KR100846011B1

KR100846011B1 - 우유에서 유도된 뼈 건강 조성물

Info

Publication number: KR100846011B1
Application number: KR1020037004843A
Authority: KR
Inventors: 이안 레지널드 라이드; 질 코니시; 닐 워드 해거티; 케이 퍼트리샤 팔마노
Original assignee: 뉴질랜드 대어리 보오드
Priority date: 2000-10-05
Filing date: 2001-09-27
Publication date: 2008-07-11
Also published as: MY132120A; EP1328286A4; KR20030046484A; DK1328286T3; EP1328286B1; JP2004510742A; TWI271154B; CN1468108A; BR0114471A; HK1053057A1; EP1328286A1; ATE460171T1; AR032897A1; US20090124551A1; DK1328286T4; DE60141526D1; AU9038801A; HUP0302304A3; HK1053057B; US20040052860A1

Abstract

본 발명은 우유의 산성 단백질 분획물을 포함하는 뼈 건강 조성물, 상기 뼈 건강 조성물의 제조방법, 상기 뼈 건강 조성물을 포함하는 치료방법과, 상기 뼈 건강 조성물의 의학적 용도에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 광의의 측면은 우유에서, 우유의 성분에서, 유장에서, 이의 가수분해물에서 또는 이의 배합물에서 얻어진 산성 단백질 분획물을 포함하는 뼈 건강 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 카제이노글리코마크로펩티트(CGMP)를 포함하지 않으며, 다른 광의의 측면은 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 본 발명의 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.

Description

우유에서 유도된 뼈 건강 조성물{BONE HEALTH COMPOSITIONS DERIVED FROM MILK}

본 발명은 우유의 산성 단백질 분획물(fraction)로부터 얻어지는 뼈 건강 조성물, 특히 유장(whey)의 산성 단백질 분획물로부터 얻어지는 뼈 건강 조성물, 상기 뼈 건강 조성물의 제조 방법, 상기 뼈 건강 조성물을 포함하는 치료 방법, 및 상기 뼈 건강 조성물의 의약적 용도에 관한 것이다.

뼈 생리학 및 질환

가장 빈번하게 발생되어 타격이 큰 뼈질환 중 하나는 골다공증으로, 뼈가 점차적으로 가늘어져서 약해지는 것을 특징으로 한다. 골다공증이 치료되지 않은채 지속되면, 외상이 거의 없으면서 뼈가 파손 또는 골절되기 쉽다.

뼈 손실의 과정이 30대 중반에서 후반에 점차적으로 시작되지만, 환자가 뼈의 손상을 알게 되기까지는 많은 세월이 소요될 정도로 매우 느리다. 보통 여성들이 남성보다 골다공증이 발병할 위험이 크다. 이는 폐경이후에 여성들은 에스트로겐의 생성감소로 인해 골격에서 뼈가 급속히 손실되기 때문이다.

사람이 40대가 되기까지는, 파골세포(osteoclast)와 골모세포(osteoblast)에 의해 각각 뼈를 파괴(흡수)하고 생성(재형성)시키는 과정이 한 단계가 다른 단계를 자극하면서, 거의 완벽하게 결합된 시스템이다. 뼈는 뼈 세포(골세포)가 산재된 세포외 단백질 기질(대부분 교원섬유)을 포함하며 무기질 성분은 나트륨, 마그네슘 및 플루오르화물을 포함하는 다른 무기물과 칼슘염으로 구성된 것 위에 있다. 파골세포는 특정 위치에서 뼈를 흡수한 후, 계획된 세포사를 겪는다. 골모세포는 단백질 기질(유골)을 복귀시키며, 이의 리미네랄화(remineralisation)를 매개한다. 리미네랄화동안, 골모세포는 석회물질내에 싸여지며, 뼈의 구조를 유지하는데 도움을 주는 세포인 골세포가 된다. 파골세포와 골모세포에 의해 매개된 뼈의 전환은 평생동안 발생하며, "리모델링(remodelling)"이라고 알려져 있다. 에스트로겐 결핍은 파골세포의 계획된 세포사 또는 세포사멸(apoptosis)을 지연시켜서 유효 뼈 손실(net bone loss)을 야기하는 것으로 사료되고 있다.

사람이 노화됨에 따라, 리모델링 시스템은 파괴되며, 2개의 과정(흡수 및 재형성)은 비(非)동조화된다. 이에 대한 이유는 밝혀지지 않고 있다. 일부는 뼈의 매우 높은 전환속도를 가지고; 일부는 매우 점진적으로 전환되지만, 뼈의 파괴가 결국에는 생성을 추월하게 된다. 뼈를 재형성하고 흡수하는 패턴은 환자에 따라 매우 다양하기 때문에, 전문가들은 이 문제를 설명하는데 수 많은 다른 요인들이 있다고 믿고 있다. 세포성장에 영향을 미치는 에스트로겐, 부갑상선 호르몬, 비타민 D 및 혈액인자들과 같은 중요한 호르몬들이 상기 과정에 관여된다. 상기 인자들 중 어느 하나의 수준 변화는 골다공증을 발전시키는 역할을 한다.

폐경후 여성은 천연 에스트로겐 수준이 감소되는데 대해 보충하기 위해 호르몬대체요법(HRT)을 종종 받는다. HRT는 환자가 골다공증 골절을 야기할 수 있는 뼈 손실의 임계수준에 도달되기 전에는 보통 처방되지 않는다.

칼슘은 뼈의 필수성분이기 때문에, 음식 또는 보충제로 적당하게 칼슘을 섭취하도록 해야할 필요가 있다고 믿고있다. 비타민 D 없이는 뼈에 칼슘이 혼입될 수 없으므로 적당한 비타민 D 섭취도 또한 필요하다.

우유 및 우유 단백질

우유는 양질의 단백질 공급원인 동시에, 종종 칼슘과 비타민 D의 주요 식이성 공급원이다. 우유 단백질과 이것이 뼈 질환에 미치는 효과는 많은 연구의 대상이 되어왔다. 우유에서 발견되는 단백질은 면역글로불린, 성장인자, 소혈청 알부민(BSA), α-락트알부민, β-락토글로불린 및 다량의 카제인을 포함하며, 이는 모두 인단백질이다. 카제인을 제외한 상기 단백질들은 또한 유장내에도 존재한다. 우유는 뼈 리모델링에 직접 관여되는 단백질과 분열촉진 단백질을 다양하게 함유하고 있는 것으로 알려져 있다.

카제이노글리코마크로펩티드(Caseinoglycomacropeptide, CGMP)는 치즈제조방법중 (키모신 작용을 통한) 렌넷-매개 카제인 응고단계중에 카파-카제인으로부터 분비된 펩티드이며, 스위트 유장(Sweet Whey) 또는 치즈 유장(cheese whey)으로 알려져 있는 유장 분획물에서 발견된다. CGMP는 때때로 GMP(글리코마크로펩티드)라고 간단하게 언급한다. 치즈 유장 단백질은 15% 내지 20%의 CGMP로 구성되어 있다. CGMP는 WO 00/49885에 개시된 바와 같이, 우유의 뼈 건강 촉진성분중 하나로서 제시되어 왔다(이하에 논의됨).

락트산 유장은 카제네이트 또는 코티지 및 리코타 치즈를 제조하는 동안 락트산 세균에 의한 발효 또는 락트산의 직접 첨가에 의해 생성된다. 무기산 유장은 카제네이트 제조동안 무기산을 첨가하여 생성된다. 락트산 유장과 무기산 유장은 CGMP를 함유하지 않는다. 상기 두 과정의 기본은 pH를 약 4.6으로 낮추어서 키모신의 작용에 의한 침전과는 반대로 카제인을 침전시킨다.

그러므로, 키모신에 노출되지 않은 우유 생성물은 CGMP를 함유하지 않을 것이다.

성장인자(IGF-인슐린유사 성장인자, TGF-전환성장인자 등), 면역글로불린, BSA 및 일부 β-락토글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 우유 또는 유장에서 회수된다. 일부 성장인자들은 중성단백질로서 회수된다. CGMP는 음이온 교환에 의해 회수될 수 있는 산성 단백질 분획물이다.

오스테오폰틴(Osteopontin, OPN)은 모든 체액(우유 포함) 및 무기질 조직의 세포외 기질내에서 발견되는 포스포릴화 및 글리코실화 단백질이다. 뼈속에 보다 풍부한 비(非)교원성 단백질중 하나인 OPN은 무기질 조직내 세포-기질 및 기질-기질 계면에 위치되어 있으며, 여기에서 파골세포 작용의 결과로서 부착된다. OPN은 노출된 뼈 표면을 보호하거나 또는 이후의 세포-기질 상호작용을 위해 작용한다. OPN은 옵소닌으로서 작용하여 대식구 부착 및 특정 무기조직편의 식작용을 용이하게 하는 것으로 제시되고 있다. OPN은 트랜스글루타미나아제에 의해 가교될 수 있으며, 타입 Ⅰ 콜라겐, 파이브로넥틴 및 오스테오칼신을 포함하는 여러 세포외 분자들에 결합할 수 있다. 이는 세포외 기질에 대한 물리적 세기를 부가하는 것으로 기대된다. OPN은 뼈 기질에 뼈 세포가 부착되는 것을 촉진시키는 것으로 밝혀지고 있다. OPN은 비교적 고농도로 척추동물 혈청내에 존재하며, 따라서 포유동물 우유에서도 또한 분비된다. [Denhardt, D.T. and Noda, M., Osteopontin expression and function: Role in bone remodelling, J. Cell Biochem. Suppl. 30/31:92-102(1998)].

종래 기술

종래 공개된 특허의 대다수는 양이온 교환을 사용하여 수득되는, 염기성 단백질의 뼈성장 작용에 중심을 두어왔다.

뉴질랜드 특허 제503608호에는 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 우유 또는 가열된 유장으로부터 뼈 흡수방지제(bone anti-resorption agent)를 제조하는 방법이 개시되어 있다. 시스타틴(Cystatin) 또는 시스타틴의 효소가수분해 생성물은 뼈 흡수를 억제하는데 유효한 것으로 알려져 있다. 뼈, 뼈와 관절 및 치주질환은 시스타틴 또는 이의 가수분해생성물이 존재하는 공급물, 식품 또는 음료수를 섭취함으로써 예방(또는 치료)될 수 있다.

뉴질랜드 특허 제282898호에는 우유, 탈지우유, 치즈유장, 환원 유장, WPC, WPI, 분유, 유장 분말 또는 초유로부터 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제시킨 소 IGF-1 유사 성장인자가 개시되어 있다. 상기 물질들은 양이온 교환 단계이전에 가열되는 것이 바람직하다. 결합은 단백질 대 양이온 교환제의 규정된 비율로 사용하여 4 ℃ 내지 40 ℃의 온도에서 실시된다. 제조물의 성장촉진효과는 배양된 골모세포유사 세포(MC3T3-E1 세포)에서 입증되었다. 뼈 및 관절 질환, 특히 골다공증을 예방 또는 치료하는데 유용한 조성물이 청구되어 있다. 성장단계중에 사람에게 투여된다면, 이의 피크(peak) 뼈 질량이 증가된다. 원료로서, 청구된 물질은 음료수, 식품의약품 및 동물 사료에 첨가되어 사용가능하다.

유럽특허 제EP 0787499호(일본특허 제8045566호의 대응특허)에는 소혈장 및 우유에서 발견되는 키니노겐이 뼈 형성을 촉진하고, 뼈 흡수를 억제한다는 것이 개시되어 있다. 전체 키니노겐, 키니노겐의 분획물 1.2 및 키니노겐의 효소분해생성물[분자량범위 0.1~70 kDa(킬로달톤)]은 모두 활성인 것으로 청구되어 있다. 상기 특허문헌에는 생성물 군이 음료, 식품, 의약품 및 사료에 사용되는 것이 개시되어 있다. 약염기성 양이온 교환제가 키니노겐을 제조하기 위해 사용된다.

뉴질랜드 특허 제314286호에는 고 운동성 그룹(HMG) 단백질과 암포테린(amphoterin)의 N-말단 서열 또는 뼈-성장 촉진제 및 뼈 흡수 억제제로서의 이의 분해생성물이 개시되어 있다. 활성인 분해생성물은 0.1~20 kDa의 분자량을 가진다. 청구된 제조물은 칼슘이 포함된 식품, 음료, 의약품 또는 사료의 성분으로서 사용될 수 있다. 기타 체액에서 회수된 HMG 단백질 및 암포테리신은 또한 유사하게 작용한다. 실시예에서, 우유의 HMG 단백질은 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리되며, 그후 S-세파로스 및 모노-Q 컬럼(Mono Q-column)상에서 정제된다.

뉴질랜드 특허 제246211호에는 산성화 유장을 에탄올로 침전시켜 수득되는 유장으로부터 얻어지며, 5~28 kDa의 분자량을 갖는 골모세포 성장/뼈 개선인자가 개시되어 있다. 활성제는 에탄올-침전된 분획물의 물 추출물로서 회수된다. 대안적으로, 가열된 유장이 30 kDa 막을 통해 한외여과되는 경우 투과물에서 같은 인자가 회수될 수 있다. 제조물의 등전점은 4 내지 9이다. 음이온 교환 크로마토그래피는 사용되지 않는다.

뉴질랜드 특허 제314097호에는 2 kDa 내지 24 kDa의 분자량, 7.5~11.0의 등전점을 가지며, 골모세포 증식효과, 뼈 강화효과 및 뼈 흡수 억제효과를 갖는 우유로부터 유도되는 단백질이 개시되어 있다. 활성 단백질은 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 회수되며, 0.1M 내지 1.0M 염에 의해 용리된다. 상기 제조물을 함유하는 식품, 음료, 의약품 및 사료도 또한 청구되어 있다.

뉴질랜드 특허 제301362호(일본특허초록 JP207508의 대응특허)에는 파골세포 억제 단백질, 그를 코딩하는 DNA 및 DNA의 발현방법이 개시되어 있다. 상기 단백질은 환원조건하에 60 kDa이고, 비(非)환원 조건하에 60~120 kDa이다. 상기 단백질은 양이온 교환에 의해, 또는 헤파린 컬럼에 결합시킴에 의해 정제될 수 있다. 상기 단백질의 생물학적 활성은 56 ℃에서 10분간 가열함으로써 감소된다.

유럽특허 제EP704218호에는 염기성 우유계 단백질 분획물 및 우유계 염기성 펩티드 분획물의 제조가 개시되어 있다. 이는 우유 또는 유장의 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 수득된다. 두 생성물과 이의 가수분해물은 경구투여될때 뼈 성장을 촉진시키고, 파골세포의 흡수를 억제한다. 식품 또는 음료로서도 존재할 수 있다. 개시된 조성물은 골다공증과 같은 다양한 뼈 질환들을 치료 또는 예방하는데 사용가능한 것으로 청구되어 있다.

PCT 특허 WO 00/49885에는 우유 단백질 가수분해물을 포함하며, 뼈 또는 치주 질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물이 개시되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 우유 단백질 가수분해물은 카제인의 가수분해물, 특히 카제이노글리코마크로펩티드(CGMP), 뼈 흡수 또는 뼈 손실을 억제; 또는 칼슘 흡수, 보유 또는 석회화를 촉진; 또는 이들을 조합할 수 있는 CGMP의 능력을 보유하는 생체유용한 형태의 이의 유사물, 동종물 또는 단편이다. 상기 조성물은 농축 및 약한 음이온 크로마토그래피에 의해 스위트 유장에서 제조된다.

Bayless외 다수의 [Isolation and biological properties of osteopontin from bovine milk, Protein Expression and Purification 9(3):309-314(1997)]에는 4℃에서 밤새 혼합된 DEAE-Sephacel(중성 우유 pH 6.6)를 사용하여 탈지원유내에 존재하는 오스테오폰틴을 정제하는 방법이 개시되어 있다. 결합되지않은 분획물이 제거되고, 다른 결합된 단백질들이 0.25M NaCl 세척에 의해 제거되었다. 오스테오폰틴 함유 분획물을 0.3M 용리액에 의해 회수하였다. 오스테오폰틴 함유 분획물을 모으고, 4M 염으로 제조하고, 그후 페닐 세파로스 컬럼위에서 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 정제하였다(2회). 탈지원유로부터 분리하는 것은 상업용으로 허용되지 않으며, 풍부한 생성물 스트림이 아니라 고도로 정제된 시료에 초점을 둔다.

Takada 외 다수의 [Milk whey protein enhances the bone breaking force in ovariectomised rats, Nutrition Research 17, 1709-1720(1997)]에 의한 초기 연구에서 뼈 강화 성분이 유장내에 존재한다는 것이 개시되어 있다. 유효성분들은 열안정성이며, 유장의 저분자량으로 30~70% 에탄올-침전가능한 부분에 존재한다. 유장의 분획화는 실시되지 않았다.

Yun S. S. 외 다수의 [Isolation of mitogenic glycophosphopeptides from cheese whey-protein concentrate, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 60(3): 429-433(1996)]에는 인덱스로서 설균목 비장세포(splenocyte)내 분열촉진 활성을 사용하여 치즈 유장 단백질 농축물(CWPC)의 면역학적 기능이 연구되었다. CWPC의 겔 여과 및 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리된 분획물은 높은 분열촉진활성을 나타내었다. 상기 연구 결과로부터 치즈 유장이 강한 분열촉진 활성을 갖는 글리코포스포펩티드(GPP)를 함유한다는 것이 입증되었다.

Sorensen E. S. 외 다수의 [Purification and characterization of 3 proteins isolated from the proteose peptone fraction of bovine-milk, Journal of Dairy Research, 60(2): 189-197(1993)]에서는 소 우유의 프로테오스 펩톤으로부터 3개의 주요 단백질이 분리되었다. 이는 우레아의 존재하에, Sephadex G-75 겔 크로마토그래피, Q-Sepharose 이온-교환 및 추가의 Sephadex G-75 겔 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 구배 SDS-PAGE에서 그들의 이동성으로부터, 단백질이 17 kDa, 28 kDa 및 60 kDa의 분자량을 가진다는 것이 밝혀졌다. 17 kDa 단백질의 N-말단 아미노산 서열은 낙타의 유장 단백질과 상동인 것으로 밝혀졌다. 상기 단백질은 소 우유에서 예전에는 알려져 있지 않았다. SDS-PAGE 결과에서, 28 kDa 단백질은 전체의 약 25%를 차지하는, 주요 단백질인 프로테오스 펩톤인 것으로 판단되었다. N-말단 아미노산 서열은 공지된 단백질 서열과 상동성을 나타내지 않았지만, 아미노산 조성물은 28 kDa 단백질이 소 우유의 프로테오스 펩톤 분획물 또는 이의 일부로부터 PP3 성분과 동일한 것을 나타내었다. 60 kDa 단백질은 세포부착을 매개하는 Arg-Gly-Asp 서열을 갖는 매우 고도로 포스포릴화된 단백질인 소 오스테오폰틴인 것으로 밝혀졌다.

과학 문헌 및 특허공보에서는 우유(또는 유장)의 산성 분획물이 뼈 흡수방지제의 (가능한) 공급원으로 제공된다는 것이 개시되어 있지 않았다.

발명의 목적

따라서, 본 발명의 다른 측면의 목적은 우유의 산성 단백질 분획물, 특히 유장의 산성 단백질 분획물로부터 얻어진 뼈 건강 조성물; 상기 조성물의 제조 방법; 상기 조성물을 포함하는 치료 방법; 상기 조성물의 의약적 용도; 및/또는 대중에게 유용하게 선택할 수 있는 선택권을 적어도 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명의 한 측면에 따라, 유효 뼈 손실을 감소시키는데 적당한 뼈 건강 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 우유의 산성 단백질 분획물, 우유의 산성 단백질 분획물의 가수분해물 또는 이의 배합물을 포함하지만, 카제이노글리코마크로펩티드(CGMP)를 함유하지 않는다.

본 발명의 두번째 측면에 따라, 유효 뼈 손실을 감소시키는데 적당한 뼈 건강 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 우유 성분으로부터 얻어진 산성 단백질 분획물, 우유 성분으로부터 얻어진 산성 단백질 분획물의 가수분해물 또는 이의 배합물을 포함하지만, 카제이노글리코마크로펩티드(CGMP)를 함유하지 않는다.

본 발명의 세번째 측면에 따라, 유효 뼈 손실을 감소시키는데 적당한 뼈 건강 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 유장의 산성 단백질 분획물, 유장의 산성 단백질 분획물의 가수분해물 또는 이의 배합물을 포함하지만, 카제이노글리코마크로펩티드(CGMP)를 함유하지 않는다.

본 발명의 조성물은 바람직하게 음이온 교환 크로마토그래피, 보다 바람직하게는 강한 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 제조된다.

본 발명의 조성물은 바람직하게 70 중량% 이상의 단백질을 포함하며, 이중에 80 중량% 이상, 바람직하게 90 중량% 이상은 오스테오폰틴 및 프로테오스 펩톤을 포함한다. 바람직하게, 프로테오스 펩톤은 플라스민의 작용에 의해 카제인으로부터 발생된 펩티드를 포함하며, 비(非)카제인 프로테오스 펩톤 3(PP3) 뿐만아니라 프로테오스 펩톤 5(PP5), 프로테오스 펩톤 8-슬로우(PP8-slow), 프로테오스 펩톤 8-패스트(PP8-fast)를 포함하는 그룹에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 단백질을 포함한다.

바람직하게, 본 발명의 조성물내 단백질의 분자량 분포는 SDS-PAGE에 의해 측정하여 3,000 내지 65,000이다.

바람직하게, 본 발명의 조성물 중의 시알산 함량은 0.8% 내지 6.5%이다. 바람직하게, 본 발명의 조성물 중의 포스페이트 함량은 0.5% 내지 3%이다.

바람직하게, 본 발명의 조성물은 재조합 또는 생 전지우유, 재조합 또는 생 탈지우유, 환원 전지분유 또는 탈지분유, 초유, 우유 단백질 농축물(MPC), 우유 단백질 분리물(MPI), 유장 단백질 분리물(WPI), 유장 단백질 농축물(WPC), 유장, 환원 유장 분말을 포함하는 그룹에서 선택되는 하나 이상의 공급원료로부터 얻어지거나, 또는 우유 가공 스트림에서 얻어지거나, 또는 상기 하나 이상의 공급원료를 한외여과 및/또는 미세여과하여 수득된 투과물에서 수득된다. 바람직하게, 상기 공급원료는 소 및 다른 낙농 공급원[예를 들어, 염소 또는 양 또는 다른 우유-분비 포유동물(milk producing mammal)]중 하나 또는 배합물로부터 수득된다. 적당한 가공 스트림의 예는 락트알부민(Lactalbumin, 상표명) 또는 TMP(상표명)(전체 우유 단백질) 분리물을 제조하는 동안 제조된 것을 포함한다. 보다 바람직하게, 본 발명의 조성물은 락트산 유장 또는 무기산 유장으로부터 얻어진다. 유장을 상업적으로 제조하기 위한 적당한 방법은 J G Zadow(Ed) "Whey and Lactose Processing"(Elsevier Applied Science, London and New York, 1992) 및 T Sienkiewicz and C Riedel(Eds) "Whey and whey utilisation"(Verlag, 독일, 1990)에 기술되어 있다.

바람직하게, 본 발명의 조성물은 생리적으로 허용가능한 양의 칼슘, 마그네슘, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K2 및/또는 아연을 추가로 포함한다.

본 발명의 네번째 측면에 따라, 하기의 단계들을 포함하는 뼈 건강 조성물의 제조 방법을 제공한다:

(a) CGMP를 포함하지 않으며, 재조합 또는 생 전지우유, 재조합 또는 생 탈지우유, 환원 전지분유 또는 탈지분유, 초유, 우유 단백질 농축물(MPC), 우유 단백질 분리물(MPI), 유장 단백질 분리물(WPI), 유장 단백질 농축물(WPC), 유장, 환원 유장 분말을 포함하는 그룹에서 선택된 하나 이상의 공급원료로부터 얻어지거나, 또는 우유 가공 스트림에서 얻어지거나, 또는 상기 하나 이상의 공급원료를 한외여과 및/또는 미세여과하여 수득된 투과물에서 얻어지는 수용액을 준비하는 단계;

삭제

(b) 약 pH 3 내지 약 pH 4.9에서 상기 수용액을 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계;

(c) 상기 음이온 교환 매질을 세척하는 단계; 및

(d) 상기 음이온 교환 매질로부터 유장의 산성 단백질 분획물을 용리시키는 단계.

바람직하게, 상기 공급원료(들)는 소 및 다른 낙농 공급원(예를 들어, 염소 또는 양 또는 다른 우유-분비 포유동물)중 하나 또는 배합물로부터 수득된다.

바람직하게, 단계(a)에서 준비된 수용액은 락트산 유장 또는 무기산 유장이다. 바람직하게, 단계(a)에서 준비된 수용액은 락트산 유장 또는 무기산 유장으로부터 얻어진다. 바람직하게, 단계(a)에서 준비된 수용액은 유장의 산성 단백질 분획물의 가수분해물을 포함한다.

바람직하게, 음이온 교환 크로마토그래피는 강한 음이온 교환 크로마토그래피이다. 바람직하게, 단계(b)는 약 pH 4 내지 약 pH 4.7, 또는 보다 바람직하게 pH 4.5에서 실시된다. 사용가능한 음이온 교환제의 통상적인 예로는 거대 다공질 친수성 아가로스계 음이온 교환제, 가령 Q-세파로스(Sepharose), Q-세파로스, 패스트 플로우(Fast Flow), Q-세파로스 빅 비드(Big Beads) 및 Q-세파덱스(Sephadex)가 있다. 대안적으로, 셀룰로스계 거대 다공질 집코셀(Gibcocel) QA 음이온 교환제와 와트만(Whatman) QA 셀룰로스(Cellulose)가 사용될 수 있다. 또한 사용가능한 다른 음이온 교환제로는 폴리스티렌계 마크로펩(Macropep) Q 및 디아이온(Diaion) 음이온 교환제가 있다.

바람직하게, 단계(c)는 매질을 세척하기 위해 탈염수를 사용하는 단계를 포함한다.

바람직하게, 단계(d)는 NaCl 또는 KCl 또는 이의 혼합물을 사용하여 실시된다. 바람직하게 단계(d)는 1M NaCl을 사용하여 실시된다. 바람직하게 단계(d)는 산을 사용하여 실시된다. 바람직하게, 단계(d)는 다른 pH를 갖는 둘 이상의 용리액을 사용하여 실시된다. 바람직하게, 단계(d)는 5.0 내지 9.0의 pH 및 1.0M 이하의 염 농도를 갖는 용리액을 사용하여 실시된다.

바람직한 형태에서, 본 발명의 방법은 단계(a)전에 단계 또는 단계들을 추가로 포함하며, 여기서 상기 추가의 단계 또는 단계들은 열처리법(thermisation), 저온살균법, 지방제거를 위한 원심분리법, 수용액을 농축하기위한 한외여과법 및/또는 미세여과법, 또는 역삼투법, 전기투석 또는 상기 제조물을 탈염화하기위한 이온교환 크로마토그래피법을 포함하는 그룹에서 선택되는 하나 이상의 단계들을 포함한다.

본 발명의 4번째 측면의 방법에 의해서 제조되는 조성물은 또한 칼슘, 마그네슘, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K₂ 및/또는 아연을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 뼈 건강 조성물 및 본 발명의 방법에 의해서 제조된 것은 식이성 보충물, 식품 또는 음료로 첨가되거나 또는 식이성 보충물, 식품 첨가제 또는 음료 첨가제로서 제공될 수 있다.

본 발명의 추가적인 바람직한 실시양태는 본 발명의 뼈 건강 조성물과 본 발명의 방법에 의해서 제조되는 것을 포함하는 식이성 보충물, 기능성 식품(nutraceutical), 식품 첨가제 또는 음료 첨가제를 포함한다.

본 발명의 추가적인 바람직한 실시양태는 본 발명의 뼈 건강 조성물과 본 발명의 방법에 의해서 제조된 것을 포함하며 우유, 분유 및 분유계 제제를 포함하는 무기질 보충제, 강화 쥬스제품, 시리얼 또는 과자 바아 및 이들을 사용하는 제품, UHT 및 저온살균된 우유, 요구르트, 발효유 및 직접 산성화 우유를 포함한다.

본 발명의 크게 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 뼈 건강 조성물 및 본 발명의 방법에 의해서 제조된 조성물은 오스테오폰틴, 뼈 시알로프로테인, 프로테오스 펩톤 3, 프로테오스 펩톤 5, 프로테오스 펩톤 8, 시알화 및 포스포릴화 단백질 및 이로부터 수득된 펩티드와, 알파-s1-카제인 포스포펩티드를 포함하는 그룹에서 선택된 하나 이상의 조성물을 포함한다.

바람직하게, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 방법에 의해서 제조된 조성물은 유익한 뼈 건강 특성을 나타내는 상기 단백질 분획물내에 특정의 펩티드 또는 펩티드 분획물을 포함한다.

본 발명의 다섯번째 측면에 따르면, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 방법에 의해서 제조된 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 뼈 건강을 유지 또는 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 여섯번째 측면에 따르면, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 방법에 의해서 제조된 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 유효 뼈 손실을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일곱번째 측면에 따르면, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 방법에 의해서 제조된 조성물을 뼈 건강을 유지 또는 향상시키는 제제의 제조에 사용되는 조성물의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 여덟번째 측면에 따르면, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 방법에 의해서 제조된 조성물을 유효 뼈 손실을 치료 또는 예방하기위한 제제의 제조에 사용되는 조성물의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명은 본 출원의 명세서에 언급되거나 또는 지시된 일부, 요소 및 특징이 개별적으로 또는 집합적으로 넓게 구성되어 있으며, 상기 일부, 요소 또는 특징들 중의 하나 또는 둘이상의 모든 조합이 포함되며, 특정 완전체는 본 발명이 관련된 당분야의 공지된 균등물을 여기서 언급하는 것이며, 가령 공지된 균등물은 개별적으로 이후에 통합될 것이다.

본 발명은 상기에 기술되어 있으며, 하기에 제공되는 실시예의 구성을 가정한다.

도 1은 실시예 1에서 무기산 유장에서 얻어진 산성 유장 단백질 분획물의 HPLC 모노 Q 분석을 나타낸다.

도 2는 실시예 2에서 락트산 유장에서 얻어지는 산성 유장 단백질 분획물의 HPLC 모노 Q 분석을 나타낸다.

도 3은 실시예 3에서 배양시 마우스(mouse)의 머리덮개뼈(두개골의 천장) 세포에 있어서 산성 유장 단백질 분획물의 흡수방지 효과를 나타낸다.

도 4는 실시예 4에서 생체내 공급 실험에서 쥐(rat)의 다른 그룹에서 대퇴골 및 척추의 뼈의 무기질 밀도를 비교한다.

본 출원인은 우유, 우유의 성분, 특히 유장의 산성 단백질 분획물이 유효 뼈 손실을 감소 또는 예방할 수 있다는 사실을 발견하였다.

상기 "산성 단백질 분획물(acidic protein fraction)"은 4.9 이하의 등전점을 갖는 단백질을 포함하는 우유 단백질의 분획물을 의미하는 것이다.

본 발명의 산성 단백질 분획물은 소량의 다수의 산성 유장 단백질을 함유하는 것이다. 상기는 오스테오폰틴, 프로테오스 펩톤 3, 프로테오스 펩톤 5(PP5)(또는 β-카제인-5P(fl-105) 또는 β-카제인-5P(fl-107)로 공지됨), 프로테오스 펩톤 8-슬로우(PP8-slow)(또한 β-카제인-1P(f29-105) 또는 β-카제인-1P(f29-107)로 공지됨), 시알화 및 포스포릴화 단백질, 알파-s1-카제인 포스포펩티드와, 자연 단백질 가수분해에 의해서 상기 단백질에서 얻어진 펩티드들의 혼합물을 포함한다. 매우 소량의 락토실레이트 알파 및 베타-락토글로불린, 소의 혈청 알부민 및 면역글로불린이 또한 존재한다.

상기 산성 단백질 분획물은 자연적으로 발생되는 우유 프로테아제 플라스민의 가수분해작용에 의해서 생성되는 단백질로부터 얻어진 펩티드들을 포함하는 것을 볼 수 있다. 락트산 유장에서 회수된 산성 단백질 분획물의 특정 경우에, 플라스민에 의해서 뿐만아니라 락트산 박테리아 프로테아제의 작용에 의해서 자연적으로 생성되는 넓은 범위의 펩티드가 있다.

뼈에서 폐경효과를 나타내는 동물 모델[난소절제된(ovariectomised) 쥐-OVX 쥐]을 사용하여, 본 발명의 산성 단백질 분획물은 폐경후에 통상 나타나는 뼈의 흡수를 저해하여 골다공증과 같은 질환을 일으키는 것이 발견되었다. 그러므로 본 발명의 산성 단백질 분획물은 골다공증 및 뼈관절염과 같은 질환을 치료 또는 예방하는 수단으로서 유용하다.

본 발명의 산성 단백질 분획물은 0.8% 내지 6.5% 범위의 전체 시알산 함량 및 0.5% 내지 3%의 포스페이트 함량을 갖는다.

상기 산성 단백질 분획물은 3000달톤(가수분해 생성물)에서 대략 65,000달톤(프로테오스 펩톤 3 응집물)의 넓은 범위의 분자량을 갖는 단백질 및 펩티드를 포함한다.

본 발명의 산성 단백질 분획물을 상업적으로 회수하기위해 가능한 공급원료는 재조합 또는 생 전지우유, 재조합 또는 생 탈지우유, 환원 전지분유 또는 탈지분유, 초유, 우유 단백질 농축물(MPC), 우유 단백질 분리물(MPI), 유장 단백질 분리물(WPI), 유장 단백질 농축물(WPC), 유장, 환원 유장 분말을 포함하거나, 또는 우유 가공 스트림에서 얻어지거나, 또는 상기 하나이상의 공급원료를 한외여과 및/또는 미세여과하여 수득된 투과물에서 얻어진다. 가능한 공급원료는 스위트 유장에서 얻은 것은 제외된다. 상기 가능한 공급원료는 소 및 다른 낙농 공급원(예를들면 염소, 양 또는 다른 우유를 분비하는 포유동물)의 하나 이상으로부터 얻어질 수 있다. 선택적으로, 가능한 공급원료는 특정의 우유 가공 스트림으로, 가령 락트알부민(Lactalbumin, 상표명) 또는 TMP(상표명)(Total Milk Protein) 분리물의 제조동안 제조된 것에서 얻어질 수 있다. 유장의 상업적인 제조에 적당한 방법은 J G Zadow(Ed) "Whey and Lactose Processing"(Elsevier Applied Science, London and New York, 1992) 및 T Sienkiewicz 및 C Riedel(Eds) "Whey and whey utilisation"(Verlag, 독일, 1990)에 기술되어 있다.

본 발명의 산성 단백질 분획물은 음이온 교환 크로마토그래피, 바람직하게 강한 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 제조될 수 있다. 바람직하게 상기 음이온 교환 크로마토그래피는 약 pH 3.0 내지 pH 4.9, 더 바람직하게 약 pH 4.0 내지 pH 4.7, 좀 더 바람직하게 pH 4.5에서 실시된다. 상기 pH 조건은 상기 범위내에서 유효성분 또는 성분들을 컬럼에 결합시키고, 원하지 않는 단백질은 결합되지 않은 분획물에서 거의 완전하게 배제되기 때문에 음이온 교환 크로마토그래피에 의해서 산성 단백질 분획물을 회수하는 것이 최적이다. 상기는 주요 유장 단백질로, 가령 알파-락트알부민, 베타-락토글로불린 및 소혈청 알부민을 포함하며, 측정된 활성의 희석제로서만 제공된다.

본 발명의 조성물 및 본 발명의 방법에 의해서 제조된 조성물은 식품 또는 음료에 첨가되어 기능성 식품의 제조와, 뼈관절염, 골다공증 및 치주 질환을 포함하는 뼈의 결함(모든 연령 그룹에서)의 치료, 관리 및/또는 예방에 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 뼈의 질환을 악화시키는 시기를 지연 또는 예방하기위해서 기능성 식품 또는 식이성 보충물로서 1일단위로 섭취하는 것으로 가상하였다.

실시예 1: 무기산 유장에서 얻어진 산성 단백질 분획물

10% 고형물 및 pH 4.5에서 20ℓ의 무기산 유장 단백질 농축물 용액(Alacen 342-NZMP제, 뉴질랜드 웰링톤)이 110 ㎖/분의 유속으로 2ℓ의 Q-세파로스 BB(Amrad Pharmacia, 오스트레일리아) 컬럼을 통과시킨다. 상기 컬럼이 5ℓ의 탈염수로 세척되고, 1.0M의 염화나트륨 용액(pH 6.0)으로 용리시킨다. 단백질 흡착 및 용리가 280nm의 흡광도로 측정하여 모니터한다.

컬럼에서 용리된 산성 단백질 분획물이 Amicon 3K NMCO 나선식 한외여과 장치(Millipore제, 미국)를 사용하여 대략 6.25배로 농축시킨다. 농축된 단백질 투석유물이 물에 대해서 투석된 후 동결건조된다.

상기 건조 생성물(회수된 56g)이 단백질 79%, 칼슘 0.5% 이하, 인 대략 1.0% 및 시알산 6.0%를 함유한다. 상기 용리된 단백질 분획물의 아미노산 조성이 하기 표 1에 개시되었다.

무기산 유장으로부터 산성 단백질 분획물의 아미노산 프로필

아미노산	함량(%w/w)
아스파르트산	8.19
세린	6.22
글루탐산	17.7
글리신	1.34
히스티딘	2.22
아르기닌	3.69
트레오닌	4.83
알라닌	2.59
프롤린	6.15
티로신	1.88
발린	4.18
리신	6.64
이소류신	5.70
류신	6.72
페닐알라닌	2.86

산성 단백질 분획물이 Elgar 등에 의해서 기술된 방법(Journal of Chromatography A, 878(2000), pp183-196)에 따라서 역상 HPLC에 의해서 유장 단백질 및 프로테오스 펩톤을 분석한다. 상기 분석학적 음이온 교환 모노 Q 컬럼 HR 5/5(Amersham-Pharmacia Biotech제, 오스트레일리아)가 산성 단백질 분획물의 단백질 조성을 측정하는데 사용된다. 상기는 오스테오폰틴, 알파-s1-카제인 포스포펩티드, 프로테오스 펩톤 3, 프로테오스 펩톤 5 및 베타-락토글로불린의 존재를 검출한다. 프로테오스 펩톤 8-슬로우가 PP5와 함께 용리되어, 구별되는 피크가 나타나지 않는다. 자연 단백질 분해반응에 의해서 상기 단백질에서 얻어진 펩티드가 또한 검출되고, 각 성분에 대해서 넓은(broad) 피크로 나타나며, 주된 피크 주변에 작은(small) 피크들이 존재한다.

음이온 교환제로부터 회수된 동결건조된 산성 분획물이 20m/M의 트리스/HCl 완충액(pH 8.0)에 용해되고, 모노 Q 컬럼에 부하된다. 상기 분석적인 분리방법이 삼상 선형 구배(triphasic linear gradient)를 사용하여 1M 염화나트륨(pH 6.0)으로 현상시킨다. 단백질 흡착 및 용리가 214nm에서 측정된다. 단백질 피크 확인은 당 실험실에서 제조된 표준을 사용하여 분리시켰다. 표준은 PP5, PP3 및 오스테오폰틴으로 제조되었다. 각 표준의 확인은 아미노산 서열화(가령 N-말단 서열화)에 의해서 확인되고, SDS-PAGE 및 HPLC 분석에 의해서 이들의 순도가 확인되었다. 기타 성분이 도 1에 개시된 HPLC를 실행하여 생긴 분리된 피크의 아미노산 서열분석에 의해서 확인되었다.

상기 분석의 결과(도 1)는 오스테오폰틴, 알파-s1-카제인 절편, 시알화 및/또는 포스포릴화 미량 단백질, 프로테오스 펩톤 5 및 3과, 상기 단백질에서 얻어진 펩티드가 무기산 유장에서 회수된 산성 단백질 분획물에 존재하는 것을 볼 수 있다.

실시예 2: 락트산 유장에서 얻어진 산성 단백질 분획물

10% 고형물 및 pH 4.5에서 20ℓ의 락트산 유장 단백질 농축물 용액(Alacen 312-NZMP제, 뉴질랜드 웰링톤)이 110 ㎖/분의 유속으로 2ℓ의 Q-세파로스 BB 컬럼을 통과한다. 상기 컬럼이 5ℓ의 탈염수로 세척되고, 1.0M의 염화나트륨 용액(pH 6.0)으로 용리시킨다. 단백질 흡착 및 용리가 280nm의 흡광도로 측정하여 모니터한다.

컬럼에서 용리된 단백질이 Amicon 3K NMCO 나선식 한외여과 장치(Millipore제, 미국)를 사용하여 대략 6.25배로 농축시킨다. 농축된 단백질 투석유물이 물에 대해서 투석된 후 동결건조된다.

산성 단백질 분획물이 Elgar 등에 의해서 기술된 방법(Journal of Chromatography A, 878(2000), pp183-196)에 따라서 역상 HPLC에 의해서 유장 단백질 및 프로테오스 펩톤을 분석한다. 상기 분석학적 음이온 교환 모노 Q 컬럼 HR 5/5(Amersham-Pharmacia Biotech제, 오스트레일리아)가 오스테오폰틴, 알파-s1-카제인 포스포펩티드, 프로테오스 펩톤 3 및 프로테오스 펩톤 5의 존재를 검출하는데 사용된다. 상기 단백질에서 얻어진 펩티드의 존재가 실시예 1에 기술된 바와같이 관찰된다.

음이온 교환제로부터 회수된 동결건조된 산성 단백질 분획물이 20mM의 트리스/HCl 완충액(pH 8.0)에 용해되고, 모노 Q 컬럼에 부하된다. 상기 분석적인 분리방법이 삼상 선형 구배를 사용하여 1M 염화나트륨(pH 6.0)으로 현상시킨다. 단백질 흡착 및 용리가 214nm에서 측정된다. 단백질 피크 확인은 분리된 피크의 N-말단 서열화 또는 공지된 표준을 사용하여 분리시켰다. 상기 분석의 결과(도 2)는 오스테오폰틴, 알파-s1-카제인 분획물, 시알화 및/또는 포스포릴화 미량 단백질, 프로테오스 펩톤 5 및 3과, 상기 단백질에서 얻어진 펩티드가 락트산 유장에서 회수된 산성 분획물에 존재하는 것을 볼 수 있다. 도 1과 비교하여 도 2는 산성 단백질 분획물의 단백질에서 얻어진 다량의 펩티드가 존재하는 것을 볼 수 있다.

실시예 3: 실험관내 유효성 분석

실시예 1에서의 생성물이 Lowe등에 의해서 기술된 것과 같은[Journal of Bone and Mineral Research(US), 6(12):1277-1283(1991)] 뼈조직배양 모델에서 시험된다. 도 3은 산성 단백질 분획물이 10㎍/㎖이하의 투여량으로 뼈 조직배양에서 세포상에 있어서 흡수방지 효과를 갖는 것을 보여준다. 대조군과 비교하여 더 낮은 칼슘의 방출 및 더 낮은 티미딘의 첨가는 흡수방지 효과를 입증한다.

실시예 4: 생체내 유효성 분석

실시예 1에서 산성 단백질 분획물이 난소절제된(OVX) 쥐에서 에스트로겐 결핍에 의해서 유도되는 뼈의 손실을 감소시키는 성능이 16주동안 연구되었다. 난소절제된 쥐 모델이 패경이후에 나타나는 뼈의 손실을 연구하는데 있어서 모델로 널리 받아드려지고 있다.

36개월된 암컷 스프라그-다울리(Sprague-Dawley)쥐들은 5.5개월된 10마리의 겉보기-수술된(Sham-operated) 동물과 20마리의 OVX 동물이다. 겉보기-수술된 동물을 마취하고, 절개는 하지만 난소는 그대로 둔다. OVX 동물에서는 난소가 제거된다. 도착하자마자 동물들이 3개의 그룹으로 분리된다(그룹당 n=10). 상기 그룹이 표 2에 개시되어 있다.

3개의 쥐 그룹에서 사용된 처치

	대조 식사	식사+0.3%w/w의 산성 유장 단백질 분획물
그룹 A(겉보기-수술됨)	예	아니오
그룹 B(OVX 대조군)	예	아니오
그룹 C(OVX 시험)	아니오	예

상기 동물들이 각각 슈박스 우리(shoebox cage)에 넣고, (22℃±2℃)의 온도 및 광조절(12시간 낮/밤 사이클)된 방에 둔다. 동물들은 임의로 탈염수를 먹는다. 상기 동물들은 15%의 카제네이트, 5%의 셀룰로스, 5%의 옥수수기름, 0.5%의 칼슘, 62%의 전분 및 필요에 따라 비타민과 무기질을 첨가한 균형잡힌 반-합성 식사를 공급받는다. 상기 카제인이 산성 유장 단백질 분획물(실시예 1에 의해서 생성된 시료)의 0.3%(w/w)를 첨가하여 조절된다. 상기 겉보기 대조 그룹(그룹 A) 및 OVX 대조 그룹(그룹 B)은 산성 단백질 분획물이 첨가되지 않은 기본 식사를 공급받는다. 그룹 C(OVX 쥐)는 실시예 1로부터 산성 단백질 분획물의 0.3%(w/w)를 포함하는 식사를 공급받는다. 동물의 1일 섭취량이 측정되고, 섭취량은 겉보기 그룹의 체중에 따라서 주단위로 조절하여 OVX그룹에서 체중의 증가를 방지한다. 상기 실험은 매달 측정하면서 4달동안 실시된다.

뼈의 무기질밀도(BMD) 측정에 있어서, 쥐를 마취시킨 상태에서 매 4주마다 스캔된다. 쥐의 체중을 재고, 적당한 투여수준으로 예를들면 0.05㎖/100g 체중으로 마취시킨다. 상기 마취약은 0.2㎖의 아세프로마진(ACP)+0.5㎖의 케타민+0.1㎖ 의 크실라진+0.2㎖의 멸균 H₂O의 혼합물이고, 25G×5/8" 주사바늘 및 1㎖ 주사기를 사용하여 복강내주사를 통해서 투여된다. 상기 쥐들은 주사하고 대략 5분 내지 10분후에 적당한 마취상태에 있고, 2시간동안 마취상태를 유지한다.

뼈 무기질 측정은 가는 빛살빔 장치(pencil beam unit, Bedford제, 미국)를 사용하여 Hologic QDR 4000 골밀도계를 사용하여 얻어진다. 매일 품질관리(QC) 스캔이 정확성을 유지하기위해서 실시된다. 상기는 변형의 계수를 만족시켜야 한다. 영역 고-해상도 스캔이 0.0127인치(3.23×10^-2㎝) 점 해상도 및 0.0254인치(6.45×10^-2㎝) 선간격을 갖는 0.06인치(0.1524㎝) 직경의 콜리메이터를 사용하여 실시된다. 쥐가 균일한 1.5인치(3.81㎝) 두께의 아크릴 플랫포옴상에 놓는다. 각 쥐는 척추와, 오른쪽 대퇴골 및 왼쪽 대퇴골의 3개의 영역 고해상도 스캔을 실시한다. 쥐가 척추 및 대퇴골과, 대퇴골과 경골사이의 정확한 각도로 반듯하게 눕힌다.

도 4는 상기 분획물을 16주동안 공급한 후에 오른쪽 대퇴골 및 척추의 BMD를 보여준다. 상기 양쪽의 경우에, 대조군 OVX 그룹(그룹 B)의 BMD는 겉보기 그룹 A보다 통계적으로 크게 낮으며(통계적으로 중요한 결과는 *로 표시한다), 반면에 산성 유장 단백질 분획물이 공급된 그룹의 BMD(그룹 C)는 겉보기 그룹과 크게 다르지 않았다(p<0.05).

상기 실험에서 대조군 식사를 공급받은 OVX 쥐(그룹 B)는 겉보기 대조군 쥐(그룹 A)와 비교하여 뼈가 상당히 손실된 것을 보이는 반면에, 놀랍게도 산성 단백질 분획물을 공급받은 쥐(그룹 C)는 겉보기 쥐와 비교하여 뼈가 크게 손실되지 않았다. 이는 본 발명의 산성 단백질 분획물이 에스트로겐 결핍에 의해 나타나는 뼈의 손실을 감소 또는 예방할 수 있다는 것을 보여준다.

상기는 본 발명의 몇가지 바람직한 실시양태를 기술하였으며, 몇가지 가능한 변형을 나타내었다. 그러나 이는 다른 변형예가 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 당분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해서 만들어질 수 있다는 것이 명백하다.

Claims

산성 유장(acid whey)의 산성 단백질 분획물, 산성 유장의 산성 단백질 분획물의 가수분해물 또는 이의 배합물을 포함하지만, 카제이노글리코마크로펩티드(CGMP)를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물.
삭제
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제 1 항에 있어서,

산성 단백질 분획물은 70 중량% 이상의 단백질을 포함하며, 상기 단백질의 80 중량% 이상은 오스테오폰틴 및 프로테오스 펩톤을 포함하는 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물.
제 1 항에 있어서,

산성 단백질 분획물은 70 중량% 이상의 단백질을 포함하며, 상기 단백질의 90 중량% 이상은 오스테오폰틴 및 프로테오스 펩톤을 포함하는 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물.
제 1 항에 있어서,

분획물내 단백질의 분자량 분포는 SDS-PAGE로 측정하여 3,000 내지 65,000인 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물.
제 4 항에 있어서,

프로테오스 펩톤은 플라스민의 작용에 의해서 카제인에서 생성된 펩티드를 포함하며, 비(非)카제인 프로테오스 펩톤 3(PP3) 뿐만아니라, 프로테오스 펩톤 5(PP5), 프로테오스 펩톤 8-슬로우(PP8-slow), 프로테오스 펩톤 8-패스트(PP8-fast)를 포함하는 그룹에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물.
제 1 항에 있어서,

분획물내 시알산 함량은 0.8% 내지 6.5%의 범위내에 있는 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물.
제 1 항에 있어서,

분획물내 포스페이트 함량은 0.5% 내지 3%의 범위내에 있는 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물.
제 1 항, 제 4 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 조성물은 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 제조되는 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물.
제 1 항, 제 4 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 조성물은 강한 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 제조되는 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물.
제 1 항, 제 4 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,

재조합 또는 생 전지우유, 재조합 또는 생 탈지우유, 환원 전지분유 또는 탈지분유, 초유, 우유 단백질 농축물(MPC), 우유 단백질 분리물(MPI), 유장 단백질 분리물(WPI), 유장 단백질 농축물(WPC), 유장, 환원 유장 분말을 포함하는 그룹에서 선택된 하나 이상의 공급원료로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물.
제 1 항, 제 4 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,

락트산 유장 또는 무기산 유장으로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물.
하기 단계들(a) 내지 (d)을 포함하는 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물의 제조 방법:

(a) CGMP를 포함하지 않고, 재조합 또는 생 전지우유, 재조합 또는 생 탈지우유, 환원 전지분유 또는 탈지분유, 초유, 우유 단백질 농축물(MPC), 우유 단백질 분리물(MPI), 유장 단백질 분리물(WPI), 유장 단백질 농축물(WPC), 유장, 환원 유장 분말을 포함하는 그룹에서 선택된 하나 이상의 공급원료로부터 얻어지는 수용액을 준비하는 단계;

(b) pH 3 내지 pH 4.9에서 상기 수용액을 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계;

(c) 상기 음이온 교환 매질을 세척하는 단계; 및

(d) 상기 음이온 교환 매질로부터 유장의 산성 단백질 분획물을 용리시키는 단계.
제 14 항에 있어서,

상기 단계(a)에서 준비된 수용액은 락트산 유장 또는 무기산 유장인 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물의 제조방법.
제 14 항에 있어서,

상기 단계(a)에서 준비된 수용액은 락트산 유장 또는 무기산 유장으로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물의 제조방법.
제 14 항에 있어서,

상기 단계(a)에서 준비된 수용액은 유장의 산성 단백질 분획물의 가수분해물을 포함하는 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물의 제조방법.
제 14 항에 있어서,

상기 음이온 교환 크로마토그래피는 강한 음이온 교환 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물의 제조방법.
제 14 항에 있어서,

상기 단계(b)는 pH 4 내지 pH 4.7에서 실시되는 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물의 제조방법.
제 14 항에 있어서,

상기 단계(b)는 pH 4.5에서 실시되는 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물의 제조방법.
제 14 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 단계(c)는 탈염수를 사용하여 상기 매질을 세척하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물의 제조방법.
제 14 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 단계(d)는 NaCl, KCl 또는 이의 혼합물을 사용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물의 제조방법.
제 14 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 단계(d)는 1M NaCl을 사용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물의 제조방법.
제 14 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 단계(d)는 산을 사용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물의 제조방법.
제 14 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 단계(d)는 다른 pH들을 갖는 둘 이상의 용리액(eluting solution)을 사용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물의 제조방법.
제 14 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 단계(d)는 5.0 내지 9.0의 pH 및 1.0M 이하의 염 농도를 갖는 용리액을 사용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물의 제조방법.
제 14 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 단계 (a) 이전에 추가의 단계 또는 단계들을 포함하며,

상기 추가의 단계 또는 단계들은 열처리법(thermisation), 저온살균법, 원심분리법, 한외여과법, 미세여과법, 역삼투법, 전기투석 및 이온 교환 크로마토그래피법을 포함하는 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 뼈 건강 조성물의 제조방법.
제 14 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해서 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항, 제 4 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,

생리학적으로 허용가능한 양의 칼슘, 마그네슘, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K₂ 및 아연을 포함하는 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항, 제 4 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 조성물은 소와, 염소 또는 양 또는 다른 우유를 분비하는 포유동물(milk producing mammal)을 포함하는 다른 낙농 공급원 중 하나 또는 조합으로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항, 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,

오스테오폰틴, 뼈 시알로프로테인, 프로테오스 펩톤 3, 프로테오스 펩톤 5, 프로테오스 8, 이로부터 수득되는 시알화 및 포스포릴화 단백질 및 펩티드와, 알파-s1-카제인 포스포펩티드를 포함하는 그룹에서 선택되는 하나 이상의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 28 항에 있어서,

상기 조성물 또는 이의 분획물은 유익한 뼈 건강 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항, 제 4 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 식이성 보충물.
제 1 항, 제 4 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 첨가물.
제 1 항, 제 4 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 음료 첨가물.
제 1 항, 제 4 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 식품(nutraceutical).
제 1 항, 제 4 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증, 뼈관절염 및 치주질환의 치료 또는 예방용 약학조성물.
제 1 항, 제 4 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 동물(인간을 제외함)에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증, 뼈관절염 및 치주질환을 치료 또는 예방하는 방법.
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