50-200重量份山梨醇以及水介质经上述方法可制得角蛋白凝胶敷料。

本发明目的之四是提供使用上述方法制得的凝胶敷料在制备伤口愈合药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

使用动物修复实验得到所述凝胶敷料具有伤口愈合的功效，可应用于临床制药。

本发明目的之五是提供使用上述方法制得的凝胶敷料在制备血管内皮细胞增殖的促进剂中的应用。

利用细胞增殖(CCK-8法)，检测得到重组角蛋白对成纤维细胞具有明显促进增殖的影响。本发明作为提供的凝胶敷料对血管内皮细胞增殖具有促进作用。

本发明的有益效果在于：

1.本发明提供一种用于制备凝胶敷料的组合物的组分，对制备角蛋白凝胶敷料提供一种组分选择；

2.本发明提供了一种将凝胶敷料组合物制备成凝胶敷料产品的方法，该方法可用于凝胶敷料药物的制备，制备简便，利于操作；

3.本发明提供了一种重组角蛋白凝胶敷料，该敷料可用于止血抗菌，促进创口愈合，防止二次伤口损伤等。

附图说明

图1为不同浓度角蛋白对细胞活性的影响；

图2为角蛋白对成纤维细胞增殖的影响；

图3为角蛋白凝胶敷料对伤口闭合率影响的照片图；

图4为角蛋白凝胶敷料对伤口闭合率影响的柱状图。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

角蛋白制备：

构建含重组角蛋白目的基因片段的重组质粒，将重组质粒转于大肠杆菌BL21(DE3)。将转化的细菌以1：5000的比例接种于无菌LB-kana(50ug/mL)液体培养基中，170rpm，37℃培养过夜。当OD值为0.8-1.0时温度降至25℃，170rpm，使用终浓度为1mM的IPTG进行诱导。诱导8h后，4℃，8000rpm离心5min收菌。用细菌重量的5倍体积的Buffer A(50mM Tris pH8.0,150mM NaCl,5mM EDTA,20mMβ-巯基乙醇)重悬菌体细胞。1000bar均质破碎，4℃20000rpm离心1小时，弃上清。用沉淀重量的10倍体积Buffer A重悬沉淀，超声3min，10000rpm离心15min，弃上清。用沉淀重量的10倍体积Buffer B(50mM Tris pH 8.0,150mM NaCl,5mM EDTA,20mMβ-巯基乙醇,1M Urea,0.5％TritonX-100)重悬沉淀，超声3min，10000rpm离心15min，弃上清。用沉淀重量的10倍体积Buffer C(50mM Tris pH8.0,2.5M NaCl,5mM EDTA,20mMβ-巯基乙醇)重悬沉淀，超声3min，10000rpm离心15min，弃上清。用沉淀重量的10倍体积Buffer A(50mM Tris pH8.0,150mM NaCl,5mM EDTA,20mMβ-巯基乙醇)重悬沉淀，超声3min，10000rpm离心15min，去上清。沉淀用纯净水洗涤2次后重悬，置于-80℃，冻干机冷冻干燥成水剂或粉末。

实施例2

凝胶敷料的配制：

将1重量份的羧甲基纤维素钠、5重量份的羟乙基纤维素用10重量份水的溶解，静置过夜，使其自然溶胀，搅拌均匀；取0.05重量份的角蛋白混悬于5重量份水中，加到上述液体中搅拌均匀，取50重量份山梨醇加入50重量份水溶解加入至上液中搅拌，再依次加入50重量份的甘油、1重量份的苯氧乙醇溶液，最后加50重量份的水至最终容量，搅拌均匀可得。

将10重量份的羧甲基纤维素钠、50重量份的羟乙基纤维素用60重量份的水溶解，静置过夜，使其自然溶胀，搅拌均匀；取2重量份的角蛋白混悬于5重量份水中，加到上述液体中搅拌均匀，取200重量份山梨醇加入200重量份水溶解加入至上液中搅拌，再依次加入150重量份的甘油、20重量份的苯氧乙醇溶液，最后加100重量份的水至最终容量，搅拌均匀可得。

实施例3

细胞毒性实验：检测不同浓度角蛋白凝胶敷料对细胞活性的影响。

角蛋白浓度：0.05mg/ml-0.8mg/ml梯度设置(96well-100ul medium)处理24后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配制)20ul。继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果并分析，如附图1所示。细胞毒性实验表明，24h时重组角蛋白对成纤维细胞生长无毒性作用。

实施例4

细胞增殖(CCK-8法)：检测重组角蛋白对成纤维细胞增殖影响。

96-well 4*10³cells，设置(96well-100ul medium)处理24-48h后，每孔加100ul培养基和10ul CCK-8。继续孵育2小时，终止培养。选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果并分析，如图2所示。细胞增殖实验表明，重组角蛋白相比于对照组而言对成纤维细胞具有明显促进增殖的影响。

实施例5

动物修复实验

SD大鼠200±20g雄性12只。腹腔注射700ul,10％三氯乙醛。待小鼠昏睡时，用剃毛刀剃去大鼠背部的毛发，用干燥洁净的棉花轻轻蘸取适量75％酒精擦拭大鼠背部进行消毒；使用记号笔在大鼠背部标记1.5*1.5cm面积的区域，然后用手术剪对其标记的区域制造大鼠的皮肤全切除创面模型。分为重组角蛋白凝胶敷料实验组和空白凝胶对照组，分别对其伤口创面用凝胶敷料进行处理，将处理后的大鼠置于干燥洁净的环境下进行饲养，分别在饲养第0、6、12、18、25天后进行拍照，观察创面愈合情况。

分析创面愈合率：愈合率(％)＝(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积×100

实验结果表明：重组角蛋白敷料实验组较对照组而言在创面修复过程中具有显著的促进愈合作用，如图3、图4所示。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.用于制备凝胶敷料的组合物，其特征在于，所述组合物由0.01-5重量份主料和80-500重量份辅料以及水介质组成；所述主料为角蛋白。

2.根据权利要求1中所述的组合物，其特征在于，所述角蛋白制得方式为：构建含角蛋白目的基因片段的重组质粒，将重组质粒转于大肠杆菌培养表达纯化而得。

3.根据权利要求2中所述的组合物，其特征在于，所述角蛋白为0.05-2重量份；所述辅料为107-430重量份。

4.根据权利要求3中所述的组合物，其特征在于，所述辅料由6-60重量份凝胶基质、50-150重量份保湿剂、1-20重量份防腐助溶剂和50-200重量份的山梨醇组成。

5.根据权利要求4中所述的组合物，其特征在于，所述凝胶基质由卡波姆、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、聚乙烯聚吡咯烷酮、聚乙烯醇组成；所述保湿剂由甘油、丙二醇、硅烷类组成；所述防腐助溶剂为苯氧乙醇。

6.根据权利要求5中所述的组合物，其特征在于，所述凝胶基质由1-10重量份羧甲基纤维素钠和5-50重量份羟乙基纤维素组成；所述保湿剂由50-150重量份甘油组成；所述防腐助溶剂由1-20重量份苯氧乙醇组成。

7.将权利要求1-6中任一项所述的组合物制成凝胶敷料的方法，其特征在于，所述方法的步骤为：将所述羧甲基纤维素钠、所述羟乙基纤维素用水溶解膨胀；取所述角蛋白混悬于水中，加到上述液体中，取所述山梨醇加入适量水溶解加入至上液中，再依次加入所述甘油、所述苯氧乙醇溶液，即得到所述的凝胶敷料。

8.权利要求1-6任意一项中所述的组合物，经权利要求7中所述的制备方法所得的凝胶敷料。

9.权利要求8所述的凝胶敷料在制备伤口愈合的药物中的应用。

10.权利要求8所述的凝胶敷料在制备血管内皮细胞增殖促进剂中的应用。

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