JP3759984B2 - 牛乳プロテオースペプトンのコンポーネント３の精製法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、牛乳プロテオースペプトンのコンポーネント３の精製法に関し、詳しくは牛乳に含まれるタンパク質のうちプロテオースペプトンと総称される画分からコンポーネント３を主要成分とする画分を乳清（ホエー）から経済的に、しかも高い純度で精製する方法に関するものである。
本発明によって得られるコンポーネント３画分は高い界面活性力をもち、食品や化粧品、医薬品用の界面活性剤あるいは乳化剤、安定剤として利用することが可能である。
【０００２】
【従来の技術】
牛乳中のプロテオースペプトンは、牛乳タンパク質のうちホエーを９５℃から１００℃で２０分加熱後、ｐＨ４．６に調整しても沈殿せず、１２％トリクロル酢酸で沈殿する成分として定義されている(Thompson, M. P., Tarassuk, N. P., Jenness, R., Lillevik, H. A., Ashworth, U. S.and Rose, D.: Journal of Dairy Science 48, 159 (1965))。
このプロテオースペプトンは、均一な化学組成をもつものではなく、主にコンポーネント３、５及び８と呼ばれる複数のタンパク質画分から構成されている(Larson, B. L., and G. R. Rolleri. : Journal of Dairy Science 38, 351(1955))。その後、さらにコンポーネント３、５、８-slow,８-fast の４種の成分があると認識されている(Kolar, C. W., and Brunner, J. R., Journal of Dairy Science 53, 997 (1970)) 。このように不均一な成分から構成されているため、今日プロテオースペプトンという用語は単一の成分を示す物質名ではなく、一つの画分名として慣用的に用いられている。
【０００３】
このうちコンポーネント３は脂肪球膜を構成する糖タンパク質と抗原性を同じくする成分を多く含み、菅野は、これをラクトフォリンと命名している(Kanno, C.: Journal of Dairy Science 72, 883(1989)) 。最近、本発明者らは、ラクトフォリンを構成する主要糖タンパク質をコードするｃＤＮＡの配列を決定することに成功し(Tsukasaki, F., Motoshima, H., Kuriki, H., Minagawa, E. and Kanno, C. 24th In ternational Dairy Congress: Melbourne, Australia, 18th-22nd September,1994, Brief communications and abstracts of posters and invited papers, page 190, Gb21p,1994) 、その配列から推定されるアミノ酸配列が、別の研究者が決定したコンポーネント３の主要糖タンパク質の一次構造(Sorensen, E. S and Petersen, T. E. Journal of Dairy Research 60, 535 (1993)) と完全に一致することを明らかにした。すなわち、プロテオースペプトンのコンポーネント３とラクトフォリンは定義がやや異なるが、物質としては事実上同一の成分を示した用語であるため、本発明ではコンポーネント３とラクトフォリンは同一のものを意味するものとして用いる。
【０００４】
本発明のプロテオースペプトン画分からのコンポーネント３の精製法は、ラクトフォリンの精製法と同義として扱う。我々は、すでにこのラクトフォリン画分が極めて高い界面活性力を有し天然の界面活性剤として利用価値が高いことを見出している（特開平４−１０４８３０号）。
コンポーネント３の従来的な分画方法は、文献（例えば、Ng, W. C., Brunner, J. R. And Rhee K. C. Journal of Dairy Science 53,987 (1969))にすでに詳しく説明されている。しかし、従来このコンポーネント３を主成分とした画分を脱脂乳やホエーから精製する方法は硫安分画等の煩雑な工程を必要とし、経済的にも非常に不利で、事実上、界面活性剤や乳化剤として利用するには問題があった。また、複雑な精製法を用いると、精製過程で不純物が混入するおそれもあり、より簡便なコンポーネント３の精製法の開発が求められている。なお、本発明のような膜処理による精製法はいまだ報告されていない。その理由は、コンポーネント３の主要な構成タンパク質の分子量が変性下で約２７０００と１７０００の分子量の糖タンパク質からなり、他の混在するα−ラクトアルブミンやβ−ラクトグロブリンとあまり大きさに差がないことから、事実上分画は困難であると考えられていたためである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
これまで、コンポーネント３あるいはラクトフォリンを効率的に精製する方法は未だ報告されていなかった。本発明は、従来報告されている方法のように硫安沈殿やカラムクロマトグラフィーなどの方法を用いずに、ホエーから特にコンポーネント３を多く含む画分を精製する方法を開発することを目的とする。
なお、本発明において原料として用いるホエーには制限がなく、例えば酸性ホエーや中性ホエーのみならず、ホエーを粉末化したホエーパウダー、ホエータンパク質を濃縮したホエータンパク質の濃縮物（ＷＰＣ）、ホエータンパク質の単離物（ＷＰＩ）なども使用できる。これらは、すべて市販されており、容易に入手が可能である。これらは、いずれもコンポーネント３成分をホエーと同様に含んでおり、適当に水などで還元すれば、ホエーと同じく原料として利用することができる。したがって、本明細書において「ホエー」とは特に断わらない限り、これらを含んだものを意味する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
牛乳やホエーをｐＨ４から５の範囲で加熱（約９０℃) した後、遠心分離により凝集物を除去しても、単にプロテオースペプトンを多く含む画分が得られるのみで、コンポーネント３のみを精製することができない。しかし、本発明者らは鋭意努力の結果、単にホエーを限外濾過濃縮装置で濃縮後（タンパク質含量として０．０５％（重量／容量）以上）に、９０℃前後の加熱をすることによって、コンポーネント３以外の大部分のタンパク質を凝集させて除去し、上清にはコンポーネント３が主要な成分として残り、精製することが可能であることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
【０００７】
すなわち、請求項１に記載の本発明は、分画分子量５万以上５０万以下の限外濾過膜を用いてホエーを濃縮及び透析することを特徴とする牛乳プロテオースペプトンのコンポーネント３の精製法であり、請求項２に記載の本発明は、限外濾過膜を用いてホエーを透析した後、濃縮液を７０〜１００℃の温度で１０〜６０分間加熱処理し、あるいはこれと同等の加熱変性を引き起こす、より高温で短時間の加熱処理を実施し、牛乳プロテオースペプトンのコンポーネント３以外のホエータンパク質を凝集させ、除去することを特徴とする請求項１記載の精製法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、ホエーから効率よく牛乳プロテオースペプトンのコンポーネント３を精製する方法である。ホエーは、チーズ製造やカゼイン製造などの副産物として得られるものであるが、ホエー（狭義）には大きく分けて酸性ホエーと甘性ホエー（あるいは中性ホエー）の２種類がある。酸性ホエーは主にクワルク、カッテージチーズなどの製造やカゼインの製造により生じ、ホエーのｐＨが低い（通常、ｐＨ４〜５）という特徴がある。一方、甘性ホエーはゴーダチーズやチェダーチーズあるいはカマンベールチーズなどの製造によって生じ、ホエーのｐＨが高い（通常ｐＨ６前後）という特徴がある。
本発明のコンポーネント３の精製方法には、これら狭義のホエーのいずれをも用いることができ、同様に前記したホエーパウダー，ＷＰＣ，ＷＰＩなども用いられ、これらの２種以上を併用することも可能である。
【０００９】
ホエーの濃縮に際して限外濾過膜を使用するが、分画分子量が１万以上の膜を使用すれば、膜透析を行うことによって、ホエー中に存在する乳糖や低分子量物質を効果的に除去して、高純度のコンポーネント３画分を得ることができる。分画分子量の上限は１００万である。それ以上の分画分子量のときは、コンポーネント３も透過してしまい、濃縮は困難となる。さらに、分画分子量が５万以上の膜、好ましくは１０万〜５０万の膜を用いて膜透析を行うことによって、コンポーネント３以外のカゼイン分解物やαラクトアルブミンやβラクトグロブリンなどの主要な共存タンパク質成分を効果的に除去し、濃縮液側にコンポーネント３を主に含む画分を蓄積させることができる。この場合は、以下に述べる加熱処理は必ずしも必要としない。
分画分子量が１万以上１００万以下の膜を使用して膜透析を行った場合は、得られた濃縮液を加熱処理することによって、コンポーネント３以外のタンパク質成分を凝集させ、除くことができる。その結果、より効果的にコンポーネント３を精製することが可能である。加熱温度は７０℃以上、通常は７０〜１００℃である。加熱処理の時間は、通常１０〜６０分が適当であり、加熱温度が８０℃では２０分以上、９０℃では１０分以上が目安とされる。しかし、この加熱処理はタンパク質を熱変性させて凝集化させることが目的であるから、これと同等の加熱変性を引き起こす、より高温で短時間の加熱処理、例えば１２１℃で数秒程度の加熱処理でもよい。この方法としては、例えばプレート式熱交換器を用いた加熱法等が挙げられる。なお、加熱処理時にｐＨを３〜１０、好ましくは３．０以上５．０未満に調整することが望ましい。このｐＨ調整は、加熱後に行い、その後で遠心等により凝集物を除去することによっても同様の結果が得られる。また、濃縮液のタンパク質濃度が０．０５（重量／容量）以上となるように濃縮を行う。
【００１０】
コンポーネント３の主要成分は変性下での分子量は３万未満程度であり、ゲル濾過での分子量は１３万程度であることが明らかにされている。しかし、ホエー中の天然条件下の存在形態では３０万以上の分子量を有していると考えられる。実際に、分画分子量が５０万あるいは１００万の膜を用いても、コンポーネント３は濃縮液側に蓄積される。
【００１１】
【実施例】
次に、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
実施例１
＜コンポーネント３の同定＞
チーズ製造、例えばクワルク製造で生じた酸性ホエーを分画分子量５万の膜を使用して濃縮し、濃縮液を非変性下でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）し、クマーシーブリリアントブルーＲ２５０で染色してコンポーネント３の存在を確認した。なお、ゲルの濃度は１２．５％であった。図１はその電気泳動写真を示したものである。なお、電気泳動は文献(Davis, B. J. Ann. N. Y. Acad. Sci. 121,404(1964))記載の方法により実施した。目的とするコンポーネント３は、この泳動方法では移動度の比較的小さい位置に容易に確認することができる。この画分は、前記したように、菅野によりラクトフォリンと命名されている。本発明のポリアクリルアミドゲル電気泳動は、すべてこの条件で実施した。
【００１２】
実施例２
＜限外濾過によるコンポーネント３の選択的濃縮＞
クワルク製造で生じた酸性ホエーからの限外濾過によるコンポーネント３の濃縮の例を示す。この酸性ホエーはｐＨ４．２３であった。これをさらにイオン交換樹脂法でｐＨを８．３０に置換したｐＨ調整ホエーを準備した。
これら２種類のｐＨのホエーを平膜型の限外濾過装置で濃縮した結果を図２に示した。なお、実験装置は東洋ソーダ（株）製ＵＦ−ＬＭＳ型ＵＦモジュールであり、分画分子量３０万の膜（ＵＦ−３００ＰＳ）を用いた。それぞれのサンプル２００ｍｌを流速２．５ｍｌ／分で通液し、濃縮液４０ｍｌと透過液１６０ｍｌを得た。
【００１３】
得られた透過液は凍結乾燥した。濃縮液はさらに水６０ｍｌを加えた後、４０ｍｌになるまで濃縮し、凍結乾燥した。得られたそれぞれの凍結乾燥物を電気泳動で比較した（図２）。その結果、ｐＨ調整していないホエーでもｐＨ調整後のホエーでも、濃縮液にはコンポーネント３が濃縮されていること、透過液側にはコンポーネント３のバンドが見られないことが明らかとなった。
また、コンポーネント３以外の移動度の大きいαラクトアルブミンやβラクトグロブリンなどのホエータンパク質は濃縮液と透過液の両方に存在することが明らかとなった。この結果から、ホエーを限外濾過膜で濃縮するときにαラクトアルブミンやβラクトグロブリンは透過し、かつコンポーネント３は透過できない分画分子量の限外濾過膜を利用すれば、コンポーネント３を効率的に濃縮できることが容易に理解できる。
図２において、レーン１はｐＨを調整していない酸性ホエー原液（ｐＨ４．２）、レーン２は該酸性ホエーを限外濾過装置で濃縮した時の濃縮液、レーン３は該酸性ホエーを限外濾過装置で濃縮した時の透過液、レーン４はイオン交換法でｐＨを調整した酸性ホエー（ｐＨ８．３）、レーン５は該ｐＨ調整酸性ホエーを限外濾過装置で濃縮した時の濃縮液、レーン６は該ｐＨ調整酸性ホエーを限外濾過装置で濃縮した時の透過液を示す。レーン３とレーン６の透過液ではコンポーネント３のバンドが見られないことが分かる。
【００１４】
実施例３
＜コンポーネント３の回収に対する加熱の影響＞
実施例２に示したように、コンポーネント３は限外濾過によって効率よく選択的に濃縮できることが明らかとなった。しかし、αラクトアルブミンとβラクトグロブリンを主成分とするコンポーネント３以外のタンパク質も、特に分画分子量の小さい膜を使用して膜透析を行った場合にはやや濃縮されるか、または濃縮されない場合でも平衡状態となり、濃縮液中に混在していることが判明した。
そこで、さらにコンポーネント３の純度を高めるために、濃縮後に９０℃、３０分の加熱処理を実施し、混在するコンポーネント３以外の成分を変性させ、凝集させた後、それらを遠心分離により分離することでコンポーネント３以外の成分を除去すべく検討した。
【００１５】
その結果、分画分子量１０万あるいは５０万の膜を用いて酸性ホエーを濃縮した後に、濃縮液を９０℃で３０分加熱し、遠心分離したとき、どちらの膜を用いても加熱処理によって効率よくコンポーネント３以外の画分を除去できることが明らかとなった。電気泳動で求めた結果を図３に示す。
図３において、レーン１は酸性ホエーを分画分子量５０万の膜で濃縮後、加熱し、遠心分離後の上澄液、レーン２はレーン１と同様なサンプルの加熱していないもの、レーン３は酸性ホエーを分画分子量１０万の膜で濃縮し、加熱していないもの、レーン４はレーン３と同じサンプルを加熱し、遠心分離した上澄液を示す。これらの電気泳動により加熱後、遠心分離を行うことによってコンポーネント３以外のバンドが減少していることが明らかである。
【００１６】
実施例４
＜コンポーネント３の回収に対する限外濾過膜の分画分子量の影響＞
コンポーネント３は、前記したように、変性下で電気泳動すると、分子量は主に２７０００と１７０００の比較的小さな分子が主要構成分であること、またゲル濾過では約１３万前後の分子量であることが分かっているが、ホエー中の天然状態ではさらに大きな分子量で存在していると考えられ、分画分子量が１万以上１００万までの限外濾過膜を使用して濃縮を行ったとき、コンポーネント３は濃縮液側に蓄積することが分かった。すなわち、従来はコンポーネント３は分子量がカゼインやαラクトアルブミンやβラクトグロブリン等と比較的近いものであると考えられていたため、膜による効率的な分画は不可能と考えられていたが、実際には、本実施例で示したように、分画分子量が５万から５０万という非常に大きい膜でも、コンポーネント３は膜を透過できずに濃縮できることが明らかとなった。
【００１７】
図４は、分画分子量１万、５万、１０万、５０万、１００万の限外濾過膜を使用して濃縮して得たものを加熱処理（９０〜９５℃で１０〜３０分間）し、遠心分離して得た上清を電気泳動により分析した結果を示したものである。図中、レーン１は分画分子量１万の膜で濃縮したのち、加熱し、遠心分離して得た上澄液のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、レーン２は分画分子量５万の膜で濃縮したのち、加熱し、遠心分離して得た上澄液のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、レーン３は分画分子量１０万の膜で濃縮したのち、加熱し、遠心分離して得た上澄液のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、レーン４は分画分子量５０万の膜で濃縮したのち、加熱し、遠心分離して得た上澄液のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、レーン５は分画分子量１００万の膜で濃縮したのち、加熱し、遠心分離して得た上澄液のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果をそれぞれ示す。
この結果から明らかなように、１万から５０万までの分画分子量の膜では濃縮液側に濃縮させることが可能で、透過液側にコンポーネント３は出てこなかった。しかし、分画分子量１００万の膜では、コンポーネント３は透過液側にも漏洩したが、ある程度濃縮された。
したがって、効率よくコンポーネント３を限外濾過法で濃縮、精製するには、コンポーネント３が通過できないぎりぎりの分画分子量の膜（例えば、５万から５０万の膜）を用いれば、膜透析によって効率よく夾雑物を減少させることが可能であり、しかも膜の詰まりが起こりにくくなり経済的である。
【００１８】
実施例５
＜加熱時のタンパク質濃度の影響＞
クワルク製造で生じた酸性ホエーを濃縮前に加熱しても、凝集物や沈殿物は生成せず、遠心分離を行ってもαラクトアルブミンやβラクトグロブリンは殆ど除去できない。それ故、効率よくコンポーネント３を限外濾過法で精製するには膜透析で濃縮後に加熱処理を行うことが必要である。このとき、どの程度のタンパク質濃度で加熱処理すれば、コンポーネント３成分以外の成分を除去できるかについて検討した。
分画分子量５０万の膜を使用して得た酸性ホエー濃縮物を凍結乾燥した。これをタンパク質濃度として０．０５、０．１、０．３、０．５、０．７、１．０、２．０％（Ｗ／Ｖ）になるように水で還元し調製した。なお、タンパク質含量はウシ血清アルブミンを標準タンパク質として色素法によって決定した。これらの濃度に調製した濃縮液を９５℃で２０分間加熱処理した後、１５０００ｒｐｍで遠心分離後、上澄液を各レーンのタンパク質量がほぼ同じになるようにして、電気泳動で分析した。結果を図５に示す。各レーンのサンプルのタンパク質濃度は次の通りである。
レーン１：加熱前の濃縮液（対照）、レーン２：０．０５％（Ｗ／Ｖ）、レーン３：０．１％（Ｗ／Ｖ）、レーン４：０．３％（Ｗ／Ｖ）、レーン５：０．５％（Ｗ／Ｖ）、レーン６：０．７％（Ｗ／Ｖ）、レーン７：１．０％（Ｗ／Ｖ）、レーン８：２．０％（Ｗ／Ｖ）
図から明らかなように、タンパク質濃度が０．０５％以上の濃縮液を加熱処理した場合に、特にβラクトグロブリンを除去できることが分かった。また、０．１％以上のタンパク質濃度では、αラクトアルブミンも除去できることが分かった。
【００１９】
実施例６
＜濃縮液のｐＨの影響＞
コンポーネント３成分以外の成分を効果的に除去してコンポーネント３を効率よく精製するためには、濃縮液のｐＨをどのように調整すればよいかを調べるため、濃縮液のｐＨの影響について検討した。すなわち、分画分子量５０万の膜を使用して得た酸性ホエー濃縮物を凍結乾燥した。この酸性ホエー濃縮物は水で膜透析を続けると、アルカリ性（ｐＨ８．３）になった。これをタンパク質濃度０．５％（Ｗ/ Ｖ）になるように各種緩衝液で調製し、これらの濃縮液を煮沸（９５〜１００℃）で２０分間加熱処理し、１５０００ｒｐｍで遠心分離後、上澄液をタンパク質量として同じになるようにしてから、電気泳動で分析した。結果を図６に示す。図中、各レーンのサンプルのｐＨは次のとおりである。
レーン１：ｐＨ３、レーン２：ｐＨ４、レーン３：ｐＨ５、レーン４：ｐＨ６、レーン５：ｐＨ７、レーン６：ｐＨ８、レーン７：ｐＨ９、レーン８：ｐＨ１０
図から明らかなように、どのｐＨ値においてもαラクトアルブミンやβラクトグロブリンなどは除去可能であると考えられる。さらに、よく観察すると、コンポーネント３よりも移動度の小さい高分子の糖タンパク質は酸性下での加熱処理によって除去することができることが分かる。遠心分離後の上澄液は、ｐＨが３．０以上５．０未満のとき透明度が高かったが、アルカリ側で加熱処理すると、上澄液が白濁し、変性したタンパク質が多くなったものと考えられる。それ故、加熱時のｐＨは３．０以上５．０未満が望ましい。なお、加熱後にｐＨ調整を行い、その後で遠心分離等により凝集物を除去しても同様の結果が得られる。
【００２０】
実施例７
＜加熱温度の影響＞
コンポーネント３を効率よく精製するためには、加熱処理の温度をどの程度にすればよいか検討した。そこで、分画分子量５０万の膜を使用して得た酸性ホエー濃縮物を凍結乾燥した。これをタンパク質濃度０．５％（Ｗ／Ｖ）になるように調製した（ＨＣｌを用いてｐＨ４．０に調整した。）次いで、濃縮液を４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃または煮沸（９５〜１００℃）の温度で２０分間加熱処理した後、１５０００ｐｐｍで遠心分離後、上澄液をタンパク質量として同じになるように調整後、電気泳動で分析した。その結果を図７に示す。なお、対照として加熱処理をしないものを用いた。図中、各レーンのサンプルの加熱温度は次の通りである。
レーン１：加熱前の濃縮液（対照）：レーン２：４０℃、レーン３：５０℃、レーン４：６０℃、レーン５：７０℃、レーン６：８０℃、レーン７：９０℃、レーン８：煮沸（９５〜１００℃）
その結果、９０℃で２０分に相当する加熱処理でかなりの除去が可能であると考えられた。しかし、加熱処理温度が９５〜１００℃であれば、さらに効率よくコンポーネント３以外の成分を除去できることが明らかとなった。
【００２１】
実施例８
＜加熱時間の影響＞
コンポーネント３を効率よく精製するためには、加熱処理の時間をどの程度とすればよいか検討した。実施例７と同様な濃縮液を煮沸（９５〜１００℃）で１分から６０分加熱した。次いで、１５０００ｒｐｍで遠心分離後、得られた上澄液を各レーンのタンパク質量が同じになるようにして、電気泳動で分析した。その結果を図８に示した。各レーンのサンプルの煮沸（９５〜１００℃）での加熱時間はレーン１：未加熱（０分間）、レーン２：１分間、レーン３：５分間、レーン４：１０分間、レーン５：１５分間、レーン６：２０分間、レーン７：２５分間、レーン８：３０分間、レーン９：４０分間、レーン１０：５０分間、レーン１１：６０分間である。
図から明らかなように、９５〜１００℃で５分間以上加熱すれば、コンポーネント３を効率的に精製できることが分かる。この結果と実施例７の結果とを併せて判断すると、９０℃で１０分程度の加熱処理が適当である。なお、当然のことながら、この加熱処理はタンパク質を熱変性させるためであるから、これと同等な変性を引き起こすことができる、より高温で短時間の加熱（例えば１２１℃、数秒間）でも同様の結果が得られることは明白である。
【００２２】
実施例９
＜酸性ホエーからのコンポーネント３画分の生産＞
上記の各実施例の結果に基づいて、実際にホエーからコンポーネント３を精製した。すなわち、クワルク製造で生じた酸性ホエー２７０ｋｇ（ｐＨ４．３）を５０〜５５℃に加温し、これを限外濾過装置（α−ラバルＵＦＲ１／２、フォローファイバーＰＭ１００、分画分子量１０万）で濃縮、加水による膜透析を行い、総量３６ｋｇまで濃縮した。次いで、逆浸透膜(Reverse Osmosis、ＲＯ）（ＤＤＳ，ＨＲ９５) で５ｋｇまで濃縮した後、煮沸（９５〜１００℃）で３０分間加熱処理し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して沈殿物を除去した。なお、加熱処理時の濃縮液のｐＨは８．３に調整した。得られた上清を凍結乾燥してコンポーネント３画分を６４ｇ得た。
【００２３】
実施例１０
＜酸性ホエーからの透明度の高いコンポーネント３画分の生産＞
実施例９で得られたコンポーネント３は水に溶解したとき白濁しているので、この例では透明度の高いコンポーネント３の製造例を示す。酸性ホエー３６３ｋｇを５０〜５５℃に加温して限外濾過装置（α−ラバルＵＦＲ１／２、フォローファイバーＰＭ５００、分画分子量５０万）で濃縮、加水による膜透析を行い、総量２２ｋｇまで濃縮した。次いで、逆浸透膜（ＲＯ）（ＤＤＳ，ＨＲ９５）で５ｋｇまで濃縮した後、撹拌しながら６規定塩酸を用いてｐＨ４．０に調整した。それから煮沸（９５〜１００℃）で３０分間加熱処理し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して沈殿物を除去した。得られた上清を凍結乾燥して透明度の高いコンポーネント３画分を５４ｇ得た。
【００２４】
実施例１１
＜実施例９および実施例１０で得たコンポーネント３画分の分析＞
実施例９および１０で製造したコンポーネント３画分をポリアクリルアミド電気泳動で分析した結果を図９に示した。図中、レーン１が実施例９で得たコンポーネント３画分であり、レーン２が実施例１０で得たコンポーネント３画分である。
【００２５】
実施例１２
＜中性ホエーからのコンポーネント３の精製例＞
これまでの実施例では酸性ホエーからのコンポーネント３の精製例のみを示したが、この例では中性ホエーからも同様な方法でコンポーネント３を精製できることを示す。中性ホエーを用い実施例９と同様な方法で処理して得たコンポーネント３画分のポリアクリルアミドゲル電気泳動での分析結果を図１０に示す。
図から明らかなように、得られたコンポーネント３画分の純度は、中性ホエーからの場合も酸性ホエーからの場合とほぼ同様であった。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によって、ホエー中のコンポーネント３を主要成分とする画分を試薬等を殆ど用いずに、物理的な方法のみで高度に精製する実用的な方法が提供される。コンポーネント３、すなわちラクトフォリンは非常に高い乳化性があることがすでに分かっているが、このものを本発明によって初めて経済的に製造することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１の結果を示す電気泳動写真である。
【図２】 実施例２の結果を示す電気泳動写真である。
【図３】 実施例３の結果を示す電気泳動写真である。
【図４】 実施例４の結果を示す電気泳動写真である。
【図５】 実施例５の結果を示す電気泳動写真である。
【図６】 実施例６の結果を示す電気泳動写真である。
【図７】 実施例７の結果を示す電気泳動写真である。
【図８】 実施例８の結果を示す電気泳動写真である。
【図９】 実施例１１の結果を示す電気泳動写真である。
【図１０】 実施例１２の結果を示す電気泳動写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、牛乳プロテオースペプトンのコンポーネント３の精製法に関し、詳しくは牛乳に含まれるタンパク質のうちプロテオースペプトンと総称される画分からコンポーネント３を主要成分とする画分を乳清（ホエー）から経済的に、しかも高い純度で精製する方法に関するものである。
本発明によって得られるコンポーネント３画分は高い界面活性力をもち、食品や化粧品、医薬品用の界面活性剤あるいは乳化剤、安定剤として利用することが可能である。
【０００２】
【従来の技術】
牛乳中のプロテオースペプトンは、牛乳タンパク質のうちホエーを９５℃から１００℃で２０分加熱後、ｐＨ４．６に調整しても沈殿せず、１２％トリクロル酢酸で沈殿する成分として定義されている(Thompson, M. P., Tarassuk, N. P., Jenness, R., Lillevik, H. A., Ashworth, U. S.and Rose, D.: Journal of Dairy Science 48, 159 (1965))。
このプロテオースペプトンは、均一な化学組成をもつものではなく、主にコンポーネント３、５及び８と呼ばれる複数のタンパク質画分から構成されている(Larson, B. L., and G. R. Rolleri. : Journal of Dairy Science 38, 351(1955))。その後、さらにコンポーネント３、５、８-slow,８-fast の４種の成分があると認識されている(Kolar, C. W., and Brunner, J. R., Journal of Dairy Science 53, 997 (1970)) 。このように不均一な成分から構成されているため、今日プロテオースペプトンという用語は単一の成分を示す物質名ではなく、一つの画分名として慣用的に用いられている。
【０００３】
このうちコンポーネント３は脂肪球膜を構成する糖タンパク質と抗原性を同じくする成分を多く含み、菅野は、これをラクトフォリンと命名している(Kanno, C.: Journal of Dairy Science 72, 883(1989)) 。最近、本発明者らは、ラクトフォリンを構成する主要糖タンパク質をコードするｃＤＮＡの配列を決定することに成功し(Tsukasaki, F., Motoshima, H., Kuriki, H., Minagawa, E. and Kanno, C. 24th In ternational Dairy Congress: Melbourne, Australia, 18th-22nd September,1994, Brief communications and abstracts of posters and invited papers, page 190, Gb21p,1994) 、その配列から推定されるアミノ酸配列が、別の研究者が決定したコンポーネント３の主要糖タンパク質の一次構造(Sorensen, E. S and Petersen, T. E. Journal of Dairy Research 60, 535 (1993)) と完全に一致することを明らかにした。すなわち、プロテオースペプトンのコンポーネント３とラクトフォリンは定義がやや異なるが、物質としては事実上同一の成分を示した用語であるため、本発明ではコンポーネント３とラクトフォリンは同一のものを意味するものとして用いる。
【０００４】
本発明のプロテオースペプトン画分からのコンポーネント３の精製法は、ラクトフォリンの精製法と同義として扱う。我々は、すでにこのラクトフォリン画分が極めて高い界面活性力を有し天然の界面活性剤として利用価値が高いことを見出している（特開平４−１０４８３０号）。
コンポーネント３の従来的な分画方法は、文献（例えば、Ng, W. C., Brunner, J. R. And Rhee K. C. Journal of Dairy Science 53,987 (1969))にすでに詳しく説明されている。しかし、従来このコンポーネント３を主成分とした画分を脱脂乳やホエーから精製する方法は硫安分画等の煩雑な工程を必要とし、経済的にも非常に不利で、事実上、界面活性剤や乳化剤として利用するには問題があった。また、複雑な精製法を用いると、精製過程で不純物が混入するおそれもあり、より簡便なコンポーネント３の精製法の開発が求められている。なお、本発明のような膜処理による精製法はいまだ報告されていない。その理由は、コンポーネント３の主要な構成タンパク質の分子量が変性下で約２７０００と１７０００の分子量の糖タンパク質からなり、他の混在するα−ラクトアルブミンやβ−ラクトグロブリンとあまり大きさに差がないことから、事実上分画は困難であると考えられていたためである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
これまで、コンポーネント３あるいはラクトフォリンを効率的に精製する方法は未だ報告されていなかった。本発明は、従来報告されている方法のように硫安沈殿やカラムクロマトグラフィーなどの方法を用いずに、ホエーから特にコンポーネント３を多く含む画分を精製する方法を開発することを目的とする。
なお、本発明において原料として用いるホエーには制限がなく、例えば酸性ホエーや中性ホエーのみならず、ホエーを粉末化したホエーパウダー、ホエータンパク質を濃縮したホエータンパク質の濃縮物（ＷＰＣ）、ホエータンパク質の単離物（ＷＰＩ）なども使用できる。これらは、すべて市販されており、容易に入手が可能である。これらは、いずれもコンポーネント３成分をホエーと同様に含んでおり、適当に水などで還元すれば、ホエーと同じく原料として利用することができる。したがって、本明細書において「ホエー」とは特に断わらない限り、これらを含んだものを意味する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
牛乳やホエーをｐＨ４から５の範囲で加熱（約９０℃) した後、遠心分離により凝集物を除去しても、単にプロテオースペプトンを多く含む画分が得られるのみで、コンポーネント３のみを精製することができない。しかし、本発明者らは鋭意努力の結果、単にホエーを限外濾過濃縮装置で濃縮後（タンパク質含量として０．０５％（重量／容量）以上）に、９０℃前後の加熱をすることによって、コンポーネント３以外の大部分のタンパク質を凝集させて除去し、上清にはコンポーネント３が主要な成分として残り、精製することが可能であることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
【０００７】
すなわち、請求項１に記載の本発明は、分画分子量５万以上５０万以下の限外濾過膜を用いてホエーを濃縮及び透析することを特徴とする牛乳プロテオースペプトンのコンポーネント３の精製法であり、請求項２に記載の本発明は、限外濾過膜を用いてホエーを透析した後、濃縮液を７０〜１００℃の温度で１０〜６０分間加熱処理し、あるいはこれと同等の加熱変性を引き起こす、より高温で短時間の加熱処理を実施し、牛乳プロテオースペプトンのコンポーネント３以外のホエータンパク質を凝集させ、除去することを特徴とする請求項１記載の精製法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、ホエーから効率よく牛乳プロテオースペプトンのコンポーネント３を精製する方法である。ホエーは、チーズ製造やカゼイン製造などの副産物として得られるものであるが、ホエー（狭義）には大きく分けて酸性ホエーと甘性ホエー（あるいは中性ホエー）の２種類がある。酸性ホエーは主にクワルク、カッテージチーズなどの製造やカゼインの製造により生じ、ホエーのｐＨが低い（通常、ｐＨ４〜５）という特徴がある。一方、甘性ホエーはゴーダチーズやチェダーチーズあるいはカマンベールチーズなどの製造によって生じ、ホエーのｐＨが高い（通常ｐＨ６前後）という特徴がある。
本発明のコンポーネント３の精製方法には、これら狭義のホエーのいずれをも用いることができ、同様に前記したホエーパウダー，ＷＰＣ，ＷＰＩなども用いられ、これらの２種以上を併用することも可能である。
【０００９】
ホエーの濃縮に際して限外濾過膜を使用するが、分画分子量が１万以上の膜を使用すれば、膜透析を行うことによって、ホエー中に存在する乳糖や低分子量物質を効果的に除去して、高純度のコンポーネント３画分を得ることができる。分画分子量の上限は１００万である。それ以上の分画分子量のときは、コンポーネント３も透過してしまい、濃縮は困難となる。さらに、分画分子量が５万以上の膜、好ましくは１０万〜５０万の膜を用いて膜透析を行うことによって、コンポーネント３以外のカゼイン分解物やαラクトアルブミンやβラクトグロブリンなどの主要な共存タンパク質成分を効果的に除去し、濃縮液側にコンポーネント３を主に含む画分を蓄積させることができる。この場合は、以下に述べる加熱処理は必ずしも必要としない。
分画分子量が１万以上１００万以下の膜を使用して膜透析を行った場合は、得られた濃縮液を加熱処理することによって、コンポーネント３以外のタンパク質成分を凝集させ、除くことができる。その結果、より効果的にコンポーネント３を精製することが可能である。加熱温度は７０℃以上、通常は７０〜１００℃である。加熱処理の時間は、通常１０〜６０分が適当であり、加熱温度が８０℃では２０分以上、９０℃では１０分以上が目安とされる。しかし、この加熱処理はタンパク質を熱変性させて凝集化させることが目的であるから、これと同等の加熱変性を引き起こす、より高温で短時間の加熱処理、例えば１２１℃で数秒程度の加熱処理でもよい。この方法としては、例えばプレート式熱交換器を用いた加熱法等が挙げられる。なお、加熱処理時にｐＨを３〜１０、好ましくは３．０以上５．０未満に調整することが望ましい。このｐＨ調整は、加熱後に行い、その後で遠心等により凝集物を除去することによっても同様の結果が得られる。また、濃縮液のタンパク質濃度が０．０５（重量／容量）以上となるように濃縮を行う。
【００１０】
コンポーネント３の主要成分は変性下での分子量は３万未満程度であり、ゲル濾過での分子量は１３万程度であることが明らかにされている。しかし、ホエー中の天然条件下の存在形態では３０万以上の分子量を有していると考えられる。実際に、分画分子量が５０万あるいは１００万の膜を用いても、コンポーネント３は濃縮液側に蓄積される。
【００１１】
【実施例】
次に、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
実施例１
＜コンポーネント３の同定＞
チーズ製造、例えばクワルク製造で生じた酸性ホエーを分画分子量５万の膜を使用して濃縮し、濃縮液を非変性下でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）し、クマーシーブリリアントブルーＲ２５０で染色してコンポーネント３の存在を確認した。なお、ゲルの濃度は１２．５％であった。図１はその電気泳動写真を示したものである。なお、電気泳動は文献(Davis, B. J. Ann. N. Y. Acad. Sci. 121,404(1964))記載の方法により実施した。目的とするコンポーネント３は、この泳動方法では移動度の比較的小さい位置に容易に確認することができる。この画分は、前記したように、菅野によりラクトフォリンと命名されている。本発明のポリアクリルアミドゲル電気泳動は、すべてこの条件で実施した。
【００１２】
実施例２
＜限外濾過によるコンポーネント３の選択的濃縮＞
クワルク製造で生じた酸性ホエーからの限外濾過によるコンポーネント３の濃縮の例を示す。この酸性ホエーはｐＨ４．２３であった。これをさらにイオン交換樹脂法でｐＨを８．３０に置換したｐＨ調整ホエーを準備した。
これら２種類のｐＨのホエーを平膜型の限外濾過装置で濃縮した結果を図２に示した。なお、実験装置は東洋ソーダ（株）製ＵＦ−ＬＭＳ型ＵＦモジュールであり、分画分子量３０万の膜（ＵＦ−３００ＰＳ）を用いた。それぞれのサンプル２００ｍｌを流速２．５ｍｌ／分で通液し、濃縮液４０ｍｌと透過液１６０ｍｌを得た。
【００１３】
得られた透過液は凍結乾燥した。濃縮液はさらに水６０ｍｌを加えた後、４０ｍｌになるまで濃縮し、凍結乾燥した。得られたそれぞれの凍結乾燥物を電気泳動で比較した（図２）。その結果、ｐＨ調整していないホエーでもｐＨ調整後のホエーでも、濃縮液にはコンポーネント３が濃縮されていること、透過液側にはコンポーネント３のバンドが見られないことが明らかとなった。
また、コンポーネント３以外の移動度の大きいαラクトアルブミンやβラクトグロブリンなどのホエータンパク質は濃縮液と透過液の両方に存在することが明らかとなった。この結果から、ホエーを限外濾過膜で濃縮するときにαラクトアルブミンやβラクトグロブリンは透過し、かつコンポーネント３は透過できない分画分子量の限外濾過膜を利用すれば、コンポーネント３を効率的に濃縮できることが容易に理解できる。
図２において、レーン１はｐＨを調整していない酸性ホエー原液（ｐＨ４．２）、レーン２は該酸性ホエーを限外濾過装置で濃縮した時の濃縮液、レーン３は該酸性ホエーを限外濾過装置で濃縮した時の透過液、レーン４はイオン交換法でｐＨを調整した酸性ホエー（ｐＨ８．３）、レーン５は該ｐＨ調整酸性ホエーを限外濾過装置で濃縮した時の濃縮液、レーン６は該ｐＨ調整酸性ホエーを限外濾過装置で濃縮した時の透過液を示す。レーン３とレーン６の透過液ではコンポーネント３のバンドが見られないことが分かる。
【００１４】
実施例３
＜コンポーネント３の回収に対する加熱の影響＞
実施例２に示したように、コンポーネント３は限外濾過によって効率よく選択的に濃縮できることが明らかとなった。しかし、αラクトアルブミンとβラクトグロブリンを主成分とするコンポーネント３以外のタンパク質も、特に分画分子量の小さい膜を使用して膜透析を行った場合にはやや濃縮されるか、または濃縮されない場合でも平衡状態となり、濃縮液中に混在していることが判明した。
そこで、さらにコンポーネント３の純度を高めるために、濃縮後に９０℃、３０分の加熱処理を実施し、混在するコンポーネント３以外の成分を変性させ、凝集させた後、それらを遠心分離により分離することでコンポーネント３以外の成分を除去すべく検討した。
【００１５】
その結果、分画分子量１０万あるいは５０万の膜を用いて酸性ホエーを濃縮した後に、濃縮液を９０℃で３０分加熱し、遠心分離したとき、どちらの膜を用いても加熱処理によって効率よくコンポーネント３以外の画分を除去できることが明らかとなった。電気泳動で求めた結果を図３に示す。
図３において、レーン１は酸性ホエーを分画分子量５０万の膜で濃縮後、加熱し、遠心分離後の上澄液、レーン２はレーン１と同様なサンプルの加熱していないもの、レーン３は酸性ホエーを分画分子量１０万の膜で濃縮し、加熱していないもの、レーン４はレーン３と同じサンプルを加熱し、遠心分離した上澄液を示す。これらの電気泳動により加熱後、遠心分離を行うことによってコンポーネント３以外のバンドが減少していることが明らかである。
【００１６】
実施例４
＜コンポーネント３の回収に対する限外濾過膜の分画分子量の影響＞
コンポーネント３は、前記したように、変性下で電気泳動すると、分子量は主に２７０００と１７０００の比較的小さな分子が主要構成分であること、またゲル濾過では約１３万前後の分子量であることが分かっているが、ホエー中の天然状態ではさらに大きな分子量で存在していると考えられ、分画分子量が１万以上１００万までの限外濾過膜を使用して濃縮を行ったとき、コンポーネント３は濃縮液側に蓄積することが分かった。すなわち、従来はコンポーネント３は分子量がカゼインやαラクトアルブミンやβラクトグロブリン等と比較的近いものであると考えられていたため、膜による効率的な分画は不可能と考えられていたが、実際には、本実施例で示したように、分画分子量が５万から５０万という非常に大きい膜でも、コンポーネント３は膜を透過できずに濃縮できることが明らかとなった。
【００１７】
図４は、分画分子量１万、５万、１０万、５０万、１００万の限外濾過膜を使用して濃縮して得たものを加熱処理（９０〜９５℃で１０〜３０分間）し、遠心分離して得た上清を電気泳動により分析した結果を示したものである。図中、レーン１は分画分子量１万の膜で濃縮したのち、加熱し、遠心分離して得た上澄液のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、レーン２は分画分子量５万の膜で濃縮したのち、加熱し、遠心分離して得た上澄液のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、レーン３は分画分子量１０万の膜で濃縮したのち、加熱し、遠心分離して得た上澄液のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、レーン４は分画分子量５０万の膜で濃縮したのち、加熱し、遠心分離して得た上澄液のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、レーン５は分画分子量１００万の膜で濃縮したのち、加熱し、遠心分離して得た上澄液のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果をそれぞれ示す。
この結果から明らかなように、１万から５０万までの分画分子量の膜では濃縮液側に濃縮させることが可能で、透過液側にコンポーネント３は出てこなかった。しかし、分画分子量１００万の膜では、コンポーネント３は透過液側にも漏洩したが、ある程度濃縮された。
したがって、効率よくコンポーネント３を限外濾過法で濃縮、精製するには、コンポーネント３が通過できないぎりぎりの分画分子量の膜（例えば、５万から５０万の膜）を用いれば、膜透析によって効率よく夾雑物を減少させることが可能であり、しかも膜の詰まりが起こりにくくなり経済的である。
【００１８】
実施例５
＜加熱時のタンパク質濃度の影響＞
クワルク製造で生じた酸性ホエーを濃縮前に加熱しても、凝集物や沈殿物は生成せず、遠心分離を行ってもαラクトアルブミンやβラクトグロブリンは殆ど除去できない。それ故、効率よくコンポーネント３を限外濾過法で精製するには膜透析で濃縮後に加熱処理を行うことが必要である。このとき、どの程度のタンパク質濃度で加熱処理すれば、コンポーネント３成分以外の成分を除去できるかについて検討した。
分画分子量５０万の膜を使用して得た酸性ホエー濃縮物を凍結乾燥した。これをタンパク質濃度として０．０５、０．１、０．３、０．５、０．７、１．０、２．０％（Ｗ／Ｖ）になるように水で還元し調製した。なお、タンパク質含量はウシ血清アルブミンを標準タンパク質として色素法によって決定した。これらの濃度に調製した濃縮液を９５℃で２０分間加熱処理した後、１５０００ｒｐｍで遠心分離後、上澄液を各レーンのタンパク質量がほぼ同じになるようにして、電気泳動で分析した。結果を図５に示す。各レーンのサンプルのタンパク質濃度は次の通りである。
レーン１：加熱前の濃縮液（対照）、レーン２：０．０５％（Ｗ／Ｖ）、レーン３：０．１％（Ｗ／Ｖ）、レーン４：０．３％（Ｗ／Ｖ）、レーン５：０．５％（Ｗ／Ｖ）、レーン６：０．７％（Ｗ／Ｖ）、レーン７：１．０％（Ｗ／Ｖ）、レーン８：２．０％（Ｗ／Ｖ）
図から明らかなように、タンパク質濃度が０．０５％以上の濃縮液を加熱処理した場合に、特にβラクトグロブリンを除去できることが分かった。また、０．１％以上のタンパク質濃度では、αラクトアルブミンも除去できることが分かった。
【００１９】
実施例６
＜濃縮液のｐＨの影響＞
コンポーネント３成分以外の成分を効果的に除去してコンポーネント３を効率よく精製するためには、濃縮液のｐＨをどのように調整すればよいかを調べるため、濃縮液のｐＨの影響について検討した。すなわち、分画分子量５０万の膜を使用して得た酸性ホエー濃縮物を凍結乾燥した。この酸性ホエー濃縮物は水で膜透析を続けると、アルカリ性（ｐＨ８．３）になった。これをタンパク質濃度０．５％（Ｗ/ Ｖ）になるように各種緩衝液で調製し、これらの濃縮液を煮沸（９５〜１００℃）で２０分間加熱処理し、１５０００ｒｐｍで遠心分離後、上澄液をタンパク質量として同じになるようにしてから、電気泳動で分析した。結果を図６に示す。図中、各レーンのサンプルのｐＨは次のとおりである。
レーン１：ｐＨ３、レーン２：ｐＨ４、レーン３：ｐＨ５、レーン４：ｐＨ６、レーン５：ｐＨ７、レーン６：ｐＨ８、レーン７：ｐＨ９、レーン８：ｐＨ１０
図から明らかなように、どのｐＨ値においてもαラクトアルブミンやβラクトグロブリンなどは除去可能であると考えられる。さらに、よく観察すると、コンポーネント３よりも移動度の小さい高分子の糖タンパク質は酸性下での加熱処理によって除去することができることが分かる。遠心分離後の上澄液は、ｐＨが３．０以上５．０未満のとき透明度が高かったが、アルカリ側で加熱処理すると、上澄液が白濁し、変性したタンパク質が多くなったものと考えられる。それ故、加熱時のｐＨは３．０以上５．０未満が望ましい。なお、加熱後にｐＨ調整を行い、その後で遠心分離等により凝集物を除去しても同様の結果が得られる。
【００２０】
実施例７
＜加熱温度の影響＞
コンポーネント３を効率よく精製するためには、加熱処理の温度をどの程度にすればよいか検討した。そこで、分画分子量５０万の膜を使用して得た酸性ホエー濃縮物を凍結乾燥した。これをタンパク質濃度０．５％（Ｗ／Ｖ）になるように調製した（ＨＣｌを用いてｐＨ４．０に調整した。）次いで、濃縮液を４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃または煮沸（９５〜１００℃）の温度で２０分間加熱処理した後、１５０００ｐｐｍで遠心分離後、上澄液をタンパク質量として同じになるように調整後、電気泳動で分析した。その結果を図７に示す。なお、対照として加熱処理をしないものを用いた。図中、各レーンのサンプルの加熱温度は次の通りである。
レーン１：加熱前の濃縮液（対照）：レーン２：４０℃、レーン３：５０℃、レーン４：６０℃、レーン５：７０℃、レーン６：８０℃、レーン７：９０℃、レーン８：煮沸（９５〜１００℃）
その結果、９０℃で２０分に相当する加熱処理でかなりの除去が可能であると考えられた。しかし、加熱処理温度が９５〜１００℃であれば、さらに効率よくコンポーネント３以外の成分を除去できることが明らかとなった。
【００２１】
実施例８
＜加熱時間の影響＞
コンポーネント３を効率よく精製するためには、加熱処理の時間をどの程度とすればよいか検討した。実施例７と同様な濃縮液を煮沸（９５〜１００℃）で１分から６０分加熱した。次いで、１５０００ｒｐｍで遠心分離後、得られた上澄液を各レーンのタンパク質量が同じになるようにして、電気泳動で分析した。その結果を図８に示した。各レーンのサンプルの煮沸（９５〜１００℃）での加熱時間はレーン１：未加熱（０分間）、レーン２：１分間、レーン３：５分間、レーン４：１０分間、レーン５：１５分間、レーン６：２０分間、レーン７：２５分間、レーン８：３０分間、レーン９：４０分間、レーン１０：５０分間、レーン１１：６０分間である。
図から明らかなように、９５〜１００℃で５分間以上加熱すれば、コンポーネント３を効率的に精製できることが分かる。この結果と実施例７の結果とを併せて判断すると、９０℃で１０分程度の加熱処理が適当である。なお、当然のことながら、この加熱処理はタンパク質を熱変性させるためであるから、これと同等な変性を引き起こすことができる、より高温で短時間の加熱（例えば１２１℃、数秒間）でも同様の結果が得られることは明白である。
【００２２】
実施例９
＜酸性ホエーからのコンポーネント３画分の生産＞
上記の各実施例の結果に基づいて、実際にホエーからコンポーネント３を精製した。すなわち、クワルク製造で生じた酸性ホエー２７０ｋｇ（ｐＨ４．３）を５０〜５５℃に加温し、これを限外濾過装置（α−ラバルＵＦＲ１／２、フォローファイバーＰＭ１００、分画分子量１０万）で濃縮、加水による膜透析を行い、総量３６ｋｇまで濃縮した。次いで、逆浸透膜(Reverse Osmosis、ＲＯ）（ＤＤＳ，ＨＲ９５) で５ｋｇまで濃縮した後、煮沸（９５〜１００℃）で３０分間加熱処理し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して沈殿物を除去した。なお、加熱処理時の濃縮液のｐＨは８．３に調整した。得られた上清を凍結乾燥してコンポーネント３画分を６４ｇ得た。
【００２３】
実施例１０
＜酸性ホエーからの透明度の高いコンポーネント３画分の生産＞
実施例９で得られたコンポーネント３は水に溶解したとき白濁しているので、この例では透明度の高いコンポーネント３の製造例を示す。酸性ホエー３６３ｋｇを５０〜５５℃に加温して限外濾過装置（α−ラバルＵＦＲ１／２、フォローファイバーＰＭ５００、分画分子量５０万）で濃縮、加水による膜透析を行い、総量２２ｋｇまで濃縮した。次いで、逆浸透膜（ＲＯ）（ＤＤＳ，ＨＲ９５）で５ｋｇまで濃縮した後、撹拌しながら６規定塩酸を用いてｐＨ４．０に調整した。それから煮沸（９５〜１００℃）で３０分間加熱処理し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して沈殿物を除去した。得られた上清を凍結乾燥して透明度の高いコンポーネント３画分を５４ｇ得た。
【００２４】
実施例１１
＜実施例９および実施例１０で得たコンポーネント３画分の分析＞
実施例９および１０で製造したコンポーネント３画分をポリアクリルアミド電気泳動で分析した結果を図９に示した。図中、レーン１が実施例９で得たコンポーネント３画分であり、レーン２が実施例１０で得たコンポーネント３画分である。
【００２５】
実施例１２
＜中性ホエーからのコンポーネント３の精製例＞
これまでの実施例では酸性ホエーからのコンポーネント３の精製例のみを示したが、この例では中性ホエーからも同様な方法でコンポーネント３を精製できることを示す。中性ホエーを用い実施例９と同様な方法で処理して得たコンポーネント３画分のポリアクリルアミドゲル電気泳動での分析結果を図１０に示す。
図から明らかなように、得られたコンポーネント３画分の純度は、中性ホエーからの場合も酸性ホエーからの場合とほぼ同様であった。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によって、ホエー中のコンポーネント３を主要成分とする画分を試薬等を殆ど用いずに、物理的な方法のみで高度に精製する実用的な方法が提供される。コンポーネント３、すなわちラクトフォリンは非常に高い乳化性があることがすでに分かっているが、このものを本発明によって初めて経済的に製造することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１の結果を示す電気泳動写真である。
【図２】 実施例２の結果を示す電気泳動写真である。
【図３】 実施例３の結果を示す電気泳動写真である。
【図４】 実施例４の結果を示す電気泳動写真である。
【図５】 実施例５の結果を示す電気泳動写真である。
【図６】 実施例６の結果を示す電気泳動写真である。
【図７】 実施例７の結果を示す電気泳動写真である。
【図８】 実施例８の結果を示す電気泳動写真である。
【図９】 実施例１１の結果を示す電気泳動写真である。
【図１０】 実施例１２の結果を示す電気泳動写真である。
Claims (4)
- 分画分子量５万以上５０万以下の限外濾過膜を用いてホエーを濃縮及び透析することを特徴とする牛乳プロテオースペプトンのコンポーネント３の精製法。
- 限外濾過膜を用いてホエーを透析した後、濃縮液を７０〜１００℃の温度で１０〜６０分間加熱処理し、あるいはこれと同等の加熱変性を引き起こす、より高温で短時間の加熱処理を実施し、牛乳プロテオースペプトンのコンポーネント３以外のホエータンパク質を凝集させ、除去することを特徴とする請求項１記載の精製法。
- 限外濾過膜を用いてホエーを透析した後、濃縮液を７０〜１００℃の温度で１０〜６０分間加熱処理し、牛乳プロテオースペプトンのコンポーネント３以外のホエータンパク質を凝集させ、除去することを特徴とする請求項１記載の精製法。
- 加熱処理の前または後にｐＨを３．０以上５．０未満に調整した後、コンポーネント３以外のホエータンパク質を凝集させる請求項２または３記載の精製法。
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