JP5357042B2 - 骨強化用食品素材 - Google Patents

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Description

本発明は、骨強化作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物に関する。
本発明の乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物は、骨強化作用を有するので、骨疾患の予防又は治療、骨強化等を目的とした骨強化剤として、また、骨疾患の予防又は治療用もしくは骨強化用医薬品、飲食品及び飼料の有効成分として有用である。
近年、高齢化に伴い、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患が増加する傾向にある。骨組織においては、絶えず骨形成と骨吸収が営まれており、若い時には骨形成と骨吸収のバランスが保たれているが、加齢に伴い種々の原因でそのバランスが骨吸収に傾く(アンカップリング)。そして、この状態が長期間続くと骨組織が脆くなり、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患を生じることになる。このアンカップリングを防止することができれば、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患を予防することができると考えられている。
従来、アンカップリングを防止し、各種骨疾患を予防あるいは治療する方法として、(1) 食餌によるカルシウム補給、(2)軽い運動、(3)日光浴、(4)薬物治療等が行われている。食餌によるカルシウム補給には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等のカルシウム塩や卵殻、魚骨粉等の天然カルシウム剤が使用されている。しかし、これらは必ずしも経口摂取に適している素材であるとはいえない。軽い運動はジョギングや散歩等が良いとされるが、体が弱っている場合は軽い運動も厄介なものであり、まして寝たきりの老人では殆んど運動できない。日光浴は活性化ビタミンDの補給という点では良いとされているが、これだけでは不充分である。薬物投与には、1α‐ヒドロキシビタミンD やカルシトニン製剤等が使用されており、骨粗鬆症の治療には有効であるということが知られている。しかし、これらの物質は医薬そのものであり、食品素材として使用可能なものではない。
本発明者らは、食品素材として使用可能な骨強化作用を有する物質を得るために、乳中に存在する骨強化因子を探索し続けてきた。その結果、乳清タンパク質の水溶性画分から乳清由来の塩を除去したタンパク質及びペプチド混合物に骨強化作用があることを見出した(例えば、特許文献1参照)。そして、このタンパク質及びペプチド混合物の水溶液をエタノール処理、加熱処理、加塩処理、限外濾過膜処理をして得られる画分に骨芽細胞増殖促進作用及び骨強化作用があることを見出した(例えば、特許文献2、3参照)。また、乳中に存在する塩基性タンパク質に骨芽細胞増殖促進作用、骨強化作用及び骨吸収防止作用があることを見出した(例えば、特許文献4参照)。
特許3160862号公報 特許3092874号公報 特開平5-320066号公報 特許3112637号公報
本発明は、食品素材としても使用可能な、骨強化作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を見出し、この骨強化作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を含有する骨強化剤、及び、骨強化作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を配合した医薬品、飲食品又は飼料を提供することを課題とする。
本発明者らは、新たな骨強化素材の探索を試みた結果、従来の食品素材よりも強い骨強化作用を示す画分が得られることを見出した。そして、これらの知見に基づいてこの骨強化作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を含有する骨強化剤、及び、骨強化作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を配合した医薬品、飲食品及び飼料を得るに至ったものである。
(A)次の特性を有する乳タンパク質画分に関する。
(1) 乳由来であること。
(2) ソディウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)電気泳動で,分子量6,000〜150,000ダルトンの範囲のタンパク質含有する画分であること。
(3) 構成アミノ酸組成中に塩基性ア本発明は、下記の構成からなる発明である。
ミノ酸を12〜14重量%含有し、かつ、塩基性アミノ酸/酸性アミノ酸比が0.5〜0.7の範囲であること。
(4) 骨芽細胞における石灰化促進作用を有すること。
(B) 前記乳タンパク質画分をタンパク質分解酵素で分解して得られる乳タンパク質画分分解物。
(C)(A)又は(B)に記載の乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を含有する骨強化剤。
(D)(A)又は(B)に記載の乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を配合した骨強化用医薬品。

(E)(A) 又は(B)に記載の乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を配合した骨強化用飲食品。
(F)(A) 又は(B)に記載の乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を配合した骨強化用飼料。
本発明の骨強化作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を有効成分とする骨強化剤、及び、骨強化作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を含有する骨強化用医薬品、飲食品及び飼料は、経口的に摂取することにより、体内において骨芽細胞の石灰化を促進する。
従って、本発明の骨強化作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を有効成分とする骨強化剤、及び、骨強化作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を配合した骨強化用医薬品、飲食品及び飼料は、ヒトや動物の生体内で骨芽細胞の石灰化を促進することから、骨強化作用を有し、また骨粗鬆症等の骨量減少の抑制に有効である。
乳由来タンパク質画分の石灰化促進効果を示した説明図である。(試験例1)。 骨粗鬆症ラットに本発明の実施例1で得られた乳タンパク質画分を投与した場合の大腿骨骨強度増強効果を示した図である(試験例2)。
本発明は、骨強化作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を有効成分とする骨強化剤、及び、骨強化作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を配合した骨強化用医薬品、飲食品及び飼料に係るものである。
本発明のこのような骨強化作用を有する乳タンパク質画分は、例えば、脱脂乳や乳清等の乳原料を陽イオン交換樹脂と接触させて、脱イオン水で洗浄後、この樹脂に吸着した乳タンパク質を0.2Mの食塩溶出液で溶出して得ることができる。なお、塩類としては、食塩の他カリウム塩、アンモニア塩、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩等を使用することができ、洗浄液のイオン強度を0.05以下、溶出溶液のイオン強度を0.15〜0.25に適宜調整して、本発明の乳タンパク質画分を得ることができる。また、この溶出画分を回収し、逆浸透(RO)膜や電気透析(ED)法等により脱塩及び濃縮し、必要に応じて乾燥することにより得ることができる。逆浸透(RO)膜としては、Desal-3(Desalination社製)、HR-95(Dow Danmark社製)、NTR-729HF(日東電工社製)等を例示することができる。また、電気透析(ED)装置は、ユアサアイオニクス社や日本錬水社製の電気透析装置を例示できる。
また、乳由来のタンパク質画分を得る方法としては、乳又は乳由来の原料を陽イオン交換体に接触させた後、この陽イオン交換体に吸着した塩基性タンパク質画分を、pH5を超え、イオン強度 0.5を超える溶出液で溶出して得る方法〔特開平5-202098号公報〕、アルギン酸ゲルを用いて得る方法(特開昭 61-246198号公報)、無機の多孔性粒子を用いて乳清から得る方法(特開平 1-86839号公報)、硫酸化エステル化合物を用いて乳から得る方法(特開昭63-255300号公報)等が知られており、本発明の骨強化作用を有する乳由来のタンパク質画分は、このような方法で得られるタンパク質画分を用いることができる。
このようにして回収された乳タンパク質画分は、通常、凍結乾燥等により粉末化して使用することができる。
本発明で用いる骨強化作用を有する乳タンパク質画分は、その構成アミノ酸組成中に塩基性アミノ酸を12〜14重量%含有し、かつ塩基性アミノ酸/酸性アミノ酸比が0.5〜0.7の範囲であることが好ましい。この範囲を外れると本願発明の効果を発揮することができない。また、本発明品は、分子量6,000〜150,000ダルトンを示す多種のタンパク質の混合物であり、等電点も6〜11の広範囲に分布を示す。
乳タンパク質画分分解物は、乳タンパク質画分と同様のアミノ酸組成を有しており、例えば、上記の方法で得られた乳タンパク質画分にペプシン、トリプシン、キモトリプシン等のタンパク質分解酵素を作用させ、さらに必要に応じ、パンクレアチン等のタンパク質分解酵素を作用させることにより、平均分子量4,000以下の分解物として得ることができる。なお、乳タンパク質画分分解物は、通常、凍結乾燥等により粉末化して使用することができる。
本発明の骨強化作用を有する乳タンパク質画分の給原となる乳又は乳由来原料としては、牛乳、人乳、山羊乳、羊乳等の乳を用いることができ、これらの乳をそのまま、あるいは、これらの乳の還元乳、脱脂乳、ホエー等を用いることができる。
本発明の骨強化剤を投与するに際しては、有効成分である骨強化作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物をそのままの状態で用いることもできるが、常法に従い、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等に製剤化して用いることもできる。さらには、これらの乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物をそのままあるいは製剤化した後、これを栄養剤や飲食品等に配合して、骨強化を図ることも可能である。なお、本発明の乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物は、比較的熱に対して安定なので、通常行われるような条件で加熱殺菌することも可能である。
本発明において、骨強化作用を発揮させるためには、体重、性別や年齢等を考慮して適宜決定すればよいが、通常成人の場合、本発明品である乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を一日当たり、1〜50mg摂取できるよう配合量等を調整すればよい。このように本発明品は低用量で効果がある。本発明の骨強化作用を有する成分は、骨強化剤として、あるいはそれらを配合した医薬品、飲食品及び飼料を経口摂取することによって、骨強化作用を発揮する。
以下に、参考例、実施例及び試験例を示して本発明を詳細に説明するが、これらは単に本発明の実施態様を例示するものであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
[参考例1]
下記の方法(特許第3112637号参照)により、骨強化が認められる市販品の乳タンパク質画分を調製した。
陽イオン交換樹脂のスルホン化キトパール(富士紡績製) 0.5リットルを充填した直径10cmのカラムを脱イオン水で充分洗浄した。このカラムに未殺菌脱脂乳 50リットルを流速100 ml /minで通液した後、このカラムを脱イオン水で充分洗浄し、0.95M塩化ナトリウムを含む 0.05Mリン酸緩衝液(pH 7.0) 2.5リットルを通液して樹脂に吸着したタンパク質を溶出した。そして、この溶出液を逆浸透(RO)膜処理により、脱塩し、濃縮した後、凍結乾燥して粉末状の乳タンパク質画分を得た。この操作を2回繰り返して104gのタンパク質画分を得た。このタンパク質画分の等電点は 7.0〜8.5 であって、このタンパク質画分に含まれる塩基性アミノ酸は17.8%であった。
陽イオン交換樹脂のスルホン化キトパール(富士紡績製) 0.5リットルを充填した直径10cmのカラムを脱イオン水で充分洗浄した。このカラムに未殺菌脱脂乳 50リットルを流速100ml/minで通液した後、このカラムを脱イオン水で充分洗浄し、0.15M塩化ナトリウムを含む 0.05Mリン酸緩衝液(pH 7.0) 2.5リットルを通液して樹脂に吸着したタンパク質を溶出した。そして、この溶出液を逆浸透(RO)膜処理により、脱塩し、濃縮した後、凍結乾燥して粉末状の乳タンパク質画分を得た。この操作を10回行い、乳タンパク質画分24.2gを得た。この画分は分子量が6,000〜150,000ダルトン、等電点が 6.0〜11.0 であって、この乳タンパク質画分に含まれる構成アミノ酸のうち、塩基性アミノ酸は12〜14%であった。また、塩基性アミノ酸/酸性アミノ酸比は0.5〜0.7であった。
陽イオン交換樹脂のスルホン化キトパール(富士紡績製) 0.5リットルを充填した直径10cmのカラムを脱イオン水で充分洗浄した。このカラムに未殺菌脱脂乳 50リットルを流速100ml/minで通液した後、このカラムを0.05M塩化ナトリウムを含む0.05Mリン酸緩衝液(pH7.0)で充分洗浄し、0.25M塩化ナトリウムを含む 0.05Mリン酸緩衝液(pH 7.0) 2.5リットルを通液して樹脂に吸着したタンパク質を溶出した。そして、この溶出液を逆浸透(RO)膜処理により、脱塩し、濃縮した後、凍結乾燥して粉末状の乳タンパク質画分を得た。この操作を5回行い、乳タンパク質画分12.8gを得た。この画分は分子量6,000〜150,000ダルトン、等電点は 6.0〜11.0 であって、この乳タンパク質画分に含まれる構成アミノ酸のうち,塩基性アミノ酸は12〜14%であった。また、塩基性アミノ酸/酸性アミノ酸比は0.5〜0.7であった。
実施例1で得られた乳タンパク質画分24.2gを蒸留水10リットルに溶解した後、ペプシン(関東化学製)を2%濃度となるよう添加し、37℃で1時間撹拌しながら加水分解した、次いで、水酸化ナトリウム溶液でpH6.8に中和後、1%パンクレアチン(シグマ社製)を添加し、37℃で2時間反応させた。反応後、80℃で10分間加熱処理して酵素を失活させた後、乳タンパク質画分分解物23.1gを得た。
実施例2で得られた乳タンパク質画分12.8gを蒸留水8リットルに溶解した後、トリプシン(関東化学製)を2%濃度となるよう添加し、37℃で1時間撹拌しながら加水分解した、次いで、水酸化ナトリウム溶液でpH6.6に中和後、1%パンクレアチン(シグマ社製)を添加し、37℃で2時間反応させた。反応後、80℃で10分間加熱処理して酵素を失活させた後、乳タンパク質画分分解物11.7gを得た。
[試験例1]
参考例1及び実施例1で得られた各タンパク質画分について、Danjoらの方法 [Danjo.A. et al., Biochem. Biophys. Res.Commun., vol.360, pp.199-204, 2007]にしたがって調べた。すなわち、マウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞MC3T3-E1を5x103 cell/cm2の細胞密度となるように、αMEM+10% FBS培地に懸濁し、24 ウエルの培養皿 へ播種した。12時間静置後、石灰化誘導培地(αMEM+10 % FBS 50μg/ml+5 mMβ-glycerophosphoacid)に交換するとともに、参考例1で得られた乳タンパク質及び実施例1で得られた本発明品をそれぞれ10-10〜10-5Mの濃度で添加した。培地を3日毎に交換し、28日間培養を続けた。
培養14、21、28 日目に、4%パラフォルムアルデヒド含有0.1M リン酸緩衝液(pH 7.4)で10分間、室温で固定した。0.01M PBS で洗浄後、2% アリザリンレッドS水溶液で15分、室温で反応させ、カルシウム染色を行った。骨の無機成分の一つであるリン酸を染色するために、固定後、蒸留水で洗浄し、5% 硝酸銀水溶液で1時間、室温で反応させてvon Kossa 染色を行った。石灰化小結節内のカルシウムイオン量の定量にはカルシウムCキット(和光純薬工業社製)を用いた。
図1に培養28日目のカルシウム濃度測定結果を示す。試料無添加の培地のみで培養した群を対照とした。
実施例1で得られた本発明品は、用量依存的に骨芽細胞の石灰化を促進する特性が認められた.参考例1で得られた乳タンパク質にも同様の作用が認められるものの、本発明品と比較するとその作用は弱いことが判明した。
[試験例2]
参考例1及び実施例1で得られた各タンパク質画分について、動物実験により骨強化作用を調べた。動物実験には4週齢のWistar系雌ラットを用いた。1週間の予備飼育後、卵巣摘出手術を施し、その後、カルシウム欠乏食で5週間飼育して動物実験に供した。なお、卵巣を摘出し、カルシウム欠乏食で5週間飼育したラットは、明らかに骨粗鬆症状態にあった。この骨粗鬆症状態を惹起したラットを1群6匹ずつ、乳タンパク質画分無添加の対照群(A群)、参考例1で得られた乳タンパク質画分0.5重量%投与群(B群)、実施例1で得られた乳タンパク質画分0.1重量%投与群(C群)、実施例1で得られた乳タンパク質画分0.5重量%投与群(D群)、実施例1で得られた乳タンパク質画分1.0重量%投与群(E群)の5試験群に分け、それぞれ表1に示す試験飼料で4ヶ月飼育した。なお、各試験飼料の窒素含量(17.06%)が同様となるようカゼインで調整した。また、各試験飼料については、100g当たり、カルシウム 300mg、リン 230mg及びマグネシウム 50mgを配合した。
Figure 0005357042
飼育4ヶ月後、各試験群のラットの両側大腿骨を摘出し、骨破断力測定装置( レオメータ・マックス R X -1 6 0 0 型、アイテクノ製)で骨強度を測定した。その結果を図2に示す。これによると、大腿骨破断応力は、対照群(A群:乳タンパク質画分無添加) に比べ、参考例1で得られた乳タンパク質画分投与群(B群)、実施例1で得られた乳タンパク質画分投与群(C群 、D群、E群)で高い値を示した。また、実施例1で得られた乳タンパク質画分の濃度が増加するに従い、大腿骨破断応力は高い値を示した。参考例1で得られた乳タンパク質画分にも大腿骨破断応力を増加させる作用が認められるものの、実施例1で得られた本発明品の方がその作用は強いことが明らかとなった。
なお、実験結果は示さなかったが、実施例3及び実施例4で得られた乳タンパク質画分分解物を用いた場合も同様の効果が認められた。
実施例1で得られた乳タンパク質画分100mg に、含水結晶ぶどう糖93.4g、炭酸カルシウム5g、シュガーエステル1g 、香料0.5gを加え、混和した後、タブレット状に打錠して、本発明の骨強化剤を製造した。
表2に示した組成で各成分を混合してドウを作成し、成型した後、ばい焼して、骨粗鬆症等の各種骨疾患の予防及び改善用のビスケットを製造した。
Figure 0005357042
表3に示す組成の骨強化用果汁飲料を製造した。
Figure 0005357042
表4に示した配合により原料を混合し、骨強化用イヌ飼育飼料を製造した。
Figure 0005357042
表5に示した組成で各成分を混合し、加圧成型して、実施例3で得られた乳タンパク質画分分解物を配合した骨強化用錠剤を調製した。
Figure 0005357042
表6に示した組成で各成分を混合し、乳化温度85℃で乳化して、実施例4で得られた乳タンパク質画分分解物を配合した骨強化用プロセスチーズを調製した。
Figure 0005357042
本発明の乳タンパク質画分は、骨強化作用を有するので、骨強化等を目的とした骨強化剤として骨疾患の予防又は治療に有用である。また、本発明品は安全性が高く、この骨強化剤を配合した骨疾患の予防又は治療用医薬品、飲食品及び飼料として利用することが出来る。

Claims (6)

  1. 次の(1)〜(4)の特性を有する乳タンパク質画分。
    (1) 乳由来であること。
    (2) ソディウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)電気泳動で、分子量6,000〜150,000ダルトンの範囲のタンパク質を含有する画分であること。
    (3) 構成アミノ酸組成中に塩基性アミノ酸を12〜14重量%含有し、かつ、塩基性アミノ酸/酸性アミノ酸比が0.5〜0.7の範囲であること。
    (4) 骨芽細胞における石灰化促進作用を有すること。
  2. 請求項1に記載の乳タンパク質画分をタンパク質分解酵素で分解して得られる骨芽細胞における石灰化促進作用を有するタンパク質分解物。
  3. 請求項1又は2に記載の乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を含有する骨強化剤。
  4. 請求項1又は2に記載の乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を配合した骨強化用医薬品。
  5. 請求項1又は2に記載の乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を配合した骨強化用飲食品。
  6. 請求項1又は2に記載の乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を配合した骨強化用飼料。
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