ES2236681T3 - Agente promotor de crecimiento. - Google Patents

Agente promotor de crecimiento.

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ES2236681T3
ES2236681T3 ES91912763T ES91912763T ES2236681T3 ES 2236681 T3 ES2236681 T3 ES 2236681T3 ES 91912763 T ES91912763 T ES 91912763T ES 91912763 T ES91912763 T ES 91912763T ES 2236681 T3 ES2236681 T3 ES 2236681T3
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cheese
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Geoffrey Leonard Francis
Geoffrey Owen Regester
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Abstract

SE PRESENTA UNA COMPOSICION DE UN EXTRACTO DE UN PRODUCTO DE LA LECHE QUE INCLUYE UNA PLURALIDAD DE FACTORES ESTIMULADORES DEL CRECIMIENTO CELULAR, QUE SE EXTRAE DE UN PRODUCTO DE LA LECHE, EN FORMA CONCENTRADA; DICHOS FACTORES TIENEN PUNTOS ISOELECTRICOS ENTRE BASICOS HASTA APROXIMADAMENTE NEUTROS. TAMBIEN SE PRESENTAN COMPOSICIONES PARA EL CULTIVO CELULAR Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS O VETERINARIAS QUE INCLUYEN EL MENCIONADO EXTRACTO DEL PRODUCTO DE LA LECHE. TAMBIEN SE PRESENTAN METODOS PARA PREPARAR Y USAR EL MISMO.

Description

Agente promotor de crecimiento.
Esta invención se refiere al crecimiento de células animales en una composición de cultivo celular. Más específicamente, se refiere a la provisión de una composición de cultivo celular que incluye una composición de extracto de suero de queso.
Las células animales se hacen crecer en cultivo para proporcionar diversos productos farmacéuticos, diagnósticos y veterinarios, incluyendo vacunas humanas, linfoquinas, hormonas, anticuerpos monoclonales, otros productos proteicos farmacéuticamente activos, hormonas veterinarias y para propósitos de investigación y desarrollo y diagnóstico.
El cultivo de células animales requiere un medio isotónico definido que contenga sales, nutrientes, precursores lipídicos, precursores de ácidos nucleicos, vitaminas y aminoácidos que se formulan para mimetizar el medio que bañaría normalmente a esas células in vivo. Los ejemplos de uso común incluyen medio esencial mínimo de Eagle, medio esencial mínimo de Eagle modificado con Dulbecco (DMEM), medio 199, medio RPMI 1640 y medio F12 de Ham. Sin embargo, virtualmente ninguna célula animal crecería en tal medio, sino que requiere la adición simultánea de suero. Frecuentemente se usa suero bovino fetal, ya que es más efectivo que el suero obtenido de animales posnatales y contiene sólo concentraciones mínimas de inmunoglobulinas que, de otro modo, podrían producir efectos indeseables.
El suministro de suero bovino fetal está limitado por el número de vacas preñadas sacrificadas. También presenta variaciones indeseables entre lotes y puede incluir toxinas. Su uso para la producción eventual de proteínas recombinantes y otras sustancias farmacéuticas para uso humano está rodeado de especial preocupación, porque el suero puede contener también virus que son nocivos para los seres humanos y se puede realizar a través de un protocolo de purificación que produce el producto deseado. Principalmente por estas razones, se han dirigido intensos esfuerzos hacia el reemplazo del suero por ingredientes puros. ejemplos de tales ingredientes son factores de crecimiento, hormonas y factores de unión celular. Desafortunadamente, los requerimientos de cada tipo celular que se está cultivando son diferentes y difíciles de establecer. Frecuentemente, no se ha probado que sea posible lograr propiedades de crecimiento equivalentes o producciones equivalentes de productos celulares con medios "exentos de suero", que los que se pueden obtener con medio que contiene suero bovino.
La disponibilidad limitada de suero bovino fetal, su variabilidad entre lotes, su coste considerable resultante, así como las deficiencias de los medios "exentos de suero" descritas anteriormente, han impulsado la investigación de otros fluidos biológicos como sustitutos potenciales en medios de cultivo celular. Se han descrito algunos progresos en el estado de la técnica con leche bovina y calostro bovino, según se evidencia por los siguientes trabajos seleccionados: M. Klagsbrun: "Human milk stimulates DNA synthesis and cell proliferation in cultured fibroblasts" (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5057, 1978); M. Klagsbrun y J. Neumann: "The serum-free growth of Balb/C 3T3 cells in medium supplemented with bovine colostrum" (J. Supramol. Struct. 11, 349, 1979).
El estado de la técnica también incluye la patente de EE.UU. 4.440.860 de M. Klagsbrun, que describe "compositions and methods for promoting cell growth featuring, in one aspect, cell culture media containing milk or colostrum and fibronectin; fibronectin is preferably pre-coated onto the culture substrate" ("Composiciones y métodos para promover el crecimiento celular, resaltando, en un aspecto, medios de cultivo celular que contienen leche o calostro y fibronectina; preferiblemente, la superficie de cultivo se recubre previamente con la fibronectina") y la patente japonesa JP 59166879 de Morinaga "A culture medium for cell incubation - containing milk or milk components" ("Un medio de cultivo para incubación de células que contiene leche o componentes lácteos"). También se han usado ultrafiltrados de suero lácteo para soportar el crecimiento de células cultivadas. como en la solicitud de patente europea 86401911.2 de Linden et al. "Fractions de lait, procedée d'obtention de ces fractions et milieux de culture cellulaires renfermant ces fraccions" ("Fracciones de leche, procedimiento de obtención de estas fracciones y medios de cultivo celulares que incluyen estas fracciones") y O. Damerdji et al. "Utilization of whey fractions as a substitute for fetal calf serum in culture media" ("Utilización de fracciones séricas como sustituto para suero bovino fetal en medios de cultivo") (Biotech. Tech. 2, 235, 1988). A pesar de este progreso, todavía hay que localizar una alternativa de éxito para el suero bovino fetal.
Ahora se ha descubierto que es posible superar, o al menos aliviar una o más de las dificultades o deficiencias relacionadas con el estado de la técnica.
Consecuentemente, en un primer aspecto de la presente invención se proporciona una composición de extracto de suero de queso que consiste esencialmente en una pluralidad de factores básicos estimuladores del crecimiento celular que tienen puntos isoeléctricos de básicos a neutros, teniendo la composición la propiedad de estimular la proliferación de fibroblastos cutáneos humanos; extraíble de suero de queso en forma concentrada mediante el método de: filtrar el suero de queso para eliminar del mismo el material insoluble; ajustar el pH del filtrado resultante entre 6,5 y 8,0; proporcionar una resina de intercambio catiónico basada en Sefarosa, adecuada para adsorber una pluralidad de proteínas básicas, de forma que los componentes más básicos del producto lácteo se adsorben sobre la misma, y las proteínas principales con puntos isoeléctricos ácidos contenidas en los productos lácteos no se adsorben; equilibrar tal resina de intercambio catiónico con un tampón de equilibrado; aplicar el filtrado a la resina de intercambio catiónico equilibrada; eluir la resina de intercambio catiónico con una solución tampón de elevada fuerza iónica, adecuada para tal elución; filtrar el eluato para reducir su contenido de sal; concentrar el eluato filtrado para obtener un extracto de suero de queso enriquecido en actividad promotora del crecimiento y estimular la proliferación de fibroblastos cutáneos humanos.
Esta composición de extracto de suero de queso se puede formar de suero de queso, en el que sus constituyentes de sal y/o proteína principal se reducen o eliminan.
Esta composición de extracto de suero de queso puede incluir menos del 1% p/p de sal, basado en el peso total de la composición. Este extracto de suero de queso puede incluir menos del 0,5% p/p de caseína, alfa lactalbúmina, beta lactoglobulina, inmunoglobulina o albúmina, basado en el peso total de la composición.
La composición de extracto de suero de queso según este aspecto de la presente invención, se puede utilizar en la promoción del crecimiento celular y proliferación in vitro, según se expone más adelante. La composición de extracto de suero de queso puede utilizarse para la estimulación de la reparación de heridas superficiales in vivo en mamíferos, según se expone más adelante.
Sorprendentemente, la composición de extracto de suero de queso puede soportar el crecimiento de células animales a concentraciones de proteína inferiores que las logradas con suero bovino fetal, aunque con una eficacia comparable al suero bovino fetal para varios tipos celulares.
Alternativamente, el extracto de suero de queso se puede usar como suplemento para medios que contienen concentraciones bajas de suero bovino fetal, a fin de conseguir velocidades de crecimientos mejores de las células cultivadas y para conservar el uso de suero bovino fetal.
El suero de queso es un subproducto de la industria del queso del que se ha eliminado esencialmente toda la grasa y la caseína durante la fabricación del queso. En el estado de la técnica actual el suero de queso no tiene esencialmente ningún valor e incluso puede representar un coste neto para la industria, ya que es un contaminante potencial.
El suero de queso, por ejemplo, es un producto pobre en proteínas y rico en sales, disponible en cantidades de toneladas procedentes de la fabricación de queso. Los principales constituyentes proteicos presentes en el suero de queso son alfa lactalbúmina (\alphaLA) y beta lactoglobulina (\betaLG), que constituyen usualmente más de 90% de las proteínas presentes. Pueden estar presentes cantidades significativas de albúmina sérica, inmunoglobulinas y caseína residual. Todas estas proteínas tienen puntos isoeléctricos ácidos. Como contraste, los principales factores proteicos que estimulan el crecimiento de las células animales tienen puntos isoeléctricos básicos. Ejemplos incluyen los factores de crecimiento básicos FGF, IGF-1, des(1-3)IGF-1 y PDGF. Se postula que la extracción de los factores básicos presentes en el suero de queso, en ausencia virtual de las proteínas ácidas abundantes en otro caso, pueden ser responsables de la sorprendente eficacia de la composición de extracto de suero de queso.
Consecuentemente, en un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para preparar una composición de extracto de suero de queso que consiste esencialmente en una pluralidad de factores estimuladores del crecimiento celular básicos, que tienen puntos isoeléctricos de básicos a neutros, teniendo la composición la propiedad de estimular la proliferación de los fibroblastos cutáneos humanos; extraída de productos lácteos en forma concentrada; dicho método incluye: proporcionar una fuente de suero de queso; filtrar el suero de queso para eliminar del mismo el material insoluble; ajustar el pH del filtrado resultante entre 6,5 y 8,0; proporcionar una resina de intercambio catiónico basada en Sefarosa, adecuada para adsorber una pluralidad de proteínas básicas, de forma que los componentes más básicos del producto lácteo se adsorben sobre la misma y las proteínas principales con puntos isoeléctricos ácidos de los productos lácteos no se adsorben; equilibrar dicha resina de intercambio catiónico con un tampón de equilibrado; aplicar el filtrado a la resina de intercambio catiónico equilibrada; eluir la resina de intercambio catiónico con una solución tampón de elevada fuerza iónica adecuada para dicha elución; filtrar el eluato para reducir el contenido en sal del mismo; concentrar el eluato filtrado para obtener un extracto de suero de queso enriquecido en actividad promotora del crecimiento y estimular la proliferación de fibroblastos cutáneos humanos.
La desorción de las proteínas básicas de la resina de intercambio iónico conduce a una preparación enriquecida en factores estimuladores del crecimiento celular. El eluato se concentra y filtra utilizando cualquier técnica adecuada. El eluato se puede concentrar, por ejemplo, mediante métodos de ultrafiltración convencionales u otros procedimientos, para producir una mezcla de proteínas que soportan el crecimiento de célula animales cuando se añaden a medios exentos de proteína, como DMEM.
La fuente de este suero de queso puede ser un filtrado de suero de queso, sustancialmente exento de material insoluble. Consecuentemente, el método de preparación incluye la etapa preliminar de filtrar el suero de queso para eliminar del mismo materiales insolubles.
El suero de queso se puede filtrar a través de un tamiz adecuado. El suero de queso se puede filtrar a través de un cartucho de fibra hueca o de porosidad definida.
La resina de intercambio catiónico es un gel de intercambio catiónico basado en Sefarosa. La etapa de contacto se puede realizar a pH de neutro a básico. La etapa de contacto se puede realizar a un pH de 6,5 a 8,0.
La resina de intercambio catiónico se equilibra con un tampón adecuado a un pH de 6,5 a 8,0. Se puede usar un tampón de citrato sódico acuoso. Las etapas de elución se pueden realizar utilizando un eluato adecuado. Se puede usar una solución salina. Se puede usar una solución salina tamponada.
Por tanto, en una forma preferida de este aspecto de la presente invención, el método de preparación de una composición de extracto de suero de queso puede incluir tratar el suero de queso secuencialmente:
someter el suero de queso a una etapa de filtración, para eliminar del mismo los materiales insolubles;
ajustar el pH del filtrado entre 6,5 y 8,0;
poner en contacto el filtrado con una resina de intercambio catiónico basada en Sefarosa;
eluir desde la resina de intercambio catiónico a fuerza iónica elevada y pH elevado con una solución tampón adecuada; y
someter el eluato a una etapa de concentración y una etapa de diafiltración para eliminar la sal del mismo.
Alternativamente, la elución desde la resina de intercambio catiónico se logra a una fuerza iónica elevada, pero sin ajustar el pH, de forma que se recuperan los factores estimuladores del crecimiento celular.
En esta realización, los factores del crecimiento celular se eluyen con menos proteína extraña.
En un aspecto adicional del aislamiento de un extracto adecuado de suero de queso, el eluyente se puede tratar a temperatura elevada y centrifugarse. Esta modificación elimina la proteína adicional. Consecuentemente, el método puede incluir posteriormente someter el eluyente a un tratamiento térmico para reducir el contenido de proteína extraña.
La composición de extracto de suero de queso se puede esterilizar y, opcionalmente, se puede liofilizar para su almacenamiento. El material liofilizado se puede disolver en solución salina estéril para adición a células en cultivo.
En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición de cultivo celular que consiste esencialmente en:
(a)
una cantidad efectiva de una composición de extracto de suero de queso que incluye una pluralidad de factores básicos estimuladores del crecimiento celular que tienen puntos isoeléctricos de básicos a neutros, teniendo la composición la propiedad de estimular la proliferación de fibroblastos cutáneos humanos; extraíble de suero de queso en forma concentrada mediante el método siguiente:
proporcionar una fuente de suero de queso;
filtrar el suero de queso para eliminar del mismo el material insoluble;
ajustar el pH del filtrado resultante a entre 6,5 y 8,0;
proporcionar una resina de intercambio catiónico adecuada basada en Sefarosa, para adsorber una pluralidad de proteínas básicas, de forma que los componentes más básicos del producto lácteo se adsorben sobre la misma, y en el que las proteínas principales con puntos isoeléctricos ácidos contenidas en los productos lácteos no se adsorben;
equilibrar tal resina de intercambio catiónico con un tampón de equilibrado;
aplicar el filtrado a la resina de intercambio catiónico equilibrada;
eluir la resina de intercambio catiónico con una solución tampón de elevada fuerza iónica, adecuada para tal elución;
filtrar el eluato para reducir su contenido de sal;
concentrar el eluato filtrado para obtener un extracto de suero de queso enriquecido en actividad promotora del crecimiento y estimular la proliferación de fibroblastos cutáneos humanos; y
(b)
un medio de cultivo.
El medio de cultivo puede ser un medio de cultivo isotónico sustancialmente exento de proteína. El medio de cultivo isotónico sustancialmente exento de proteína puede ser medio esencial mínimo de Eagle modificado con Dulbecco (DMEM).
Se ha descubierto que se puede lograr una velocidad de crecimiento de fibroblastos cutáneos humanos aproximadamente equivalente a la conseguida con suero bovino fetal al 5%, con aproximadamente 20 \mug de factores estimuladores del crecimiento celular extraídos de suero de queso, según el aspecto preferido de la presente invención, por 100 \mul de medio.
Alternativamente, se puede usar como medio de cultivo una cantidad pequeña pero efectiva de suero bovino fetal. Se ha descubierto que la adición de aproximadamente 25 \mug de factores estimuladores del crecimiento celular por 100 \mul de medio que contiene aproximadamente suero bovino fetal al 2%, incrementará la velocidad de crecimiento de células Balb C/3T3 hasta la velocidad lograda de otra forma con suero bovino fetal al 10%.
Se pueden realizar otras adiciones al medio, dependiendo del tipo celular, incluyendo factores de crecimiento, factores de unión o pequeñas cantidades de suero.
En una forma preferida, la presente invención proporciona una composición de cultivo celular, según se describió anteriormente, en la que el extracto de producto lácteo está presente en medios con una concentración de proteína de 10 a 20.000 microgramos por ml, preferiblemente de 100 a 2.000 microgramos por ml.
Consecuentemente, en otro aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para cultivar células, que incluye:
tomar una fuente de células animales;
una composición de cultivo celular que incluye:
una cantidad efectiva de una composición de extracto de suero de queso que incluye una pluralidad de factores básicos estimuladores del crecimiento celular que tienen puntos isoeléctricos de básicos a neutros, teniendo la composición la propiedad de estimular la proliferación de los fibroblastos cutáneos humanos; extraíble a partir de un producto lácteo en forma concentrada mediante el método consistente en:
proporcionar una fuente de suero de queso;
filtrar el suero de queso para eliminar del mismo el material insoluble;
ajustar el pH del filtrado resultante entre 6,5 y 8,0;
proporcionar una resina de intercambio catiónico adecuada basada en Sefarosa para adsorber una pluralidad de proteínas básicas, de forma que los componentes más básicos del producto lácteo se adsorben sobre la misma, y las proteínas principales con puntos isoeléctricos ácidos contenidas en los productos lácteos no se adsorben;
equilibrar tal resina de intercambio catiónico con un tampón de equilibrado;
aplicar el filtrado a la resina de intercambio catiónico equilibrada;
eluir la resina de intercambio catiónico con una solución tampón de elevada fuerza iónica, adecuada para tal elución;
filtrar el eluato para reducir su contenido de sal;
concentrar el eluato filtrado para obtener un extracto de suero de queso enriquecido en actividad promotora del crecimiento y estimular la proliferación de fibroblastos cutáneos humanos; y
un medio de cultivo.
y;
cultivar las células en la composición de cultivo celular durante un tiempo suficiente y a una temperatura suficiente para lograr una concentración celular predeterminada.
El método de cultivo celular se puede realizar a temperatura ambiente o superior. Se puede usar una temperatura en el intervalo de aproximadamente 35ºC a 40ºC. El procedimiento de cultivo celular se puede realizar en una incubadora, por ejemplo, en una incubadora humidificada.
El método de cultivo celular se puede realizar sobre cualquier superficie adecuada o en suspensión. Se pueden usar placas de cultivo celular.
El método de cultivo celular puede continuar durante un período de aproximadamente 1 a 5 días, dependiendo de la concentración celular deseada.
Aunque el método se aplica en particular al crecimiento de células animales in vitro, también se puede aplicar a animales, incluyendo seres humanos, que tengan heridas superficiales.
Consecuentemente, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición para el tratamiento de heridas superficiales, lesiones gastrointestinales, enfermedades o úlceras, incluyendo dicha composición:
(a)
una cantidad efectiva de una composición de extracto de suero de queso que incluye una pluralidad de factores básicos estimuladores del crecimiento celular que tienen puntos isoeléctricos de básicos a neutros, teniendo la composición la propiedad de estimular la proliferación de fibroblastos cutáneos humanos; extraíble de suero de queso en forma concentrada mediante el método de:
proporcionar una fuente de suero de queso;
filtrar el suero de queso para eliminar del mismo el material insoluble;
ajustar el pH del filtrado resultante a entre 6,5 y 8,0;
proporcionar una resina de intercambio catiónico adecuada basada en Sefarosa, para adsorber una pluralidad de proteínas básicas, de forma que los componentes más básicos del producto lácteo se adsorben sobre la misma, y las proteínas principales con puntos isoeléctricos ácidos contenidas en los productos lácteos no se adsorben;
equilibrar tal resina de intercambio catiónico con un tampón de equilibrado;
aplicar el filtrado a la resina de intercambio catiónico equilibrada;
eluir la resina de intercambio catiónico con una solución tampón de elevada fuerza iónica, adecuada para tal elución;
filtrar el eluato para reducir su contenido de sal;
concentrar el eluato filtrado para obtener un extracto de suero de queso enriquecido en actividad promotora del crecimiento y estimular la proliferación de fibroblastos cutáneos humanos; y
(b)
un vehículo diluyente o excipiente para la misma.
La composición farmacéutica o veterinaria puede incluir además una cantidad efectiva de al menos un ingrediente activo.
El ingrediente activo, al menos uno, se puede seleccionar de antibióticos, antisépticos, otros promotores del crecimiento, anestésicos y similares, y sus mezclas.
La composición farmacéutica o veterinaria se puede adaptar para administración de cualquier manera adecuada. La composición se puede adaptar para administración interna o tópica. Puede estar en forma oral, inyectable o tópica. Se prefiere la administración tópica. La composición puede estar en forma de lavatorio, loción, crema, ungüento o
gel.
No existen limitaciones en cuanto al tipo de herida superficial que se puede tratar, y éstas incluyen, pero no están limitadas a quemaduras, úlceras, laceraciones y penetraciones.
La presente invención se describirá a continuación más completamente con respecto a los siguientes ejemplos. Se debe entender, sin embargo, que la siguiente descripción es sólo ilustrativa, y no se debe considerar de ningún modo como una restricción de la generalidad de la invención descrita anteriormente.
Ejemplo 1 Preparación de una fracción procedente de suero de queso (GFE) que se enriquece en actividad promotora del crecimiento
Se filtró suero pasteurizado obtenido como producto final de la fabricación de queso, a través de un tamiz de 10 micrones y un módulo Sartorius Microsart Sartocon II de 0,2 micrones para eliminar sólidos. El ultrafiltrado se ajustó hasta pH 6,5 y se aplicó a una columna de resina de intercambio catiónico S de flujo rápido de S-Sefarosa (Pharmacia) que se había equilibrado con tampón de citrato sódico 50 mM a pH 6,5. Tras lavar la columna con el mismo tampón, el material absorbido se eluyó mediante una solución de NaCl 1 M que contenía NH_{4}OH 0,25 M. Este eluato se diafiltró frente a agua hasta que la conductividad alcanzó 0 \muS y luego se concentró mediante ultrafiltración; utilizando ambos procedimientos una membrana que excluía 3 KDa. La preparación resultante se liofilizó para producir el producto "GFE".
Una preparación procedente de 30 litros de suero de queso que contenía 18 g de proteína, produjo un extracto de GFE que contenía 2,66 g de proteína.
Ejemplo 2 Preparación de una fracción procedente de suero de queso que se enriquece en actividad promotora del crecimiento y se empobrece en proteína extraña, incluyendo lactoferrina (GFE-2)
Se filtró suero pasteurizado y se aplicó a una columna de S-Sefarosa, y la columna se lavó como en el Ejemplo 1. La elución se efectuó con una solución que contenía NaCl 0,4 M añadido a una solución de citrato sódico 10 mM y pH 6,5. Esta GFE-2 se diafiltró frente a agua, se concentró y liofilizó, según se describe en el ejemplo 1.
Una preparación procedente de 30 litros de suero de queso que contenía 18 g de proteína produjo un extracto de GFE-2 que contenía 0,56 g de proteína.
Ejemplo 3 Preparación de una fracción de GFE-2 modificada que se empobreció también en proteína extraña, incluyendo lactoperoxidasa (GFE-3)
La GFE-2 liofilizada (Ejemplo 2) se disolvió a una concentración de 25 mg/ml y se calentó a 80ºC durante 2,5 min. La muestra calentada se enfrió rápidamente y se centrifugó. El sobrenadante puro se hizo pasar a través de un filtro de 0,22 \mum antes de usarlo. Esta solución contenía 50% de la proteína presente en GFE-2 y aproximadamente 10% de lactoperoxidasa.
Ejemplo 4 Estimulación del crecimiento de células cultivadas mediante extractos de suero de queso (Ejemplos 1,2), comparada con suero bovino fetal
Previamente a la adición a medios de cultivo, los polvos liofilizados (GFE, GFE-2) se pusieron en suspensión primero en solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato y se esterilizaron haciéndolos pasar a través de un filtro de 0,22 \mum.
Este ejemplo utiliza las líneas celulares L6 (mioblasto de rata), Balb C/3T3 (fibroblasto de ratón) y SF1972 (fibroblasto cutáneo diploide humano).
Cada línea celular se subcultivó sobre placas de cultivo de tejido de 96 pocillos en medio esencial mínimo de Eagle modificado con Dulbecco (DMEM), que contenía suero bovino fetal al 5% y se dejó en CO_{2} al 5%, a 37ºC, en una incubadora humidificada durante la noche, para asegurar la unión de las células. Durante todo el proceso se usaron técnicas estériles. Las placas se lavaron abundantemente en DMEM para eliminar cualquier suero residual y se añadió el extracto de suero (GFE o GFE-2) o el suero bovino fetal (FBS) a las concentraciones indicadas. El volumen total en cada pocillo era 0,1 ml a 3ºC, CO_{2} al 5% y humedad del 100%.
Tras 2 días más, las placas se lavaron, se fijaron y los números de células se cuantificaron usando un método automatizado de azul de metileno (M.H. Oliver et al., J. Cell Sci. 92, 513, 1989). El crecimiento se expresa como el porcentaje de incremento en unidades de absorbancia, relativo al incremento de absorbancia producido por crecimiento de las células en DMEM que contiene suero bovino fetal al 5% (Figura 1).
Este ejemplo muestra que, en las tres líneas celulares, GFE y GFE-2 estimulan el crecimiento tanto como el suero bovino fetal. además, en células Balb C/3T3 y SF1972, GFE-2 es activo a aproximadamente un quinto del contenido de proteína que el suero bovino.
Ejemplo 5 Estimulación del crecimiento de células cultivadas mediante extractos de suero de queso empobrecidos en proteína extraña, incluyendo lactoperoxidasa (GFE-3, Ejemplo 3), comparada con GFE-2 (Ejemplo 2)
Los detalles experimentales fueron exactamente según se describen en el Ejemplo 4, excepto porque los datos se expresan como contenido de proteína (\mug/pocillo de 100 \mul) que lograba la misma respuesta de crecimiento alcanzada con suero bovino fetal al 5% (véase Tabla 1).
TABLA 1
1
Se requiere claramente menos GFE-3 que GFE-2 para estimular el crecimiento. También, debido a que el suero bovino fetal al 5% tiene un contenido de proteína de 250 \mug/100 \mul, tanto el GFE-2 como el GFE-3 son sustancialmente más potentes que el suero bovino fetal al 5%, especialmente para células Balb C/3T3 y fibroblastos cutáneos humanos (SF1972).
Ejemplo 6 Efectos de crecimiento de células cultivadas producidas enriqueciendo medio que contiene suero bovino fetal al 2% con extractos de GFE-2 (Ejemplo 2)
Los detalles experimentales fueron exactamente según se describen en el Ejemplo 4, excepto porque la línea de fibroblastos pulmonares humanos (HEL) reemplazó a la línea de fibroblastos cutáneos humanos (SF1972). Los datos se expresan como absorbancias logradas tras el crecimiento de las células durante 2 días (véase Tabla 2).
TABLA 2
2
Este experimento demuestra que pequeñas cantidades de GFE-2 añadidas a un medio que contiene sólo suero bovino fetal al 2% pueden incrementar la velocidad de crecimiento hasta la alcanzada con suero bovino fetal al 10%. La cantidad aproximada de GFE-2 requerida para lograr este incremento del crecimiento fue 100 \mug/100 \mul en células L6, 25 \mug/100 \mul en células BalbC/3T3, y sólo 5 \mug/100 \mul en células HEL. Tal incremento representa un ahorro muy sustancial de suero bovino fetal.

Claims (22)

1. Una composición de extracto de suero de queso que consiste esencialmente en una pluralidad de factores estimuladores del crecimiento celular básicos que tienen puntos isoeléctricos de básicos a neutros, teniendo dicha composición la propiedad de estimular la proliferación de los fibroblastos cutáneos humanos, extraíble desde suero de queso en forma concentrada mediante el método consistente en:
filtrar el suero de queso para eliminar del mismo el material insoluble;
ajustar el pH del filtrado resultante entre 6,5 y 8,0;
proporcionar una resina de intercambio catiónico basada en Sefarosa, adecuada para adsorber una pluralidad de proteínas básicas, de forma que los componentes más básicos del producto lácteo se adsorben sobre la misma y las proteínas principales con puntos isoeléctricos ácidos contenidas en los productos lácteos, no se adsorben;
equilibrar dicha resina de intercambio catiónico con un tampón de equilibrado;
aplicar el filtrado a la resina de intercambio catiónico equilibrada;
eluir la resina de intercambio catiónico con una solución tampón de elevada fuerza iónica, adecuada para tal elución;
filtrar el eluato para reducir su contenido de sal;
concentrar el eluato filtrado para obtener un extracto de suero de queso enriquecido en actividad promotora el crecimiento y estimular la proliferación de los fibroblastos cutáneos humanos.
2. Una composición de extracto de suero de queso según la reivindicación 1, formulada en una solución salina.
3. Una composición de extracto de suero de queso según la reivindicación 1, que incluye una concentración de proteína de 10 a 20.000 microgramos por litro.
4. Una composición de extracto de suero de queso según la reivindicación 1, en la que el tampón de equilibrado es citrato sódico 50 mM a un pH de 6,5.
5. Una composición de extracto de suero de queso según la reivindicación 1, en la que el tampón de elución comprende NaCl 1M que contiene NH_{4}OH 0,25 M o NaCl 0,4 M añadidos a citrato sódico 10 mM a pH 6,5.
6. Una composición de extracto de suero de queso según la reivindicación 1, en la que la concentración incluye ultrafiltración usando una membrana de exclusión de 3 kD.
7. Un método para preparar una composición de extracto de suero de queso, que consiste esencialmente en una pluralidad de factores estimuladores del crecimiento celular básicos que tienen puntos isoeléctricos de básicos a neutros, teniendo dicha composición la propiedad de estimular la proliferación de los fibroblastos cutáneos humanos, extraída desde suero de queso en forma concentrada; incluyendo dicho método:
proporcionar una fuente de suero de queso;
filtrar el suero de queso para eliminar del mismo el material insoluble;
ajustar el pH del filtrado resultante hasta entre 6,5 y 8,0;
proporcionar una resina de intercambio catiónico basada en Sefarosa, adecuada para adsorber una pluralidad de proteínas básicas, de forma que los componentes más básicos del producto lácteo se adsorben sobre la misma y las proteínas principales con puntos isoeléctricos ácidos contenidas en los productos lácteos, no se adsorben;
equilibrar dicha resina de intercambio catiónico con un tampón de equilibrado;
aplicar el filtrado a la resina de intercambio catiónico equilibrada;
eluir la resina de intercambio catiónico con una solución tampón de fuerza iónica elevada, adecuada para tal elución;
filtrar el eluato para reducir su contenido de sal;
concentrar el eluato filtrado para obtener un extracto de suero de queso enriquecido en actividad promotora el crecimiento y estimular la proliferación de los fibroblastos cutáneos humanos.
8. Un método según la reivindicación 7, en el que la composición de extracto de suero de queso se formula en una solución salina.
9. Un método según la reivindicación 7, en el que la composición de extracto de suero de queso incluye una concentración de proteína de 10 a 20.000 microgramos por ml.
10. Un método según la reivindicación 7, en el que el tampón de equilibrado es citrato sódico 50 mM a pH 6,5.
11. Un método según la reivindicación 7, en el que el tampón de elución comprende NaCl 1 M, que contiene NH_{4}OH 0,25 M o NaCl 0,4 M, añadidos a citrato sódico 10 mM a pH 6,5.
12. Un método según la reivindicación 7, en el que la concentración incluye ultrafiltración usando una membrana de exclusión de 3 kD.
13. Un método según la reivindicación 7, que incluye además someter el eluato a un tratamiento térmico para reducir las proteínas extrañas.
14. Una composición de cultivo celular consistente esencialmente en:
(a)
una cantidad efectiva de una composición de extracto de suero de queso que incluye una pluralidad de factores estimuladores del crecimiento celular básicos que tienen puntos isoeléctricos de básicos a neutros, teniendo la composición la propiedad de estimular la proliferación de fibroblastos cutáneos humanos; extraíble de un producto lácteo en forma concentrada mediante el método de:
proporcionar una fuente de suero de queso;
filtrar el suero de queso para eliminar del mismo el material insoluble;
ajustar el pH del filtrado resultante a entre 6,5 y 8,0;
proporcionar una resina de intercambio catiónico adecuada basada en Sefarosa, para adsorber una pluralidad de proteínas básicas, de forma que los componentes más básicos del producto lácteo se adsorben sobre la misma, y en el que las proteínas principales con puntos isoeléctricos ácidos contenidas en los productos lácteos no se adsorben;
equilibrar tal resina de intercambio catiónico con un tampón de equilibrado;
aplicar el filtrado a la resina de intercambio catiónico equilibrada;
eluir la resina de intercambio catiónico con una solución tampón de elevada fuerza iónica, adecuada para tal elución;
filtrar el eluato para reducir su contenido de sal;
concentrar el eluato filtrado para obtener un extracto de suero de queso enriquecido en actividad promotora del crecimiento y estimular la proliferación de fibroblastos cutáneos humanos; y
(b)
un medio de cultivo.
15. Una composición de cultivo celular según la reivindicación 14, en la que el medio de cultivo contiene suero bovino fetal.
16. Una composición de cultivo celular según la reivindicación 14, en la que la composición de extracto de suero de queso está presente a una concentración de proteína de 10 a 20.000 microgramos por ml de medio de cultivo.
17. Un método para cultivar células que incluye:
tomar una fuente de células animales;
una composición de cultivo celular que incluye: una cantidad efectiva de una composición de extracto de suero de queso que incluye una pluralidad de factores básicos estimuladores del crecimiento celular que tienen puntos isoeléctricos de básicos a neutros, teniendo la composición la propiedad de estimular la proliferación de los fibroblastos cutáneos humanos, pudiéndose extraer dicha composición a partir de un producto lácteo en forma concentrada mediante el método consistente en:
proporcionar una fuente de suero de queso;
filtrar el suero de queso para eliminar del mismo el material insoluble;
ajustar el pH del filtrado resultante entre 6,5 y 8,0;
proporcionar una resina de intercambio catiónico adecuada basada en Sefarosa, para adsorber una pluralidad de proteínas básicas, de forma que los componentes más básicos del producto lácteo se adsorben sobre la misma, y en la que las proteínas principales con puntos isoeléctricos ácidos contenidas en los productos lácteos no se adsorben;
equilibrar tal resina de intercambio catiónico con un tampón de equilibrado;
aplicar el filtrado a la resina de intercambio catiónico equilibrada;
eluir la resina de intercambio catiónico con una solución tampón de elevada fuerza iónica, adecuada para tal elución;
filtrar el eluato para reducir su contenido de sal;
concentrar el eluato filtrado para obtener un extracto de suero de queso enriquecido en actividad promotora del crecimiento y estimular la proliferación de fibroblastos cutáneos humanos; y
un medio de cultivo.
y;
cultivar las células en la composición de cultivo celular durante un tiempo suficiente y a una temperatura suficiente para lograr una concentración celular predeterminada.
18. Un método según la reivindicación 17, en el que las células se cultivan a una temperatura en el intervalo de 35ºC a 40ºC, durante un período de 1 a 5 días.
19. Un método según la reivindicación 17, en el que la composición de extracto de suero de queso está presente en una concentración de proteína de 10 a 20.000 microgramos por ml de medio de cultivo.
20. Una composición para el tratamiento de heridas superficiales, lesiones gastrointestinales, enfermedades o úlceras, que incluye:
(a)
una cantidad efectiva de una composición de extracto de suero de queso que incluye una pluralidad de factores estimuladores del crecimiento celular básicos que tienen puntos isoeléctricos de básicos a neutros, teniendo la composición la propiedad de estimular la proliferación de fibroblastos cutáneos humanos; extraíble de un producto lácteo en forma concentrada mediante el método de:
proporcionar una fuente de suero de queso;
filtrar el suero de queso para eliminar del mismo el material insoluble;
ajustar el pH del filtrado resultante a entre 6,5 y 8,0;
proporcionar una resina de intercambio catiónico adecuada basada en Sefarosa, para adsorber una pluralidad de proteínas básicas, de forma que los componentes más básicos del producto lácteo se adsorben sobre la misma, y en el que las proteínas principales con puntos isoeléctricos ácidos contenidas en los productos lácteos no se adsorben;
equilibrar tal resina de intercambio catiónico con un tampón de equilibrado;
aplicar el filtrado a la resina de intercambio catiónico equilibrada;
eluir la resina de intercambio catiónico con una solución tampón de elevada fuerza iónica, adecuada para tal elución;
filtrar el eluato para reducir su contenido de sal;
concentrar el eluato filtrado para obtener un extracto de suero de queso enriquecido en actividad promotora del crecimiento y estimular la proliferación de fibroblastos cutáneos humanos; y
(b)
un vehículo diluyente o excipiente para la misma.
21. Una composición según la reivindicación 20, que incluye una concentración de proteína de 10 a 20.000 microgramos por ml.
22. Una composición según la reivindicación 20, que incluye además una cantidad efectiva de al menos un ingrediente activo seleccionado de antibióticos, antisépticos, otros promotores del crecimiento, anestésicos y sus mezclas.
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