CN108982869A - 一种检测舒血宁注射液中痕量蛋白质的方法 - Google Patents

一种检测舒血宁注射液中痕量蛋白质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测舒血宁注射液痕量蛋白质的方法。该方法包括如下步骤：(1)采用10KD超滤离心管对舒血宁注射液超滤离心处理，收集上层截留液；(2)以牛血清白蛋白绘制标准曲线；(3)采用考马斯亮蓝法检测步骤(1)获得的上层截留液，以确定舒血宁注射液中是否存在大分子蛋白质。本发明方法操作简便，灵敏度高，耗时短，可以有效检测到舒血宁注射液中的微量蛋白，对提高舒血宁注射液的质量，防止发生过敏等不良反应有重要意义。

Description

一种检测舒血宁注射液中痕量蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及注射剂中痕量蛋白质的检测，具体属于一种检测舒血宁注射液中痕量蛋白质的方法。
背景技术
舒血宁注射液由银杏叶提取制成，其主要成分为总黄酮醇苷、银杏内酯，此外在提取的过程中会产生蛋白质、多肽、色素、树脂、鞣质等大分子杂质，而大分子杂质是产生过敏反应等不良反应的主要原因。这些成分进入机体后成为抗原，可激发人体免疫系统，出现类似胃肠道反应、皮肤过敏、中枢系统反应甚至过敏性休克等速发性致敏反应。
2013年11月13日，CFDA发布舒血宁注射液更改说明书的通知，说明书中“不良反应”一栏由“极少见过敏反应”增加过敏反应、全身性损害、呼吸系统、心脑血管系统、消化系统、皮肤、精神及神经系统等8大类不良反应。根据2014、2015年连续两年CFDA发布的药品不良反应监测年度报告，舒血宁注射液在中注射剂严重不良反应/事件报告居前10位(中国中西医结合杂志:2017,37(3):283-289)。
中国专利申请201210116801.5公开了一种检测参芪扶正注射液大分子物质的方法，采用BCA法检测中药注射液中的蛋白质，BCA试剂的蛋白质测定限度是25μg/mL，灵敏度低，且该法受注射液本身颜色影响较大。
中国专利申请201010504574.4公开了中药注射液中的微量蛋白质检测方法，该方法虽然灵敏度高，但操作繁琐，耗时长，蛋白质特异性吸附膜脱色时浸泡时间至少需要15小时。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度高，可以快速测定舒血宁注射液中痕量蛋白的方法。
本发明提供一种检测舒血宁注射液中微量蛋白质的方法，该方法包括如下步骤：
(1)取10mL舒血宁注射液置于10KD超滤离心管中，在5000rpm/min下超滤离心至上层截留液体积500μL；
(2)分别精确移取浓度为100μg/mL的牛血清白蛋白标准溶液0，40，160，320，480，640，800，960μL，加蒸馏水定容至2mL，配成浓度为0，2，8，16，24，32，40，48μg/mL的蛋白质溶液；于96孔板中加入100μL蛋白质溶液及100μL考马斯亮蓝试剂，室温放置10min，使用酶标仪在595nm波长下测定吸光度，以牛血清白蛋白溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线；
(3)于96孔板中加入100μL截留液及100μL考马斯亮蓝试剂，室温放置10min，使用酶标仪在595nm波长下测定吸光度，通过标准曲线确定蛋白含量。
所述考马斯亮蓝法试剂采用如下步骤制备：称取10mg考马斯亮蓝G250，溶于5mL90％乙醇，加入85％磷酸10mL，最后用蒸馏水定容到100mL。
本发明的有益效果：本发明提供的一种舒血宁注射液痕量蛋白质的检测方法，操作简便，耗时短，可在2小时内完成，成本低廉，灵敏度高，可检测到舒血宁注射液中浓度大约0.4μg/ml的痕量蛋白。此外，通过超滤处理克服了非大分子物质对蛋白质检测结果的影响。本发明对于提高中药注射剂生产的安全性控制具有重要意义。
附图说明
图1为采用考马斯亮蓝法测定蛋白质的标准曲线图：浓度梯度为0、2、8、16、24、32、40、48μg/mL，标准曲线为y＝0.0097x+0.007，R2＝0.9736。
图2为采用BCA法测定蛋白质的标准曲线图：浓度梯度为0、25、75、125、250、500、1000μg/mL，标准曲线为y＝0.0002x+0.0194，R2＝0.9888。
图3为采用三氯甲烷定性测定牛血清白蛋白图片，从左到右浓度为0、2、8、16μg/mL。
图4为采用三氯甲烷定性测定舒血宁注射液上层截留液中微量蛋白质的图片，从左到右分别为0、50、100、300μL。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本方法做进一步的说明。
实施例1：舒血宁注射液样品中痕量蛋白质的检测
(1)精密吸取舒血宁注射液10mL置于Millipore Ultra 10KD超滤离心管中，5000rpm/min离心至上层截留液体积为500μL，收集上层截留液。
(2)考马斯亮蓝法测定蛋白标准曲线的绘制：标准蛋白选用牛血清白蛋白，称取牛血清白蛋白，用蒸馏水配成100μg/mL的标准溶液，置于4℃冰箱备用。
分别精确移取牛血清白蛋白标准溶液0，40，160，320，480，640，800，960μL，加蒸馏水定容置2mL，配成浓度为0，2，8，16，24，32，40，48μg/mL的蛋白质溶液。于96孔板中加入100μL蛋白质溶液及100μL考马斯亮蓝试剂，室温放置10min，使用酶标仪在595nm波长下测定吸光度，以牛血清白蛋白质溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线(图1)。
(3)吸取100μL上层截留液于96孔板中，加入100μL考马斯亮蓝试剂，室温放置10min，使用酶标仪在595nm波长下测定吸光度，比较样品和空白对照组的吸光度，并运用标准曲线计算样品中蛋白质浓度。
加入100μL上层截留液的样品溶液吸光度为0.09015，根据标准曲线可以计算出，上层截留液的蛋白质浓度大约分别为8.57μg/mL。由此推算出待测舒血宁注射液样品中蛋白质的含量为0.4μg/mL。
比较例：
BCA法测定蛋白质：使用BCA试剂盒(生工C503051BCA蛋白浓度测定试剂盒)，按试剂盒说明绘制标准曲线(图2)。于96孔板中分别加入25，50μL上层截留液，加入200μL BCA工作液，37℃放置30min，于562nm检测吸光度。
BCA法蛋白质检测限度为25μg/mL，加入25、50μL上层截留液的样品溶液吸光度分别为0.0113，0.0122，均低于最低检测限。说明，BCA法无法检测到舒血宁注射液中的痕量蛋白质。
上述结果说明，待测舒血宁注射液样品中可能存在痕量蛋白质，其含量约为0.4μg/mL。可见，与已有专利公开的BCA法(201210116801.5)相比，本发明提供的方法可以有效的检测出舒血宁注射液中可能存在的痕量蛋白，可为舒血宁注射液的生产过程质量控制提供参考，保证产品的安全性。
实施例2:舒血宁注射液样品中痕量蛋白质的检测
(1)精密吸取舒血宁注射液10mL置于Millipore Ultra 10KD超滤离心管中，5000rpm/min离心至上层截留液体积为500μL，收集上层截留液。
(2)考马斯亮蓝法测定蛋白标准曲线的绘制：标准蛋白选用牛血清白蛋白，称取牛血清白蛋白，用蒸馏水配成100μg/mL的标准溶液，置于4℃冰箱备用。
分别精确移取牛血清白蛋白标准溶液0，40，160，320，480，640，800，960μL，加蒸馏水定容置2mL，配成浓度为0，2，8，16，24，32，40，48μg/mL的蛋白质溶液。于96孔板中加入100μL蛋白质溶液及100μL考马斯亮蓝试剂，室温放置10min，使用酶标仪在595nm波长下测定吸光度，以牛血清白蛋白质溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线(图1)。
(3)将25μL、50μL上层截留液稀释至100μL，于96孔板中加入100μL样品液及100μL考马斯亮蓝试剂，室温放置10min，使用酶标仪在595nm波长下测定吸光度，比较样品和空白对照组的吸光度，并运用标准曲线计算样品中蛋白质浓度。
加入25μL、50μL上层截留液的样品溶液吸光度为0.0401、0.05925，根据标准曲线可以计算出，25、50μL上层截留液的蛋白质浓度大约分别为3.41、5.38μg/mL。由于注射液中蛋白质浓度太低，与最低检出浓度接近，所以该测定值可能具有一定误差，但可以证明舒血宁注射液中确实存在痕量蛋白。说明，25μL、50μL上层截留液样品仍然可以灵敏检测到舒血宁注射液中的痕量蛋白。
为了进一步证明所检测的上层截留液中确实含有蛋白质，采用三氯甲烷定性测定舒血宁注射液中的微量蛋白：分别取上层截留液50、100、300μL，稀释至1mL，置玻璃管中,加2mol/L盐酸1滴,三氯甲烷100μL，与此同时，取超纯水1mL，置玻璃管之中,随后加2mol/L盐酸1滴，三氯甲烷100μL，作为空白对照。将样品管与对照管共同置旋涡混合器上震荡1min。观察各自的乳化度变化。另外，设置阳性对照组，以牛血清白蛋白为阳性对照，浓度分别为2、8、16μg/mL，操作步骤同上。观察各自的乳化度变化。蛋白量越高，所形成的三氯甲烷珠状颗粒越细，稳定性越好(图3)。通过与空白对照和阳性对照比较，50、100μL上层截留液三氯甲烷珠状颗粒不明显，300μL上层截留液较明显(图4)，说明舒血宁注射液上层截留液中确实含有微量蛋白。

Claims (2)

1.一种检测舒血宁注射液痕量蛋白质的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取10mL舒血宁注射液置于10KD超滤离心管中，在5000rpm/min下超滤离心至上层截留液体积为500μL；
(2)分别精确移取浓度为100μg/mL的牛血清白蛋白标准溶液0，40，160，320，480，640，800，960μL，加蒸馏水定容至2mL，配成浓度为0，2，8，16，24，32，40，48μg/mL的蛋白质溶液；于96孔板中加入100μL蛋白质溶液及100μL考马斯亮蓝试剂，室温放置10min，使用酶标仪在595nm波长下测定吸光度，以牛血清白蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线；
(3)于96孔板中加入100μL截留液及100μL考马斯亮蓝试剂，室温放置10min，使用酶标仪在595nm波长下测定吸光度，通过标准曲线确定蛋白含量。
2.根据权利1所述的检测舒血宁注射液痕量蛋白质的方法，其特征在于，所述考马斯亮蓝试剂采用如下方法制备得到：称取10mg考马斯亮蓝G250，溶于5mL 90％乙醇，加入85％磷酸10mL，最后用蒸馏水定容到100mL。
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