TWI607709B

TWI607709B - 骨強化劑

Info

Publication number: TWI607709B
Application number: TW102108276A
Authority: TW
Inventors: 松山博昭; 森田如一; 石田祐子; 大町愛子; 小林敏也; 高野義彥; 加藤健
Original assignee: 雪印惠乳業股份有限公司
Priority date: 2012-03-09
Filing date: 2013-03-08
Publication date: 2017-12-11
Also published as: WO2013133326A1; JP2013184960A; TW201343080A; JP5969225B2

Description

骨強化劑

本發明關於一種骨強化劑，其係以鹼性蛋白質組分及/或鹼性蛋白質組分分解物與乳清蛋白水解物為有效成分，骨強化作用優異、可使骨原細胞增殖、又具有抑制破骨細胞的分化與該細胞所為的骨吸收的作用，對於骨質疏鬆症與骨折治療、風濕症、關節炎等各種骨病的預防與治療有效，且安定性及安全性優異。本發明更關於含有該骨強化劑的骨強化用飲食品、骨強化用營養組成物、骨強化用飼料或骨強化用醫藥品。

近年來，在世界的規模上隨著高齡化等，骨質疏鬆症與骨折或腰痛等各種與骨有關聯的疾病正增加中，而成為很大的社會問題。其原因乃是因為鈣的攝取不足與鈣吸收能力的降低、停經後的賀爾蒙的失衡等。為了預防骨質疏鬆症與骨折、腰痛等各種骨病，從年輕時期起促進骨原細胞所為之骨形成而儘量增加體內的骨量、提高最大骨量與骨強度(骨密度+骨質)乃為有效。此外，骨質係指骨的微細構造與代謝轉換、微小骨折、鈣化。又，作為預防骨質疏鬆症與骨折、腰痛等各種骨病的方法，也有人考慮抑制破骨細胞所為的骨吸收。骨雖然會不斷地重複取得平衡的吸收與形成(骨再塑)，但因為停經後的賀爾蒙的平衡變化等會使得骨吸收超過了骨形成，其乃成為骨質疏鬆症與骨折、腰痛等各種骨病的原因。因此，藉由抑制破骨細胞的骨吸收而保持一定的骨強度，結果可使得骨強化。

基於像這樣的現狀，以強化骨為目的，將碳酸鈣或磷酸鈣、乳酸鈣等鈣鹽以及乳清鈣或牛骨粉、蛋殼等天然鈣劑分別單獨地添加於醫藥品與飲食品、飼料等中進行攝取，或將此等鈣劑與酪蛋白磷胜肽及寡糖等的具有鈣吸收促進效果之物質一同添加於醫藥品與飲食品、飼料等中進行攝取。然而，在將此等鈣鹽與天然鈣劑添加於飲食品後攝取的情況中，鈣的吸產率為50%以下，據稱一半以上的鈣沒有被吸收而被排出於體外的緣故。又，即使被吸收至體內的鈣，取決於其形態與同時被攝取的其他營養成分的種類對於骨的親和性不同的緣故，有時也未必會顯示出骨代謝的改善與骨強化作用。

此外，骨質疏鬆症治療與骨強化用的醫藥，已知有女性賀爾蒙製劑與活性型維他命D3製劑和維他命K2製劑、雙膦酸鹽製劑、降鈣素製劑等，並且正進行抗RANKL抗體等新藥的開發。然而，使用此等醫藥品的情況會伴隨有耳鳴、頭痛、食慾不振等副作用。再者，此等物質從安全性及成本等面來看，目前的情況尚無法添加至飲食品中。因此，期待開發有可依骨質疏鬆症與骨折、腰痛等各種骨病的疾病性質而能長期的口服攝取、具有促進骨形成及/或抑制骨吸收的作用且可提高骨強度、可期待其預防或治療效果的骨強化劑與含有該骨強化劑的飲食品、飼料。

像上述這樣的骨強化劑，已報告有例如像專利文獻1所記載的來自乳的鹼性蛋白質組分(以下稱為「乳源鹼性蛋白質組分」)、與以蛋白質分解酵素分解乳源鹼性蛋白質組分所得之鹼性蛋白質組分分解物(以下稱為「乳源鹼性蛋白質組分分解物」)。

【先前技術文獻】

【專利文獻】

專利文獻1：日本特開平8-151331

本發明之課題為提供一種骨強化劑，其係安全性高、可強化骨、且對於骨質疏鬆症與骨折、風濕症、關節炎等各種骨病的預防與治療有用。又，本發明之課題為提供摻混有骨強化劑之骨強化用飲食品、骨強化用營養組成物、骨強化用飼料或骨強化用醫藥品。

本案發明人等為了解決上述課題而進行專心研究，發現藉由同時攝取：以往報告具有骨強化作用的乳源鹼性蛋白質組分及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物、與乳清蛋白水解物，顯示出更高的骨強化作用。

亦即，本發明包含以下態樣。

(1)一種骨強化劑，其係以乳源鹼性蛋白質組分及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物、與乳清蛋白水解物為有效成分。

(2)如(1)所記載之骨強化劑，其中前述乳源鹼性蛋白質組分分解物係使用由胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及胰酶構成之群中所選出之至少1種蛋白質分解酵素，將乳源鹼性蛋白質組分予以分解而得到者。

(3)如(1)或(2)所記載之骨強化劑，其中前述乳源鹼性蛋白質組分係在其胺基酸組成中含有15重量%以上的鹼性胺基酸的組分。

(4)如(1)或(2)所記載之骨強化劑，其中前述乳源鹼性蛋白質組分係使乳或乳源原料與陽離子交換樹脂接觸以吸附鹼性蛋白質，並以鹽濃度0.1M~1.0M的洗提液洗提吸附於該樹脂的組分而得到的組分。

(5)如(1)所記載之骨強化劑，其中前述乳清蛋白水解物的分解率為25%以上。

(6)如(1)所記載之骨強化劑，其中前述乳清蛋白水解物具有以下的特徵：(A)分子量為10kDa以下、主峰為200Da~3kDa；(B)APL(平均胜肽鏈長)為2~8；(C)游離胺基酸含量為20%以下；且(D)抗原性為β-乳球蛋白之抗原性的1/10,000以下。

(7)如(1)所記載之骨強化劑，其中前述乳清蛋白水解物係使用耐熱性的蛋白質水解酵素在pH6~10、50~70℃邊使乳清蛋白熱變性邊進行酵素分解，進行加熱使酵素失活而得到者。

(8)如(1)所記載之骨強化劑，其中前述乳清蛋白水解物係使用蛋白質水解酵素在pH6~10、20~55℃將乳清蛋白進行酵素分解，使其升溫至50~70℃，使用耐熱性的蛋白質水解酵素在pH6~10、50~70℃使未分解的乳清蛋白熱變性並且酵素分解，進行加熱使酵素失活而得到者。

(9)一種骨強化用飲食品、骨強化用營養組成物、骨強化用飼料或骨強化用醫藥品，其特徵為包含如(1)至(8)中任一項之骨強化劑。

(10)一種骨強化方法，其係利用同時攝取乳源鹼性蛋白質組分及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物、與乳清蛋白水解物。

本發明的骨強化劑對於骨質疏鬆症與骨折、風濕症、關節炎等各種骨病的預防與治療有用。

【用以實施發明的形態】

本發明的特徵係以乳源鹼性蛋白質組分及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物與乳清蛋白水解物為有效成分。本發明所使用的乳源鹼性蛋白質組分為從牛乳、人乳、山羊乳、羊乳等哺乳類的乳汁所得到者，又，本發明所使用的乳源鹼性蛋白質組分分解物係使蛋白質分解酵素作用於乳源鹼性蛋白質組分而得到者。

該乳源鹼性蛋白質組分具有以下性質。

(1)根據十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，包含分子量在3,000~80,000範圍的數種蛋白質。

(2)95重量%以上為蛋白質，含有其他少量的脂肪、及灰分。

(3)蛋白質主要包含乳鐵蛋白及乳過氧化酶。

(4)蛋白質的胺基酸組成含有15重量%以上的離胺酸、組胺酸、精胺酸等鹼性胺基酸。

像這樣的乳源鹼性蛋白質組分可藉由例如將脫脂乳與乳清等乳原料與陽離子交換樹脂接觸且吸附鹼性蛋白質，用0.1M~1M鹽濃度的洗提液洗提吸附於該樹脂的鹼性蛋白質組分，回收該洗提組分，利用逆滲透(RO)膜與電透析(ED)法等進行脫鹽及濃縮，且按照需要進行乾燥而得到。

又，得到本發明的乳源鹼性蛋白質組分之方法已知有：將乳或乳源原料與陽離子交換體接觸且吸附鹼性蛋白質之後，用pH大於5、離子強度大於0.5的洗提液洗提吸附於該陽離子交換體的鹼性蛋白質組分而得到的方法(日本特開平5-202098號公報)、使用褐藻酸凝膠而得到的方法(日本特開昭61-246198號公報)、使用無機的多孔性粒子而從乳清得到的方法(日本特開平1-86839號公報)、使用硫酸化酯化合物而從乳得到的方法(日本特開昭63-255300號公報)等，本發明可使用以像這樣的方法所得到之乳源鹼性蛋白質組分。

再者，乳源鹼性蛋白質組分分解物具有與乳源鹼性蛋白質組分相同的胺基酸組成，例如藉由使胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等蛋白質分解酵素作用於以上述方法所得到之乳源鹼性蛋白質組分，並進一步按照需要使胰酶等蛋白質分解酵素起作用，可得到平均分子量4,000以下的胜肽組成物。

本發明所使用的乳清蛋白水解物可依照例如日本特開平4-112753所記載之方法而得到。該方法係藉由使乳清蛋白為pH6~10、50~70℃，於其中加入耐熱性的蛋白質水解酵素邊使其熱變性邊進行酵素分解，將其加熱使酵素失活而得到。此外，在進行上述酵素分解之前，使用蛋白質水解酵素在pH6~10、20~55℃將乳清蛋白進行酵素分解，不將其冷卻而是直接以上述的條件進行酵素分解時，可進一步提高產率。

又，亦可以選自於截留分子量(molecular weight cutoff)為1kDa~20kDa、宜為2kDa~10kDa的超過濾過濾(UF)膜及/或截留分子量為100Da~500Da、宜為150Da~300Da的精密過濾(MF)膜的方法，將如上述般所調製之乳清蛋白水解物予以濃縮。藉由利用像這樣的膜處理，使乳清蛋白水解物的平均分子量為300~500Da，可進一步減輕苦味，且可使透明性提昇。

依照日本特開平4-112753所記載之方法來調製乳清蛋白水解物的情況，係將前述溶液調整成pH6~10，由於通常乳清蛋白的pH就在該範圍內，所以沒有特別進行pH調整的必要，但在必要的情況可使用鹽酸、檸檬酸及乳酸等酸性溶液或氫氧化鈉、氫氧化鈣及磷酸鈉等鹼性溶液使pH為6~10。加熱係在50~70℃進行，但耐熱性的蛋白質水解酵素與其在該溫度下進行添加，不如在加熱前就進行酵素分解的話，從產率之面來看為宜。

又，一般的蛋白酶的最佳溫度為40℃以下，但耐熱性的蛋白質水解酵素的最佳溫度為45℃以上，耐熱性的蛋白質水解酵素若為習知具有像這樣的最佳溫度之耐熱性的蛋白質水解酵素，可沒有特別地限制地使用。像這樣的耐熱性的蛋白質水解酵素可例示如木瓜酶、蛋白酶S(商品名)、Proleather(商品名)、Thermoase(商品名)、Alcalase(商品名)、Protin A(商品名)等。耐熱性的蛋白質水解酵素最好是在80℃加熱30分鐘後殘存活性為約10%或其以上者。又，併用複數種的酵素比僅單獨使用者要有效果。反應宜為進行約30分鐘~10小時。

最後，加熱反應液使酵素失活。酵素的失活可藉由將反應液在100℃以上、加熱10秒鐘以上來進行。

然後將反應液離心分離並回收上清液，乾燥上清液並作成粉末製品。此外，於離心分離時所產生的沈澱物由於與上清液相比其低過敏原化的程度較小的緣故，所以將其除去的話為宜，當然也可直接就這樣將反應液乾燥而使用也沒有關係。所得之乳清蛋白水解物的APL(平均胜肽鏈長)可利用TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)法等方法來進行測定。又，乳清蛋白水解物的分子量分布可利用High performance size exclusion chromatography(HPSEC,高效能分子篩層析儀)法等方法來進行測定，其游離胺基酸含量可以75%乙醇等將游離胺基酸萃取，並以胺基酸分析裝置等進行測定。再者，乳清蛋白水解物的分解率係可利用將游離的胺基修飾後進行測定之鄰苯二甲醛 (OPA)法等來進行測定。

此外，本發明中的乳清蛋白係指由牛乳、人乳、山羊乳、羊乳等哺乳類的乳所調製的乳清、其凝集物、粉末、或精製蛋白質，其在進行酵素反應時於水溶液的狀態下使用。

本發明的乳源鹼性蛋白質組分及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物與乳清蛋白水解物係可經由同時攝取就這樣作為骨強化劑而使用，亦可按照需要，依照一般的方法使其製劑化成粉末劑、顆粒劑、錠劑、膠囊劑、飲用劑等而使用。

本發明中，摻混乳源鹼性蛋白質組分及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物與乳清蛋白水解物的方法並沒有特別地限制，例如在溶液中進行添加、摻混方面，乃是將乳源鹼性蛋白質組分及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物與乳清蛋白水解物懸浮或溶解於去離子水中，經攪拌混合之後，調製成醫藥品、飲食品與飼料的形態而使用。攪拌混合的條件只要能使乳源鹼性蛋白質組分及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物與乳清蛋白水解物均勻混合即可，亦可使用超分散器與TK均質混合機等來進行攪拌混合。又，為了容易使用於醫藥品、飲食品與飼料，該組成物的溶液亦可按照需要進行RO膜等濃縮、冷凍乾燥而使用。本發明中，可進行醫藥品、飲食品與飼料的製造中通常使用的殺菌處理，若是粉末狀亦可進行乾熱殺菌。因此，可製造含有本發明的乳源鹼性蛋白質組分及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物與乳清蛋白水解物之液狀、凝膠狀、粉末狀、顆粒狀等各式各樣形態的醫藥品、飲食品與飼料。

再者，在將此等予以製劑化之後，亦可將其摻混於營養劑與酸酪乳、乳飲料、威化餅等飲食品、營養組成物、飼料及醫藥品。

本發明的骨強化用飲食品、骨強化用營養組成物、骨強化用飼料及骨強化用醫藥品，除了僅含有該乳源鹼性蛋白質組分及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物與乳清蛋白水解物的情況外，還可含有安定劑與糖類、脂質、香味料、維他命、礦物質、類黃酮、多酚等其他飲食品、飼料及醫藥中通常含有的原材料等。又，除了乳源鹼性蛋白質組分及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物與乳清蛋白水解物外，亦可與其他的顯示骨強化作用的成分，例如維他命D與維他命K、大豆異黃酮等一同使用。又，亦可將像那樣的骨強化用飲食品、骨強化用營養組成物、骨強化用飼料或骨強化用醫藥品當做原材料，摻混其他的飲食品等中通常含有之原材料等來進行調製。

骨強化用飲食品、骨強化用營養組成物、骨強化用飼料及骨強化用醫藥品中的乳源鹼性蛋白質組分及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物與乳清蛋白水解物的摻混量沒有特別地限制，宜為成人每人每日攝取1mg以上的乳源鹼性蛋白質組分及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物、2mg以上的乳清蛋白水解物，因此，依據飲食品、飼料及醫藥的形態，每100g含有0.05~200mg的乳源鹼性蛋白質組分及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物，相對於總質量而言含有0.001~10%(重量/重量)的乳清蛋白水解物、宜為含有0.1~5%(重量/重量)較理想。

本發明的骨強化劑係可在上述的有效成分中添加適當的助劑來製劑化成任意的形態，以作成可口服投予的骨強化組成物。在製劑化時，可使用通常使用的填充劑、增量劑、黏結劑、崩解劑、界面活性劑、潤滑劑等稀釋劑或賦形劑。賦形劑可將例如蔗糖、乳糖、澱粉、結晶性纖維素、甘露醇、輕質矽酸酐、鋁酸鎂、合成矽酸鋁、偏矽酸鋁酸鎂、碳酸鈣、碳酸氫鈉、磷酸氫鈣、羧基甲基纖維素鈣等1種或2種以上予以組合而加入。

以下顯示實施例及試驗例，並就本發明作詳細地說明，但此等僅為例示而已，本發明並不因此而受到任何的限定。

〔實施例1〕

用去離子水將填充有陽離子交換樹脂的磺化CHITOPEARL(富士紡績股份有限公司製)400g之管柱(直徑5cm×高度30cm)充分洗淨之後，將未殺菌的脫脂乳40公升(pH6.7)以流速25ml/min對該管柱進行通液。於通液後，用去離子水充分洗淨該管柱，以含有0.98M氯化鈉之0.02M碳酸緩衝液(pH7.0)洗提吸附於樹脂之鹼性蛋白質組分。然後，利用逆滲透(RO)膜對該洗提液進行脫鹽、濃縮之後，進行冷凍乾燥以得到粉末狀的乳源鹼性蛋白質組分21g(實施例品1)。關於所得到的乳源鹼性蛋白質組分，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行測定，結果分子量分布在3,000~80,000的範圍，成分組成係如表1所示。又，以6N鹽酸在110℃、水解24小時之後，以胺基酸分析裝置(L-8500型、日立製作所製)分析該胺基酸組成並將結果表示於表2。再者，利用ELISA法分析該蛋白質組成，結果如表3所示，含有40%以上的乳鐵蛋白及乳過氧化酶。

〔實施例2〕

用去離子水將填充有陽離子交換樹脂的SP TOYOPEARL(東曹股份有限公司製)30kg之管柱(直徑100cm×高度10cm)充分洗淨之後，將在121℃經加熱殺菌30秒鐘之乾酪乳清3t(pH6.2)以流速10公升/min對該管柱進行通液。通液後，用去離子水充分洗淨該管柱，以含有0.9M氯化鈉之0.1M檸檬酸緩衝液(pH5.7)洗提吸附於樹脂之鹼性蛋白質組分。然後，利用電透析(ED)法將該洗提液脫鹽、濃縮之後，進行冷凍乾燥以得到粉末狀的乳源鹼性蛋白質組分183g(實施例品2)。

〔實施例3〕

將實施例1中所得之乳源鹼性蛋白質組分50g溶解於蒸餾水10公升之後，添加1%胰酶(SIGMA公司製)，並使其在37℃下反應2小時。反應後，在80℃加熱處理10分鐘使酵素失活之後，得到乳源鹼性蛋白質組分分解物48.3g(實施例品3)。

〔實施例4〕

於乳清蛋白10%水溶液1L中加入木瓜酶50U/g．乳清蛋白及Proleather(天野酶公司製)150U/g．乳清蛋白，調整為pH8，於55℃邊使乳清蛋白變性並且邊進行酵素分解6小時。將反應液在100℃加熱15秒鐘以上使得酵素失活，進行離心分離並回收上清液，將其乾燥而得到乳清蛋白水解物(實施例品4)。所得之乳清蛋白水解物的分子量分布為10kDa以下、主峰為1.3kDa、APL為7.2、相對於全部的構成成分而言游離胺基酸含量為 18.9%。利用Inhibition ELISA法測定對於β-乳球蛋白的抗原性的下降，結果為1/10,000以下，且分解率為28%、產率(將酵素反應液離心分離，上清液的乾燥重量對進料量的乾燥重量之比率(%))為80.3%、苦味度為2。

〔實施例5〕

於乳清蛋白10%水溶液1L中加入木瓜酶50U/g．乳清蛋白及Proleather(天野酶公司製)150U/g．乳清蛋白，在pH8、50℃進行酵素分解3小時。將其升溫至55℃，在該溫度維持3小時，使蛋白質變性並且進行蛋白質的酵素分解，在100℃加熱15秒鐘以上使酵素失活。以截留分子量為10kDa的UF膜(STC公司製)及截留分子量為300Da的MF膜(STC公司製)處理該反應液，回收濃縮液組分，將其乾燥以得到乳清蛋白水解物(實施例品5)。所得之乳清蛋白水解物的分子量分布為10kDa以下、主峰為500Da、APL為3.0、相對於全部的構成成分而言游離胺基酸含量為15.2%。利用Inhibition ELISA法測定對於β-乳球蛋白的抗原性的下降為1/10,000以下，且分解率為32%、產率65.4%、苦味度為2。

〔實施例6〕

按照日本特開平4-69315號公報所報告的方法，調製乳清蛋白的水解物。將乳清蛋白120g溶解於精製水1,800ml中，並以1M氫氧化鈉溶液將其pH調整至7.0。接著，在60℃加熱10分鐘進行殺菌，保持在45℃並添加AMANO A(天野酶公司製)20g，使之反應2小時。在80℃加熱10分鐘使酵素失活，且進行冷凍乾燥，以得到乳清蛋白水解物(實施例品6)。所得之乳清蛋白水解物的分子量分布為14kDa以下、主峰為3.1kDa、APL為17.2、相對於全部的構成成分而言游離胺基酸含量為13.2%。利用Inhibition ELISA法測定對於β-乳球蛋白的抗原性的下降，結果為1/5,000以下，且分解率為18%、產率為80.6%、苦味度為2。

〔實施例7〕

按照日本特開平4-69315號公報所報告的方法，調製乳清蛋白的水解物。將乳清蛋白120g溶解於精製水1,800ml中，並以1M氫氧化鈉溶液將其pH調整至7.0。接著，在60℃加熱10分鐘進行殺菌，保持在45℃並添加AMANO A(天野酶公司製)20g，使之反應8小時。在80℃加熱10分鐘使酵素失活，且進行冷凍乾燥，以得到乳清蛋白水解物(實施例品7)。所得之乳清蛋白水解物的分子量分布為10kDa以下、主峰為1.8kDa、APL為100、相對於全部的構成成分而言游離胺基酸含量為19.3%。利用Inhibition ELISA法測定對於β-乳球蛋白的抗原性的下降，結果為1/10,000以下，且分解率為25%、產率為80.6%、苦味度為2。

[試驗例1]

(動物實驗)

使用實施例品1的乳源鹼性蛋白質組分與實施例品4的乳清蛋白水解物，針對骨強化作用加以評價。實驗係使用6週齡的C3H/HeJ小鼠。將小鼠分為以下的6群試驗群(每群各10隻)：投予生理食鹽水的群(A群)；小鼠體重每1kg投予1mg的實施例品1之乳源鹼性蛋白質組分的群(B群)；小鼠體重每1kg投予2mg的實施例品4之乳清蛋白水解物的群(C群)；小鼠體重每1kg投予3mg的實施例品1之乳源鹼性蛋白質組分的群(D群)；小鼠體重每1kg投予3mg的實施例品4之乳清蛋白水解物的群(E群)；小鼠體重每1kg同時各投予1mg與2mg的實施例品1之乳源鹼性蛋白質組分與實施例品4之乳清蛋白水解物的群(F群)。每天1次以探針對其分別口服投予並飼養2週。將實施例品1、4及實施例品1與4的混合物分別懸浮於生理食鹽水中，且分別對B~F群進行口服投予。試驗結束時，使用3D微X射線CT(理學(股))測定小鼠右足脛骨的骨密度。其結果表示於表4。

其結果投予2週後的脛骨的骨密度，小鼠體重每1kg投予1mg或3mg的實施例品1之乳源鹼性蛋白質組分的群、小鼠體重每1kg投予2mg或3mg的實施例品4之乳清蛋白水解物的群、小鼠體重每1kg同時各攝取1mg與2mg的實施例品1之乳源鹼性蛋白質組分與實施例品4之乳清蛋白水解物群，與對照群相比，骨密度明顯地上昇。又，藉由同時攝取實施例品1之乳源鹼性蛋白質組分與實施例品4之乳清蛋白水解物，骨密度明顯地比分別單獨攝取的群更為上昇。從該結果可知：同時攝取本發明的乳源鹼性蛋白質組分與乳清蛋白水解物的情況，與分別單獨攝取之情況相比，其具有相乘地提高骨密度的效果。又，了解到該骨強化作用可在小鼠體重每1kg同時各投予最低1mg與最低2mg的乳源鹼性蛋白質組分與乳清蛋白水解物的情況下觀察到。

[試驗例2]

(動物實驗)

使用實施例品3的乳源鹼性蛋白質組分分解物與實施例品5的乳清蛋白水解物，針對骨強化作用加以評價。實驗係使用51週齡的SD系雌大鼠。將大鼠每6隻1群，分成5群，對4群實施卵巢摘出手術，對剩餘的1群實施模擬手術。設置4週的回復期間，對施以卵巢摘出手術的大鼠，以大鼠體重每1kg投予1mg的實施例品3(A群)、大鼠體重每1kg投予2mg的實施例品5(B群)、大鼠體重每1kg同時各投予1mg與2mg的實施例品3與實施例品5(C群)的方式，1天1次分別以探針進行口服投予，或是1天1次以探針口服投予不含有任何的實施例品之作為溶劑的生理食鹽水(對照群)後，飼養16週。又，在4週的回復期間後，施以模擬手術的大鼠，與對照群同樣地，1天1次以探針口服投予(模擬手術群)生理食鹽水。於投予結束後(第16週)，利用骨強度測定裝置(RX-1600、ITECNO)測定大鼠的右大腿骨的骨強度。其結果表示於表5。

其結果，大鼠體重每1kg各口服投予1mg、2mg的實施例品3之乳源鹼性蛋白質組分分解物或實施例品5之乳清蛋白水解物的群、大鼠體重每1kg同時各攝取1mg與2mg的實施例品3之乳源鹼性蛋白質組分分解物與實施例品5之乳清蛋白水解物的群，與對照群相比，骨斷裂強度明顯地上昇。又，同時攝取實施例品3之乳源鹼性蛋白質組分分解物與實施例品5之乳清蛋白水解物的群，與分別單獨攝取的群相比，骨斷裂強度明顯較高，其值具有與模擬手術群相同的水準。從該結果可知：同時投予本發明的乳源鹼性蛋白質組分分解物與乳清蛋白水解物的情況，與分別單獨攝取的情況相比，具有相乘地提高骨斷裂強度的效果。又，了解到該骨強化作用可在大鼠體重每1kg各投予最低1mg與最低2mg的乳源鹼性蛋白質組分分解物與乳清蛋白水解物的情況下觀察到。

[試驗例3]

針對實施例品2、3的乳源鹼性蛋白質組分分解物或乳源鹼性蛋白質組分分解物與實施例品6、7的乳清蛋白水解物，調查骨原細胞的增殖效果。將骨原細胞株(MC3T3-E1)接種於96孔的平板細胞培養皿中，並以含有10%胎牛血清的α-MEM培養基培養24小時。將培養基全部移除後，各添加90μl的不含有胎牛血清的α-MEM培養基，並各添加10μl的實施例品2、3、6、7及實施例品2與6的混合物、實施例品3與7的混合物，進而繼續培養24小時。添加Cell proliferation kit(Cell Proliferation kit,GE Health Care公司製)附帶的溴脫氧尿苷(BrdU)且培養2小時後，與過氧化酶標識抗BrdU抗體反應，添加作為基質的3,3',5,5'-四甲基聯苯胺，測定在450nm中的吸光度，藉由測定進入細胞內的BrdU量，而求得骨原細胞增殖活性。將其結果表示於表6。

其結果，於培養基中添加有實施例品2、3的乳源鹼性蛋白質組分分解物或乳源鹼性蛋白質組分分解物、實施例品6、7的乳清蛋白水解物、實施例品2與實施例品6的混合物、實施例品3與實施例品7的混合物之情況，與於培養基中添加生理食鹽水之情況相比，顯著地促進了骨原細胞的增殖。又，將乳源鹼性蛋白質組分分解物及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物與乳清蛋白水解物同時添加至培養基的情況，與分別單獨添加的情況相比，顯示出顯著較高的骨原細胞增殖活性。從該結果可知：本發明的乳源鹼性蛋白質組分分解物及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物與乳清蛋白水解物的混合物，相較於分別單獨使用而言，具有相乘的骨原細胞增殖促進作用。

[試驗例4]

針對實施例品1、3的乳源鹼性蛋白質組分分解物或乳源鹼性蛋白質組分分解物與實施例品4、5的乳清蛋白水解物，調查抑制破骨細胞所為之骨吸收的效果。取出5日齡的兔子的脛骨及大腿骨且去除軟組織後，在含有5%FBS的DMEM/F12培養基中，將含有經機械細切之破骨細胞的全骨髓細胞以1000,000 cells/well的方式撒入結晶性磷酸鈣平板(Cornig公司製)的孔上後進行培養。於培養2小時後，更換為新的培養基之後，添加溶解有實施例品1、3及實施例品4、5、實施例品1與5的混合物、實施例品3與4的混合物之溶液以使其濃度為10%，且進行培養72小時。然後，藉由添加5%次亞氯酸鈉溶液去掉細胞後，於實體顯微鏡下拍攝出現在磷酸鈣平板的孔上的骨吸收陷窩(pit)、藉由利用影像解析來設定其面積，調查抑制破骨細胞所為之骨吸收的效果(瀬野悍二等人，研究主題別動物培養細胞操作手冊，pp.199-200,1993)。其結果表示於表7。

其結果，於培養基中添加有實施例品1、3的乳源鹼性蛋白質組分分解物或乳源鹼性蛋白質組分分解物、實施例品4、5乳清蛋白水解物、實施例品1與實施例品5的混合物、實施例品3與實施例品4的混合物之情況，與於培養基中添加生理食鹽水之情況相比，骨吸收陷窩的面積顯著地減少了。又，將乳源鹼性蛋白質組分分解物及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物與乳清蛋白水解物同時添加於培養基之情況，與分別單獨添加的情況相比，骨吸收陷窩的面積顯著地減少了。從該結果可知：本發明的乳源鹼性蛋白質組分分解物及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物與乳清蛋白水解物的混合物，相較於分別單獨使用而言，具有相乘的破骨細胞抑制骨吸收的作用。

〔實施例8〕

(骨強化用錠劑的調製)

以表8所示之調配量混合原材料後，藉由一般的方法成型、打錠成1g以製造本發明的骨強化用錠劑。此外，該錠劑1g中含有25mg的實施例品1的乳源鹼性蛋白質組分、50mg的實施例品4的乳清蛋白水解物。

〔實施例9〕

(骨強化液狀營養組成物的調製)

將實施例品3的乳源鹼性蛋白質組分分解物25g與實施例品5的乳清蛋白水解物50g溶解於4,925g的去離子水中，加熱至50℃後，用TK均質混合機(TKROBOMICS；特殊機化工業公司製)以6,000rpm攪拌混合30分鐘，以得到含有實施例品3之乳源鹼性蛋白質組分分解物為25g/5kg、與實施例品5之乳清蛋白水解物含量為50g/5kg的溶液。於該溶液5.0kg中，摻混酪蛋白5.0kg、大豆蛋白質5.0kg、魚油1.0kg、紫蘇油3.0kg、糊精17.0kg、礦物質混合物6.0kg、維他命混合物1.95kg、乳化劑2.0kg、安定劑4.0kg、香料0.05kg，填充至200ml的殺菌袋內，以蒸餾殺菌機(第1種壓力容器、TYPE：RCS-4CRTGN、日阪製作所製)於121℃殺菌20分鐘，以製造本發明的骨強化用液狀營養組成物50kg。此外，該骨強化用液狀營養組成物中，每100g含有50mg的實施例品3之乳源鹼性蛋白質組分分解物、100mg的實施例品5之乳清蛋白水解物。

〔實施例10〕

(骨強化用飲料的調製)

將脫脂粉乳300g溶解於408.5g的去離子水中後，溶解實施例品2之乳源鹼性蛋白質組分0.5g與實施例品5之乳清蛋白水解物1g，並加熱至50℃後，用超分散器(ULTRA-TURRAXT-25；IKA日本公司製)以9,500rpm攪拌混合30分鐘。添加麥芽糖醇100g、酸味料2g、還原糖漿20g、香料2g、去離子水166g後，填充至100ml的玻璃瓶中，於95℃、殺菌15秒鐘後加以密栓，以調製本發明的骨強化用飲料10瓶(內容量100ml)。此外，該骨強化用飲料中，每100ml含有50mg的實施例品2之乳源鹼性蛋白質組分、與100mg的實施例品5之乳清蛋白水解物。

〔實施例11〕

(狗用骨強化飼料的調製)

將實施例品1之乳源鹼性蛋白質組分1kg與實施例品7之乳清蛋白水解物2kg溶解於97kg的去離子水中，並加熱至50℃後，用TK均質混合機(MARKII 160型；特殊機化工業公司製)以3,600rpm攪拌混合40分鐘，以得到含有實施例品1的乳源鹼性蛋白質組分為1g/100g、與實施例品7的乳清蛋白水解物為2g/100g的溶液。於該乳清蛋白水解物溶液10kg中，摻混大豆粕12kg、脫脂奶粉14kg、大豆油4kg、玉米油2kg、棕櫚油23.2kg、玉米澱粉14kg、小麥粉9kg、麥麩2kg、維他命混合物5kg、纖維素2.8kg、礦物質混合物2kg，於120℃殺菌4分鐘，以製造本發明的狗用骨強化飼料100kg。此外，該狗用骨強化飼料中，每100g含有100mg的實施例品1之乳源鹼性蛋白質組分、與 200mg的實施例品7之乳清蛋白水解物。

Claims

一種骨強化劑，其係以乳源鹼性蛋白質組分及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物、與乳清蛋白水解物為有效成分；該乳源鹼性蛋白質中，按該乳源鹼性蛋白質組分之全部重量基準計，含有95重量%以上之蛋白質、脂肪、以及灰分；該蛋白質係由根據十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)換算之分子量在3,000~80,000範圍的數種蛋白質構成；該蛋白質的胺基酸組成中，按該蛋白質之全部重量基準，含有15重量%以上的鹼性胺基酸；該乳清蛋白水解物具有以下之特徵：分子量為10kDa以下、主峰為200Da~3kDa；APL(平均胜肽鏈長)為2~8；游離胺基酸含量為20%以下；抗原性為β-乳球蛋白之抗原性的1/10,000以下；該乳源鹼性蛋白質組分及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物、與乳清蛋白水解物之比率為1：2。
如申請專利範圍第1項之骨強化劑，其中該乳源鹼性蛋白質組分分解物係使用由胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及胰酶構成之群中所選出之至少1種蛋白質分解酵素，將乳源鹼性蛋白質組分予以分解而得到者。
如申請專利範圍第1或2項之骨強化劑，其中該乳源鹼性蛋白質組分係使乳或乳源原料與陽離子交換樹脂接觸以吸附鹼性蛋白質，以鹽濃度0.1M~1.0M的洗提液洗提吸附於該樹脂的組分而得到的組分。
如申請專利範圍第1項之骨強化劑，其中該乳清蛋白水解物的分解率為25%以上。
如申請專利範圍第1項之骨強化劑，其中該乳清蛋白水解物係使用耐熱性的蛋白質水解酵素在pH6~10、50~70℃邊使乳清蛋白熱變性邊進行酵素分解，並進行加熱使酵素失活而得到者。
如申請專利範圍第1項之骨強化劑，其中該乳清蛋白水解物係使用蛋白質水解酵素在pH6~10、20~55℃將乳清蛋白進行酵素分解，使其升溫至50~70℃，使用耐熱性的蛋白質水解酵素在pH6~10、50~70℃邊使未分解的乳清蛋白熱變性邊進行酵素分解，並進行加熱使酵素失活而得到者。
一種骨強化用飲食品，其特徵為包含如申請專利範圍第1至6項中任一項之骨強化劑。
一種骨強化用營養組成物，其特徵為包含如申請專利範圍第1至6項中任一項之骨強化劑。
一種骨強化用飼料，其特徵為包含如申請專利範圍第1至6項中任一項之骨強化劑。
一種骨強化用醫藥品，其特徵為包含如申請專利範圍第1至6項中任一項之骨強化劑。
一種骨強化劑之使用方法，係利用同時攝取乳源鹼性蛋白質組分及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物、與乳清蛋白水解物，該骨強化劑係以乳源鹼性蛋白質組分及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物、與乳清蛋白水解物為有效成分；該乳源鹼性蛋白質中，按該乳源鹼性蛋白質組分之全部重量基準計，含有95重量%以上之蛋白質、脂肪、以及灰分；該蛋白質係由根據十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)換算之分子量在3,000~80,000範圍的數種蛋白質構成；該蛋白質的胺基酸組成中，按該蛋白質之全部重量基準，含有15重量%以上的鹼性胺基酸；該乳清蛋白水解物具有以下之特徵：分子量為10kDa以下、主峰為200Da~3kDa；APL(平均胜肽鏈長)為2~8；游離胺基酸含量為20%以下；抗原性為β-乳球蛋白之抗原性的1/10,000以下；該乳源鹼性蛋白質組分及/或乳源鹼性蛋白質組分分解物、與乳清蛋白水解物之比率為1：2。