CN105521483A - 复合生物活性因子的冻干方法及冻干粉 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物组织培养技术领域,尤其涉及一种复合生物活性因子的冻干方法及冻干粉。能够提高复合生物活性因子冻干粉的生物活性和稳定性,且所得复合生物活性因子冻干粉能够在冷藏或者常温下保存较长时间。本发明实施例提供的方法包括:将保护剂与5-10份包含复合生物活性因子的溶液混合所得的混合液依次经过预冻、加强预冻、升华干燥和解析干燥处理;其中,该保护剂包括5-10份多元醇,该混合液除保护剂和包含复合生物活性因子的溶液之外的其余部分为纯净水。
Description
技术领域
本发明涉及生物组织培养技术领域,尤其涉及一种复合生物活性因子的冻干方法及冻干粉。
背景技术
生物活性因子由多种细胞类型通过旁分泌、自分泌或内分泌的方式产生,能够调节细胞的生长、分化和免疫等功能,尤其能够有效的与皮肤细胞发生作用,参与炎症发生和创伤愈合。例如:生物活性因子能够促进上皮细胞的营养代谢,预防皮肤受到紫外线、自由基等侵害;生物活性因子还能促使真皮层胶原细胞的增生,加速术后皮肤的修复。
常见的细胞分泌的生物活性因子有EGF(中文:表皮生长因子,英文:epidermalgrowthfactor),BFGF(中文:碱性成纤维细胞生长因子,英文:basicfibroblastgrowthfactor),VEGF(中文:血管内皮生长因子,英文:vascularendothelialgrowthfactor)等。包含多种生活因子的组合体可以称为复合生物活性因子。复合生物活性因子除了具备各种生物活性因子自身的功能外,各种生物因子之间还可以相互促进,所以,复合生物活性因子在医疗和化妆品等行业具有重要作用。
复合生物活性因子的保存方法直接影响其生物活性的高低以及保存时间的长短,进而影响复合生物活性因子的应用。对于生物制品,常见的保存方法有冷冻干燥保存方法,冷冻干燥又称升华干燥,是将需要干燥的物料溶液预先冻结成固体,然后在低温低压条件下,从冻结状态不经过液态而直接升华去除水分的一种干燥方法。此过程中物料的干燥是在冻结状态下完成的,所以物料的组织结构和外观形态将会被较好地保存。
现有技术也不乏利用冷冻干燥方法获取的生物制品,例如,公开号为CN101444619A的专利,提供了一种不含人血白蛋白的细胞因子冻干制剂配方,并具体公开了该配方的组成为:
再例如,公开号为CN103251649A的专利提供一种人间充质干细胞培养上清液冻干粉及其制备方法,并具体公开了该冻干粉的制备过程为:在超净工作台中用50mL无菌离心管收集低传代数的人间充质干细胞培养液上清液,在4℃,400g离心15min;在超净工作台中打开离心管,用无菌枪头吸出离心管中的上清液至一无菌的收集管中,弃沉淀,记录标志,-80℃冻存凝固备用;将-80℃冻存凝固的上清液抽真空,升华干燥,除去冰晶。最后制得冻干粉,-20℃保存。将筛选合适的阳性菌株进行扩大化培养,离心收集菌体,用细胞裂解液裂解后经超声破碎,离心收集上清,阳离子交换层析粗提融合蛋白。层析峰上Ni金属亲和层析提纯融合蛋白,收集蛋白峰过SephadexG50柱除盐,获得目标蛋白。
但是现有技术公开的冷冻干燥方法都存在一些缺陷,不利于复合生物活性因子的冻干保存,例如,在公开号为CN101444619A的专利中,采用了吐温系列,该系列物质有溶血作用,会限制复合生物活性因子冻干粉后期的使用;并且冻干过程中加有磷酸盐缓冲液,其中含有大量的盐分,会降低复合生物活性因子的活性。公开号为CN103251649A的专利中,在升华干燥前液体需要-80℃冻存凝固,非常耗费能量,导致成本增加;并且获得的冻干粉需要-20℃保存,保存条件非常苛刻,不利于保存和运输。
发明内容
本发明的主要目的在于,提供一种复合生物活性因子的冻干方法及冻干粉,提高复合生物活性因子冻干粉的生物活性和稳定性,且能够在冷藏或者常温下保存较长时间。
为达到上述目的,本发明采用如下技术方案:
一方面,本发明实施例提供一种复合生物活性因子的冻干方法,包括:
将保护剂与5-10份包含复合生物活性因子的溶液混合所得的混合液依次经过预冻、加强预冻、升华干燥和解析干燥处理;
其中,所述保护剂包括5-10份多元醇,所述混合液除所述保护剂和复合生物活性因子溶液之外的其余部分为纯净水。
优选的,所述复合生物活性因子溶液至少包括:人表皮生长因子hEGF、血管内皮生长因子VEGF、成纤维细胞生长因子FGF、转化生长因子-β1TGF-β1、转化生长因子-β2TGF-β2、类胰岛素一号增长因子IGF-1、类胰岛素二号增长因子IGF-2、角质细胞生长因子KGF、血小板衍生生长因子PDGF。
优选的,所述预冻的目标温度为-30—-50℃,时长为1-2小时;
所述加强预冻的目标温度为-30—-50℃,时长为1-2小时。
优选的,所述升华干燥包含三个阶段,其中,第一阶段的目标温度为-20℃—-10℃,时长为5-8小时,真空度为150-300mT;第二阶段的目标温度为-5℃—5℃,时长为1-3小时,真空度为100-250mT;第三阶段的目标温度为5℃—15℃,时长为1-3小时,真空度为50-150mT;所述解析干燥的目标温度为20℃—30℃,时长为3-6小时,真空度为10-100mT。
优选的,所述保护剂还包括3-5份的氨基酸,其中,所述多元醇包括山梨醇或甘露醇中的一种或两种;所述氨基酸包括甘氨酸或谷氨酸的一种或两种;
优选的,所述保护剂还包括1-3份的聚合物,其中,所述多元醇包括山梨醇或甘露醇中的一种或两种;所述聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮PVP、右旋糖苷、聚乙二醇和明胶中的一种或多种。
优选的,所述保护剂还包括0.5-1份的糖和0.4-1份的聚合物;其中,所述多元醇包括山梨醇或甘露醇中的一种或两种;所述聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮PVP、右旋糖苷、聚乙二醇和明胶中的一种或多种;所述糖包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、和海藻糖中的一种或多种。
另一方面,本发明实施例提供一种复合生物活性因子冻干粉,所述复合生物活性因子冻干粉的配方包括:5-10份多元醇,以及0.005-0.01份的复合生物活性因子,所述复合生物活性因子至少包含:人表皮生长因子hEGF、血管内皮生长因子VEGF、成纤维细胞生长因子FGF、转化生长因子-β1TGF-β1、转化生长因子-β2TGF-β2、类胰岛素一号增长因子IGF-1、类胰岛素二号增长因子IGF-2、角质细胞生长因子KGF、血小板衍生生长因子PDGF。
优选的,所述复合生物活性因子冻干粉的配方还包括3-5份的氨基酸和1-3份的聚合物,其中,所述多元醇包括山梨醇或甘露醇中的一种或两种;所述氨基酸包括甘氨酸或谷氨酸的一种或两种;所述聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮PVP、右旋糖苷、聚乙二醇和明胶中的一种或多种。
优选的,所述复合生物活性因子冻干粉的配方还包括0.5-1份的糖和0.4-1份的聚合物,其中,所述多元醇包括山梨醇或甘露醇中的一种或两种;所述聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮PVP、右旋糖苷、聚乙二醇和明胶中的一种或多种;所述糖包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、和海藻糖中的一种或多种。
本发明实施例提供的一种复合生物活性因子的冻干方法,通过选择有效的保护剂,并合理配置保护剂与复合生物活性因子溶液的配比,然后通过预冻、加强预冻、升华干燥和解析干燥处理,获得复合生物活性因子冻干粉,该方法工艺简单,成本合理,整个冻干周期仅需要15-20小时,且所得复合生物活性因子冻干粉所含的生物活性因子的活性可以保持70-80%,并且可冷藏或是室温保存1-2年,极大地改善了保存条件的要求。
本发明实施例提供的复合生物活性因子冻干粉,包含9种生物活性因子和冻干保护剂,可以有效的与皮肤细胞发生作用,促进上皮细胞的营养代谢,预防皮肤受到紫外线、自由基等侵害,还可以促使真皮层胶原细胞的增生。因此对皮肤术后可以加速修复,并具有抚平细纹,延缓皮肤老化等功能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例所得的冻干曲线图;
图2为本发明实施例中利用基因表达方式检测复合生物活性因子冻干前和冻干后的生物活性的检测结果示意图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考,其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上,对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如,作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中,来产生更进一步的实施方式。因此,基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明实施例所涉及的材料均可以通过商业途径或通过申请人获取。
本发明实施例提供了一种复合生物活性因子粉的冻干方法,包括:将保护剂与5-10份包含复合生物活性因子的溶液混合所得的混合液,依次经过预冻、加强预冻、升华干燥和解析干燥处理;其中,所述保护剂包括5-10份多元醇,所述混合液除所述保护剂和复合生物活性因子溶液之外的其余部分为纯净水。
本发明实施例提供的复合生物活性因子的冻干方法,选择有效的保护剂,并合理配置保护剂与复合生物活性因子溶液的配比,然后通过预冻、加强预冻、升华干燥和解析干燥处理,能够获得复合生物活性因子冻干粉,该方法工艺简单,成本合理,整个冻干周期仅需要15-20小时,且所得复合生物活性因子冻干粉所含的生物活性因子的活性可以保持70-80%,并且可冷藏或是室温保存1-2年,极大地改善了保存条件的要求。
下面对本发明实施例的具体实现方式和优选实现方式进行说明。
其中,包含复合活性因子的溶液(以下简称复合活性因子溶液),可以通过公知渠道获得各种生物活性因子,再进行配比而获得,当然也可通过对组织工程皮肤条件培养液进行提纯浓缩处理后而得到。本发明实施例对比不进行限制。
作为一种优选的实施方式,本实施例中复合生物活性因子溶液中至少包含如表1所示的生物活性因子。
表1
其中,hEGF(中文:人表皮生长因子,英文:humanepidermalgrowthfactor),是由53个氨基组成的生物活性多肽,藉由刺激表皮细胞生长因子受体之酪氨酸磷酸化,达到修补增生肌肤表层细胞,对受伤、受损之表皮肌肤拥有较佳疗效;能够促进细胞的增殖分化,从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。并且,hEGF还能止血,并具有加速皮肤和粘膜创伤愈合,消炎镇痛,防止溃疡的功效。
VEGF(中文:血管内皮生长因子,英文:vascularendothelialgrowthfactor),具有促进血管内皮细胞分裂与增殖,增加微静脉、小静脉的通透性,诱导丝氨酸蛋白酶和间质胶原酶的表达,使细胞质钙聚集,诱导血管生成,在创伤愈合、胚胎发育、肿瘤生长和转移过程中起着重要的作用。
FGF(中文:成纤维细胞生长因子,英文:fibroblastgrowthfactor)是一种促细胞分裂的肝素结合蛋白,可诱导多种细胞的增殖与分化,对神经系统有重要作用。在美容护肤方面具有抗皱,预防衰老;美白,祛斑;防晒和晒后修复;防粉刺以及去疤痕等作用。
TGF-β(中文:转化生长因子-β,英文:transforminggrowthfactors-β)是一多功能蛋白质,作用于中胚层,在机体的免疫调节、细胞生长和分化、细胞外基质的合成和贮存、胚胎发育、创伤和瘢痕修复等方面都发挥着重要的作用。
IGF-1(中文:类胰岛素一号增长因子,英文:insulin-likegrowthfactors-1),是一种在分子结构上与胰岛素类似的多肽蛋白物质。IGF-1在婴儿的生长和在成人体内持续进行合成代谢作用上具有重要意义。具有降血糖、降血脂、舒张血管、促进骨的合成代谢保持其正常结构功能、促生长、促细胞分化、创伤修复等多种功能。
IGF-2(中文:类胰岛素二号增长因子,英文:insulin-likegrowthfactors-2),IGF-2的表达状况与肿瘤,以及潜在肿瘤的发生发展关系密切,在肿瘤治疗方面起重要作用。
KGF(中文:角质细胞生长因子,英文:keratinocytegrowthfactor),作用于新生或老化的上皮细胞,通过其特异性受体在刺激上皮细胞生长的同时,能启动上皮细胞对皮下间质组织的协调信号反馈,促进新组织的形成,安全性好,无潜在的副作用,以此达到皮肤除疤痕和抗辐射损伤的功能。
PDGF(中文:血小板衍生生长因子或血小板衍生因子英文:plateletderivedgrowthfactor),是一种重要的促有丝分裂因子,具有刺激特定细胞群分裂增殖的能力,促进纤维母细胞生成和胶原蛋白(尤其是I型及Ⅲ型胶原)产生,增加皮肤弹性抚平皱纹。
包含上述9种生物活性因子的复合生物活性因子溶液可以有效的与皮肤细胞发生作用,促进上皮细胞的营养代谢,预防皮肤受到紫外线、自由基等侵害,还可以促使真皮层胶原细胞的增生。因此对皮肤术后可以加速修复,并具有抚平细纹,延缓皮肤老化等功能。
但是,复合生物活性因子溶液以液态形式保存的保质期非常短,而且保存条件非常苛刻,一般在-20℃冷冻的条件下也只能保存半年左右,极大的限制的复合生物活性因子的应用。为了延长复合生物活性因子的保存时间,一般可以将复合生物活性因子溶液进行冷冻干燥,获得复合生物活性因子冻干粉。但是,复合生物活性因子的冷冻干燥过程是一个多步骤过程,会产生低温、冻结和脱水等多种效应;即使成功完成冷冻干燥过程后,在保存过程中也很难保证复合生物活性因子的稳定性。
例如:在冻干过程中产生的冻结效应包括:
1、在复合生物活性因子的冻干过程中,不断结晶会导致溶液的浓度快速升高,当溶液浓度发生变化时,离子浓度增加,促进化学反应。
2、包含复合生物活性因子的混合液在冻干过程中,会产生大量的冰-水界面,生物活性因子可能会被吸附到界面上,从而可能破坏生物活性因子的天然结构,导致生物活性因子变性。
3、在包含复合生物活性因子的混合液的冻干过程中,混合液的pH值也会发生变化,导致生物活性因子发生物理聚集和化学变性。
脱水效应为:在冻干过程中,一部分结合水(生物活性因子经过水合作用后,在生物活性因子表面附着的单层水)被除去的现象。结合水的去除能破坏生物活性因子的天然结构,导致生物活性因子变性。这是因为富含结合水的生物活性因子在冻干过程中暴露在乏水环境中,将质子转化为带电羧酸基团,破坏了生物活性因子中电荷平衡,电荷密度的降低可能促进生物活性因子之间的疏水作用,从而使生物活性因子发生聚集。
再例如,在保存过程中可能产生的使生物活性因子变性的因素有:由于物理(非共价)相互作用或者化学凝集(共价)造成的蛋白质凝聚;氧化反应;水解作用等,虽然冻干的生物活性因子中含有极少量的水分,但在保存过程中仍然会发生水解作用。
所以,为了防止复合生物活性因子在冷冻干燥和保存过程中变性或者失活,需要添加有效的保护剂,以稳定复合生物活性因子的活性。然而,冻干保护剂的种类繁多,机制复杂,如果保护剂添加不当,不仅不能有效对生物活性因子进行保护,甚至在复合生物活性因子冻干粉的后期使用中会产生毒性等较大负面影响,限制复合生物活性因子冻干粉的应用范围。所以,保护剂的种类非常重要。而且,保护剂添加的浓度也对保护剂的保护效果起着非常重要的作用,通常,在某个浓度范围内,保护剂的保护作用随着浓度的升高而增大,当达到某一浓度时,保护作用达到最大值,而此后再增大保护剂的浓度,则保护剂的保护效果不再显著增加,过高的浓度甚至会使得冷冻干燥过程中生物活性因子发生变性。但是不同保护剂的保护机制不一样,呈现最大保护作用的浓度也不同,实际使用时,需要考虑多种保护剂的综合效果。
本发明实施例的一种实现方式中,保护剂包括5-10份多元醇,与5-10份复合生物活性因子溶液混合,得混合液。
一种优选的实现方式中,本发明实施例的保护剂包括5-10份多元醇,3-5份的氨基酸,与5-10份复合生物活性因子溶液混合,得混合液。
另一种优选的实现方式中,本发明实施例的保护剂包括5-10份多元醇,1-3份的聚合物,与5-10份复合生物活性因子溶液混合,得混合液。
再一种优选的实现方式中,本发明实施例的保护剂包括5-10份多元醇,3-5份的氨基酸,1-3份的聚合物,与5-10份复合生物活性因子溶液混合,得混合液。
又一种优选的实现方式中,本发明实施例的保护剂包括5-10份多元醇,0.5-1份的糖和0.4-1份的聚合物,与5-10份复合生物活性因子溶液混合,得混合液。
其中,混合液除保护剂和复合生物活性因子溶液之外的其余部分为纯净水。
多元醇为含有两个或两个以上羟基的醇。可以包括山梨醇或甘露醇中的一种或两种。优选的,多元醇为甘露醇。
本发明实施例中,糖可以包含葡萄糖、乳糖、蔗糖和海藻糖中的一种或几种。
优选的,包括蔗糖和海藻糖中的一种或两种。蔗糖和海藻糖作为非还原性二糖,非常稳定,能够在高温、高寒、干燥失水等恶劣的条件下在细胞表面形成特殊的保护膜,有效地保护生物活性因子结构不被破坏,从而维持生物活性因子的活性。
优选的,本发明实施例中氨基酸可以包括甘氨酸和谷氨酸中的一种或两种。
优选的,本发明实施例中聚合物可以包含明胶、右旋糖苷、PVP、聚乙二醇中的一种或多种。
更优选的,可以包含右旋糖苷40、PVP、聚乙二醇中的一种或多种。其中,右旋糖苷是若干葡萄糖分子脱水的聚合产物。右旋糖苷40为低分子,分子量区间为25000-50000。右旋糖苷40可以抑制冰晶的长大,所以能有效对生物活性因子起到保护作用。PVP在生物活性因子的冷冻干燥和保存过程中,可以为生物活性因子提供很强的支撑作用。聚乙二醇(PEG)在生物活性因子的冷冻干燥过程中,可以防止生物活性因子发生变性。
生物活性因子的变性不仅发生在冻干的过程中,在保存期生物活性因子的变性率往往比在整个冻干过程中的变性率要大。而本发明实施例中保护剂的配方,不仅能够在整个冻干过程中对生物活性因子起到良好的保护作用,而且能够对保存期内生物活性因子的变性起到抑制作用,所以,本发明实施例中保护剂的配方极大的改善了生物活性因子的保存条件,能够在冷藏或常温下保存1-2年,有效降低了生物活性因子保存的成本。
需要说明的是,复合生物活性因子冻干后的活性及保存期的活性不仅受保护剂的影响,也收到冻干的工艺的影响。本发明实施例中,冻干工艺依次包含预冻、加强预冻、升华干燥和解析干燥4个过程。具体参数如表2所示。
表2
冻干工艺的具体实现可以由冻干机完成,参照表2设置冻干机的参数即可。冻干机根据参数的设置进行冻干,并且冻干机的探头会记录冻干过程中,物料product的温度变化。(以下将包含复合生物活性因子的混合液以及该混合液因降温或升温变化的所有状态均称为物料)。
在此以一组具体的冻干参数为例,对冻干工艺的具体过程进行说明。该组具体的冻干参数为:预冻的目标温度为-40℃,时长为2小时;加强预冻的目标温度为-40℃,时长为2小时;升华干燥的第一阶段的目标温度为-10℃,时长为7小时,真空度为200mT;第二阶段的目标温度为0℃,时长为1小时,真空度为150mT;第三阶段的目标温度为10℃,时长为1小时,真空度为100mT;解析干燥的目标温度为20℃,时长为5小时,真空度为60mT。最终绘制的冻干曲线如图1所示。
参见图1,在预冻阶段,复合生物活性因子以溶于混合液(物料)的状态存在,物料的初始温度为20℃,经过2个小时的预冻,物料降至-40℃,由于温度一直降低,物料过冷产生冰,在加强预冻阶段,物料将沿着平衡的熔融线不断析出冰晶,冰晶周围剩余的未冻混合液随温度下降,浓度不断升高,一直到物料中剩余的水分将不再结晶,此时的物料达到最大冻结浓缩状,浓度较高,以非晶态的形式包围在冰晶周围,形成镶嵌着冰晶的玻璃体。玻璃体是指物质以非晶态形式存在的一种状态,其粘度极大,分子的能动性几乎为零,这种非晶体结构的扩散系数很低,故在这种结构中分子运动和分子变性反应非常微弱,不利的化学反应能够被抑制,从而提高复合生物活性因子的稳定性。并且通过本发明实施例的预冻和加强预冻阶段,所得玻璃体结晶均匀、晶核数量合适,利于后续的升华干燥过程中,维持通畅的升华通道,使升华速度加快。
在升华干燥阶段,分三个阶段把上述玻璃体进行加热,使其温度从-40℃升至10℃。在该过程中,同时用真空泵抽真空,使其中被冻结成冰的自由水直接升华成水蒸气,使得最初水分的90%以上被除去。
需要说明的是,在升华干燥阶段,如果温度过高,会使复合生物活性因子出现软化、塌陷等现象,造成冻干失败;如果温度过低,不仅给制冷系统提出了过高的要求,而且大大降低了升华过程的速率,费时又耗能。本发明实施例中,整个升华干燥过程分成三个温度梯度,因为随着水分的升华,使复合生物活性因子的浓度升高,玻璃化转变温度也会提高,通过适当逐渐提高温度,既可以加快升华进行,又可以节约能源。
需要说明的是,升华干燥阶段真空度的控制也非常重要,本发明实施例真空度也采用三个梯度,既能形成恰当的对流传热,又能使物料表面始终处于匀速干燥的压力状态,所以,使得在保证升华干燥不同阶段对真空度的需要的同时,提高干燥速度。
在解析干燥阶段,通过将温度从10℃升至20℃,在较高的温度下对物料加热,使部分结合水解析,再吸热蒸发成水蒸气,以进一步去除水分。
优选的,在对混合液进行预冻、加强预冻、升华干燥和解析干燥处理之前,所述方法还包括:
将混合液用0.22μm的膜过滤除菌。
通过除菌的步骤,可以避免对复合生物活性因子引入污染物,影响复合生物活性因子的生物活性和保质期。
本发明实施例提供的一种复合生物活性因子的冻干方法,通过选择有效的保护剂,并合理配置保护剂与复合生物活性因子溶液的配比,然后通过预冻、加强预冻、升华干燥和解析干燥处理,获得复合生物活性因子冻干粉,该方法工艺简单,成本合理,整个冻干周期仅需要15-20小时,且所得复合生物活性因子冻干粉所含的生物活性因子的活性可以保持70%-80%,并且可冷藏或是室温保存1-2年,极大地改善了保存条件的要求以及延长了保存时间。
我们通过对几种基因的表达的方式检测复合生物活性因子的生物活性,即根据复合生物活性因子的抗氧化指标CAT、GSH、Cu-SOD、Mn-SOD检测复合生物活性因子的生物活性。检测结果如图2所示,根据图2的检测结果可知,所得复合生物活性因子冻干粉的生物活性和冻干前的混合液相比,保持了70%-80%的生物活性。
本发明实施例提供的复合生物活性因子冻干粉,包含9种生物活性因子和冻干保护剂,可以有效的与皮肤细胞发生作用,促进上皮细胞的营养代谢,预防皮肤受到紫外线、自由基等侵害,还可以促使真皮层胶原细胞的增生。因此对皮肤术后可以加速修复,并具有抚平细纹,延缓皮肤老化等功能。
实施例
下面的实施例用来说明本发明,并不是想限制本发明的范围。
实施例1
取10份甘露醇与10份复合生物活性因子溶液混合,并加纯净水至100份,得混合液;
将混合液依次经过预冻、加强预冻、升华干燥和解析干燥处理(具体过程同前文所述),获得复合生物活性因子冻干粉。
结论,所得复合生物活性因子冻干粉包含10份甘露醇,0.01份复合生物活性因子,所得冻干粉中复合生物活性因子保持复合生物活性因子溶液中75%以上的生物活性因子的活性,主要为EGF、BFGF、VEGF、IGF1、IGF2、TGF-B1、TGF-B2、PDGF和KGF。
所得复合生物活性因子冻干粉在2-8℃下可保存2年,在室温下可保存1-2年。
实施例2
取5份山梨醇与5份复合生物活性因子溶液混合,并加纯净水至100份,得混合液;
将混合液依次经过预冻、加强预冻、升华干燥和解析干燥处理(具体过程同前文所述),获得复合生物活性因子冻干粉。
结论,所得复合生物活性因子冻干粉包含5份山梨醇,0.005份复合生物活性因子,所得冻干粉中复合生物活性因子保持复合生物活性因子溶液中72%以上的生物活性因子的活性,主要为EGF、BFGF、VEGF、IGF1、IGF2、TGF-B1、TGF-B2、PDGF和KGF。
所得复合生物活性因子冻干粉在2-8℃下可保存2年,在室温下保存1-2年。
实施例3
取8份山梨醇和甘露醇的混合物(具体比例可为任意),0.5份海藻糖,0.6份右旋糖苷40,与5份复合生物活性因子溶液混合,并加纯净水至100份,得混合液;
将混合液依次经过预冻、加强预冻、升华干燥和解析干燥处理(具体过程同前文所述),获得复合生物活性因子冻干粉。
结论,所得复合生物活性因子冻干粉包含8份山梨醇和甘露醇,0.5份海藻糖,0.6份右旋糖苷40,0.005份复合生物活性因子,所得冻干粉中复合生物活性因子保持复合生物活性因子溶液中78%以上的生物活性因子的活性,主要为EGF、BFGF、VEGF、IGF1、IGF2、TGF-B1、TGF-B2、PDGF和KGF。
所得复合生物活性因子冻干粉在2-8℃下可保存2年,在室温下保存1-2年。
实施例4
取10份甘露醇,0.6份海藻糖,0.4份PVP,与5份复合生物活性因子溶液混合,并加纯净水至100份,得混合液;
将混合液依次经过预冻、加强预冻、升华干燥和解析干燥处理(具体过程同前文所述),获得复合生物活性因子冻干粉。
结论,所得复合生物活性因子冻干粉包含10份甘露醇,0.6份海藻糖,0.4份PVP,0.005份复合生物活性因子,所得冻干粉中复合生物活性因子保持复合生物活性因子溶液中80%以上的生物活性因子的活性,主要为EGF、BFGF、VEGF、IGF1、IGF2、TGF-B1、TGF-B2、PDGF和KGF。
所得复合生物活性因子冻干粉在2-8℃下可保存2年,在室温下保存1-2年。
实施例5
取10份甘露醇,0.1份海藻糖,1份右旋糖苷40,与7份复合生物活性因子溶液混合,并加纯净水至100份,得混合液;
将混合液依次经过预冻、加强预冻、升华干燥和解析干燥处理(具体过程同前文所述),获得复合生物活性因子冻干粉。
结论,所得复合生物活性因子冻干粉包含10份甘露醇,0.1份海藻糖,1份右旋糖苷40,0.007份复合生物活性因子,所得冻干粉中复合生物活性因子保持复合生物活性因子溶液中78%以上的生物活性因子的活性,主要为EGF、BFGF、VEGF、IGF1、IGF2、TGF-B1、TGF-B2、PDGF和KGF。
所得复合生物活性因子冻干粉在2-8℃下可保存2年,在室温下保存1-2年。
实施例6
取10份甘露醇,3份甘氨酸,3份PVP,与9份复合生物活性因子溶液混合,并加纯净水至100份,得混合液;
将混合液依次经过预冻、加强预冻、升华干燥和解析干燥处理(具体过程同前文所述),获得复合生物活性因子冻干粉。
结论,所得复合生物活性因子冻干粉包含10份甘露醇,3份甘氨酸,3份PVP,0.009份复合生物活性因子,所得冻干粉中复合生物活性因子保持复合生物活性因子溶液中80%以上的生物活性因子的活性,主要为EGF、BFGF、VEGF、IGF1、IGF2、TGF-B1、TGF-B2、PDGF和KGF。
所得复合生物活性因子冻干粉在2-8℃下可保存2年,在室温下保存1-2年。
实施例7
取5份山梨醇,5份甘氨酸,1份右旋糖苷40,与6份复合生物活性因子溶液混合,并加纯净水至100份,得混合液;
将混合液依次经过预冻、加强预冻、升华干燥和解析干燥处理(具体过程同前文所述),获得复合生物活性因子冻干粉。
结论,所得复合生物活性因子冻干粉包含5份山梨醇,5份甘氨酸,1份右旋糖苷40,0.006份复合生物活性因子,所得冻干粉保持复合生物活性因子溶液中76%以上的生物活性因子的活性,主要为EGF、BFGF、VEGF、IGF1、IGF2、TGF-B1、TGF-B2、PDGF和KGF,并且在2-8℃下可保存2年,在室温下保存1-2年。
实施例8
取7份山梨醇和甘露醇的混合物,4份谷氨酸,2份聚乙二醇,与8份复合生物活性因子溶液混合,并加纯净水至100份,得混合液;
将混合液依次经过预冻、加强预冻、升华干燥和解析干燥处理(具体过程同前文所述),获得复合生物活性因子冻干粉。
结论,所得复合生物活性因子冻干粉包含7份山梨醇和甘露醇的混合物,4份谷氨酸,2份聚乙二醇,0.008份复合生物活性因子,所得复合生物活性因子冻干粉保持复合生物活性因子溶液中78%以上的生物活性因子的活性,主要为EGF、BFGF、VEGF、IGF1、IGF2、TGF-B1、TGF-B2、PDGF和KGF。
所得复合生物活性因子冻干粉在2-8℃下可保存2年,在室温下保存1-2年。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种复合生物活性因子的冻干方法,其特征在于,包括:
将保护剂与5-10份包含复合生物活性因子的溶液混合所得的混合液依次经过预冻、加强预冻、升华干燥和解析干燥处理;
其中,所述保护剂包括5-10份多元醇,所述混合液除所述保护剂和包含复合生物活性因子的溶液之外的其余部分为纯净水。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述复合生物活性因子溶液至少包括:人表皮生长因子hEGF、血管内皮生长因子VEGF、成纤维细胞生长因子FGF、转化生长因子-β1TGF-β1、转化生长因子-β2TGF-β2、类胰岛素一号增长因子IGF-1、类胰岛素二号增长因子IGF-2、角质细胞生长因子KGF、血小板衍生生长因子PDGF。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,
所述预冻的目标温度为-30—-50℃,时长为1-2小时;
所述加强预冻的目标温度为-30—-50℃,时长为1-2小时。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述升华干燥包含三个阶段,其中,
第一阶段的目标温度为-20℃—-10℃,时长为5-8小时,真空度为150-300mT;
第二阶段的目标温度为-5℃—5℃,时长为1-3小时,真空度为100-250mT;
第三阶段的目标温度为5℃—15℃,时长为1-3小时,真空度为50-150mT;
所述解析干燥的目标温度为20℃—30℃,时长为3-6小时,真空度为10-100mT。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述保护剂还包括3-5份的氨基酸,其中,
所述多元醇包括山梨醇或甘露醇中的一种或两种;
所述氨基酸包括甘氨酸或谷氨酸中的一种或两种。
6.根据权利要求1或5所述的方法,其特征在于,所述保护剂还包括1-3份的聚合物,其中,
所述聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮PVP、右旋糖苷、聚乙二醇和明胶中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述方法,其特征在于,所述保护剂还包括0.5-1份的糖和0.4-1份的聚合物;其中,
所述多元醇包括山梨醇或甘露醇中的一种或两种;
所述聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮PVP、右旋糖苷、聚乙二醇和明胶中的一种或多种;
所述糖包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、和海藻糖中的一种或多种。
8.一种复合生物活性因子冻干粉,其特征在于,所述复合生物活性因子冻干粉的配方包括:5-10份多元醇和0.005-0.01份复合生物活性因子,所述复合生物活性因子至少包含:人表皮生长因子hEGF、血管内皮生长因子VEGF、成纤维细胞生长因子FGF、转化生长因子-β1TGF-β1、转化生长因子-β2TGF-β2、类胰岛素一号增长因子IGF-1、类胰岛素二号增长因子IGF-2、角质细胞生长因子KGF、血小板衍生生长因子PDGF。
9.根据权利要求8所述复合生物活性因子冻干粉,其特征在于,所述复合生物活性因子冻干粉的配方还包括3-5份的氨基酸和1-3份的聚合物,其中,所述多元醇包括山梨醇或甘露醇中的一种或两种;所述氨基酸包括甘氨酸或谷氨酸的一种或两种;所述聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮PVP、右旋糖苷、聚乙二醇和明胶中的一种或多种。
10.根据权利要求8所述复合生物活性因子冻干粉,其特征在于,所述复合生物活性因子冻干粉的配方还包括0.5-1份的糖和0.4-1份的聚合物,其中,所述多元醇包括山梨醇或甘露醇中的一种或两种;所述聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮PVP、右旋糖苷、聚乙二醇和明胶中的一种或多种;所述糖包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、和海藻糖中的一种或多种。
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