JP5969225B2 - 骨強化剤 - Google Patents
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Description
すなわち本発明は、以下の様態を含むものである。
(1)乳由来塩基性タンパク質画分及び/又は乳由来塩基性タンパク質画分分解物と、ホエイタンパク質加水分解物を有効成分とする骨強化剤。
(2)前記乳由来塩基性タンパク質画分分解物が、乳由来塩基性タンパク質画分を、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン及びパンクレアチンよりなる群から選択される少なくとも1種のタンパク質分解酵素を用いて分解したものである(1)に記載の骨強化剤。
(3)前記乳由来塩基性タンパク質画分が、そのアミノ酸組成中に塩基性アミノ酸を15重量%以上含有している画分である(1)又は(2)に記載の骨強化剤。
(4)前記乳由来塩基性タンパク質画分が、乳または乳由来の原料を陽イオン交換樹脂に接触させて塩基性タンパク質を吸着させ、この樹脂に吸着した画分を塩濃度0.1M〜1.0Mの溶出液で溶出して得られる画分である(1)又は(2)に記載の骨強化剤。
(5)前記ホエイタンパク質加水分解物が分解率25%以上であることを特徴とする(1)に記載の骨強化剤。
(6)前記ホエイタンパク質加水分解物が、以下の特徴を有するものである(1)に記載の骨強化剤。
(A)分子量が10kDa以下、メインピークが200Da〜3kDaである。
(B)APL(平均ペプチド鎖長)は2〜8である。
(C)遊離アミノ酸含量が20%以下である。
(D)抗原性がβ−ラクトグロブリンの抗原性の1/10,000以下である。
(7)前記ホエイタンパク質加水分解物が、ホエイタンパク質をpH6〜10、50〜70℃において耐熱性のタンパク質加水分解酵素を用いて熱変性させながら酵素分解し、加熱して酵素を失活させて得られるものであることを特徴とする(1)に記載の骨強化剤。
(8)前記ホエイタンパク質加水分解物が、ホエイタンパク質をpH6〜10、20〜55℃においてタンパク質加水分解酵素を用いて酵素分解し、これを50〜70℃に昇温させ、pH6〜10、50〜70℃において耐熱性のタンパク質加水分解酵素を用いて未分解のホエイタンパク質を熱変性させながら酵素分解し、加熱して酵素を失活させて得られるものであることを特徴とする(1)に記載の骨強化剤。
(9)(1)乃至(8)のいずれかに記載の骨強化剤を含むことを特徴とする骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品。
(10)乳由来塩基性タンパク質画分及び/又は乳由来塩基性タンパク質画分分解物と、ホエイタンパク質加水分解物を同時に摂取することによる骨強化方法。
1) ソジウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によると分子量 3,000〜80,000の範囲の数種のタンパク質よりなる。
2) 95重量%以上がタンパク質であって、その他少量の脂肪、灰分を含む。
3) タンパク質は主としてラクトフェリン及びラクトパーオキシダーゼよりなる。
4) タンパク質のアミノ酸組成は、リジン、ヒスチジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸を15重量%以上含有する。
また、本発明の乳由来塩基性タンパク質画分を得る方法としては、乳または乳由来の原料を陽イオン交換体に接触させて塩基性タンパク質を吸着させた後、この陽イオン交換体に吸着した塩基性タンパク質画分を、pH5を越え、イオン強度0.5を越える溶出液で溶出して得る方法(特開平5−202098号公報)、アルギン酸ゲルを用いて得る方法(特開昭61−246198号公報)、無機の多孔性粒子を用いて乳清から得る方法(特開平1−86839号公報)、硫酸化エステル化合物を用いて乳から得る方法(特開昭 63−255300号公報)などが知られており、本発明では、このような方法で得られた乳由来塩基性タンパク質画分を用いることができる。
さらに、乳由来塩基性タンパク質画分分解物は、乳由来塩基性タンパク質画分と同様のアミノ酸組成を有しており、例えば、上記の方法で得られた乳由来塩基性タンパク質画分にペプシン、トリプシン、キモトリプシンなどのタンパク質分解酵素を作用させ、さらに必要に応じ、パンクレアチンなどのタンパク質分解酵素を作用させることにより、平均分子量 4,000以下のペプチド組成物として得ることができる。
また、上記のように調製したホエイタンパク質加水分解物を、分画分子量1kDa〜20kDa、好ましくは、2kDa〜10kDaの限外濾過(UF)膜及び/又は分画分子量100Da〜500Da、好ましくは150Da〜300Daの精密濾過(MF)膜から選ばれる方法で濃縮することも可能である。このような膜処理により、ホエイタンパク質加水分解物の平均分子量を300〜500Daとすることによって、さらに苦味を軽減し、透明性を向上させることが可能である。
最後に、反応液を加熱して酵素を失活させる。酵素の失活は、反応液を100℃以上で10秒間以上加熱することにより行うことができる。
さらに、これらを製剤化した後に、これを栄養剤やヨーグルト、乳飲料、ウエハース等の飲食品、栄養組成物、飼料及び医薬品に配合することも可能である。
(動物実験)
実施例品1の乳由来塩基性タンパク質画分と実施例品4のホエイタンパク質加水分解物を使用して、骨強化作用について評価した。実験には6週齢のC3H/HeJマウスを使用した。マウスを、生理食塩水を投与する群(A群)、実施例品1の乳由来塩基性タンパク質画分をマウス体重1kgあたり1mg投与する群(B群)、実施例品4のホエイタンパク質加水分解物をマウス体重1kgあたり2mg投与する群(C群)、実施例品1の乳由来塩基性タンパク質画分をマウス体重1kgあたり3mg投与する群(D群)、実施例品4のホエイタンパク質加水分解物をマウス体重1kgあたり3mg投与する群(E群)、実施例品1の乳由来塩基性タンパク質画分と実施例品4のホエイタンパク質加水分解物を、それぞれマウス体重1kgあたり1mgと2mg同時に投与する群(F群)の6試験群(各群10匹ずつ)にわけた。それぞれを毎日1回ゾンデで経口投与して2週間飼育した。実施例品1、4および実施例品1と4の混合物は、それぞれ生理食塩水に懸濁して、それぞれB〜F群に経口投与した。試験終了時に、マウスの右足の脛骨の骨密度を3DマイクロX線CT((株)リガク)を用いて測定した。その結果を表4に示す。
(動物実験)
実施例品3の乳由来塩基性タンパク質画分分解物と実施例品5のホエイタンパク質加水分解物を使用して、骨強化作用について評価した。実験には51週齢のSD系雌ラットを用いた。ラットを6匹ずつ5群に分け、4群は卵巣摘出手術を施し、残りの1群は疑似手術を施した。4週間の回復期間を設け、卵巣摘出手術を施したラットに実施例品3をラット体重1kgあたり1mg(A群)、実施例品5をラット体重1kgあたり2mg(B群)、実施例品3と実施例品5を同時にラット体重1kgあたり、それぞれ1mgと2mg(C群)になるよう1日1回ゾンデで経口投与する、あるは、いずれの実施例品も含まない溶媒である生理食塩水のみを1日1回ゾンデで経口投与(対照群)して16週間飼育した。また、4週間の回復期間の後、疑似手術を施したラットには、対照群と同様に、生理食塩水のみを1日1回ゾンデで経口投与(疑似手術群)した。投与終了後(16週目)に、ラットの右大腿骨の骨強度を骨強度測定装置(RX−1600、アイテクノ)により測定した。その結果を表5に示す。
実施例品2、3の乳由来塩基性タンパク質画または乳由来塩基性タンパク質画分分解物と実施例品6、7のホエイタンパク質加水分解物について、骨芽細胞増殖効果を調べた。株化骨芽細胞(MC3T3−E1)を96穴の平板細胞培養プレートに播種し、10%ウシ胎児血清を含むα−MEM培地で24時間培養した。培地を全て除いた後、ウシ胎児血清を含まないα−MEM培地を90μlずつ添加し、実施例品2、3、6、7及び実施例品2と6の混合物、実施例品3と7の混合物を10μlずつ添加して、さらに24時間培養を続けた。Cell Proliferation kit(GEヘルスケア社製)付属のブロモデオキリウリジン(BrdU)を添加し2時間培養後、ペルオキシダーゼ標識抗BrdU抗体と反応させ、基質である3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンを添加し、450nmにおける吸光度を測定することで、細胞内に取り込まれたBrdU量を測定することにより骨芽細胞増殖活性を求めた。その結果を表6に示す。
実施例品1、3の乳由来塩基性タンパク質画または乳由来塩基性タンパク質画分分解物と実施例品4、5のホエイタンパク質加水分解物ついて、破骨細胞による骨吸収を抑制する効果を調べた。5日齡のウサギの脛骨及び大腿骨を摘出し、軟組織を除去した後、5%FBSを含むDMEM/F12培地中で機械的に細切した破骨細胞を含む全骨髄細胞を1000,000cells/wellになるように結晶性リン酸カルシウムプレート(Cornig社製)のウェル上に撒き込み、培養した。培養2時間後に、新しい培地へと交換した後、実施例品1、3及び実施例品4、5、実施例品1と5の混合物、実施例品3と4の混合物を溶解した溶液を10%濃度となるように添加して72時間培養した。そして、5%次亜塩素酸ナトリウム溶液を添加することで細胞を取り除いた後、リン酸カルシウムプレートのウェル上にできた骨吸収窩(ピット)を実体顕微鏡下で撮影し、画像解析によってその面積を測定することにより破骨細胞による骨吸収を抑制する効果を調べた(瀬野悍二ら,研究テーマ別動物培養細胞マニュアル,pp.199−200, 1993) 。その結果を表7に示す。
表8に示す配合で原材料を混合後、常法により1gに成型、打錠して本発明の骨強化用錠剤を製造した。なお、この錠剤1g中には、実施例品1の乳由来塩基性タンパク質画分が25mg、実施例品4のホエイタンパク質加水分解物が50mg含まれていた。
実施例品3の乳由来塩基性タンパク質画分分解物25gと実施例品5のホエイタンパク質加水分解物50gを4,925gの脱イオン水に溶解し、50℃まで加熱後、TKホモミクサー(TK ROBO MICS;特殊機化工業社製)にて、6,000rpmで30分間撹拌混合して、実施例品3の乳由来塩基性タンパク質画分分解物を25g/5kgと実施例品5のホエイタンパク質加水分解物含量を50g/5kgを含有する溶液を得た。この溶液5.0kgに、カゼイン5.0kg、大豆タンパク質5.0kg、魚油1.0kg、シソ油3.0kg、デキストリン17.0kg、ミネラル混合物6.0kg、ビタミン混合物1.95kg、乳化剤2.0kg、安定剤4.0kg、香料0.05kgを配合し、200mlのレトルトパウチに充填し、レトルト殺菌機 (第1種圧力容器、TYPE: RCS−4CRTGN、日阪製作所製)で121℃、20分間殺菌して、本発明の骨強化用液状栄養組成物50kgを製造した。なお、この骨強化用液状栄養組成物には、100gあたり、実施例品3の乳由来塩基性タンパク質画分分解物が50mg、実施例品5のホエイタンパク質加水分解物が100mg含まれていた。
脱脂粉乳300gを408.5gの脱イオン水に溶解した後、実施例品2の乳由来塩基性タンパク質画分0.5gと実施例品5のホエイタンパク質加水分解物1gを溶解し、50℃まで加熱後、ウルトラディスパーサー(ULTRA−TURRAX T−25;IKAジャパン社製)にて、9,500rpmで30分間撹拌混合した。マルチトール100g、酸味料2g、還元水飴20g、香料2g、脱イオン水166gを添加した後、100mlのガラス瓶に充填し、95℃、15秒間殺菌後、密栓し、本発明の骨強化用飲料10本(100ml入り)を調製した。なお、この骨強化用飲料には、100mlあたり実施例品2の乳由来塩基性タンパク質画分が50mgと実施例品5のホエイタンパク質加水分解物が100mg含まれていた。
実施例品1の乳由来塩基性タンパク質画分1kgと実施例品7のホエイタンパク質加水分解物2kgを97kgの脱イオン水に溶解し、50℃まで加熱後、TKホモミクサー(MARK II 160型;特殊機化工業社製)にて、3,600rpmで40分間撹拌混合して、実施例品1の乳由来塩基性タンパク質画分を1g/100gと実施例品7のホエイタンパク質加水分解物を2g/100g含有する溶液を得た。このホエイタンパク質加水分解物溶液10kgに大豆粕12kg、脱脂粉乳14kg、大豆油4kg、コーン油2kg、パーム油23.2kg、トウモロコシ澱粉14kg、小麦粉9kg、ふすま2kg、ビタミン混合物5kg、セルロース2.8kg、ミネラル混合物2kgを配合し、120℃、4分間殺菌して、本発明のイヌ用骨強化飼料100kgを製造した。なお、このイヌ用骨強化飼料には、100gあたり、実施例品1の乳由来塩基性タンパク質画分が100mgと実施例品7のホエイタンパク質加水分解物が200mg含まれていた。
Claims (7)
- 乳由来塩基性タンパク質画分及び/又は乳由来塩基性タンパク質画分分解物と、ホエイタンパク質加水分解物を有効成分とし、
前記乳由来塩基性タンパク質が、前記乳由来塩基性タンパク質画分の全重量基準で、95重量%以上のタンパク質と、脂肪と、灰分とを含み、
前記タンパク質が、ソジウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)換算分子量が3,000〜80,000の範囲の数種のタンパク質よりなり、
前記タンパク質のアミノ酸組成が、塩基性アミノ酸を、前記タンパク質の全重量基準で15重量%以上含有し、
前記ホエイタンパク質加水分解物が、
分子量が10kDa以下、メインピークが200Da〜3kDaであり、
APL(平均ペプチド鎖長)は2〜8であり、
遊離アミノ酸含量が20%以下であり、
抗原性がβ−ラクトグロブリンの抗原性の1/10,000以下であり、
前記乳由来塩基性タンパク質画分及び/又は乳由来塩基性タンパク質画分分解物と、前記ホエイタンパク質加水分解物の比率が1:2であることを特徴とする骨強化剤。 - 前記ホエイタンパク質加水分解物が分解率25%以上であることを特徴とする請求項1に記載の骨強化剤。
- 前記乳由来塩基性タンパク質画分が、乳または乳由来の原料を陽イオン交換樹脂に接触させて塩基性タンパク質を吸着させ、この樹脂に吸着した画分を塩濃度0.1M〜1.0Mの溶出液で溶出して得られる画分である請求項1又は請求項2のいずれか1項に記載の骨強化剤を製造する方法。
- 前記乳由来塩基性タンパク質画分分解物が、乳由来塩基性タンパク質画分を、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン及びパンクレアチンよりなる群から選択される少なくとも1種のタンパク質分解酵素を用いて分解したものである請求項1又は請求項2のいずれか1項に記載の骨強化剤を製造する方法。
- 前記ホエイタンパク質加水分解物が、ホエイタンパク質をpH6〜10、50〜70℃において耐熱性のタンパク質加水分解酵素を用いて熱変性させながら酵素分解し、加熱して酵素を失活させて得られるものであることを特徴とする請求項1又は請求項2のいずれか1項に記載の骨強化剤を製造する方法。
- 前記ホエイタンパク質加水分解物が、ホエイタンパク質をpH6〜10、20〜55℃においてタンパク質加水分解酵素を用いて酵素分解し、これを50〜70℃に昇温させ、pH6〜10、50〜70℃において耐熱性のタンパク質加水分解酵素を用いて未分解のホエイタンパク質を熱変性させながら酵素分解し、加熱して酵素を失活させて得られるものであることを特徴とする請求項1又は請求項2のいずれか1項に記載の骨強化剤を製造する方法。
- 請求項1又は請求項2のいずれか1項に記載の骨強化剤を含むことを特徴とする骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品。
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