JP7372046B2

JP7372046B2 - ペプチド

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Publication number: JP7372046B2
Application number: JP2019077626A
Authority: JP
Inventors: 武彦安枝; 泰幸瀬戸
Original assignee: Megmilk Snow Brand Co Ltd
Current assignee: Megmilk Snow Brand Co Ltd
Priority date: 2019-04-16
Filing date: 2019-04-16
Publication date: 2023-10-31
Anticipated expiration: 2039-04-16
Also published as: JP2020176069A

Description

本発明は、破骨細胞による骨吸収を抑制する作用を有し、骨強化作用に優れ、骨粗鬆症や骨折治療、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有効であるペプチドに関する。さらに、本発明は、該ペプチドを含有する、骨強化剤、骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品に関する。

近年、世界的規模で、高齢化等に伴い、骨粗鬆症や骨折あるいは腰痛などの種々の骨に関連する疾患が増加しており、大きな社会問題となっている。これは、カルシウムの摂取不足やカルシウム吸収能力の低下、閉経後のホルモンのアンバラスなどが原因であるとされている。骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患を予防するためには、若齢期から骨芽細胞による骨形成を促進して体内の骨量をできるだけ増加させ、最大骨量や骨強度（骨密度＋骨質）を高めることが有効であるとされている。なお、骨質とは、骨の微細構造や代謝回転、微小骨折、石灰化を指すものである。また、骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患を予防する方法としては、破骨細胞による骨吸収を抑制することも考えられる。骨はバランスのとれた吸収と形成を絶えず繰り返している（リモデリング）が、閉経後のホルモンのバランス変化等により、骨吸収が骨形成を上回り、これが骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患の原因となる。したがって、破骨細胞による骨吸収を抑制して骨強度を一定に保つことにより、結果的に骨を強化することが可能である。

このような現状から、骨を強化する目的で、炭酸カルシウムやリン酸カルシウム、乳酸カルシウムなどのカルシウム塩ならびに乳清カルシウムや牛骨粉、卵殻などの天然カルシウム剤を、それぞれ単独で医薬品や飲食品、飼料などに添加して摂取する、あるいは、これらのカルシウム剤をカゼインホスホペプチドやオリゴ糖などのカルシウム吸収促進効果を有する物質と共に医薬品や飲食品、飼料などに添加して摂取している。しかしながら、これらのカルシウム塩や天然カルシウム剤を飲食品に添加して摂取した場合、カルシウムの吸収率は５０％以下であり、半分以上のカルシウムが吸収されず体外に排出されてしまうといわれている。また、体内に吸収されたカルシウムも、その形態や同時に摂取される他の栄養成分の種類によって骨への親和性が異なるので、必ずしも骨代謝の改善や骨強化作用を示さないこともある。

その他、骨粗鬆症治療や骨強化のための医薬として、女性ホルモン製剤や活性型ビタミンＤ３製剤やビタミンＫ２製剤、ビスフォスフォネート製剤、カルシトニン製剤などが知られており、抗ＲＡＮＫＬ抗体などの新薬開発が進められている。しかし、これらの医薬品を用いた場合、耳鳴り、頭痛、食欲不振などの副作用を伴うことがある。また、服用期間に制限があるものもある。さらに、これらの物質は安全性及びコストなどの面から、現在のところ飲食品に添加することができない状況にある。したがって、骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患の疾病の性質から、長期的に副作用が無く、摂取することができ、骨形成促進的及び／または骨吸収抑制的に作用して骨強度を高め、その予防または治療効果が期待できるような骨強化剤や、骨強化剤を含有する飲食品、飼料の開発が望まれている。

こうしたなかで、最近の研究成果として、例えば、天然植物由来の抽出物が、骨形成を促進することが報告されている（例えば、特許文献１や特許文献２）。また、例えば食品由来成分として、卵黄タンパク質を加水分解処理したペプチドを含む組成物が、骨形成を促進することが報告されている（特許文献３）。しかしながら、これらは植物由来の抽出物あるいは卵黄タンパク質加水分解物を含む、組成物の骨強化作用であり、特定の配列のペプチドに骨吸収抑制作用を通じた骨強化作用があることはこれまで知られていなかった。

特開２０１７－２０９１０８号公報特表２０１７－５２４６７１号公報特開２０１３－２２４２７７号公報

本発明の課題は、破骨細胞による骨吸収を抑制する作用があり、骨を強化することができ、骨粗鬆症や骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有用である骨強化作用を有する素材を提供することである。また、本発明の課題は、破骨細胞による骨吸収を抑制する作用があり、骨を強化することができ、骨粗鬆症や骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有用である骨強化作用を有する素材を配合した骨強化剤、骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を進めた結果、多数存在するジペプチドまたはトリペプチドの中から特定配列のジペプチドあるいはトリペプチドに骨強化作用があることを見出したことにもとづく発明であり、以下の構成が含まれる。
（１）Ｉｌｅ－Ａｒｇ、Ｉｌｅ－Ｇｌｎ、Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ｓｅｒ－Ｐｒｏ、Ｌｙｓ－Ｇｌｙ、Ｔｈｒ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ、Ｌｅｕ－Ｇｌｕ、Ａｓｎ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒからなる群から選択される１つ以上のペプチドを有効成分として含む骨強化用組成物。
（２）前記（１）に記載の骨強化用組成物を含むことを特徴とする骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品。

本発明の骨強化用組成物は、安全性が高く、破骨細胞の分化ならびに該細胞による骨吸収を抑制する作用を介した骨強化作用が顕著であり、該骨強化用組成物は、骨粗鬆症や骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有用である。また、本発明は、破骨細胞の分化ならびに該細胞による骨吸収を抑制する作用があり、骨を強化することができ、骨粗鬆症や骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有用である骨強化用組成物を配合した骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品を提供するものである。

本発明のＩｌｅ－Ａｒｇ、Ｉｌｅ－Ｇｌｎ、Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ｓｅｒ－Ｐｒｏ、Ｌｙｓ－Ｇｌｙ、Ｔｈｒ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ、Ｌｅｕ－Ｇｌｕ、及び／またはＡｓｎ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒの配列からなるペプチドについて、以下に詳細に説明する。

（本発明のペプチドとその製造方法）
本発明のペプチドは、Ｉｌｅ－Ａｒｇ、Ｉｌｅ－Ｇｌｎ、Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ｓｅｒ－Ｐｒｏ、Ｌｙｓ－Ｇｌｙ、Ｔｈｒ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ、Ｌｅｕ－Ｇｌｕ、及びＡｓｎ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒからなる群からから選択される１つ以上を用いることができる。
これらのペプチドは、上記した配列を有するものであればどのように調製されたものでもよく、調製方法としてペプチド合成装置を用いた固相法、液相法などの化学合成法、遺伝子工学的手法、酵素工学的手法、微生物による産生等を例示できる。また、精製され、市販されているペプチドを使用することも可能である。さらに、該アミノ酸配列を有する各種のタンパク質やペプチドを原料に、タンパク質加水分解酵素を用いて酵素分解して得ることもできる。原料とするタンパク質に制限はないが、動物性タンパク質や植物性タンパク質を用いることが可能であり、例えば、牛乳、卵、大豆、小麦、とうもろこし、牛肉、鶏肉、豚肉などが挙げられる。

（ペプチドの摂取量）
本発明のペプチドの摂取量は、破骨細胞の分化ならびに該細胞による骨吸収を抑制する作用を介した骨強化作用を示す量であれば特に制限はないが、Ｉｌｅ－Ａｒｇ、Ｉｌｅ－Ｇｌｎ、Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ｓｅｒ－Ｐｒｏ、Ｌｙｓ－Ｇｌｙ、Ｔｈｒ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ、Ｌｅｕ－Ｇｌｕ、及び／またはＡｓｎ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒからなる群から選択されるペプチドを成人１日あたり０．１ｍｇ以上摂取すればよく、１ｍｇ以上が好ましく、１０ｍｇ以上がさらに好ましく、５０ｍｇ以上が最も好ましい。前記群から複数種のペプチドを摂取する場合は、その合計量が上記量以上になればよい。本発明のペプチドは、そのまま経口摂取してもよいが、飲食品、栄養組成物、飼料および経口用医薬等への配合する場合は、上記した摂取量となるように配合量を調整すればよい。なお、非経口医薬の場合は、経口投与した場合の上記投与量と同等の効果を示す有効量を投与すればよい。

（本発明のペプチドの飲食品及び医薬品への使用方法について）
本発明のペプチドは、それぞれを単独もしくは、任意の組み合わせでそのまま骨強化用組成物として使用してもよいが、破骨細胞の分化ならびに該細胞による骨吸収を抑制する作用を介した骨強化作用を失わない範囲で必要に応じて常法に従い、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等に製剤化して用いることもできる。また、そのまま又は製剤化した後に、栄養剤や粉乳、乳飲料、乳酸菌飲料、発酵乳、清涼飲料水、チーズ、マーガリン、クリーム、プリン、ゼリー、ウエハース等の飲食品、栄養組成物、飼料及び医薬品に配合することも可能である。
本発明のペプチドは、他の飲食品、飼料及び医薬に通常含まれる安定剤や糖類、脂質、フレーバー、ビタミン、ミネラル、フラボノイド、ポリフェノール等の原材料とともに使用することができる。

製剤化に際しては、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤等の希釈剤又は賦形剤を用いることができる。賦形剤としては、例えばショ糖、乳糖、デンプン、結晶性セルロース、マンニット、軽質無水珪酸、アルミン酸マグネシウム、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素カルシウム、カルボキシルメチルセルロースカルシウム等の１種又は２種以上を組み合わせて加えることができる。

以下に実施例、試験例を示し、本発明について詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

（実施例１）
カゼインタンパク質１０％水溶液５Ｌに、パパイン５０Ｕ／ｇ・カゼインタンパク質及びプロレザー(天野エンザイム社製)１５０Ｕ／ｇ・カゼインタンパク質を加え、ｐＨ８に調整し、５５℃において６時間カゼインタンパク質を変性させながら酵素分解を行った。反応液を１００℃で１５秒間以上加熱して酵素を失活させ、遠心分離して上清を回収して、カゼインタンパク質加水分解物を得た。このカゼインタンパク質加水分解物をＳｕｐｅｒｄｅｘＰｅｐｔｉｄｅ（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに通液し、分子サイズで分画し、平均分子量２００～３５０Ｄａの画分を得た。この画分を、Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ１２０ＳＢ－Ｃ１８（アジレント・テクノロジー社製）を充填した逆相カラムに通液して、Ｉｌｅ－Ｇｌｎ、Ｓｅｒ－Ｐｒｏ、Ｔｈｒ－Ｐｒｏを含む画分をそれぞれ回収した。これらのフラクションを凍結乾燥して、Ｉｌｅ－Ｇｌｎ、Ｓｅｒ－Ｐｒｏ、Ｔｈｒ－Ｐｒｏ（実施例品１）を得た。これらＩｌｅ－Ｇｌｎ、Ｓｅｒ－Ｐｒｏ、Ｔｈｒ－ＰｒｏをＨＰＬＣによって分析したところ、純度はそれぞれ９０％以上であった。このようにして得られたＩｌｅ－Ｇｌｎ、Ｓｅｒ－Ｐｒｏ、Ｔｈｒ－Ｐｒｏは、そのまま本発明の骨強化作用を有するペプチドとして使用できる。

（実施例２）
卵白タンパク質１０％水溶液５Ｌに、パパイン５０Ｕ／ｇ・卵白タンパク質及びプロレザー(天野エンザイム社製)１５０Ｕ／ｇ・卵白タンパク質を加え、ｐＨ８に調整し、５５℃において６時間卵白タンパク質を変性させながら酵素分解を行った。反応液を１００℃で１５秒間以上加熱して酵素を失活させ、遠心分離して上清を回収して、卵白タンパク質加水分解物を得た。この卵白タンパク質加水分解物をＳｕｐｅｒｄｅｘＰｅｐｔｉｄｅ（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに通液し、分子サイズで分画し、平均分子量２００～３５０Ｄａの画分を得た。この画分を、Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ１２０ＳＢ－Ｃ１８（アジレント・テクノロジー社製）を充填した逆相カラムに通液して、Ｉｌｅ－Ａｒｇ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ、Ｌｅｕ－Ｇｌｕを含む画分をそれぞれ回収した。これらのフラクションを凍結乾燥して、Ｉｌｅ－Ａｒｇ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ、Ｌｅｕ－Ｇｌｕ（実施例品２）を得た。これらＩｌｅ－Ａｒｇ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ、Ｌｅｕ－ＧｌｕをＨＰＬＣによって分析したところ、純度はそれぞれ９０％以上であった。このようにして得られたＩｌｅ－Ａｒｇ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ、Ｌｅｕ－Ｇｌｕは、そのまま本発明の骨強化作用を有するペプチドとして使用できる。

（実施例３）
卵黄タンパク質１０％水溶液５Ｌに、パパイン５０Ｕ／ｇ・卵黄タンパク質及びプロレザー(天野エンザイム社製)１５０Ｕ／ｇ・卵黄タンパク質を加え、ｐＨ８に調整し、５５℃において６時間卵黄タンパク質を変性させながら酵素分解を行った。反応液を１００℃で１５秒間以上加熱して酵素を失活させ、遠心分離して上清を回収して、卵黄タンパク質加水分解物を得た。この卵黄タンパク質加水分解物をＳｕｐｅｒｄｅｘＰｅｐｔｉｄｅ（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに通液し、分子サイズで分画し、平均分子量２００～３５０Ｄａの画分を得た。この画分を、Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ１２０ＳＢ－Ｃ１８（アジレント・テクノロジー社製）を充填した逆相カラムに通液して、Ｉｌｅ－Ｇｌｎ、Ｌｙｓ－Ｇｌｙ、Ａｓｎ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒを含む画分をそれぞれ回収した。これらのフラクションを凍結乾燥して、Ｉｌｅ－Ｇｌｎ、Ｌｙｓ－Ｇｌｙ、Ａｓｎ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ（実施例品３）を得た。これらＩｌｅ－Ｇｌｎ、Ｌｙｓ－Ｇｌｙ、Ａｓｎ－Ｐｒｏ－ＴｈｒをＨＰＬＣによって分析したところ、純度はそれぞれ９０％以上であった。このようにして得られたＩｌｅ－Ｇｌｎ、Ｌｙｓ－Ｇｌｙ、Ａｓｎ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒは、そのまま本発明の骨強化作用を有するペプチドとして使用できる。

（実施例４）
小麦タンパク質１０％水溶液５Ｌに、パパイン５０Ｕ／ｇ・小麦タンパク質及びプロレザー(天野エンザイム社製)１５０Ｕ／ｇ・小麦タンパク質を加え、ｐＨ８に調整し、５５℃において６時間小麦タンパク質を変性させながら酵素分解を行った。反応液を１００℃で１５秒間以上加熱して酵素を失活させ、遠心分離して上清を回収して、小麦タンパク質加水分解物を得た。この小麦タンパク質加水分解物をＳｕｐｅｒｄｅｘＰｅｐｔｉｄｅ（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに通液し、分子サイズで分画し、平均分子量２００～３５０Ｄａの画分を得た。この画分を、フェニルイソチオシアネートにより誘導化し、ＳｕｐｅｒｓｐｈｅｒｅＲＰ－１８（アジレント・テクノロジー社製）を充填した逆相カラムに通液して、Ｓｅｒ－Ｐｒｏ、Ｔｈｒ－Ｐｒｏを含む画分をそれぞれ回収した。これらのフラクションを凍結乾燥して、Ｓｅｒ－Ｐｒｏ、Ｔｈｒ－Ｐｒｏ（実施例品４）を得た。これらＳｅｒ－Ｐｒｏ、Ｔｈｒ－ＰｒｏをＨＰＬＣによって分析したところ、純度はそれぞれ９０％以上であった。このようにして得られたＳｅｒ－Ｐｒｏ、Ｔｈｒ－Ｐｒｏは、そのまま本発明の骨強化作用を有するペプチドとして使用できる。

（実施例５）
大豆タンパク質１０％水溶液５Ｌに、パパイン５０Ｕ／ｇ・大豆タンパク質及びプロレザー(天野エンザイム社製)１５０Ｕ／ｇ・大豆タンパク質を加え、ｐＨ８に調整し、５５℃において６時間大豆タンパク質を変性させながら酵素分解を行った。反応液を１００℃で１５秒間以上加熱して酵素を失活させ、遠心分離して上清を回収して、大豆タンパク質加水分解物を得た。この大豆タンパク質加水分解物をＳｕｐｅｒｄｅｘＰｅｐｔｉｄｅ（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに通液し、分子サイズで分画し、平均分子量２００～３５０Ｄａの画分を得た。この画分を、フェニルイソチオシアネートにより誘導化し、ＳｕｐｅｒｓｐｈｅｒｅＲＰ－１８（アジレント・テクノロジー社製）を充填した逆相カラムに通液して、Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ｌｙｓ－Ｇｌｙ、Ｌｅｕ－Ｇｌｕを含む画分をそれぞれ回収した。これらのフラクションを凍結乾燥して、Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ｌｙｓ－Ｇｌｙ、Ｌｅｕ－Ｇｌｕ（実施例品５）を得た。これらＬｅｕ－Ｌｙｓ、Ｌｙｓ－Ｇｌｙ、Ｌｅｕ－ＧｌｕをＨＰＬＣによって分析したところ、純度はそれぞれ９０％以上であった。このようにして得られたＬｅｕ－Ｌｙｓ、Ｌｙｓ－Ｇｌｙ、Ｌｅｕ－Ｇｌｕは、そのまま本発明の骨強化作用を有するペプチドとして使用できる。

（実施例６）
トリ由来コラーゲンタンパク質１０％水溶液５Ｌに、パパイン５０Ｕ／ｇ・トリ由来コラーゲンタンパク質及びプロレザー(天野エンザイム社製)１５０Ｕ／ｇ・トリ由来コラーゲンタンパク質を加え、ｐＨ８に調整し、５５℃において６時間トリ由来コラーゲンタンパク質を変性させながら酵素分解を行った。反応液を１００℃で１５秒間以上加熱して酵素を失活させ、遠心分離して上清を回収して、トリ由来コラーゲンタンパク質加水分解物を得た。このトリ由来コラーゲンタンパク質加水分解物をＳｕｐｅｒｄｅｘＰｅｐｔｉｄｅ（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに通液し、分子サイズで分画し、平均分子量２００～３５０Ｄａの画分を得た。この画分を、フェニルイソチオシアネートにより誘導化し、ＳｕｐｅｒｓｐｈｅｒｅＲＰ－１８（アジレント・テクノロジー社製）を充填した逆相カラムに通液して、Ｉｌｅ－Ａｒｇ、Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｅｕを含む画分をそれぞれ回収した。これらのフラクションを凍結乾燥して、Ｉｌｅ－Ａｒｇ、Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ（実施例品６）を得た。これらＩｌｅ－Ａｒｇ、Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－ＬｅｕをＨＰＬＣによって分析したところ、純度はそれぞれ９０％以上であった。このようにして得られたＩｌｅ－Ａｒｇ、Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｅｕは、そのまま本発明の骨強化作用を有するペプチドとして使用できる。

（試験例１）
ウサギの全骨髄細胞を用いて、実施例品２のＩｌｅ－Ａｒｇ、実施例品１のＩｌｅ－Ｇｌｎ、及び実施例品５のＬｅｕ－Ｌｙｓの配列からなるペプチドの、骨代謝改善効果を調べた。５日齢のウサギの脛骨及び大腿骨を摘出し、軟組織を除去した後、５％ＦＢＳを含むα‐ＭＥＭ培地中で機械的に細切した破骨細胞を含む全骨髄細胞を５００，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように結晶性リン酸カルシウムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）のウェル上に撒き込み、培養した。培養２時間後に、新しい培地へと交換した後、本発明のペプチドＩｌｅ－Ａｒｇを２ｍＭ、Ｉｌｅ－ＧｌｎとＬｅｕ－Ｌｙｓを４ｍＭの濃度となるように添加して７２時間培養した。そして、５％次亜塩素酸ナトリウム溶液を添加することで細胞を取り除いた後、リン酸カルシウムプレートのウェル上にできた骨吸収窩（ピット）を実体顕微鏡下で撮影し、画像解析によってその面積を測定することにより破骨細胞による骨吸収を抑制する効果を調べた（瀬野悍二ら，研究テーマ別動物培養細胞マニュアル，ｐ．１９９－２００，１９９３）。その結果を表１に示す。

この結果、培地に実施例品２のＩｌｅ－Ａｒｇ、実施例品１のＩｌｅ－Ｇｌｎ、及び実施例品５のＬｅｕ－Ｌｙｓの配列からなるペプチドを添加した場合は、培地のみに比べ、有意にピットの面積が減少した。この結果から、本発明のＩｌｅ－Ａｒｇ、Ｉｌｅ－Ｇｌｎ、及びＬｅｕ－Ｌｙｓの配列からなるペプチドには破骨細胞による骨吸収を抑制する作用があることがわかった。

（試験例２）
ウサギの全骨髄細胞を用いて、実施例品４のＳｅｒ－Ｐｒｏ、実施例品５のＬｙｓ－Ｇｌｙ、実施例品４のＴｈｒ－Ｐｒｏ、実施例品６のＶａｌ－Ｌｅｕ、実施例品２のＬｅｕ－Ｇｌｕ、及び実施例品３のＡｓｎ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒの配列からなるペプチドの、骨代謝改善効果を調べた。５日齢のウサギの脛骨及び大腿骨を摘出し、軟組織を除去した後、５％ＦＢＳを含むα‐ＭＥＭ培地中で機械的に細切した破骨細胞を含む全骨髄細胞を５００，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように結晶性リン酸カルシウムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）のウェル上に撒き込み、培養した。培養２時間後に、新しい培地へと交換した後、本発明のペプチドＳｅｒ－Ｐｒｏ、Ｌｙｓ－Ｇｌｙ、Ｔｈｒ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ、Ｌｅｕ－Ｇｌｕ、及びＡｓｎ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒを１０ｍＭの濃度となるように添加して７２時間培養した。そして、５％次亜塩素酸ナトリウム溶液を添加することで細胞を取り除いた後、リン酸カルシウムプレートのウェル上にできた骨吸収窩（ピット）を実体顕微鏡下で撮影し、画像解析によってその面積を測定することにより破骨細胞による骨吸収を抑制する効果を調べた（瀬野悍二ら，研究テーマ別動物培養細胞マニュアル，ｐ．１９９－２００，１９９３）。その結果を表２に示す。

この結果、培地に実施例品４のＳｅｒ－Ｐｒｏ、実施例品５のＬｙｓ－Ｇｌｙ、実施例品４のＴｈｒ－Ｐｒｏ、実施例品６のＶａｌ－Ｌｅｕ、実施例品２のＬｅｕ－Ｇｌｕ、及び実施例品３のＡｓｎ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒの配列からなるペプチドを添加した場合は、培地のみに比べ、有意にピットの面積が減少した。この結果から、本発明のＳｅｒ－Ｐｒｏ、Ｌｙｓ－Ｇｌｙ、Ｔｈｒ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ、Ｌｅｕ－Ｇｌｕ、及びＡｓｎ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒの配列からなるペプチドには破骨細胞による骨吸収を抑制する作用があることがわかった。

（実施例７）
（骨強化用カプセル剤の調製）
表３に示す配合で原材料を混合後、常法により造粒し、カプセルに充填して、本発明の骨強化用カプセル剤を製造した。

(実施例８）
（骨強化用錠剤の調製）
表４に示す配合で原材料を混合後、常法により１ｇに成型、打錠して本発明の骨強化用錠剤を製造した。

(実施例９）
（骨強化用液状栄養組成物の調製）
Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（実施例品５）２．５ｇを４９９７．５ｇの脱イオン水に溶解し、４０℃まで加熱後、ＴＫホモミクサー（ＴＫＲＯＢＯＭＩＣＳ；特殊機化工業社製）にて、６，０００ｒｐｍで１０分間撹拌混合して２．５ｇ／５ｋｇのＬｅｕ－Ｌｙｓ溶液を得た。このＬｅｕ－Ｌｙｓ溶液５．０ｋｇに、カゼイン５．０ｋｇ、大豆タンパク質５．０ｋｇ、魚油１．０ｋｇ、シソ油３．０ｋｇ、デキストリン１７．０ｋｇ、ミネラル混合物６．０ｋｇ、ビタミン混合物１．９５ｋｇ、乳化剤２．０ｋｇ、安定剤４．０ｋｇ、香料０．０５ｋｇを配合し、２００ｍｌのレトルトパウチに充填し、レトルト殺菌機(第１種圧力容器、ＴＹＰＥ: ＲＣＳ－４ＣＲＴＧＮ、日阪製作所製)で１２１℃、２０分間殺菌して、本発明の骨強化用液状栄養組成物５０ｋｇを製造した。なお、本発明の骨強化用液状栄養組成物２００ｇには、Ｌｅｕ－Ｌｙｓが１０ｍｇ含まれていた。

（実施例１０）
（骨強化用飲料の調製）
実施例品４のＳｅｒ－Ｐｒｏ０．５ｇを６９９．５ｇの脱イオン水に溶解した後、４０℃まで加熱後、ウルトラディスパーサー（ＵＬＴＲＡ－ＴＵＲＲＡＸＴ－２５；ＩＫＡジャパン社製）にて、９，５００ｒｐｍで２０分間撹拌混合した。マルチトール１００ｇ、酸味料２ｇ、還元水２０ｇ、香料２ｇ、脱イオン水１７６ｇを添加した後、１００ｍｌのガラス瓶に充填し、９５℃、１５秒間殺菌後、密栓し、本発明の骨強化用飲料１０本（１００ｍｌ入り）を調製した。なお、本発明の骨強化用飲料１００ｇには、Ｓｅｒ－Ｐｒｏが５０ｍｇ含まれていた。

（実施例１１）
（イヌ用骨強化用飼料の調製）
実施例品３のＬｙｓ－Ｇｌｙ２ｇを３，９９８ｇの脱イオン水に溶解し、４０℃まで加熱後、ＴＫホモミクサー（ＭＡＲＫＩＩ１６０型；特殊機化工業社製）にて、３，６００ｒｐｍで２０分間撹拌混合して２ｇ／４ｋｇのＬｙｓ－Ｇｌｙ溶液を得た。このＬｙｓ－Ｇｌｙ溶液２ｋｇに大豆粕１ｋｇ、脱脂粉乳１ｋｇ、大豆油０．４ｋｇ、コーン油０．２ｋｇ、パーム油２.３ｋｇ、トウモロコシ澱粉１ｋｇ、小麦粉０．９ｋｇ、ふすま０．２ｋｇ、ビタミン混合物０．５ｋｇ、セルロース０．３ｋｇ、ミネラル混合物０．２ｋｇを配合し、１２０℃、４分間加熱殺菌して、本発明の骨強化用飼料１０ｋｇを製造した。なお、本発明の骨強化用飼料１００ｇには、Ｌｙｓ－Ｇｌｙが１０ｍｇ含まれていた。

（実施例１２）
(骨強化用粉乳の調製)
実施例品１のＴｈｒ－Ｐｒｏ１ｇ、脱脂粉乳９．９９９ｋｇ、脱イオン水９０ｋｇを混合し、４０℃まで加熱後、ＴＫホモミクサー（ＴＫＲＯＢＯＭＩＣＳ；特殊機化工業社製）にて、６，０００ｒｐｍで１０分間撹拌混合した。この溶液を噴霧乾燥して本発明の骨強化用粉乳１０ｋｇを製造した。なお、本発明の骨強化粉乳１０ｇにはＴｈｒ－Ｐｒｏが１ｍｇ含まれていた。

（実施例１３）
（骨強化用乳飲料の調製）
実施例品６のＶａｌ－Ｌｅｕ１ｇ、牛乳９．９９９ｋｇを混合し、４０℃まで加熱後、ＴＫホモミクサー（ＴＫＲＯＢＯＭＩＣＳ；特殊機化工業社製）にて、６，０００ｒｐｍで１０分間撹拌混合した。１３０℃で２秒間、加熱殺菌した後、１０℃以下まで冷却して本発明の骨強化用乳飲料１０ｋｇを製造した。なお、本発明の骨強化用乳飲料２００ｇにはＶａｌ－Ｌｅｕが２０ｍｇ含まれていた。

（実施例１４）
（骨強化用発酵乳の調製）
実施例品５のＬｅｕ－Ｇｌｕ０．０１ｇ、脱脂粉乳１７００ｇ、グルコース３００ｇ、脱イオン水７６９９．９９ｇを混合し、９５℃で２時間保持することで加熱殺菌した。これを３７℃まで冷却し、乳酸菌スターター（Ｌｂ．ｃａｓｅｉ）を３００ｇ植菌し、攪拌混合後、３７℃に保持したインキュベーター内でｐＨ４．０まで発酵させた。ｐＨ４．０到達後１０℃以下まで冷却し、本発明の骨強化用発酵乳１０ｋｇを製造した。なお、本発明の骨強化用発酵乳２００ｇには、Ｌｅｕ－Ｇｌｕが０．２ｍｇ含まれていた。

（実施例１５）
（骨強化用乳酸菌飲料の調製）
脱脂粉乳１７００ｇ、グルコース３００ｇ、脱イオン水７７００ｇを混合し、９５℃で２時間保持することで加熱殺菌した。これを３７℃まで冷却し、乳酸菌スターター（Ｌｂ．ｃａｓｅｉ）を３００ｇ植菌し、攪拌混合後、３７℃に保持したインキュベーター内でｐＨ４．０まで発酵させた。ｐＨ４．０到達後、攪拌しながら１０℃以下まで冷却し、発酵ベースを得た。また、実施例品３のＡｓｎ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ４ｇ、上白糖１８００ｇ、酸味料２０ｇ、香料１０ｇ、脱イオン水８１６６ｇを混合し、９０℃で１０分間殺菌後１０℃以下まで冷却し、糖液を得た。前述の発酵ベース２０００ｇと糖液８０００ｇを混和し、均質機で組織を滑らかにし、２００ｍｌ入り紙容器５０本に分注後、アルミ蓋で密封し、本発明の骨強化用乳酸菌飲料１０ｋｇを製造した。なお、本発明の骨強化用乳酸菌飲料２００ｍｌには、Ａｓｎ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒが６４ｍｇ含まれていた。

（実施例１６）
（骨強化用清涼飲料水の調製）
Ｉｌｅ－Ａｒｇ（ＧＬＢｉｏｃｈｅｍ社製）３ｇ、５０％乳酸０．７５ｋｇ、エリスリトール５．７ｋｇ、香料１ｋｇ、脱イオン水４２．５４７ｋｇを混合し、４０℃まで加熱後、ＴＫホモミクサー（ＴＫＲＯＢＯＭＩＣＳ；特殊機化工業社製）にて、６，０００ｒｐｍで１０分間撹拌混合した。この溶液を９０℃で１０分間殺菌後１０℃以下まで冷却することで、本発明の骨強化用清涼飲料水５０ｋｇを製造した。なお、本発明の骨強化用清涼飲料水２００ｍｌには、Ｉｌｅ－Ａｒｇが１２ｍｇ含まれていた。

（実施例１７）
（骨強化用チーズの調製）
ゴーダチーズ９．５ｋｇ、チェダーチーズ９．５ｋｇ、Ｉｌｅ－Ｇｌｎ（ＧＬＢｉｏｃｈｅｍ社製）４ｇ、クエン酸ナトリウム２００ｇ、脱イオン水７９６ｇを混合し、８５℃で乳化した。乳化後にチーズをカルトンに充填して２昼夜、５℃で冷却して、本発明の骨強化用チーズ２０ｋｇを製造した。なお、本発明の骨強化用チーズ１００ｇには、Ｉｌｅ－Ｇｌｎが２０ｍｇ含まれていた。

（実施例１８）
（骨強化用マーガリンの調製）
大豆硬化油２ｋｇ、大豆白絞油４ｋｇ、パーム油２．５ｋｇ、グリセリン脂肪酸エステル５０ｇを混合して油層を調製した。次に、Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（ＧＬＢｉｏｃｈｅｍ社製）２０ｇ、乳酸１０ｇ、脱イオン水１４２０ｇを混合し、油層へ添加して油中水型乳化物を得た、この乳化物をマーガリン製造機で冷却、固化および練圧して、本発明の骨強化用マーガリン１０ｋｇを製造した。なお本発明の骨強化マーガリン１０ｇには、Ｌｅｕ－Ｌｙｓが２０ｍｇ含まれていた。

（実施例１９）
（骨強化用クリームの調製）
ナタネ硬化油４．５ｋｇ、レシチン４０ｇ、モノグリセリン脂肪酸エステル１０ｇ、ソルビタン脂肪酸エステル１０ｇを混合し、油相を調製した。次に、Ｓｅｒ－Ｐｒｏ（ジェンスクリプト社製）４０ｇ、脱脂粉乳４００ｇ、カゼインナトリウム１０ｇ、シュガーエステル２０ｇ、リン酸塩１０ｇ、キサンタンガム５ｇ、脱イオン水４．９５５ｋｇを混合して、水相を調製した。水相を６５℃に加温し、７０℃に加温した油相を少量ずつ攪拌しながら添加し、ＴＫホモミクサー（ＴＫＲＯＢＯＭＩＣＳ；特殊機化工業社製）にて、６，０００ｒｐｍで１０分間撹拌混合した。これを均質機で均質処理して本発明の骨強化クリーム１０ｋｇを製造した。なお、本発明の骨強化クリーム１０ｇには、Ｓｅｒ－Ｐｒｏが４０ｍｇ含まれていた。

（実施例２０）
（骨強化用プリンの調製）
はちみつ２０００ｇ、Ｌｙｓ－Ｇｌｙ（ＧＬＢｉｏｃｈｅｍ社製）４ｇ、脱脂粉乳８００ｇ、マスカルポーネ３００ｇ、液状水７００ｇ、グラニュー糖５００ｇ、生クリーム２５０ｇ、バター２００ｇ、加糖卵黄４００ｇ、ゼラチン４０ｇ、寒天１５ｇ、ローカストビーンガム１２０ｇ、脱イオン水４６７１ｇを混合して、プリンミックスとした。このプリンミックスをＴＫホモミクサー（ＴＫＲＯＢＯＭＩＣＳ；特殊機化工業社製）にて、６，０００ｒｐｍで１０分間撹拌混合し、６０℃に加熱して溶解した後、１００ｇずつ容器へ充填して冷却することで、本発明の骨強化用プリン１００個を製造した。なお、本発明の骨強化プリン１００ｇには、Ｌｙｓ－Ｇｌｙが４０ｍｇ含まれていた。

（実施例２１）
（骨強化用ゼリーの調製）
Ｔｈｒ－Ｐｒｏ（ジェンスクリプト社製）４．４ｇ、果糖２０００ｇ、グラニュー糖１５００ｇ、水５００ｇ、寒天１００ｇ、香料１０ｇ、脱イオン水５８８５．６ｇを混合し、ＴＫホモミクサー（ＴＫＲＯＢＯＭＩＣＳ；特殊機化工業社製）にて、６，０００ｒｐｍで１０分間撹拌混合し、５０℃に加熱して溶解した後、１００ｇずつ容器へ充填して冷却することで、本発明の骨強化用ゼリー１００個を製造した。なお、本発明の骨強化用ゼリー１００ｇには、Ｔｈｒ－Ｐｒｏが４４ｍｇ含まれていた。

（実施例２２）
（骨強化用ウエハースの調製）
Ｖａｌ－Ｌｅｕ（ＧＬＢｉｏｃｈｅｍ社製）９．２ｇ、小麦粉８．５ｋｇ、コーンスターチ１．２１ｋｇ、パーム油０．２２ｋｇ、膨張剤０．０５ｋｇを混合した後、脱イオン水を適量加えてバッターを調製した後、ウエハース焼成機で焼成して、本発明の骨強化用ウエハース１０ｋｇを製造した。なお、本発明の骨強化用ウエハース５０ｇには、Ｖａｌ－Ｌｅｕが４６ｍｇ含まれていた。

本発明によれば長期摂取が可能で、安全性が高く、破骨細胞の分化ならびに該細胞による骨吸収を抑制する作用を介した骨強化作用が顕著な骨強化用組成物を提供することが可能である。したがって、本発明の摂取により骨粗鬆症や骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療が可能である。

Claims

Ｉｌｅ－Ａｒｇを有効成分として含む骨強化用組成物。
請求項１に記載の骨強化用組成物を含むことを特徴とする骨強化用飲食品。
請求項１に記載の骨強化用組成物を含むことを特徴とする骨強化用栄養組成物。
請求項１に記載の骨強化用組成物を含むことを特徴とする骨強化用飼料。
請求項１に記載の骨強化用組成物を含むことを特徴とする骨強化用医薬品。