JPH07267994A

JPH07267994A - 新規蛋白質及びその製造法

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Publication number: JPH07267994A
Application number: JP6085335A
Authority: JP
Inventors: Toshiaki Uchida; 俊昭内田; Isahiro Kawasaki; 功博川崎; Shunichi Dosemari; 俊一堂迫
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1994-03-31
Filing date: 1994-03-31
Publication date: 1995-10-17

Abstract

(57)【要約】【構成】次のアミノ酸配列を含有し、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで見かけの分子量が約１３ｋＤａであり、細胞増殖活
性を示す蛋白質。Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ａｓｐ（Ｘは天然に存在する２３種のアミノ酸のうちのいずれ
かを示す）ウシ尿等を陽イオン交換樹脂処理して上記蛋白質を得る
方法。【効果】腸管成熟促進作用、発育促進作用その他の細
胞増殖作用を有し、食品、飼料、医薬品等に利用するこ
とができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細胞増殖活性を有する
新規蛋白質（サイトカイン）およびその製造法に関す
る。さらに、本発明はこの蛋白質を配合した生理活性組
成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】上皮細胞増殖活性を持つ物質としては上
皮細胞増殖因子（以下、ＥＧＦと略記する）、腫瘍細胞
増殖因子（以下、ＴＧＦαと略記する）〔Teixido,J.,
J.Biol.Chem., 265:6410-6415,1990〕、アンフィレギュ
リン〔Shoyab,M.,Proc.Patl.Acad.Sci.USA,85:6528-653
2,1988〕、ワクシニア増殖因子〔Strobant,P.,Cell,42:
383-393,1980〕、ショープ繊維増殖因子〔Hang,W.,Mol.
Cell.Biol.,7:535-540,1987 〕、ミクソーマ増殖因子
〔Upton,C.,J.Viol.,61:1271-1275,1987〕などが知られ
ている。この中で特にＥＧＦは多くの研究がなされてお
り、ヒトでは乳、尿の他に、ほとんどの器官に存在する
ことが報告されている〔小口学、日本小児科学会誌、9
2:1920-1927,1988 〕。ＥＧＦの生理活性は、上皮細胞
の増殖促進効果〔Cohen, S.and Elliott,G.A.,J.inves
t.Dermatol.,40,1-5:1963〕表皮細胞の増殖促進効果〔B
arrandon,Y.,Cell,50:1131-1137,1987 〕などの細胞増
殖活性が知られている。また、ラットによる胃潰瘍治癒
促進効果〔Konturek,S.J.,Gastroenterol,81:438,1981
〕、ヒト胃潰瘍に対する臨床試験により被験者の８２
％に効果が認められたとする報告〔伊藤誠、消化性潰瘍
−基礎と臨床、8:178,1989〕、ラット腎臓組織の修復作
用〔Nathaue,J. et al.,Am.J.Physiol.,263:806-811,19
92〕、ラット腸管内のラクターゼ活性低下、ＤＮＡ合成
促進、カルシウムイオン輸送増加促進効果および小腸重
量の増加〔Oka,Y. et al.,Endocrinology,112:940-944,
1983〕、幼若マウス小腸のグルコアミラーゼ、アルカリ
フォスファターゼ活性の増加〔Christiane,M.and Menar
d,D.,Gastroenterology,83:28-35,1982 〕、ＥＧＦを産
生する主要な器官である顎下腺を除去した雌マウスを用
いた試験で、乳腺の未発達、乳の分泌量減少が見られた
こと〔Okamoto,S. et al.,Natl.Acad.Sci.USA,81:6059-
6063,1984 〕、マウスにおける同様な実験で、妊娠後期
に流産が多くなるが EGF投与により正常になることを示
したこと〔Tstsumi,O. et al.,Am.J.Obstet.Gynecol.,1
56:241-244,1987 〕、ウサギ胎児の肺成熟にＥＧＦが関
与する報告〔Catterton,W. et al.,Pediatr.Res.,13:10
4-108,1979〕及び羊胎児における各上皮組織の成熟にＥ
ＧＦが関与していることを示唆する報告〔Sundell,H. e
t al.,Pediatr.Res.,9:371-376,1975 〕などが知られて
いる。以上のように、ＥＧＦの生理効果は多種多様であ
ることが知られている。一方、ウシでは初乳に上皮細胞
増殖活性があること〔Browm,K.D.and Blakeley,D.M.,Br
itish Veterinary J.,139:68-78,1983〕、ウシＥＧＦ様
物質があることが示唆されて〔Byatt,J.C.,Biochem.Int
ernational,20:1179-1187,1990〕いるが、未だにはっき
りしたことは解明されていない。そこで、我々は同上の
ＥＧＦに似た作用を持つ新規な物質がウシに存在してい
る可能性が高いと考え、鋭意検討した結果、本発明を成
すに至った。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は細胞増殖活性
を持つウシ由来の新規蛋白質を見出したものである。本
発明の新規蛋白質は、細胞増殖、特に、上皮、表皮及び
線維芽細胞に関わる種々の疾患の治療、予防に効果があ
る。さらに腸管成熟を促進する効果も存在し、特に、乳
幼児、幼若動物に対して発育促進効果が期待できる。本
発明の新規蛋白質は、乳、尿、血液及び臓器より得るこ
とができ、食品、飼料及び化粧品などに使用でき、また
さらに精製することで試薬、医薬品などへ使用できる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、細胞増殖活性
を有し、次の (1)〜(3) の性質を示す蛋白質（サイトカ
イン）である。 (1)Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ａｓｐの配列を含有し（ただし、式
中Ｘは、天然に存在する２３種のアミノ酸のうちのいず
れかを示す）、(2) この蛋白質を５％メルカプトエタノ
ールで還元し、１０％ＳＤＳ存在下で２０％のポリアク
リルアミドゲル電気泳動を行った時に得られる、みかけ
の分子量が約１３ｋＤａであり、(3) この蛋白質の細胞
増殖活性が上皮細胞増殖活性、線維芽細胞増殖活性及び
表皮細胞増殖活性である。本発明で使用するアミノ酸の
略号は慣用の三文字表記で示されている。また、本発明
はこの蛋白質をイオン交換樹脂を用いて分離精製する方
法に関する。

【０００５】本発明で得られた蛋白質は上皮細胞増殖活
性を持つので、小腸の成熟促進効果の他、上皮、線維芽
及び表皮細胞増殖に関わる種々の器官の成熟及び疾患の
予防、治療などにも効果が期待できる。

【０００６】さらに、本発明は、この蛋白質をその他の
配合成分と配合し、食品、飼料、化粧品、試薬、医薬品
などの生理活性組成物として利用することに関する。

【０００７】本蛋白質の調製方法及び性質についての詳
細を以下に示す。なお、以下で用いる精製蛋白質とは純
度がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより９０％以上のものを示す。
原料はウシ尿、乳、血液または腎臓、顎下腺などを使用
することができる。この中でも、尿、乳及び血液は比較
的大量に入手できるので原料とし易い。尿は特に本発明
の物質を多く含むので使用し易い。また、乳からは、初
乳、生乳、脱脂乳、チーズホエー、酸ホエーなどの乳原
料、また脱脂粉乳、ホエー粉、ホエー蛋白濃縮物（ＷＰ
Ｃ）やホエー蛋白分離物（ＷＰＩ）などの粉末化原料な
どが原料として適している。血液はそのまま、あるいは
血清などから調製できる。

【０００８】本研究では新規細胞増殖活性をもつ物質を
探索するために、実施例１に記載したＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ
３を用い、チミジンの取り込みを見る方法を用いて、細
胞増殖活性が認められる物質を検索した。また、抗体を
作製後はイムノブロッティングで検出を行った。

【０００９】本発明の蛋白質を精製するには以下の様に
行う。原料は前もってクラリファイヤーや遠心分離機、
ＭＦ膜などで前処理を行うことが好ましい。これによ
り、原料中の不溶物を除去し、カラムへの通液を容易に
する。本発明の蛋白質は、イオン交換法、アフィニティ
ークロマト法、ゲルろ過法、逆層クロマト法、疎水クロ
マト法など通常の分離、精製法で精製できるが、イオン
交換法が特にすぐれている。具体的には、まず、陽イオ
ン交換樹脂に本発明蛋白質を吸着させる。使用できる陽
イオン交換樹脂としては、ＣＭ−トヨパール６５０（東
ソー社）、ＣＭ−セファロース（ファルマシア社）、Ｃ
Ｍ−セファデックス（ファルマシア社）、ＳＰ−トヨパ
ール５５０（東ソー社）、ＳＰ−セファロース（ファル
マシア社）、ＳＰ−セルロファイン（生化学工業社）、
Ｓ−セファシル（ＩＢＦ社）、マクロプレップＳサポー
ト（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）、スルホン化キトパール（富士
紡績社）など特に制限なくどれでも使用できる。カラム
はｐＨ１０以下の緩衝液あるいは水で平衡化する。ｐＨ
が１０を越えると本発明の蛋白質が十分吸着されない。
原料と樹脂は充填層型カラム、回転型カラム（特開平2-
138295号公報、特開平3- 83573号公報）及びバッチ式な
ど、一般に用いられる方法で吸着する。樹脂と原料の比
率は特に制限ないが、樹脂／原料が１／１５（Ｗ／Ｖ）
以下がコスト及び回収率の点で好ましい。樹脂と原料と
の接触温度は特に制限はないが、プロテアーゼ、微生物
汚染などの影響を考慮して、１０℃以下が好ましい。接
触時間もプロテアーゼの影響および微生物汚染などの影
響を少なくするため、２０時間以内が好ましいが、特に
制限はない。原料を通液したのち、ｐＨ１０以下の緩衝
液あるいは水で十分洗浄を行う。

【００１０】溶出は塩濃度が０．０５Ｍから１．１Ｍで
行う。０．０５Ｍより低いと本発明の蛋白質が十分に溶
出されず１．１Ｍを越える塩濃度では他の不純物が多く
溶出される。ｐＨは特に制限はないが、ｐＨ１０を越え
ると蛋白質が変性する可能性があるので好ましくない。
好ましい溶出条件としては、ｐＨが３から８で、塩濃度
が０．３Ｍから１Ｍである。

【００１１】このようにして溶出した蛋白質は濃縮、脱
塩を行う。脱塩にはゲル濾過、脱塩用イオン交換樹脂、
限外濾過膜、ナノフィルトレーション用の膜、逆浸透
膜、電気透析法、透析膜などを用いて脱塩し、限外濾過
膜、ナノフィルトレーション用の膜、凍結乾燥あるいは
噴霧乾燥などにより濃縮、粉体とすることができる。得
られた本発明蛋白質画分は陰イオン交換樹脂によりさら
に濃縮する。陰イオン交換樹脂として、ＤＥＡＥ−トヨ
パール６５０（東ソー社）、ＤＥＡＥ−セファロース
（ファルマシア社）、ＤＥＡＥ−セファデックス（ファ
ルマシア社）、ＤＥＡＥ−セルロファイン（生化学工業
社）、ＱＡＥ−トヨパール５５０（東ソー社）、Ｑ−セ
ファロース（ファルマシア社）、ＱＡＥ−セファシル
（ＩＢＦ社）、マクロプレップＱサポート（ＢＩＯ−Ｒ
ＡＤ社）など特に制限なくどれでも使用できる。カラム
はｐＨ２．０以上の緩衝液あるいは水で平衡化する。ｐ
Ｈ２．０を下回る場合には本発明の蛋白質の吸着量が少
なくなる。使用する本発明蛋白質画分は陰イオン交換樹
脂を平衡化した緩衝液または水に溶解または置換する。
原料と樹脂は充填層型カラム、回転型カラム（特開平2-
138295号公報、特開平3- 83573号公報）及びバッチ式な
ど、一般に用いられる方法で吸着する。樹脂と原料の比
率は特に制限ないが、樹脂／原料が１／１５（Ｗ／Ｖ）
以下がコスト及び回収率の点で好ましい。樹脂と原料と
の接触温度は特に制限はないが、プロテアーゼ、微生物
汚染などの影響を考慮して、１０℃以下が好ましい。接
触時間もプロテアーゼの影響及び微生物汚染などの影響
を少なくするため、２０時間以内が好ましいが、特に制
限はない。原料を通液したのち、ｐＨ２．０以上の緩衝
液あるいは水で十分洗浄を行う。溶出は塩濃度が０．０
５Ｍから１Ｍで行う。０．０５Ｍより低いと本発明の蛋
白質が十分に溶出されず１Ｍを越えると他の不純物が多
く溶出される。ｐＨは特に制限はないが、ｐＨ１０を越
えると蛋白質が変性する可能性があるので好ましくな
い。好ましい溶出条件としては、ｐＨが４．０から９．
０で、塩濃度が０．１Ｍから０．５Ｍである。このよう
にすると、本発明の蛋白質を濃縮することができる。こ
のように濃縮または粉体とした本発明蛋白質画分は本蛋
白質濃縮物として使用できる。

【００１２】さらに精製する場合には以下の方法を用い
る。粉体の本発明蛋白質はゲル濾過カラムにより分画す
る。使用するゲル濾過用樹脂としては、バイオゲルＰ６
０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）、セファデクスＧ２００（ファ
ルマシア社）、ＴＳＫｇｅｌトヨパールＨＷ（東ソー
社）、ウルトラゲルＡｃＡ５４（ＩＢＦ社）などを使用
できるが、分子量分画範囲１ｋＤａから１，０００ｋＤ
ａの範囲であれば使用可能である。ｐＨは特に制限はな
く、樹脂の使用範囲内で使用する。好ましいｐＨ範囲は
ｐＨが２から１０である。ｐＨが２より低いと本発明の
蛋白質が変性する可能性がある。また、ｐＨ１０を越え
ると同様に変性する可能性がある。溶出緩衝液及び塩濃
度共に特に制限はない。また、有機溶媒たとえばアセト
ニトリル、ｎ−プロパノールを添加した溶液でもかまわ
ない。有機溶媒は容易に除去できるので後に本発明蛋白
質を濃縮する際に有利である。塩濃度は樹脂との非特異
的吸着を抑えるために、０．１Ｍから１Ｍで使用するこ
とが好ましい。添加する試料を溶解する溶液は特に制限
はないが、ゲル濾過カラムと同様な組成のものが好まし
い。

【００１３】細胞増殖活性あるいは本発明蛋白質に対す
る抗体を用いたイムノアッセイ法などで陽性の画分（分
子量５ｋＤａから２０ｋＤａの範囲）を分取し、上記の
方法で濃縮を行う。さらにゲル濾過により精密に分取を
行う。このためには通常のゲルろ過カラムによる分離の
他、バイオパイロット、ＦＰＬＣシステム（ファルマシ
ア社）やＨＰＬＣを用いることがよい。樹脂はスーパー
ロース１２または６（ファルマシア社）、ＴＳＫｇｅｌ
Ｇ２０００ＳＷ、ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ（東ソ
ー）などが使用でき、特にゲル濾過樹脂を限定せずどれ
でも使用可能である。以上の操作は２度以上行うことが
好ましい。これにより、不純物の多くを除去できる。得
られた本発明蛋白質画分は上記の方法で濃縮、脱塩を行
う。得られた本発明蛋白質は好ましくは粉体として、逆
層クロマトグラフィーに使用する溶液に溶解する。使用
する逆層クロマトグラフィー用の樹脂は化学結合基の結
合炭素鎖がＣ１からＣ１８のもの、フェニル基などを導
入したものなど通常の逆層クロマトグラフィー用樹脂が
使用できる。これには例えばＴＳＫｇｅｌＥｔｈｅｒ
トヨパール６５０（東ソー社）、バイオシルＯＤＳ１０
（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）、ＩｎｅｒｔｓｉｌＣ８（ＧＣ
サイエンス社）、アサヒパックＧＳ−３２０ＨＱ（昭和
電工社）、フェニルスーパーロース（ファルマシア社）
などを使用できるが特に限定するものでない。また使用
する樹脂を平衡化する溶液も広い範囲のものが使用で
き、特に限定するものではない。例えば、０．０１％〜
０．５％のトリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ヘプタ
フルオロブチル酸、０．０１Ｍ〜０．４Ｍのピリジンフ
ォルメートなどの酸を含む水溶液、または２０％以下の
アセトニトリル、ｎ−プロパノールなど、溶離液を含み
上記酸を含む水溶液、その他リン酸−リン酸ナトリウム
緩衝液（中性）などが使用可能である。また、溶離液を
添加する際には３０％以下とする。２０％を越えると本
発明蛋白質は十分にカラムに吸着せず、回収率が低下す
る。溶液には塩化ナトリウムなどの塩を添加することも
できる。溶離液としては通常用いられるアセトニトリ
ル、ｎ−プロパノールなどが使用できる。溶離液による
グラジュエント溶出または段階溶出法で得られた本発明
蛋白質は有機溶媒を除去し、脱塩濃縮を行う。通常はこ
れで９０％以上の純度の本発明蛋白質が得られる。純度
が低い場合には再度逆層クロマトグラフィーにより精製
する。以上の精製方法は精製度合いに応じて一部を削除
したり、同じ操作を繰り返したりしても良い。また一
部、手順の順序を変更してもかまわない。

【００１４】本発明の蛋白質を粗画分として濃縮する場
合には上記の方法、すなわち陽イオン交換クロマトグラ
フィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、
逆層クロマトグラフィーの一部を用いることができる。
これらに使用する樹脂は一般に市販されているもので特
に制限はない。この他にも本発明の蛋白質を濃縮する方
法として、よく用いられる有機溶媒による分別回収、硫
安等塩類による分別回収法、限外濾過膜を用いた分子量
分画法などを用いることができる。

【００１５】また、陰イオン交換樹脂あるいは陽イオン
交換樹脂を用いると効率的に濃縮画分を得ることができ
る。陰イオン交換樹脂を用いる場合には上記精製法に示
した方法と同様に行うことができる。すなわち、陰イオ
ン交換樹脂として、ＤＥＡＥ−トヨパール６５０（東ソ
ー社）、ＤＥＡＥ−セファロース（ファルマシア社）、
ＤＥＡＥ−セファデックス（ファルマシア社）、ＤＥＡ
Ｅ−セルロファイン（生化学工業社）、ＱＡＥ−トヨパ
ール５５０（東ソー社）、Ｑ−セファロース（ファルマ
シア社）、ＱＡＥ−セファシル（ＩＢＦ社）、マクロプ
レップＱサポート（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）など特に制限な
くどれでも使用できる。カラムはｐＨ２．０以上の緩衝
液あるいは水で平衡化する。ｐＨ２．０を下回る場合に
は本発明の蛋白質の吸着量が少なくなる。また、使用す
る原料のｐＨが２．０を下回る時はｐＨを２．０以上に
調製する。原料と樹脂は充填層型カラム、回転型カラム
（特開平2-138295号公報、特開平3- 83573号公報）及び
バッチ式など、一般に用いられる方法で吸着する。樹脂
と原料の比率は特に制限ないが、樹脂／原料が１／１５
（Ｗ／Ｖ）以下がコスト及び回収率の点で好ましい。樹
脂と原料との接触温度は特に制限はないが、プロテアー
ゼ、微生物汚染などの影響を考慮して、１０℃以下が好
ましい。接触時間もプロテアーゼの影響及び微生物汚染
などの影響を少なくするため、２０時間以内が好ましい
が、特に制限はない。原料を通液したのち、ｐＨ２．０
以上の緩衝液あるいは水で十分洗浄を行う。溶出は塩濃
度が０．０５Ｍから１Ｍで行う。０．０５Ｍより低いと
本発明の蛋白質が十分に溶出されず１Ｍを越えると他の
不純物が多く溶出される。ｐＨは特に制限はないが、ｐ
Ｈ１０を越えたりあるいはｐＨ２より低いと蛋白質が変
性する可能性があるので好ましくない。好ましい溶出条
件としては、ｐＨが４．０から９．０で、塩濃度が０．
１Ｍから０．５Ｍである。このようにすると、より本発
明の蛋白質を濃縮することができる。

【００１６】陽イオン交換樹脂を使用する場合は本蛋白
質の精製法で示した方法とほぼ同様に行うことができ
る。すなわち、陽イオン交換樹脂としては、ＣＭ−トヨ
パール６５０（東ソー社）、ＣＭ−セファロース（ファ
ルマシア社）、ＣＭ−セファデックス（ファルマシア
社）、ＳＰ−トヨパール５５０（東ソー社）、ＳＰ−セ
ファロース（ファルマシア社）、ＳＰ−セルロファイン
（生化学工業社）、Ｓ−セファシル（ＩＢＦ社）、マク
ロプレップＳサポート（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）、スルホン
化キトパール（富士紡績社）など特に制限なくどれでも
使用できる。カラムはｐＨ１０以下の緩衝液あるいは水
で平衡化する。ｐＨが１０を越えると本発明の蛋白質が
変性する可能性がある。原料と樹脂は充填層型カラム、
回転型カラム（特開平2-138295号公報、特開平3- 83573
号公報）及びバッチ式など一般に用いられる方法で吸着
する。樹脂と原料の比率は特に制限ないが、樹脂／原料
が１／１５（Ｗ／Ｖ）以下がコスト及び回収率の点で好
ましい。樹脂と原料との接触温度は特に制限はないが、
プロテアーゼ、微生物汚染などの影響を考慮して、１０
℃以下が好ましい。接触時間もプロテアーゼの影響およ
び微生物汚染などの影響を少なくするため、２０時間以
内が好ましいが、特に制限はない。原料を通液したの
ち、ｐＨ１０以下の緩衝液あるいは水で十分洗浄を行
う。溶出は塩濃度が０．０５Ｍから１．１Ｍで行う。
０．０５Ｍより低いと本発明の蛋白質が十分に溶出され
ず１．１Ｍを越えると他の不純物が多く溶出される。ｐ
Ｈは特に制限はないが、ｐＨ１０を越えると蛋白質が変
性する可能性があるので好ましくない。好ましい溶出条
件としては、ｐＨが３から８で、塩濃度が０．１Ｍから
０．９Ｍである。このようにすると、より本発明の蛋白
質を濃縮することができる。以上のような本発明の濃縮
物はゲル濾過、脱塩用イオン交換樹脂、限外濾過膜、ナ
ノフィルトレーション用の膜、逆浸透膜、電気透析法、
透析膜などを用いて脱塩し、凍結乾燥あるいは噴霧乾燥
などにより粉体とすることができる。これにより本濃縮
物中に１ｐｐｍ以上の本発明の蛋白質を含有させること
ができる。

【００１７】本発明の蛋白質の分子量は５％メルカプト
エタノール存在下、１０％ＳＤＳ（Ｗ／Ｖ）を含む２０
％ポリアクリルアミドゲルを用いたスラブ電気泳動によ
り、見かけ上約１３ｋＤａの分子量をもつ蛋白質である
（図１参照）。部分アミノ酸配列の決定はアプライドバ
イオシステムズ社の４７６Ａプロテインシーケンサーを
用いた。アミノ酸配列の決定は通常の方法によりＰＶＤ
Ｆ膜に本発明蛋白質を転写後、上記プロテインシーケン
サーで決定した。これにより得られたアミノ酸配列は次
のとおりであった（配列表配列番号１）。Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ａｓｐ（ただし式中、Ｘは天然に存在する２３種のアミノ酸の
うちいずれかを示す）また、本発明蛋白質はウシ乳、尿、血液及び臓器などよ
り精製されるものであるため、プロテアーゼなどで分解
されている可能性が十分考えられる。したがって、得ら
れたアミノ酸配列が必ずしもアミノ基末端にあるとは限
らずいくつかのアミノ酸が切断されている可能性があ
る。したがって、本アミノ酸配列はかならずしもアミノ
基末端にあるとは限らず、アミノ基末端以外に本アミノ
酸配列を含む蛋白質であることも考えられる。本発明で
は、アミノ基末端以外にも上記アミノ酸配列を持ち、細
胞増殖活性を示すものであれば全て本発明の蛋白質に含
まれる。

【００１８】本発明蛋白質は体重１ｋｇに対して２μｇ
／日以上投与することで腸管成熟の向上に効果が認めら
れる（実施例１４）。本発明蛋白質の投与量は２μｇ／
ｋｇ／日以上の投与を行うことが望ましい。しかし、動
物種によってこの値は変動すると思われるため、これ以
下でも投与できる場合もあると考えられる。また、投与
に際しては、その他の細胞増殖活性のある物質、たとえ
ばＥＧＦ、ＴＧＦα、ラクトフェリン、ＩＧＦ−１（イ
ンシュリン様増殖因子Ｉ）、ＮＧＦ（神経成長因子）、
ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）およびこれらの物質の分
解物などと併用することもできる。本発明蛋白質の濃縮
物は飲食品、化粧品、飼料などに添加し、使用する。ま
た本発明蛋白質の精製品は医薬品、化粧品、飲食品、飼
料、試薬などに使用する素材として使用される。これら
の本発明蛋白質を含有させた組成物は生理活性組成物と
して有用である。

【００１９】以下実施例を上げて説明をするが、これら
は本発明を制限するものではない。

【実施例１】ウシ尿５０ｌは、氷酢酸によりｐＨを３．
０になるように調整する。次に、陽イオン交換樹脂ＢＩ
Ｏ−ＲＥＸ７０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を１ｋｇ添加し、
４℃で一晩攪拌しながら接触させた。吸着後、ＢＩＯ−
ＲＥＸ７０は充填層型カラム（１０ｃｍ×１３ｃｍ）に
充填し、３０ｍＭ塩酸水溶液で十分洗浄し、１Ｍ酢酸ア
ンモニウム溶液（ｐＨ８．０）で吸着物を溶出した。得
られた溶出物は分子量分画１０００の透析膜（スペクト
ラムメディカルインダストリー社）により４℃で二
晩、脱イオン水で透析した。透析膜中の溶液を凍結乾燥
し、約１．９ｇの粉末を得た。粉末は０．５Ｍ塩化ナト
リウムを含む０．０５Ｍイミダゾール塩酸緩衝液（ｐＨ
６．０）に溶解し、同緩衝液で平衡化したバイオゲルＰ
−１０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を充填したカラム（０．８
ｃｍ×９０ｃｍ）に２ｍｌを添加した。流速は２ｍｌ／
時で行った。本クロマトグラフィーで得られた溶出パタ
ーンでは５つの主なピークが認められ、このうち細胞増
殖活性の強かった第３番目のピークを分取した。得られ
た画分は脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥した。こ
の試料は５００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸を含む
５０％アセトニトリル溶液に溶解し、０．１％トリフル
オロ酢酸を含む５０％アセトニトリル溶液で平衡化した
ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＰＷ（東ソー社）に５０μｌ添
加し、分画した。これによりさらに７ピークが得られ
た。得られたピークの中で細胞増殖活性の特に強く認め
られたピーク３および４（リテンションタイム４０〜５
０分）を分取し、再度ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＰＷによ
り精製した。細胞増殖活性の強かったピーク４（リテン
ションタイム５０分）を分取し、アセトニトリルを除去
し、凍結乾燥を行った。さらに０．２％トリフルオロ酢
酸を含む水で平衡化したＴＳＫｇｅｌＥｔｈｅｒトヨ
パール６５０（東ソー社）、凍結乾燥粉末を２００μｌ
の０．２％トリフルオロ酢酸を含む水に溶解したものを
５０μｌ添加した。得られた画分はアセトニトリルを除
去した後、凍結乾燥し、上皮細胞増殖活性の測定を行っ
た。凍結乾燥品は１００μｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）に溶解し、第３番目のピークを１μｌ培地に添加し
たところ、ネガティブコントロールの３．９倍量のチミ
ジン取り込みの増加が検出された。この画分を２０％の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（テフコ社）を用いて電気泳動を
行ったところ、分子量約１３ｋＤａにバンドが検出され
た。この他に特にバンドは認められず電気泳動的に単一
であった。本蛋白質のアミノ酸配列の決定には４７６Ａ
プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ
社）を用いた。アミノ基末端の配列は配列表配列番号１
に示されるように次の通りであった。Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ａｓｐ（Ｘは天然に存在する２３種のアミノ酸のうちのいずれ
かを示す）

【００２０】

【実施例２】ウシ初乳２０ｌを遠心分離機により脱脂し
た。次にｐＨ４．６に塩酸を用いて調整し、カゼインを
除去しウシ初乳ホエーを作製した。陽イオン交換樹脂Ｓ
Ｐ−セファロースＦＦ（ファルマシア社）を５００ｇ充
填したカラム（７×１８ｃｍ）に、ウシ初乳ホエーを流
速３０ｍｌ／分で４℃にて一晩通液した。０．１Ｍ塩化
ナトリウムを含む５０ｍＭの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ５．５）でカラムを洗浄し、０．５Ｍ塩化ナト
リウムを含む同緩衝液で吸着物を溶出した。得られた溶
出物は透析膜により４℃で二晩、脱イオン水で透析し
た。これを凍結乾燥し、約９ｇの粉末を得た。粉末は
０．０５Ｍイミダゾール塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）４０
０ｍｌに溶解し、同緩衝液で平衡化した６０ｇのＤＥＡ
Ｅ−セファロース（ファルマシア社）を充填したカラム
（４ｃｍ×６ｃｍ）に７ｍｌ／分で添加した。同緩衝液
で洗浄した後、０．６Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液
によりグラジュエント溶出を行い、０．２２Ｍに溶出し
てくる画分を分取した。得られた画分は脱イオン水に対
して透析し、凍結乾燥し、０．８ｇの粉末を得た。粉末
は６ｍｌの０．５ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解し、同緩衝液で平衡化し
たセファデックスＧ７５（ファルマシア社）を充填した
カラム（０．８ｃｍ×９０ｃｍ）に２ｍｌを添加した。
流速は３ｍｌ／時で行った。得られた本発明の蛋白質は
透析膜で脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥した。こ
の試料は１ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸を含む５０
％アセトニトリル溶液に溶解し、０．１％トリフルオロ
酢酸を含む５０％アセトニトリル溶液で平衡化したＴＳ
ＫｇｅｌＧ２０００ＰＷ（東ソー社）に５０μｌ添加
し、分画した。得られたピークのうちリテンションタイ
ムが４０〜５０分で溶出したものを分取し、再度ＴＳＫ
ｇｅｌＧ２０００ＰＷにより精製した。同様に本発明の
蛋白質を分取し、アセトニトリルを除去し、凍結乾燥を
行った。さらに０．１Ｍトリエチルアンモニウムフォス
フェートを含む水で平衡化したフェニルスーパーロース
（ファルマシア社）に凍結乾燥粉末を４００μｌの０．
１％ヘプタフルオロブチル酸を含む水に溶解したものを
５０μｌ添加した。溶離液としてｎ−プロパノールを用
い、グラジュエント溶出を行った。得られた本発明の蛋
白質はｎ−プロパノールを除去した後、凍結乾燥した。
凍結乾燥品は１００μｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
に溶解し、１μｌ培地に添加したところ、ネガティブコ
ントロールの２．５倍量のチミジン取り込みの増加が検
出された。この画分を４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ル（テフコ社）を用いて電気泳動を行ったところ、分子
量約１３ｋＤａにバンドが検出された。この他に特にバ
ンドは認められず電気泳動的に単一であった。この蛋白
質のＮ末端のアミノ酸配列を分析したところ、配列番号
１に示したアミノ酸配列と同一であった。

【００２１】

【実施例３】ウシ血清１０ｌは、陽イオン交換樹脂スル
ホン化キトパール（富士紡績社）を５００ｇ添加し、４
℃で一晩撹拌しながら接触させた。吸着後、スルホン化
キトパールは充填層型カラムに充填し、１００ｍＭ炭酸
水素ナトリウム水溶液で十分洗浄し、０．４Ｍ塩化ナト
リウムを含む同水溶液で吸着物を溶出した。得られた溶
出物は分画分子量１ｋＤａの限外濾過膜（ミリポア社）
により濃縮、脱塩後、凍結乾燥し、約１ｇの粉末を得
た。粉末は２０ｍｌの０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む
０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、
同緩衝液で平衡化したウルトラゲルＡｃＡ５４（ＩＢＦ
社）を充填したカラム（２．０ｃｍ×９０ｃｍ）に５ｍ
ｌを添加した。流速は３ｍｌ／時で行った。本クロマト
グラフィーで得られた溶出パターンでは６つの主なピー
クが認められ、このうち細胞増殖活性の強かった第４番
目のピークを分取した。得られた画分は脱イオン水に対
して透析し、凍結乾燥した。この試料は１００μｌの
０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む酢酸緩衝液（ｐＨ４．
０）に溶解し、同NaClを含む同緩衝液で平衡化したスー
パーロース１２（ファルマシア社）に５０μｌずつ添加
した。溶出した本発明蛋白質画分は分画分子量５ｋＤａ
のモルカットII（ミリポア社）で濃縮し、脱イオン水に
対して透析した後、０．３Ｍになるようにピリジンフォ
ルメートを添加した。さらに０．３Ｍピリジンフォルメ
ート水溶液で平衡化したＩｎｅｒｔｓｉｌＣ８（ＧＬ
サイエンス社）に試料を３０μｌ添加した。さらに４０
％アセトニトリル水溶液を溶離液として本発明蛋白質を
溶出した。得られた画分はアセトニトリルを除去した
後、超純水に対して透析し、凍結乾燥した。凍結乾燥品
は１００μｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、
Ｉｎｔｅｓｔｉｎ４０７を用いた細胞増殖活性測定系に
本発明蛋白質１μｌを添加したところ、ネガティブコン
トロールの１．８倍量のチミジン取り込みの増加が検出
された。この画分を２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（テ
フコ社）を用いて電気泳動を行ったところ、分子量約１
３ｋＤａにバンドが検出された。この他に特にバンドは
認められず電気泳動的に単一であった。

【００２２】

【実施例４】未殺菌チーズホエー１，０００ｌ（ｐＨ
６．１）を、脱イオン水で充分洗浄したスルホン化キト
パール（富士紡績社）２，５００ｇを充填した回転型カ
ラム（直径６５ｃｍ×長さ１２０ｃｍ）に、５℃、１．
５ｌ／分で通液した。さらに脱イオン水で十分に洗浄
後、０．２Ｍ塩化ナトリウムを溶解した脱イオン水で吸
着した蛋白質を溶出した。得られた溶液は分子量分画約
１３ｋＤａの限外濾過膜ＵＦ１０（アドバンテック社）
で濃縮、脱塩し、凍結乾燥を行った。この結果、１０５
ｇの本発明の蛋白質濃縮物を得た。イムノブロッティン
グにより検出を行った結果から、本発明蛋白質が１１ｐ
ｐｍ含有されていた。

【００２３】

【実施例５】ウシ血清１０ｌをｐＨ７．５に水酸化ナト
リウムを用いて調整し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で平衡化した２００ｇのＱ−セファロースＦ
Ｆ（ファルマシア社）を充填したカラム（５ｃｍ×１０
ｃｍ）に４℃、１５ｍｌ／分で通液した。１０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分洗浄した後、０．４
Ｍ塩化カリウムを含む同緩衝液で吸着蛋白質を溶出し
た。溶液は脱塩用イオン交換樹脂（アンバーライトＭＢ
３、オルガノ社）を用いて脱塩し、次いで凍結乾燥を行
った。得られた粉末中の本発明蛋白質の濃度は２９ｐｐ
ｍであった。

【００２４】

【実施例６】酢酸を添加しｐＨを４．５としたウシ尿
１，０００ｌに５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平
衡化した２，０００ｇのＣＭ−トヨパール６５０（東ソ
ー社）を混合し、４℃、一晩バッチ法で吸着した。樹脂
は吸引濾過により回収し、カラム（１５ｃｍ×１２ｃ
ｍ）に充填した。５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で
十分に洗浄した後、０．６Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩
衝液で蛋白質を溶出した。得られた蛋白質は分画分子量
５，０００の限外濾過膜（ミリポア社）で濃縮、脱塩
し、凍結乾燥した。これより３１ｇの凍結乾燥粉末を
得、イムノブロッティングにより、９０ｐｐｍ濃度の本
発明蛋白質を得た。

【００２５】

【実施例７】ホエー蛋白分離物（ＷＰＩ）２００ｇを４
０ｌの脱イオン水に溶解し（ｐＨ５．９) 、１０ｍＭク
エン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で平
衡化した２，０００ｇのマクロプレップＤＥＡＥサポー
ト（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を充填したカラム（１５ｃｍ×
１２ｃｍ）に４℃、４５０ｍｌ／分で通液した。１０ｍ
Ｍクエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）
で十分洗浄した後、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩
衝液で吸着蛋白質を溶出した。溶液は電気透析法を用い
て脱塩し、次いで凍結乾燥を行った。これにより２０ｇ
の粉末が得られ、粉末中の本発明蛋白質の濃度は１６ｐ
ｐｍであった。

【００２６】

【実施例８】実施例６で得られた濃縮物を精製するため
に以下の操作を行った。得られた濃縮物３０ｇを６００
ｍｌの１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）
に溶解した。この試料を１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝
液（ｐＨ５．５）で平衡化した６００ｇのＱＡＥ−トヨ
パール５５０（東ソー社）を充填したカラム（５ｃｍ×
３０ｃｍ）に４℃で流速２０ｍｌ／分で通液した。同緩
衝液で十分洗浄を行い、１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液
（ｐＨ５．５）でグラジュエント溶出を行った。イムノ
ブロッティングで反応した画分（酢酸アンモニウム濃度
が約０．３Ｍ）を分取し、限外濾過膜により濃縮５ｍｌ
まで濃縮した。次に、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．
０）で平衡化したＰ−１０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を充填
したカラム（１ｃｍ×９０ｃｍ）に２ｍｌの試料を添加
し、４℃で、流速２ｍｌ／分でゲル濾過を行った。得ら
れた溶出画分のうち、イムノブロッティングで反応の認
められた画分を脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥し
た。これにより、１００ｍｇの粉末を得た。次に０．１
％トリフルオロ酢酸を含む６０％アセトニトリル溶液１
ｍｌに粉末を溶解し、同溶液で平衡化したＴＳＫｇｅｌ
Ｇ３０００ＰＷ（東ソー社）に１００μｌ添加し、分画
した。これにより得られたピークの中でイムノブロッテ
ィングで反応の認められたメインピークを分取し、再度
ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＰＷにより精製した。イムノブ
ロッティングで反応のあるピーク（リテンションタイム
１０分）を分取し、アセトニトリルを除去し、凍結乾燥
を行った。さらに０．２５Ｍトリエチルアンモニウムフ
ォスフェートを含む超純水で平衡化したＴＳＫｇｅｌ
Ｏｃｔｙｌ−８０Ｔ（東ソー社）に凍結乾燥粉末を２０
０μｌの０．２５Ｍトリエチルアンモニウムフォスフェ
ートを含む超純水に溶解したものを５０μｌ添加した。
溶離液はｎ−プロパノールを用いた。イムノブロッティ
ングで反応が認められたピークを分取し、凍結乾燥し
た。この結果ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度９６％の本発明蛋
白質１８ｍｇが得られた。

【００２７】

【実施例９】ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３を用いた細胞増殖活性
の測定培養上皮ガン細胞株（ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３）を９
６穴の平底細胞培養プレートに分注し、０．３％ウシ血
清を含むα−ＭＥＭ（ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ社製）で１８時間培養した。なお、培養に際して
は、培地１００μｌに対し、終濃度１５０ｎｇ／ｍｌの
実施例１で調製した精製本発明蛋白質を添加した。培養
後、トリチウムでラベルしたチミジンを添加し、２時間
後に細胞に取り込まれたチミジンの放射活性を測定する
ことにより細胞増殖活性を求めた。結果を表１に示す。

【００２８】

【実施例１０】ヒト腸管上皮細胞（Ｉｎｔｅｓｔｉｎ４
０７）及びヒト表皮癌細胞（Ａ４３１）を用いて増殖活
性を実施例４に従い測定した。この結果を表１に示す。
試料は終濃度１５０ｎｇ／ｍｌの精製した本発明蛋白質
を用いて行った。

【００２９】

【表１】＊（本発明蛋白質を添加しない場合を１として相対値を
示した。）

【００３０】

【実施例１１】本発明蛋白質に対する抗体の作製雌ウサギ（白色和種）に通常の方法により免疫を行い本
発明蛋白質の抗体を作製した。すなわち、４週令のウサ
ギに２００μｇの精製蛋白質を完全アジュバントと混合
し、背部に皮下注射した。１週間後、さらに２００μｇ
を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム）に溶解し、静
脈注射を行った。この操作を４回繰り返し、この間にウ
サギ耳より４０ｍｌ採血を３回行った。最後に全採血を
行い総量１４０ｍｌの血清を得た。これをプロテインＧ
セファロース（ファルマシア社）を充填したカラムに通
液し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄後、
０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ３．５）で吸着した抗体を溶出した。得られた抗体は
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で透析し、凍結乾
燥した。この結果、２６ｍｇの本発明蛋白質に対する抗
体を得た。

【００３１】

【実施例１２】イムノブロッティングによる本発明蛋白質の検出ニトロセルロース膜（０．２μｍ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社）
に５０μｌから２００μｌの試料を添加し、ニトロセル
ロース膜に蛋白質を固定した。脱イオン水で軽く洗浄
後、１／４に希釈したブロックエース（大日本製薬社）
に２時間浸漬し、ブロッキングを行った。続いて、実施
例６で作製した本発明蛋白質に対する抗体を５μｇ／ｍ
ｌの濃度になるように１／１０希釈したブロックエース
（大日本製薬社）で調製した。溶解した抗体とニトロセ
ルロース膜を１時間室温下で反応させた。次に、０．０
１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）で１０分間３回洗浄した。さらに１／１０希釈
したブロックエース（大日本製薬社）でパーオキシダー
ゼ標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ社）を１
／１０００に希釈し、ニトロセルロース膜と室温下１時
間反応させた。０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１０分間６回洗浄した
後、コニカイムノステインＨＲＰ（コニカ社）で発色し
た。

【００３２】

【実施例１３】実施例８で得られた濃縮物２ｍｇを５０
μｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、
トリプシン（シグマ社）を２０μｇ添加されるように加
えた。３７℃、１時間反応を行った後、９０℃、１０分
間加熱処理を行い反応を停止した。これを凍結乾燥し
た。

【００３３】

【実施例１４】実施例８より得られた本発明蛋白質を用
いて生後１６日で離乳したウィスター系ラットを用いて
腸管内酵素の活性変化を検討した。一群３匹として、５
日間強制投与を行い効果を見た。Ａ群は本発明蛋白質を
投与しなかった群、Ｂ群は本発明蛋白質０．１μｇ／日
を強制投与した群、Ｃ群は本発明蛋白質を１０μｇ／日
を強制投与した群、Ｄ群は本発明蛋白質分解物（実施例
９）１０μｇ／日を投与したものを作製した。なお、こ
の試験ではカゼイン２０重量％、セルロース５重量％、
コーンスターチ１５重量％、シュークロース４５重量
％、ビタミン類１重量％、ミネラル類３．５重量％、重
酒石酸コリン０．２重量％、ＤＬ−メチオニン０．３重
量％及び大豆油１０重量％に調製した食餌を投与した。
水は自由摂取とした。酵素活性は以下のとおり測定し
た。ラット小腸を開き、粘膜をカバーガラスでかき取っ
た。これをホモジュナイズし、生理食塩水を加え、０．
５ｇ／１０ｍｌ程度になるように調製し試料とした。

【００３４】小腸粘膜の蛋白質量はプロテインアッセイ
キット（ピアス社）を用いた。酵素活性は試料５０μｌ
と基質（０．０５６Ｍシュークロース、ラクトースまた
はマルトース）５０μｌを混合し、３７℃、３０分間イ
ンキュベートした。このうち２０μｌを取り、グルコー
ス測定用キット（和光純薬社）で発色により測定した。
開始及び終了時のシュークラーゼ、マルターゼ及びラク
ターゼの酵素活性の変化を表２に示す。

【００３５】

【表２】

【００３６】以上の結果から、Ｃ群及びＤ群では小腸の
未成熟中に多く見られるラクターゼは減少し、小腸の成
熟とともに活性が増加するといわれているシュークラー
ゼおよびマルターゼの活性〔Buts J.P. et al.,Digesti
ve Diseases and Sciences.38.1091-1098.1993〕はコン
トロール群（Ａ群）よりも明らかに増加していることが
わかった。Ｄ群でも活性が認められることから、分解物
にも作用はあると考えられた。また、Ｂ群でもややＣ及
びＤ群と同様な傾向が見られるので僅かながら効果があ
ると考えられた。このことから、本発明蛋白質は腸管成
熟を促進する物質であることが示された。

【００３７】

【実施例１５】脱脂乳５９８ｇ、ホエー粉９５ｇ、実施
例４で得た本発明濃縮物１０ｇ、植物油５９ｇ、ビタミ
ン・ミネラル類２．５ｇ、ウシラクトフェリン５００ｍ
ｇ、ヒトＥＧＦ５０μｇを配合して乳児用の発育促進効
果を付与した育児用粉乳７６５ｇを製造した。

【００３８】

【実施例１６】脱脂粉乳６０ｇ、実施例７で調製した本
発明蛋白濃縮物１４ｇ、脂肪１７．２ｇ、グルコース
５．０ｇ、ビタミン・ミネラル類２．５ｇを配合して幼
若動物用の配合試料を製造した。

【００３９】

【発明の効果】本発明の蛋白質は新規な上皮細胞増殖活
性を持つ蛋白質であり、腸管の成熟など、細胞増殖作用
に関わる生理効果を提供できるものである。本蛋白質は
ウシ乳あるいは尿中より分離できるので、大量に供給が
可能であり、医薬品、飲食品、飼料、化粧品などに使用
できる。

【００４０】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【図面の簡単な説明】

【図１】ポリアルクリルアミドゲル電気泳動による本発
明の蛋白質のパターンを示す。

【符号の説明】

レーン１：マーカーレーン２：本発明の蛋白質

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞増殖活性を示し、次の性質を示す蛋
白質； 1)Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ａｓｐ（Ｘは天然に存在する２３種のアミノ酸のうちのいずれ
かを示す）で示されるアミノ酸配列をその分子内に有す
る。 2)５％メルカプトエタノールで還元し、１０％ＳＤＳ
（Ｗ／Ｖ）存在下で、２０％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行った際のみかけの分子量が約１３ｋＤａであ
る。
【請求項２】細胞増殖活性が上皮細胞増殖活性、線維
芽細胞増殖活性または表皮細胞増殖活性である請求項１
記載の蛋白質。
【請求項３】Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙ
ｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ａｓｐ（Ｘは天然に存在する２３種のアミノ酸のうちのいずれ
かを示す）で示されるアミノ酸配列がＮ末端に存在する
請求項１記載の蛋白質。
【請求項４】ウシの尿、乳、血液あるいは臓器由来の
請求項１記載の蛋白質。
【請求項５】請求項１記載の蛋白質を含有する材料を
ｐＨ１０以下で陽イオン交換樹脂に吸着させ、塩濃度
０．０５〜１．１Ｍの溶出液で溶出させ、細胞増殖活性
を示す画分を採取することを特徴とする請求項１記載の
細胞増殖活性を示す蛋白質の製造法。
【請求項６】請求項１記載の蛋白質を含有する材料を
ｐＨ２〜１０で陰イオン交換樹脂に吸着させ、塩濃度
０．０５〜１Ｍの溶出液で溶出させ、細胞増殖活性を示
す画分を採取することを特徴とする請求項１記載の細胞
増殖活性を示す蛋白質の製造法。
【請求項７】請求項１記載の細胞増殖活性を示す蛋白
質を含む生理活性組成物。