JP2005139084A - システインプロテアーゼ阻害剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】 食品素材として幅広く利用することが可能であり、且つシステインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤、並びに各種飲食品及び飼料等に利用することが可能なシステインプロテアーゼ阻害剤を提供する。
【解決手段】 乳清蛋白質の酵素加水分解物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤に関するものであり、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌・ウイルス感染症等の予防・治療剤、並びに飲食品及び飼料等に利用することが可能なシステインプロテアーゼ阻害剤。
【選択図】 なし
【解決手段】 乳清蛋白質の酵素加水分解物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤に関するものであり、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌・ウイルス感染症等の予防・治療剤、並びに飲食品及び飼料等に利用することが可能なシステインプロテアーゼ阻害剤。
【選択図】 なし
Description
本発明は、乳清蛋白質加水分解物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤に関するものであり、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症等の予防・治療剤、並びに飲食品及び飼料等に利用することが可能なシステインプロテアーゼ阻害剤である。
活性中心にチオール基を有する蛋白分解酵素はシステインプロテアーゼ(チオールプロテアーゼ)と総称されている。カテプシンL、カテプシンB、カテプシンKは、カルシウム依存性中性プロテアーゼ(CAMP)、パパイン、フィシン、ブロメライン等とともに代表的なシステインプロテアーゼの一つである。そしてこれらシステインプロテアーゼに対して阻害作用を有する物質は、システインプロテアーゼが関与するとされる疾患、例えば筋ジストロフィー、筋萎縮症、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、頭部外傷時の意識障害や運動障害、多発性硬化症、末梢神経のニューロパシー、白内障、炎症、アレルギー、劇症肝炎、骨粗鬆症、高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、前立腺肥大症の治療薬として、あるいは癌の増殖抑制、転移予防薬、血小板の凝集阻害薬として期待される。また、近年に至り、勝沼等の研究によってカテプシンL、カテプシンB、又はカテプシンKと骨粗鬆症乃至悪性腫瘍性高カルシウム血症の関係が解明され、それによって、とりわけカテプシンL阻害剤の骨粗鬆症治療剤乃至悪性腫瘍性高カルシウム血症治療剤としての医薬への適用が注目されつつある(例えば、非特許文献1を参照)。骨組織においては、骨芽細胞(osteoblast)による骨形成と、破骨細胞(osteoclast)による骨吸収が生涯を通じて行われており、成長期には骨形成が骨吸収を上回ることにより骨重量が増加し、一方老年期には逆に骨吸収が骨形成を上回るために骨重量が減少し、骨粗鬆症の発症となる。これら骨粗鬆症の原因としては様々なものがあるが、特に骨崩壊(骨吸収)を主原因の一つとして挙げることができる。これを更に2つの原因に分けると次のようになる。即ち、一つはカルシウムの吸収と沈着不全に起因するものであり、更に詳しくはカルシウムの供給量、転送、吸収、及び沈着が関係するものであり、ビタミンD誘導体、女性ホルモン(エストロゲン)等が関与していると考えられる。いま一つは、骨支持組織であるコラーゲンの分解促進を内容とするものであり、破骨細胞内リソゾームから分泌されるシステインプロテアーゼ群、中でも特にカテプシンL、カテプシンB、又はカテプシンKによる骨コラーゲン分解が主たる原因である。破骨細胞内のリソゾームから分泌されたこれらカテプシンL、カテプシンB、又はカテプシンKは骨組織中のコラーゲンの分解を促進し、それによって古い骨は溶解され、ヒドロキシプロリンとともにカルシウムが血中に遊離放出させられる。従って、カテプシンL、カテプシンB、又はカテプシンKのコラーゲン分解能を阻害することによって過剰な骨崩壊を防止することが可能であり、ひいては骨粗鬆症の治療が可能となる。これら骨粗鬆症の治療剤としては、エストロゲン、タンパク同化ホルモン、カルシウム剤、ビタミンD、カルシトニン、あるいはビスホスホネート等が知られている。またカテプシンL阻害、カテプシンB阻害、又はカテプシンK阻害のいわゆるシステインプロテアーゼ阻害を作用機序とする骨粗鬆症治療剤についてもいくつかのシステインプロテアーゼ阻害剤をもちいた骨粗鬆症治療剤の開発が進められているが、さらなる骨粗鬆症治療剤の開発が望まれている。
一方、高カルシウム血症は、血清中のカルシウム濃度が正常値以上となる代謝異常であり、腫瘍患者に多く見受けられる。これを放置した場合、患者の寿命は10日程度であると言われている。原因の多くは腫瘍の骨転移である。腫瘍が骨に転移すると、骨破壊が起こり、カルシウムが血中に放出される。このカルシウムは腎臓で処理されるが、骨破壊のスピードが腎臓の処理能力を上回ったとき、高カルシウム血症の発現となる。治療方法としては、フロセミドを併用した生理的食塩水の輸液を用いることにより腎臓からのカルシウム排泄を促進する方法や、骨粗鬆症治療薬であるカルシトニンを使用する方法等が知られている。即ち、骨吸収を抑制するがごとき骨粗鬆症治療薬は悪性腫瘍性高カルシウム血症の治療剤としても有効であるといえる。
本発明者らにより、このような目的に使用し得るシステインプロテアーゼ阻害剤としてすでに以下の公報を開示している。
(a)カテプシンL特異的阻害ポリペプチド(特許文献1)
(b)チオールプロテアーゼ阻害剤(特許文献2)
(c)バリン誘導体およびその用途(特許文献3)
(d)チオールプロテアーゼ阻害剤(特許文献4)
(e)FA−70C1物質(特許文献5)
(f)FA−70D物質、その製造法及びその用途(特許文献6)
しかしながら、食品素材として利用の点から、より汎用性の高いシステインプロテアーゼ阻害剤の開発が望まれていた。
(a)カテプシンL特異的阻害ポリペプチド(特許文献1)
(b)チオールプロテアーゼ阻害剤(特許文献2)
(c)バリン誘導体およびその用途(特許文献3)
(d)チオールプロテアーゼ阻害剤(特許文献4)
(e)FA−70C1物質(特許文献5)
(f)FA−70D物質、その製造法及びその用途(特許文献6)
しかしながら、食品素材として利用の点から、より汎用性の高いシステインプロテアーゼ阻害剤の開発が望まれていた。
本発明は、食品素材として幅広く利用することが可能であり、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症等の予防・治療剤、並びに各種飲食品及び飼料等に利用することが可能な、汎用性の高いシステインプロテアーゼ阻害剤を提供することを目的としている。
前記課題を解決する本発明の第一の発明は、乳清蛋白質を加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、システインプロテアーゼ阻害作用を有する乳清蛋白質加水分解物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤であって、以下の(1)〜(5)を望ましい態様としている。
(1)前記加水分解酵素が、動物又は微生物由来の加水分解酵素から選択される1種又は複数種であること。
(2)前記乳清蛋白質加水分解物の分解率が6〜25%であること。
(3)前記乳清蛋白質加水分解物を全量に対して0.005質量%以上含有すること。
(4)前記システインプロテアーゼ阻害剤が、システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤であること。
(5)前記(4)に記載のシステインプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌・ウイルス感染症のいずれかであること。
前記課題を解決する本発明の第二の発明は、第一の発明に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤を添加してなる飲食品組成物又は飼料組成物である。
(1)前記加水分解酵素が、動物又は微生物由来の加水分解酵素から選択される1種又は複数種であること。
(2)前記乳清蛋白質加水分解物の分解率が6〜25%であること。
(3)前記乳清蛋白質加水分解物を全量に対して0.005質量%以上含有すること。
(4)前記システインプロテアーゼ阻害剤が、システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤であること。
(5)前記(4)に記載のシステインプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌・ウイルス感染症のいずれかであること。
前記課題を解決する本発明の第二の発明は、第一の発明に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤を添加してなる飲食品組成物又は飼料組成物である。
本発明は乳清蛋白質加水分解物を有効成分とするシステインプロテアーゼ阻害剤に関するものであり、本発明により奏される効果は次のとおりである。
(1)乳中に含まれるタンパク質の加水分解物であるので、食品素材として幅広く利用できる点で優れ、日常的に長期間投与又は摂取が可能である。
(2)幅広いシステインプロテアーゼに対して阻害活性スペクトルを有する。
(3)システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤として使用することが可能である。
(1)乳中に含まれるタンパク質の加水分解物であるので、食品素材として幅広く利用できる点で優れ、日常的に長期間投与又は摂取が可能である。
(2)幅広いシステインプロテアーゼに対して阻害活性スペクトルを有する。
(3)システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤として使用することが可能である。
次に、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤は、乳清蛋白質を加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、システインプロテアーゼ阻害作用を有する乳清蛋白加水分解物を有効成分として含有する。本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤製造の出発物質として用いる乳清蛋白質は、乳清蛋白質を主成分とするものであれば、如何なるものでも使用することができるが、市販の各種乳清蛋白質、例えば、乳清蛋白質濃縮物(WPC)、乳清蛋白質単離物(WPI)等が望ましい。また、牛乳、脱脂乳、全脂粉乳、脱脂粉乳から乳清蛋白質を常法により精製することもできる。
次に、具体的に乳清蛋白質を加水分解酵素で加水分解する方法を説明する。
前記に示すような原料乳清蛋白質を水又は温湯に分散し、溶解する。該溶解液の濃度は格別の制限はないが、通常、蛋白質換算で5〜15%前後の濃度範囲にするのが効率性及び操作性の点から望ましい。また、前記乳清蛋白質を含有する溶液を70〜90℃で10分間〜15秒間程度加熱殺菌することが、雑菌汚染による変敗防止の点から望ましい。
前記に示すような原料乳清蛋白質を水又は温湯に分散し、溶解する。該溶解液の濃度は格別の制限はないが、通常、蛋白質換算で5〜15%前後の濃度範囲にするのが効率性及び操作性の点から望ましい。また、前記乳清蛋白質を含有する溶液を70〜90℃で10分間〜15秒間程度加熱殺菌することが、雑菌汚染による変敗防止の点から望ましい。
次いで、前記乳清蛋白質を含有する溶液にアルカリ剤又は酸剤を添加し、pHを使用する加水分解酵素の至適pH又はその付近に調整することが好ましい。本発明の方法に使用するアルカリ剤又は酸剤は、食品又は医薬品に許容されるものであれば如何なるアルカリ剤又は酸剤であってもよい。具体的には、アルカリ剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム等を、酸剤としては、塩酸、クエン酸、リン酸、酢酸等を例示することができる。
次いで、前記乳清蛋白溶液に加水分解酵素溶液を添加する。加水分解酵素は蛋白質を加水分解する酵素であれば特に制限されず、エンドペプチダーゼであることが好ましい。エンドペプチダーゼとしては動物由来又は微生物由来が例示され、種々の酵素を使用することができる。中でも、動物由来としてトリプシン、微生物由来としてバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)由来のプロテアーゼ、乳酸菌由来のプロテアーゼ等を好ましいものとして例示することができる。尚、「由来」とは、元来上記の生物が保持していることを意味し、採取原を意味するものではない。例えば、バチルス・ズブチリスが産生するプロテアーゼをコードする遺伝子をエシェリヒア・コリに導入し、同遺伝子を発現させることにより製造したプロテアーゼは、バチルス・ズブチリス「由来」である。
前記酵素を乳清蛋白質1g当たり20〜200活性単位(この単位については後記する)の割合で添加する。活性単位は、次の方法により測定する。プロテアーゼを含有する粉末を0.2g/100mlの割合で0.1モルのリン酸緩衝液(pH7.0)に分散又は溶解して酵素溶液を調製する。一方、ロイシルパラニトロアニリド(国産化学社製。以後Leu−pNAと記載する)を0.1モルのリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解して2mMの基質溶液を調製する。酵素溶液1mlに基質溶液1mlを添加し、37℃で5分間反応させ、その後30%の酢酸溶液2mlを添加して反応を停止させる。反応液をメンブランフィルターで濾過し、波長410nmで濾液の吸光度を測定する。プロテアーゼの活性単位は、1分間に1μmolのLeu−pNAを分解するのに必要な酵素量を1活性単位と定義し、次式により求める。
活性単位(粉末1g当たり)=20×(A/B)
ただし、前記の式においてA及びBは、それぞれ波長410nmにおける試料の吸光度及び0.25mMパラニトロアニリンの吸光度を示す。
ただし、前記の式においてA及びBは、それぞれ波長410nmにおける試料の吸光度及び0.25mMパラニトロアニリンの吸光度を示す。
本発明において用いる加水分解酵素は1種でもよく、2種以上用いてもよい。2種以上の酵素を用いる場合は、それぞれの酵素反応は同時に行ってもよく、別々に行ってもよい。酵素を添加した溶液を、酵素の種類に応じて適当な温度、例えば30〜60℃、望ましくは45〜55℃に保持して乳清蛋白質の加水分解を開始する。加水分解反応時間は、酵素反応の分解率をモニターしながら、好ましい分解率に達するまで反応を続ける。本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤の有効成分である乳清蛋白加水分解物を得るためには、分解率は6〜25%が好ましく、8.5〜18%において特に好ましい。尚、蛋白質の分解率の算出方法は、ケルダール法(日本食品工業学会編、「食品分析法」、第102頁、株式会社光琳、昭和59年)により試料の全窒素量を測定し、ホルモール滴定法(満田他編、「食品工学実験書」、上巻、第547ページ、養賢堂、1970年)により試料のホルモール態窒素量を測定し、これらの測定値から分解率を次式により算出する。
分解率(%)=(ホルモール態窒素量/全窒素量)×100
酵素反応の停止は、加水分解液中の酵素の失活により行われ、常法による加熱失活処理により実施することができる。加熱失活処理の加熱温度と保持時間は、使用した酵素の熱安定性を考慮し、十分に失活できる条件を適宜設定することができるが、例えば、80〜130℃の温度範囲で30分間〜2秒間の保持時間で行うことができる。得られた反応液はクエン酸等の酸によりpHを5.5〜7の範囲に調整することが好ましい。
得られた乳清蛋白質加水分解物を含有する溶液は、そのまま使用することも可能であり、また、必要に応じて、この溶液を公知の方法により濃縮した濃縮液として、更に、この濃縮液を公知の方法により乾燥した粉末として使用することもできる。
上記のようにして得られる乳清蛋白質加水分解物は、システインプロテアーゼ阻害作用を有する。したがって、システインプロテアーゼ阻害作用を指標として、乳清蛋白質加水分解物を製造する際の条件を適宜設定することができる。
本発明に用いることができる乳清蛋白質加水分解物は、カテプシンB、L、K及びパパイン等のシステインプロテアーゼに対して阻害活性を有する。システインプロテアーゼ阻害活性は、バレット(Barrett)等の方法[メソッド・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology)、第80巻、第535〜561ページ、1981年]に従って測定することができる。すなわち、0.1M酢酸緩衝液pH5.5に溶解した乳清蛋白質消化物溶液に、基質としてZ−Phe−Arg−MCA(最終濃度20mM:ペプチド研究所社製)等を添加し、システインプロテアーゼ(本試験ではパパイン:シグマ社製)溶液(最終濃度:15units/ml)を添加して混合し、37℃で10分間反応させた後、消化を受けた基質から遊離したAMCの蛍光強度(励起波長:370nm、発光波長:460nm)を蛍光分光度計(日立社製)を用いて測定した。
本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤の有効成分である乳清蛋白加水分解物は、乳由来の天然物であって、摂取した場合の安全性が高く、牛乳等の食品中に含有され、日常的に摂取されており、毒性を示さず、長期間連続的に摂取しても副作用がほとんど認められない。従って、本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤は乳清蛋白質加水分解物、若しくはこれらを製剤学的に許容される製剤担体と組合わせて、経口的、又は非経口的にヒトを含む哺乳動物に投与することができる。本発明の製剤の投与単位形態は特に限定されず、治療目的に応じて適宜選択でき、具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤等を例示できる。製剤化にあたっては製剤担体として通常の薬剤に汎用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。また、公知の、もしくは将来的に見出されるシステインプロテアーゼ阻害作用を有する薬剤を併用することもできる。
本発明の製剤中に含まれる乳清蛋白質加水分解物の量は特に限定されず適宜選択すればよいが、例えばいずれも通常製剤中に0.005〜80質量%、好ましくは0.02〜60質量%とするのがよい。本発明の製剤の投与方法は特に限定されず、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、患者の症状の程度等に応じて決定される。本発明の製剤の有効成分の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件等により適宜選択される。通常有効成分としての乳清蛋白質加水分解物の量は、0.1〜1200mg/kg/日、好ましくは10〜500mg/kg/日の範囲となる量を目安とするのが良く、1日1回又は複数回に分けて投与することができる。
本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤は、システインプロテアーゼが関与する疾患、例えばアレルギー、筋ジストロフィー、筋萎縮症、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、多発性硬化症、白内障、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、前立腺肥大症、乳癌、前立腺癌、歯周病等の予防・治療剤、若しくは癌細胞の増殖や転移の抑制剤、又は細菌(スタフィロコッカス・アウレウスV8等)やウイルス(ポリオウイルス、ヘルペスウイルス、コロナウイルス、エイズウイルス等)の増殖抑制剤として有用である。本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤は、単独で使用しても良いが、公知の前記疾患の予防・治療剤、又は前記細菌・ウイルス増殖抑制剤と併用して使用することも可能である。併用することによって、前記疾患の予防・治療効果、又は前記細菌・ウイルス増殖抑制効果を高めることができる。併用する前記疾患の予防・治療剤、又は前記細菌・ウイルス増殖抑制剤は、本発明の組成物中に有効成分として含有させても良いし、本発明の組成物中には含有させずに別個の薬剤として組み合わせて商品化して使用時に組み合わせても良い。
本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤は、乳清蛋白加水分解物を有効成分として食品中や飼料中に含有させ、システインプロテアーゼ阻害剤の一態様として、システインプロテアーゼ阻害効果の機能を有する飲食品組成物又は飼料組成物として加工することも可能である。この場合、システインプロテアーゼ阻害作用の効果を発揮させるために必要な乳清蛋白加水分解物の配合量は、システインプロテアーゼ阻害剤中の配合量として、有効成分を最終組成物に対し少なくとも0.005〜80質量%、好ましくは0.02〜60質量%含有されていることが好ましい。
次に試験例を示して本発明を詳細に説明する。
[試験例1]
本試験は、乳清蛋白質酵素加水分解物のシステインプロテアーゼ阻害効果を測定するために行った。
(1)試料の調製
市販の乳清蛋白質濃縮物(以下WPCと記載することがある。ミライ社製)について、1検体当り100gを50℃に加熱した精製水で12%濃度に溶解し、3検体を用意した。その後各検体について75℃で15分間殺菌を行い、さらに各検体を40℃に保温した。分解後の分解率が8.5%、18.0%又は26.5%となるように各検体にブタトリプシン(PTN6.0S;ノボザイム社製、1250 units/g)及び/又はパンクレアチン(天野エンザイム社製、112,000 units/g)を添加して、40℃で6時間保持することによって加水分解した。次いで90℃で10分間加熱処理して酵素を失活させ、分解率が8.5%の検体を試験試料1、18.0%の検体を試験試料2、26.5%の検体を試験試料3として、各試験試料を調製した。尚、試験試料1、試験試料2、及び試験試料3の数平均分子量(ダルトン)は、それぞれ1070、480及び380であった。
[試験例1]
本試験は、乳清蛋白質酵素加水分解物のシステインプロテアーゼ阻害効果を測定するために行った。
(1)試料の調製
市販の乳清蛋白質濃縮物(以下WPCと記載することがある。ミライ社製)について、1検体当り100gを50℃に加熱した精製水で12%濃度に溶解し、3検体を用意した。その後各検体について75℃で15分間殺菌を行い、さらに各検体を40℃に保温した。分解後の分解率が8.5%、18.0%又は26.5%となるように各検体にブタトリプシン(PTN6.0S;ノボザイム社製、1250 units/g)及び/又はパンクレアチン(天野エンザイム社製、112,000 units/g)を添加して、40℃で6時間保持することによって加水分解した。次いで90℃で10分間加熱処理して酵素を失活させ、分解率が8.5%の検体を試験試料1、18.0%の検体を試験試料2、26.5%の検体を試験試料3として、各試験試料を調製した。尚、試験試料1、試験試料2、及び試験試料3の数平均分子量(ダルトン)は、それぞれ1070、480及び380であった。
(2)試験方法
0.1M酢酸緩衝液pH5.5に溶解した試験試料溶液に、基質としてZ−Phe−Arg−MCA(最終濃度20mM:ペプチド研究所社製)を添加し、システインプロテアーゼであるパパイン溶液(最終濃度15units/ml)を添加して混合し、37℃で10分間反応させた後、消化を受けた基質から遊離したAMCの蛍光強度(励起波長:370nm、発光波長:460nm)を蛍光分光度計(日立製作所社製)を用いて測定した。
0.1M酢酸緩衝液pH5.5に溶解した試験試料溶液に、基質としてZ−Phe−Arg−MCA(最終濃度20mM:ペプチド研究所社製)を添加し、システインプロテアーゼであるパパイン溶液(最終濃度15units/ml)を添加して混合し、37℃で10分間反応させた後、消化を受けた基質から遊離したAMCの蛍光強度(励起波長:370nm、発光波長:460nm)を蛍光分光度計(日立製作所社製)を用いて測定した。
(3)試験結果
本試験の結果は、表1に示すとおりである。表1は、各試験試料のシステインプロテアーゼ阻害活性を示す。その結果、試験試料1は、0.2mg/mlの濃度で、パパインによるシステインプロテアーゼ活性を11%阻害した。一方、試験試料2は、パパインによるシステインプロテアーゼ活性を、0.05mg/mlの濃度で27%阻害し、0.1mg/mlで45%阻害し、更に0.2mg/mlで60%阻害した。また、試験試料3は、いずれの濃度においても、パパインによるシステインプロテアーゼ活性の阻害作用は認められなかった。
本試験の結果は、表1に示すとおりである。表1は、各試験試料のシステインプロテアーゼ阻害活性を示す。その結果、試験試料1は、0.2mg/mlの濃度で、パパインによるシステインプロテアーゼ活性を11%阻害した。一方、試験試料2は、パパインによるシステインプロテアーゼ活性を、0.05mg/mlの濃度で27%阻害し、0.1mg/mlで45%阻害し、更に0.2mg/mlで60%阻害した。また、試験試料3は、いずれの濃度においても、パパインによるシステインプロテアーゼ活性の阻害作用は認められなかった。
以上の結果から、乳清蛋白質加水分解物の分解率が8.5%の試料(試験試料1)が0.2mg/mlでシステインプロテアーゼ阻害活性を示し、18.0%の試料(試験試料2)において、最も好ましいシステインプロテアーゼ阻害活性を示すことが判明した。
ここで、本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤の有効成分として使用した乳清蛋白質加水分解物の製造例を以下に示す。
[製造例1]
市販乳清蛋白質濃縮物(ミライ社製)100gを50℃に加熱した精製水に12%濃度に懸濁し、2.5gの水酸化ナトリウムを加えて完全に溶解した。その後、75℃で10分間殺菌を行い、溶解液を40℃に調整した。次いで、加水分解酵素としてブタトリプシン(PTN6.0S;ノボザイム社製、1250units/g)を1500units添加し、40℃で6時間保持することによって加水分解し、90℃で10分間加熱処理して酵素を失活した後、凍結乾燥を行った。これにより分解率18.0%、数平均分子量480ダルトンの乳清蛋白質加水分解物約100gを製造した。
[製造例1]
市販乳清蛋白質濃縮物(ミライ社製)100gを50℃に加熱した精製水に12%濃度に懸濁し、2.5gの水酸化ナトリウムを加えて完全に溶解した。その後、75℃で10分間殺菌を行い、溶解液を40℃に調整した。次いで、加水分解酵素としてブタトリプシン(PTN6.0S;ノボザイム社製、1250units/g)を1500units添加し、40℃で6時間保持することによって加水分解し、90℃で10分間加熱処理して酵素を失活した後、凍結乾燥を行った。これにより分解率18.0%、数平均分子量480ダルトンの乳清蛋白質加水分解物約100gを製造した。
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
(乳清蛋白質加水分解物を配合した錠剤の調製)
次の組成からなる錠剤のシステインプロテアーゼ阻害剤を次の方法により製造した。
次の組成からなる錠剤のシステインプロテアーゼ阻害剤を次の方法により製造した。
製造例1で製造した乳清蛋白質加水分解物 40.0(%)
乳糖(森永乳業社製) 18.5
トウモロコシ澱粉(日清製粉社製) 30.7
ステアリン酸マグネシウム(太平化学産業社製) 1.4
カルボキシメチルセルロ−スカルシウム(五徳薬品社製) 9.4
乳清蛋白質加水分解物、乳糖、トウモロコシ澱粉及びカルボキシメチルセルロ−スカルシウムの混合物に、滅菌精製水を適宜添加しながら均一に混練し、50℃で3時間乾燥させ、得られた乾燥物にステアリン酸マグネシウムを添加して混合し、常法により打錠し、錠剤を得た。
乳糖(森永乳業社製) 18.5
トウモロコシ澱粉(日清製粉社製) 30.7
ステアリン酸マグネシウム(太平化学産業社製) 1.4
カルボキシメチルセルロ−スカルシウム(五徳薬品社製) 9.4
乳清蛋白質加水分解物、乳糖、トウモロコシ澱粉及びカルボキシメチルセルロ−スカルシウムの混合物に、滅菌精製水を適宜添加しながら均一に混練し、50℃で3時間乾燥させ、得られた乾燥物にステアリン酸マグネシウムを添加して混合し、常法により打錠し、錠剤を得た。
(乳清蛋白質加水分解物を添加した飲料の調製)
脱脂粉乳(森永乳業社製)90gを50℃の温湯800mlに溶解し、砂糖(日新製糖社製)30g、インスタントコーヒー粉末(ネスレ社製)14g、カラメル(昭和化工社製)2g、及びコーヒーフレーバー(三栄化学社製)0.01g、を攪拌しながら順次添加して溶解し、10℃に冷却し、製造例1で製造した乳清蛋白質加水分解物1gを添加し、乳清蛋白質加水分解物約0.1%を含むシステインプロテアーゼ阻害効果を有する乳飲料を調製した。
脱脂粉乳(森永乳業社製)90gを50℃の温湯800mlに溶解し、砂糖(日新製糖社製)30g、インスタントコーヒー粉末(ネスレ社製)14g、カラメル(昭和化工社製)2g、及びコーヒーフレーバー(三栄化学社製)0.01g、を攪拌しながら順次添加して溶解し、10℃に冷却し、製造例1で製造した乳清蛋白質加水分解物1gを添加し、乳清蛋白質加水分解物約0.1%を含むシステインプロテアーゼ阻害効果を有する乳飲料を調製した。
本発明は乳清蛋白質加水分解物を有効成分とするシステインプロテアーゼ阻害剤に関するものであって、有効成分が乳中に含まれるタンパク質の加水分解物であるので、食品素材として幅広く利用する点で優れ、日常的に長期間投与又は摂取が可能である。また、幅広いシステインプロテアーゼに対して阻害活性スペクトルを有することから、システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤として使用することが可能である。
Claims (7)
- 乳清蛋白質を加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、システインプロテアーゼ阻害作用を有する乳清蛋白質加水分解物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤。
- 前記加水分解酵素が、動物又は微生物由来の加水分解酵素から選択される1種又は複数種である請求項1に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
- 前記乳清蛋白質加水分解物の分解率が6〜25%である請求項1又は請求項2に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
- 乳清蛋白質加水分解物を全量に対して0.005質量%以上含有する請求項1〜請求項3のいずれか一項に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
- システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤である請求項1〜請求項4のいずれか一項に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
- システインプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌・ウイルス感染症のいずれかである請求項5に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
- 請求項1〜請求項6のいずれか一項に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤を添加してなる飲食品組成物又は飼料組成物。
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