CN104497127A - 一种人表皮生长因子的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备人表皮生长因子的工艺的方法研究。具体的说，就是以健康成年男性新鲜尿液为原料，经过超滤、等电点沉淀以及梯度洗脱法等现代蛋白质高端生化分离技术来制备人表皮生长因子，可以从10L尿液中，得到初步电泳纯的人表皮生长因子0.61mg。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说用超滤浓缩方法,将原尿浓缩10 倍以上。然后利用等电点法及饱和硫酸铵,沉淀出尿中蛋白的一种制备人表皮生长因子的方法研究。
背景技术
表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）是最早发现的生长因子, 对调节细胞生长、 增殖和分化起着重要作用。在人类，表皮生长因子蛋白有53个氨基酸残基，三个二硫键，质量6千道耳顿。
在人体中，表皮生长因子是由53个氨基酸残基组成的单链多肽，多肽中没有丙氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸。它有三个二硫键，这些二硫键是它具有生物活性所必需的，如加入琉基试剂和尿素，则表皮生长因子失活，肽链上的巯基可在空气中自然氧化而完全恢复活性。
表皮生长因子是人体内分泌的一种重要的生长因子，极微量即能强烈促进皮肤细胞的分裂和生长，此外，它还能刺激细胞外一些大分子（如透明质酸和糖蛋自等）的合成和分泌，滋润皮肤，因此它既可作为化妆品的添加剂及用于面部整形手术，促进人皮肤的新陈代谢、减少皮肤畸形；也可在医药上治疗皮肤外伤、术后创口、褥疮、口腔溃疡和坏疽、以及放射治疗引起的皮炎等。它可以加速伤口和溃疡面的愈合。
人表皮生长因子广泛存在人体多种组织，具有促进角化细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞等细胞的生长作用。对内皮细胞和成纤维细胞有趋化刺激作用，使其迁移向受损部位，还可促进成纤维细胞产生胶原蛋白，在创伤修复中有一定的作用，但因组织中表皮生长因子的含量普遍较低，即使所有积累在创面的内源性表皮生长因子均能与受体结合，其分子环境中的表皮生长因子仍达不到最适水平，难以满足细胞增殖和肉芽组织发育的最大需要。
发明内容
本发明的目是提供了一种精制表皮生长因子的方法。
本发明采用以下工艺方案予以实现上述目的：
健康青年男性尿液10L，加0.8%苯酚,12h内处理。
（1）超滤浓缩工序: 取10L尿液，用50%NaOH调pH8.2～8.8，静置1.5h,虹吸上清液，用冰醋酸调节PH6.2~6.8值，静置0.5h，将上清液进行超滤浓缩至2L，之后再用冰醋酸调节PH4.2~4.8值，最后放于4℃的环境中过夜。
（2）蛋白质等电点沉淀工序: 上清液加(NH4)2SO4至饱和，4 ℃静置25~35h,离心后沉淀。
（3）梯度洗脱工艺：阴离子交换柱用洗脱液 B平衡，将上述离心液流经平衡好的阴离子交换柱，流速控制在120~130ml/min左右；用洗脱液B溶液洗脱，流速控制在120~130ml/min，得洗脱液；将洗脱液经超滤膜，超滤至其体积的二十分之一，得超滤液。
（4）沉淀工艺：超滤液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小时，离心，固体再用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，留取沉淀物。
（5）冻干：将沉淀物装入盘进冻干机，冻干即得表皮生长因子。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，而不以任何方式限制。
实施例1
健康青年男性尿液10L，加0.8%苯酚,12h内处理。
1）超滤浓缩工序: 取10L尿液，用50%NaOH调pH8.5，静置1.5h,虹吸上清液，用冰醋酸调节PH6.5值，静置0.5h，将上清液进行超滤浓缩至2L，之后再用冰醋酸调节PH4.5值，最后放于4℃的环境中过夜。
2）蛋白质等电点沉淀工序: 上清液加(NH4)2SO4至饱和，4℃静置30h,离心后沉淀。
3）梯度洗脱法工序（以0.25L柱体为例）
3.1）称取表皮生长因子粗品1kg，用8.5L的洗脱液 A溶解，搅拌30分钟，离心20分钟，留取离心液；
3.2）阴离子交换柱用2.5L的洗脱液 B平衡，将上述离心液流经平衡好的阴离子交换柱，流速控制在120ml/min左右；
3.3）用33L的洗脱液B溶液洗脱，流速控制在120ml/min，得洗脱液；
3.4）将洗脱液经超滤膜，超滤至其体积的二十分之一，得超滤液约1.65L。
4）沉淀
超滤液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小时，离心，固体再用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，留取沉淀物。
5）冻干
将沉淀物装入盘进冻干机，冻干即得表皮生长因子。
实施例2
健康青年男性尿液10L，加0.8%苯酚,12h内处理。
1）超滤浓缩工序: 取10L尿液，用50%NaOH调pH8.2，静置1.5h,虹吸上清液，用冰醋酸调节PH6.2值，静置0.5h，将上清液进行超滤浓缩至2L，之后再用冰醋酸调节PH4.2值，最后放于4℃的环境中过夜。
2）蛋白质等电点沉淀工序: 上清液加(NH4)2SO4至饱和，4 ℃静置25h,离心后沉淀。
3）梯度洗脱法工序（以0.25L柱体为例）
3.1）称取表皮生长因子粗品1kg，用8.5L的洗脱液 A溶解，搅拌30分钟，离心20分钟，留取离心液；
3.2）阴离子交换柱用3.0L的洗脱液 B平衡，将上述离心液流经平衡好的阴离子交换柱，流速控制在130ml/min左右；
3.3）用33L的洗脱液B溶液洗脱，流速控制在130ml/min，得洗脱液；
3.4）将洗脱液经超滤膜，超滤至其体积的二十分之一，得超滤液约1.65L。
4）沉淀
超滤液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小时，离心，固体再用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，留取沉淀物。
5）冻干
将沉淀物装入盘进冻干机，冻干即得表皮生长因子。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (8)
1.一种人表皮生长因子的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）超滤浓缩工序:取10L尿液，用50%NaOH调pH，静置1.5h,虹吸上清液，用冰醋酸调节PH值，静置0.5h，将上清液进行超滤浓缩至2L，之后再用冰醋酸调节PH值，最后放于4℃的环境中过夜；
（2）蛋白质等电点沉淀工序: 上清液加(NH4)2SO4至饱和，4 ℃静置,离心后沉淀；
（3）梯度洗脱工艺：用洗脱液 A溶解沉淀，搅拌、离心，留取离心液；用洗脱液 B平衡阴离子交换柱，将上述离心液上柱；用洗脱液B溶液洗脱柱子；收集洗脱液；洗脱液经超滤膜，超滤，得超滤液；
（4）沉淀
超滤液中加入乙醇沉淀，离心，固体再用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，留取沉淀物；
（5）冻干
将沉淀物装入盘进冻干机，冻干即得表皮生长因子。
2.根据权利要求1所述的人表面生长因子的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，用50%NaOH溶液调溶液的PH值为8～9，用冰醋酸调节PH值为6～7，之后再次用冰醋酸调节PH值为4～5。
3.根据权利要求1所述的人表面生长因子的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，4 ℃静置24～36 h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）其中洗脱液A可选用0.01~0.3mol/L 醋酸盐缓冲液，在PH值4.0~9.0的条件下洗脱。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）其中洗脱液B可选用0.01~0.5mol/L 醋酸钠+0.1~5mol/L NaCl，在PH值3.0~8.0的条件下洗脱。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）其中洗脱液D可选用0.01~0.5mol/L磷酸盐缓冲液，在PH值3.0~8.0的条件下洗脱。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其中选用的阴离子交换柱包括：强阴离子交换柱Q-Sephadex A-25,Q-Sephadex A-50,Q-Sephadex C-25,Q-Sephadex C-50;弱阴离子交换柱DEAE-Cellulose DE-22，DEAE-Cellulose DE-23，DEAE-Cellulose DE-51，DEAE-Cellulose DE-52，DEAE-Cellulose DE-53。
8.根据权利要求1~7所述制备的人表皮生长因子，其特征在于：冻干后得到的蛋白质0.61mg，充分证明了人尿是人表皮生长因子的一个可用来源。
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