CN111671572A - 冻干医用敷料的制备方法和冻干医用冷敷贴 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种冻干医用敷料的制备方法和冻干医用冷敷贴，制备方法包括：以表达载体T7启动子‑lac操纵子‑目的蛋白‑6xHis‑T7标记区‑6xHis‑T7终止子,附加体lac‑rop‑bom‑ori‑kanR,ori系统构建并合成质粒；将质粒与感受态细菌悬液混匀培养；将菌液由IPTG诱导、发酵、洗脱得到目的蛋白；加入寡肽‑1、D‑柠檬烯、甘油、目的蛋白、透明质酸钠、HA－800透明质酸、神经酰胺、银耳提取物、EDTA‑二钠和壳聚糖，对混合液剪切、脱气、低温蒸发蒸干、冻干，形成冻干医用敷料。通过本发明的技术方案，提高了目的蛋白的纯度、活性、适用性，提高了冷敷贴的稳定性，提高了活性物质的利用率，使用灵活。
Description
技术领域
本发明涉及医用材料及生物技术领域，尤其涉及一种冻干医用敷料的制备方法和一种冻干医用冷敷贴。
背景技术
医用敷料常用于覆盖疮、伤口或其他损害的医用材料，包括天然纱布、合成纤维类敷料等。医用敷料能防止伤口再伤害，对伤口的温度和湿度进行妥善调节，减少并发症和防止自然愈合过程中的感染现象。但现有的敷料仍存在吸收渗液能力差、透气性差、抑菌效果较差等缺点，除此之外，这类产品携带不方便，无法随时随地使用，伤口愈合后皮肤愈合效果不佳。
发明内容
针对上述问题中的至少之一，本发明提供了一种冻干医用敷料的制备方法和冻干医用冷敷贴，适用于闭合性软组织的物理退热、冷敷理疗，通过冷敷贴所含成分带走热量，可以达到局部降温，其中的功效成分与空气接触迅速吸收空气中的水分形成水凝胶，通过水合作用，可以使功效成分迅速穿透脂肪层，渗透到皮下组织，直达病灶部位，作用于患处，达到冷敷祛痛、经皮吸收、缓释给药的效果。本发明采用构建的包括目的蛋白的质粒在原核生物细菌中进行培养，诱导产生大量稳定的目的蛋白，降低工业成本的同时保证原料的纯度与活性，且不同的目的蛋白能够应用于不同作用的产品。本发明制备的医用敷料中不含水分，无需添加防腐剂，可以减少因防腐剂引起的皮肤伤害或过敏现象；使用比较灵活，润湿时间快速，放在皮肤表面后即可使用。另外，本发明采用低温蒸发蒸干处理，既保证了外泌体的活性，又大大降低了水结晶时产生的冰晶对蛋白的破坏作用，从始至终维持低温对活性物质形成了良好的保护，减少了热敏性物质的损失，敷料中一些易氧化的物质得到了保护，从而提高了活性物质的利用率，提高了冷敷贴的稳定性。
为实现上述目的，本发明提供了一种冻干医用敷料的制备方法，包括：以表达载体T7启动子-lac操纵子-目的蛋白-6xHis-T7标记区-6xHis-T7终止子,附加体lac-rop-bom-ori-kanR,ori系统构建并合成质粒；将所述质粒与感受态细菌悬液混匀，并进行培养；将经由IPTG诱导后的菌液进行发酵，并洗脱得到所述目的蛋白；以重量份计，加入0.1-10份寡肽-1、0.1-10份D-柠檬烯、0.1-10份甘油、0.1-10份所述目的蛋白、0.1-10份透明质酸钠、1-10份HA－800透明质酸、0.1-10份神经酰胺、0.5-5份银耳提取物、0.1-1份EDTA-二钠和0.1-2份壳聚糖；加入纯水定容至所需重量，将混合液进行剪切和脱气后采用低温蒸发蒸干及冻干操作，形成冻干医用敷料。
在上述技术方案中，优选地，所述将所述质粒与感受态细菌悬液混匀并进行培养具体包括：将感受态细菌悬液加入离心管中，置于冰上；向所述离心管中加入所述质粒，并用移液器轻柔混匀，冰上静置20-30分钟；向所述离心管中加入LB液体培养基，混匀后在37℃环境下振荡培养；取所述离心管中的细菌培养液涂布至含有卡那霉素的LB固体培养基上；在37℃环境下倒置培养12-16小时，菌落生长良好而未互相重叠时取出；将所述菌落接种至LA液体培养基中，在37℃环境下以200rpm振摇培养；培养至OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG进行诱导，并置于37℃摇床继续培养4小时。
在上述技术方案中，优选地，所述将经由IPTG诱导后的菌液进行发酵并洗脱得到所述目的蛋白具体包括：将诱导后的菌液加入含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃环境下振荡培养，待LB液体培养基浑浊后倒入发酵罐中发酵12-24小时；取出发酵后的LB液体培养基装入离子交换柱，根据所述目的蛋白进行条件选择，洗脱得到所述目的蛋白。
在上述技术方案中，优选地，以重量份计，加入2份寡肽-1、0.5份D-柠檬烯、1份甘油、0.5份目的蛋白、5份透明质酸钠、1份HA－800透明质酸，0.5份神经酰胺、1份银耳提取物、0.15份EDTA-二钠和1份壳聚糖，并加纯水定容至所需重量。
在上述技术方案中，优选地，所述目的蛋白包括寡肽-1、碱性成纤维蛋白、角质蛋白、胶原蛋白、纤维连接蛋白、原纤蛋白、再生蛋白、转化因子、胰岛素样生长因子和转化因子、透明质酸、白介素、干扰素、肿瘤坏死因子、穿孔素和细胞毒因子。
在上述技术方案中，优选地，所述将混合液进行剪切和脱气后采用冻干操作的具体步骤包括：将所需量的原料置于烧杯中进行湿混并定容；采用高剪切混合乳化机对原料进行剪切；将剪切后的原料转移至脱气瓶中，并在磁力搅拌下抽真空脱气至无气泡为止；将混合物在4-8℃、真空度100毫巴的条件下蒸发蒸干20分钟；将混合物在液氮下速冻，将冷冻后的混合物在低温冻干箱内冷冻干燥成固体。
在上述技术方案中，优选地，所述冻干箱中的冷冻干燥的方法包括：低温冻干箱的冷阱温度为-40度，真空度为0.1毫巴，板层温度为-20度，混合物在-110度冻干15分钟后，板层温度由-20度升至8度，继续冻干60分钟，压升试验合格后，由所述冻干箱取出。
在上述技术方案中，优选地，剪切工艺过程的剪切速率为2000rpm，剪切时间为30分钟。
本发明还提出一种冻干医用冷敷贴，利用如上述技术方案中任一项所述的冻干医用敷料的制备方法所制备出的冻干医用敷料，将所述冻干医用敷料均匀敷设于膜布上，形成冻干医用冷敷贴。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：通过冷敷贴所含成分带走热量，可以达到局部降温，其中的功效成分与空气接触迅速吸收空气中的水分形成水凝胶，通过水合作用，可以使功效成分迅速穿透脂肪层，渗透到皮下组织，直达病灶部位，作用于患处，达到冷敷祛痛、经皮吸收、缓释给药的效果。本发明采用构建的包括目的蛋白的质粒在原核生物细菌中进行培养，诱导产生大量稳定的目的蛋白，降低工业成本的同时保证原料的纯度与活性，且不同的目的蛋白能够应用于不同作用的产品。本发明制备的医用敷料中不含水分，无需添加防腐剂，可以减少因防腐剂引起的皮肤伤害或过敏现象；使用比较灵活，润湿时间快速，放在皮肤表面后即可使用。另外，本发明采用冻干处理，通过4℃沸腾蒸干蒸发至80％水分，既保证了外泌体的活性，又大大降低了水结晶时产生的冰晶对蛋白的破坏作用，从始至终维持低温对活性物质形成了良好的保护，减少了热敏性物质的损失，敷料中一些易氧化的物质得到了保护，从而提高了活性物质的利用率，提高了冷敷贴的稳定性。
附图说明
图1为本发明一种实施例公开的冻干医用敷料的制备方法的流程示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合附图对本发明做进一步的详细描述：
如图1所示，根据本发明提供的一种冻干医用敷料的制备方法，包括：以表达载体T7启动子-lac操纵子-目的蛋白-6xHis-T7标记区-6xHis-T7终止子,附加体lac-rop-bom-ori-kanR,ori系统构建并合成质粒；将质粒与感受态细菌悬液混匀，并进行培养；将经由IPTG诱导后的菌液进行发酵，并洗脱得到目的蛋白；以重量份计，加入0.1-10份寡肽-1、0.1-10份D-柠檬烯、0.1-10份甘油、0.1-10份目的蛋白、0.1-10份透明质酸钠、1-10份HA－800透明质酸、0.1-10份神经酰胺、0.5-5份银耳提取物、0.1-1份EDTA-二钠和0.1-2份壳聚糖；加入纯水定容至所需重量，将混合液进行剪切和脱气后采用低温蒸发蒸干及冻干操作，形成冻干医用敷料。
在该实施例中，通过冷敷贴所含成分带走热量，可以达到局部降温，其中的功效成分与空气接触迅速吸收空气中的水分形成水凝胶，通过水合作用，可以使功效成分迅速穿透脂肪层，渗透到皮下组织，直达病灶部位，作用于患处，达到冷敷祛痛、经皮吸收、缓释给药的效果。本发明采用构建的包括目的蛋白的质粒在原核生物细菌中进行培养，诱导产生大量稳定的目的蛋白，降低工业成本的同时保证原料的纯度与活性，且不同的目的蛋白能够应用于不同作用的产品。本发明制备的医用敷料中不含水分，无需添加防腐剂，可以减少因防腐剂引起的皮肤伤害或过敏现象；使用比较灵活，润湿时间快速，放在皮肤表面后即可使用。另外，本发明采用冻干处理，减少了热敏性物质的损失，敷料中一些易氧化的物质得到了保护，提高了冷敷贴的稳定性。
具体地，相比于一般的质粒系统外源基因随着表达而逐渐丢失，本发明中构建的质粒适用于原核生物强启动子高表达载体。其中，质粒的拷贝数在细菌里本身很低，T7-lac系统通过IPTG诱导使目的蛋白的表达量增高，产物稳定，具有易鉴定、易纯化等优点，质粒载体基础表达水平最低，T7 lac启动子具有自己的lacI，确保足够的阻碍蛋白结合到操纵基因位点上，保障目的蛋白的稳定表达，T7标记区提供多种目的蛋白表达，通过大量稳定的蛋白表达降低了生产成本。
其中，D-柠檬烯不易溶于易溶于有机溶剂，甘油作为一种有机溶剂可以溶解D-柠檬烯，G甘油可以以任意比例容易水从而解决了D-柠檬烯不溶于水的难题，D-柠檬烯增加药物进入皮肤的渗透性，使药物更有效的进入皮肤，促进皮肤吸收效果。透明质酸钠可迅速吸收空气中的水分形成一层透气的薄膜，透明质酸分子将其结合的水分子锁定在其双螺旋柱状结构中，使水分不易流失，吸收的大量水分为甘油所包含的D-柠檬烯等其他成分提供了良好的溶解环境。D-柠檬烯增强皮肤的渗透性而HA-800透明质酸具有轻微扩张毛细血管、增加血液循环、改善中间代谢作用。壳聚糖的添加使有效成分更好的附着在皮肤表面，使本发明的冷敷贴其他有效成分更容易进入体内发挥作用。EDTA-二钠为生物活性成分提供稳定的保护使作用成分的利用率达到90％以上，大大提高吸收效果，同时结合银耳提取物，银耳提取物中因富含银耳多糖，银耳多糖分子中含有大量羧基、羟基等基团，这些极性基团可与水分子结合形成氢键，具有良好的保湿锁水效果，大量的水分具有散热降温的功效。
在上述实施例中，优选地，将质粒与感受态细菌悬液混匀并进行培养具体包括：将100μl感受态细菌悬液加入1.5ml离心管中，置于冰上；向离心管中加入20μl质粒，并用移液器轻柔混匀，冰上静置20-30分钟；将离心管42℃水浴热激90秒，然后迅速置冰上3-5分钟；向离心管中加入1ml的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后在37℃环境下振荡(180rpm/h-300rpm/h)培养1-2小时，使细菌恢复生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；取离心管中100μl的细菌培养液均匀涂布至含有卡那霉素的LB固体培养基上；在37℃环境下倒置培养12-16小时，菌落生长良好而未互相重叠时取出；将菌落接种至4ml的LA液体培养基中，在37℃环境下以200rpm振摇培养过夜；取100μl培养过夜的菌液接种到5mL的LA液体培养液中，在37℃、200rpm振摇培养至OD600达到0.6-0.8时，加入1M的IPTG进行诱导，并置于37℃摇床继续培养4小时。
在上述实施例中，优选地，将经由IPTG诱导后的菌液进行发酵并洗脱得到目的蛋白具体包括：将诱导后的菌液加入1L含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃环境下振荡(180rpm/h-300rpm/h)培养24-36小时，待LB液体培养基浑浊后倒入10-100L的含有抗生素卡那霉素的LB液体培养基的发酵罐中发酵12-24小时；取出发酵后的LB液体培养基装入离子交换柱，根据所要表达目的蛋白的大小进行条件选择，洗脱得到目的蛋白。
在上述实施例中，优选地，以重量份计，加入2份寡肽-1、0.5份D-柠檬烯、1份甘油、0.5份目的蛋白、5份透明质酸钠、1份HA－800透明质酸，0.5份神经酰胺、1份银耳提取物、0.15份EDTA-二钠和1份壳聚糖，并加纯水定容至所需重量，能够使得产品达到最优效果。
在上述实施例中，优选地，目的蛋白包括寡肽-1、碱性成纤维蛋白、角质蛋白、胶原蛋白、纤维连接蛋白、原纤蛋白、再生蛋白、转化因子、胰岛素样生长因子和转化因子、透明质酸、白介素、干扰素、肿瘤坏死因子、穿孔素和细胞毒因子。
在上述实施例中，优选地，将混合液进行剪切和脱气后采用冻干操作的具体步骤包括：将所需量的原料置于1L烧杯中进行湿混并定容至500克；采用高剪切混合乳化机对原料以2000rpm剪切30分钟；将剪切后的原料转移至脱气瓶中，并在磁力搅拌下抽真空脱气至无气泡为止；将混合物在4-8℃、真空度100毫巴的条件下蒸发蒸干20分钟；将混合物在液氮下速冻，将冷冻后的混合物在低温冻干箱内冷冻干燥成固体。
在上述实施例中，优选地，冻干箱中的冷冻干燥的方法包括：低温冻干箱的冷阱温度为-40度，真空度为0.1毫巴，板层温度为-20度，混合物在-110度冻干15分钟后，板层温度由-20度升至8度，继续冻干60分钟压升试验合格后，由所述冻干箱取出。
在上述实施例中，优选地，具体的制备工艺参数范围如下：
本发明还提出一种冻干医用冷敷贴，利用如上述实施例中任一项的冻干医用敷料的制备方法所制备出的冻干医用敷料，将冻干医用敷料均匀敷设于膜布上，形成冻干医用冷敷贴。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京本真工坊生物科技有限公司
<120> 冻干医用敷料的制备方法和冻干医用冷敷贴
<160> 16
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 未知
<400> 1
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<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 未知
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<211> 18
<212> DNA
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<213> 未知
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<212> DNA
<213> 未知
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gatctgagga ggctggagat gtactgtgct ccgctgaagc ctacaaagtc agctcgttcc 360
atccgggccc agcgccacac tgacatgccc aagactcaga aggaagtaca cttgaagaac 420
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<211> 5037
<212> DNA
<213> 未知
<400> 15
atgcaccctg ggttgtggct gctcctggtt acgttgtgcc tgaccgagga actggcagca 60
gcgggagaga agtcttatgg aaagccatgt gggggccagg actgcagtgg gagctgtcag 120
tgttttcctg agaaaggagc gagaggacga cctggaccaa ttggaattca aggcccaaca 180
ggtcctcaag gattcactgg ctctactggt ttatcgggat tgaaaggaga aaggggtttc 240
ccaggccttc tgggacctta tggaccaaaa ggagataagg gtcccatggg agttcctggc 300
tttcttggca tcaatgggat tccgggccac cctggacaac caggccccag aggcccacct 360
ggtctggatg gctgtaatgg aactcaagga gctgttggat ttccaggccc tgatggctat 420
cctgggcttc tcggaccacc cgggcttcct ggtcagaaag gatcaaaagg tgaccctgtc 480
cttgctccag gtagtttcaa aggaatgaag ggggatcctg ggctgcctgg actggatgga 540
atcactggcc cacaaggagc acccggattt cctggagctg taggacctgc aggaccacca 600
ggattacaag gtcctccagg gcctcctggt cctcttggtc ctgatgggaa tatggggcta 660
ggttttcaag gagagaaagg agtcaagggg gatgttggcc tccctggccc agcaggacct 720
ccaccatcta ctggagagct ggaattcatg ggattcccca aagggaagaa aggatccaag 780
ggtgaaccag ggcctaaggg ttttccaggc ataagtggcc ctccaggctt cccgggcctt 840
ggaactactg gagaaaaggg agaaaaggga gaaaagggaa tccctggttt gccaggacct 900
aggggtccca tgggttcaga aggagtccaa ggccctccag ggcaacaggg caagaaaggg 960
accctgggat ttcctgggct taatggattc caaggaattg agggtcaaaa gggtgacatt 1020
ggcctgccag gcccagatgt tttcatcgat atagatggtg ctgtgatctc aggtaatcct 1080
ggagatcctg gtgtacctgg cctcccaggc cttaaaggag atgaaggcat ccaaggccta 1140
cgtggccctt ctggtgtccc tggattgcca gcattatcag gtgtcccagg agccctaggg 1200
cctcagggat ttccagggct gaagggggac caaggaaacc caggccgtac cacaattgga 1260
gcagctggcc tccctggcag agatggtttg ccaggcccac caggtccacc aggcccacct 1320
agtccagaat ttgagactga aactctacac aacaaagagt cagggttccc tggtctccga 1380
ggagaacaag gtccaaaagg aaacctaggc ctcaaaggaa taaaaggaga ctcaggtttc 1440
tgtgcttgtg acggtggtgt tcccaacact ggaccacccg gggaaccagg cccacctggt 1500
ccatggggtc tcataggcct tccaggcctt aaaggagcca gaggagatcg aggctctggg 1560
ggtgcacagg gcccagcagg ggctccaggc ttagttgggc ctctgggtcc ttcaggaccc 1620
aaaggaaaga agggggaacc aattctcagt acaatccaag gaatgccagg agatcggggt 1680
gattctggct cccagggctt ccgtggtgta ataggagaac caggcaagga cggagtacca 1740
ggtttaccag gtctgccagg ccttccgggt gatggtggac agggcttccc aggtgaaaag 1800
gggttacctg gacttcctgg tgaaaaaggc catcctggtc cacctggcct cccaggaaat 1860
gggttaccag gacttcctgg accccgtggg cttcctggag ataaaggcaa ggatggatta 1920
ccgggacaac aaggccttcc cggatctaag ggaatcaccc tgccctgtat tattcctggg 1980
tcatacggtc catcaggatt tccaggcact cccggattcc caggccctaa agggtctcga 2040
ggcctccctg ggaccccagg ccagcctggg tcaagtggaa gtaaaggaga gccagggagt 2100
ccaggattgg ttcatcttcc tgaattacca ggatttcctg gacctcgtgg ggagaagggc 2160
ttgcctgggt ttcctgggct ccctggaaaa gatggcttgc ctgggatgat tggcagtcca 2220
ggcttacctg gttccaaggg agccactggt gacatctttg gtgctgaaaa tggtgctccg 2280
ggggaacaag gcctacaagg attaacaggg cacaaaggat ttcttggaga ctctggcctt 2340
ccaggactca agggtgtgca cgggaagcct ggcttactag gccccaaagg tgagcggggc 2400
agccctggga caccaggaca ggtgggacag ccaggcaccc caggatctag tggtccatat 2460
ggcatcaagg gcaaatctgg gctcccagga gcaccaggct tcccaggcat ctcaggacat 2520
cctggaaaga aaggaacaag aggcaagaaa ggtcctcctg gatcaattgt aaagaaaggg 2580
ctgccagggc taaaaggcct tcctggaaat ccaggcctag taggactgaa aggaagccca 2640
ggctctccag gggtcgctgg gttgccagcc ctctctggac ccaagggaga gaaggggtct 2700
gttggattcg taggttttcc aggaatacca ggtctgcctg gtatttctgg aacaagagga 2760
ttaaaaggaa ttccaggatc aactggaaaa atgggaccat ctggacgcgc tggtactcct 2820
ggtgaaaagg gagacagagg caatccgggg ccagtcggaa tacctagtcc aagacgtcca 2880
atgtcaaacc tttggctcaa aggagacaaa ggctctcaag gctcagccgg atccaatgga 2940
tttcctgggc caagaggtga caaaggagag gctggtcgac ctggaccacc aggcctacct 3000
ggagctcctg gcctcccagg cattatcaaa ggagttagtg gaaagccagg gccccctggc 3060
ttcatgggaa tccggggttt acctggcctg aaggggtcct ctgggatcac aggtttccca 3120
ggaatgccag gagaaagtgg ttcacaaggt atcagagggt cgcctggact cccaggagca 3180
tctggtctcc caggcctgaa aggagacaac ggccagacag ttgaaatttc cggtagccca 3240
ggacccaagg gacagcctgg cgaatctggt tttaaaggca caaaaggaag agatggacta 3300
ataggcaata taggcttccc tggaaacaaa ggtgaagatg gaaaagttgg tgtttctgga 3360
gatgttggcc ttcctggagc tccaggattt ccaggagttg ccggcatgag aggagaacca 3420
ggacttccag gttcttctgg tcaccaaggg gcaattgggc ctctaggatc ccccggatta 3480
ataggaccca aaggcttccc tggatttcct ggtttacatg gactgaatgg gcttccgggc 3540
accaagggta cccatggcac tccaggacct agtatcaccg gtgtgcctgg gcctgctggt 3600
ctccctggac ccaaaggaga aaaaggatat ccaggaattg gcatcggagc tccagggaag 3660
ccgggcctga gagggcaaaa aggtgatcga ggtttcccag gtctccaggg ccctgctggt 3720
ctccccggtg ccccaggcat ctccttgccc tcactcatag caggacagcc tggtgacccc 3780
gggcgaccag gcctagatgg agaacgaggc cgcccaggcc ccgctggacc cccaggtccc 3840
cctgggccat cctcgaatca aggcgacacc ggagaccctg gcttccctgg aattccaggt 3900
ttttctggcc tccctggaga gctaggactg aaaggcatga gaggtgagcc tggcttcatg 3960
gggactccag gcaaggttgg gccacctgga gacccaggat ttcccggaat gaaggggaag 4020
gcaggggcaa gaggctcttc tggcctccaa ggtgatcctg gacaaacacc aactgcagaa 4080
gctgtccagg ttcctcctgg acccttgggt ctaccaggga tcgatggcat ccctggcctc 4140
actggggacc ctggggctca aggccctgta ggcctacaag gctccaaagg tttacctggc 4200
atccccggta aagatggccc cagtgggctc ccaggcccac ctggggctct tggtgatcct 4260
ggtctgcctg gactgcaagg ccctccagga tttgaaggag ctccagggca gcaaggcccc 4320
ttcgggatgc ctggaatgcc tggccagagc atgagagtgg gctacacgtt ggtaaagcac 4380
agccagtcgg aacaggtgcc cccgtgtccc atcgggatga gccagctgtg ggtggggtac 4440
agcttactgt ttgtggaggg gcaagagaaa gcccacaacc aggacctggg ctttgctggc 4500
tcctgtctgc cccgcttcag caccatgccc ttcatctact gcaacatcaa cgaggtgtgc 4560
cactatgcca ggcgcaatga taaatcttac tggctctcca ctaccgcccc tatccccatg 4620
atgcccgtca gccagaccca gattccccag tacatcagcc gctgctctgt gtgtgaggca 4680
ccctcgcaag ccattgctgt gcacagccag gacatcacca tcccgcagtg ccccctgggc 4740
tggcgcagcc tctggattgg gtactctttc ctcatgcaca ctgccgctgg tgccgagggt 4800
ggaggccagt ccctggtctc acctggctcc tgcctagagg actttcgggc cactcctttc 4860
atcgaatgca gtggtgcccg aggcacctgc cactactttg caaacaagta cagtttctgg 4920
ttgaccacag tggaggagag gcagcagttt ggggagttgc ctgtgtctga aacgctgaaa 4980
gctgggcagc tccacactcg agtcagtcgc tgccaggtgt gtatgaaaag cctgtag 5037
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知
<400> 16
acttctcttt ttccacccca ttt 23
Claims (9)
1.一种冻干医用敷料的制备方法，其特征在于，包括：
以表达载体T7启动子-lac操纵子-目的蛋白-6xHis-T7标记区-6xHis-T7终止子,附加体lac-rop-bom-ori-kanR,ori系统构建并合成质粒；
将所述质粒与感受态细菌悬液混匀，并进行培养；
将经由IPTG诱导后的菌液进行发酵，并洗脱得到所述目的蛋白；
以重量份计，加入0.1-10份寡肽-1、0.1-10份D-柠檬烯、0.1-10份甘油、0.1-10份所述目的蛋白、0.1-10份透明质酸钠、1-10份HA－800透明质酸、0.1-10份神经酰胺、0.5-5份银耳提取物、0.1-1份EDTA-二钠和0.1-2份壳聚糖；
加入纯水定容至所需重量，将混合液进行剪切和脱气后采用低温蒸发蒸干及冻干操作，形成冻干医用敷料。
2.根据权利要求1所述的冻干医用敷料的制备方法，其特征在于，所述将所述质粒与感受态细菌悬液混匀并进行培养具体包括：
将感受态细菌悬液加入离心管中，置于冰上；
向所述离心管中加入所述质粒，并用移液器轻柔混匀，冰上静置20-30分钟；
向所述离心管中加入LB液体培养基，混匀后在37℃环境下振荡培养；
取所述离心管中的细菌培养液涂布至含有卡那霉素的LB固体培养基上；
在37℃环境下倒置培养12-16小时，菌落生长良好而未互相重叠时取出；
将所述菌落接种至LA液体培养基中，在37℃环境下以200rpm振摇培养；
培养至OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG进行诱导，并置于37℃摇床继续培养4小时。
3.根据权利要求1所述的冻干医用敷料的制备方法，其特征在于，所述将经由IPTG诱导后的菌液进行发酵并洗脱得到所述目的蛋白具体包括：
将诱导后的菌液加入含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃环境下振荡培养，待LB液体培养基浑浊后倒入发酵罐中发酵12-24小时；
取出发酵后的LB液体培养基装入离子交换柱，根据所述目的蛋白进行条件选择，洗脱得到所述目的蛋白。
4.根据权利要求1所述的冻干医用敷料的制备方法，其特征在于，以重量份计，加入2份寡肽-1、0.5份D-柠檬烯、1份甘油、0.5份目的蛋白、5份透明质酸钠、1份HA－800透明质酸，0.5份神经酰胺、1份银耳提取物、0.15份EDTA-二钠和1份壳聚糖，并加纯水定容至所需重量。
5.根据权利要求1所述的冻干医用敷料的制备方法，其特征在于，所述目的蛋白包括寡肽-1、碱性成纤维蛋白、角质蛋白、胶原蛋白、纤维连接蛋白、原纤蛋白、再生蛋白、转化因子、胰岛素样生长因子和转化因子、透明质酸、白介素、干扰素、肿瘤坏死因子、穿孔素和细胞毒因子。
6.根据权利要求1所述的冻干医用敷料的制备方法，其特征在于，所述将混合液进行剪切和脱气后采用冻干操作的具体步骤包括：
将所需量的原料置于烧杯中进行湿混并定容；
采用高剪切混合乳化机对原料进行剪切；
将剪切后的原料转移至脱气瓶中，并在磁力搅拌下抽真空脱气至无气泡为止；
将混合物在4-8℃、真空度100毫巴的条件下蒸发蒸干20分钟；
将混合物在液氮下速冻，将冷冻后的混合物在低温冻干箱内冷冻干燥成固体。
7.根据权利要求6所述的冻干医用敷料的制备方法，其特征在于，所述冻干箱中的冷冻干燥的方法包括：
低温冻干箱的冷阱温度为-40度，真空度为0.1毫巴，板层温度为-20度，混合物在-110度冻干15分钟后，板层温度由-20度升至8度，继续冻干60分钟，压升试验合格后，由所述冻干箱取出。
8.根据权利要求6所述的冻干医用敷料的制备方法，其特征在于，剪切工艺过程的剪切速率为2000rpm，剪切时间为30分钟。
9.一种冻干医用冷敷贴，其特征在于，利用如上述权利要求1至8中任一项所述的冻干医用敷料的制备方法所制备出的冻干医用敷料，将所述冻干医用敷料均匀敷设于膜布上，形成冻干医用冷敷贴。
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