CN104155444A - 用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的elisa试剂盒及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的ELISA试剂盒及制备方法。本发明的用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的ELISA试剂盒中包括包被有从山羊支原体山羊肺炎亚种培养物提取的多糖为抗原的酶标板。同时本发明的试剂盒具有重复性好，检测使用方法简便的优点。

Description

用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的ELISA试剂盒及制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的ELISA试剂盒及制备方法。

背景技术

山羊支原体山羊肺炎亚种是山羊传染性胸膜肺炎的病原，山羊传染性胸膜肺炎是世界动物卫生组织（OIE）所列需要上报和监控的重要疾病之一。1922年本病在我国新疆伊犁地区发生，此后甘肃、宁夏、青海、四川、贵州等十余省市均有临床诊断报道，危害严重。目前针对该病的血清学检测技术主要是间接血凝试验方法，参见：赵萍等，2008， 甘肃农业大学学报。众所周知，间接血凝试验方法虽然操作简单，但敏感性低，判定标准有一定误差，对发病初期以及早期接种疫苗的动物往往检测不到抗体，导致误诊误判。

发明内容

本发明提供一种检测方法简洁明了、具有高敏感性、高特异性及重复性良好的用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种血清抗体的试剂盒。

本发明的用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的ELISA试剂盒中包括包被有从山羊支原体山羊肺炎亚种培养物提取的多糖为抗原的酶标板。

为方便使用，本发明的用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的ELISA试剂盒中还包括有：

（1）阳性对照血清；

（2）阴性对照血清；

（3）兔抗羊IgG-辣根过氧化物酶结物；

（4）25倍浓缩洗涤液；

（5）血清稀释液； 

（6）由柠檬酸、Na₂HPO₄.和邻苯二胺构成的底物溶液A； 

（7）作为底物溶液B的双氧水；

（8）终止液 。

本发明的用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的ELISA试剂盒中抗原的制备方法是从山羊支原体山羊肺炎亚种培养物上清中提取多糖。

本发明所述的抗原制备方法是

（1）将山羊支原体山羊肺炎亚种菌种按5%量接种于Thicaucourt’s培养基，37℃下经3~5次连续扩大培养，当培养物pH值下降至6.8~7.0，培养基颜色变为黄色，12000 rpm离心30 min，取上清液；

（2）用冰醋酸调节培养物上清pH值到5.0，煮沸60 min，等冷却后用滤纸过滤去除杂质，得到滤液；将两倍体积量的无水乙醇加入到滤液中混匀，4℃过夜，5000rpm离心20 min，去上清，将沉淀物溶解在适量灭菌水中；

（3）加入等体积60％苯酚（V/V），混匀，68℃水浴1 h，取出置4℃过夜后，6000 rpm离心30min，取上清；

（4）将上清装入透析袋中，用自来水透析48 h；

（5）向透析液中加入两体积的无水乙醇，混匀，置4℃过夜后，7000rpm离心30 min，

弃上清，收集沉淀物；

（6）将沉淀物溶于适量无菌水，装入透析袋中，用灭菌水透析48 h，每4h换一次水；

（7）取出透析液，在常温下进行适宜倍数浓缩，即得到粗多糖提取物。

本发明制备抗原中使用的Thicaucourt’s培养基为每1000ml培养基包含：PPLO 21 g，葡萄糖1g，25%（m/v）酵母浸液100 ml，健康马血清200 ml，1%醋酸铊溶液1 ml，青霉素200 IU/ml，0.4%酚红0.18 ml，用氢氧化钠溶液调整pH值至7.4~7.6。

采用本发明的试剂盒检测方法比现阶段广泛采用的间接血凝试验具有更好的敏感性；而且本发明的试剂盒具有特异性，对健康山羊血清、丝状支原体山羊亚种阳性血清、绵羊肺炎支原体阳性血清、溶血曼氏杆菌阳性血清、猪肺炎支原体阳性血清用本发明的试剂盒进行检测，其结果均为阴性；同时本发明的试剂盒重复性好。

具体实施方式

以下结合实施例详细解说本专利发明。

一、抗原制备（7.1支原体培养和培养上清收集）

（1）从某发病羊场确诊患有支原体山羊肺炎亚种病的羊血清中分离得到支原体山羊肺炎亚种的菌种。

（2）培养基制备：Thicaucourt’s培养基的配制：每1000ml培养基包含：PPLO 21 g，葡萄糖1g，25%酵母浸液100 ml，健康马血清200 ml，1%醋酸铊溶液1 ml，青霉素200 IU/ml，0.4%酚红0.18 ml，1 mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至7.4~7.6，无菌分装。

（3）培养：将山羊支原体山羊肺炎亚种菌种按5%量接种于Thicaucourt’s培养基，37℃下经3~5次连续扩大培养，当培养物pH值下降至6.8~7.0，培养基颜色变为黄色，12000 rpm离心30 min，取上清备用。

二、包被抗原的制备

（1） 用冰醋酸调节培养物上清pH值到5.0，煮沸60 min，等冷却后用Whatman滤纸过滤，去除杂质，得到滤液。

（2） 将两倍体积量的无水乙醇加入到滤液中混匀，4℃过夜，5000rpm离心20 min，去上清，将沉淀物溶解在适量灭菌水中。

（3）加入等体积60％苯酚（V/V），混匀，68℃水浴1 h，取出置4℃过夜后，6000 rpm离心30min，取上清。

（4）将上清装入透析袋中，用自来水透析48 h。

（5）向透析液中加入两体积的无水乙醇，混匀，置4℃过夜后，7000rpm离心30 min，

弃上清，收集沉淀物。

（6）将沉淀物溶于适量无菌水，装入透析袋中，用灭菌水透析48 h，每4h换一次水。

（7）取出透析液，在常温下进行适宜倍数浓缩，即得到粗多糖提取物。

三、抗原的浓度测定

本发明实施例中是用苯酚-浓硫酸法对抗原进行测定。

（1）制作葡萄糖的标准曲线：准确称取标准葡萄糖400mg 于200毫升容量瓶中，加双蒸水至刻度。分别取0.2ml、0.3m、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，各加水补至1.0ml，分别加入6%的苯酚（V/V）0.5ml、浓硫酸2.5ml，摇匀，室温放置20min后，于490nm处测定OD值。以1.0ml双蒸水按同样操作为空白，以横坐标为多糖含量，纵坐标为OD值，绘制标准曲线，得到回归方程。

（2）样品含量的测定：取样品液1ml，用双蒸水进行5倍稀释后，再取1ml，分别加入6%的苯酚（V/V）0.5ml、浓硫酸2.5ml，摇匀，室温放置20min后，于490nm处测定OD值。以回归方程计算多糖的含量。

四、酶标板的包被

将抗原用pH9.6、浓度为0.05 mol/L碳酸盐缓冲液稀释成一个单位（5 μg/ml），用微量移液器将稀释好的抗原加到酶标板各孔内，每孔50 μl，然后将酶标板置湿盒中4℃过夜。甩掉酶标板孔内的抗原包被液，加洗涤液PBST（含0.05%Tween20的0.01 mol/L pH7.4 PBS）300 μl，室温下浸泡2 分钟，甩掉洗涤液，用吸水纸吸干并驱除孔内气泡。再重新加洗涤液，按同法洗涤4次，拍干，每孔加50 μl封闭液（含0.1%BSA的PBST），置湿盒中37℃吸附1 小时。取出酶标板，将其甩干，用洗涤液洗涤4次，洗涤方法同上，风机吹干，用铝箔袋真空包装，2～8℃保存备用。

五、阳性对照血清制备

（1）用12月龄、体重20 kg左右的、山羊支原体山羊肺炎亚种抗体阴性的健康山羊

（2）免疫原制备  

将生长良好的山羊支原体山羊肺炎亚种培养物分成两部分，一部分不灭活，一部分加40%的甲醛溶液，使其终浓度为0.2%，随加随摇，使其充分混合，置37℃灭活12小时，期间振摇3～4次。灭活检验合格后培养物，在2～8℃下以 10000转/分离心30分钟，取沉淀物用0.15 mol/L pH6.4 PBS悬浮，离心洗涤3次，制成原液量的1/100体积的抗原，用紫外分光光度计测定蛋白浓度后，将每种抗原稀释至10 mg/ml，作为免疫原。

（3）弗氏完全和不完全佐剂抗原的配制

弗氏完全佐剂抗原  弗氏佐剂3 ml，加卡介苗60 mg、灭活抗原3 ml。

弗氏不完全佐剂抗原  弗氏佐剂3 ml，加灭活抗原3 ml。

上述佐剂抗原均在免疫接种前配制，并充分混合乳化。

（4）免疫程序  

取上述充分乳化的弗氏完全佐剂抗原，每只羊两后腿腘淋巴结处及背部皮下多点接种，接种总量为6 ml，14日后仍以上述抗原和剂量由背部皮下多点接种，进行第二次免疫；隔11日后，以上述弗氏不完全佐剂抗原，由每只羊肩部肌肉2点，背部皮下多点接种，接种总量为6 ml，为其第三次免疫；11日后，取前述制备好的不含佐剂未灭活抗原，每只羊气管注射4 ml，以加强免疫。 隔14日后由颈静脉采血，无菌分离血清，定量分装、贴签、-25℃保存。

六、阴性对照血清制备

选取山羊支原体山羊肺炎亚种抗体阴性的健康山羊，颈静脉采血，无菌分离血清，定量分装、贴签、-25℃保存。

七、试剂盒组装

用包装盒打包下列试剂（每个试剂盒检测46头份血清），贴签（标示名称、批号、生产日期、有效期等），2～8℃存放。（相关组分的产地、配方见附件1）

（1）96孔抗原包被板   1块                                    

（2）阳性对照血清  0.1 ml /瓶×1瓶

（3）阴性对照血清  0.1 ml/瓶×1瓶

（4）兔抗羊IgG-辣根过氧化物酶结合物  10 mL /瓶×1瓶

（5）25倍浓缩洗涤液  50 ml/瓶×1瓶

（6）血清稀释液  50 ml /瓶×1瓶

（7）底物溶液A   10 ml /瓶×1瓶 （由柠檬酸、Na₂HPO₄.和邻苯二胺构成）

（8）底物溶液B   1 ml /瓶×1瓶（双氧水）

（9）终止液  10 ml /瓶×1瓶

（10）使用说明书1份

其中：底物溶液A配方：称取柠檬酸0.048g，Na₂HPO₄.12H₂O 0.0448g，邻苯二胺0.004g，将上述试剂溶于5 mL去离子水中，充分搅拌溶解后，去离子水定容至10 mL；底物溶液B 配方：市售的30% H₂O₂；终止液配方：1.11 mL市售的98%的浓硫酸加入8.89 mL去离子水中混匀。

如此制备得到的山羊支原体山羊肺炎亚种ELISA抗体检测试剂盒中可有1块96孔抗原包被板；1瓶0.1 ml 阳性对照血清 ；1瓶0.1 ml阴性对照血清 ；1瓶10 mL兔抗羊IgG-辣根过氧化物酶结合物 ；1瓶50 ml 25倍浓缩洗涤液；1瓶50 ml血清稀释液；1瓶10 ml底物溶液A；1瓶1 ml底物溶液B；1瓶10 ml终止液 ；1块血清稀释板 。 

八、用法与判定  

（1）用法

〈1〉 样品准备  取动物全血，待血液凝固后4000转/分离心10分钟，收集上清。要求血清清亮，无溶血。

〈2〉 洗涤液配制  使用前，浓缩的洗涤液应恢复至室温（20～25℃），并摇动使沉淀溶解（最好在37℃水浴5～10分钟），然后用去离子水作25倍稀释（例如：50 ml浓缩洗涤液加上1200 ml去离子水），混匀。

〈3〉 待检血清和对照血清稀释  待检血清和对照血清在血清稀释板中按1∶64的比例稀释（例如：315 μl血清稀释液中加5 μl样品或对照血清）。

〈4〉 取抗原包被板（根据样品多少，可拆开分多次使用），先用洗涤液洗板1次，再将稀释好的待检血清和对照血清各取50 μl加入抗原包被板相应孔中，每份待检血清加2孔，阴性对照和阳性对照各2孔，轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37℃温箱内孵育1 小时。

〈5〉 弃去孔中液体，用洗涤液洗涤4次，300 μl/孔，在吸水纸上拍干。

〈6〉 每孔加兔抗羊IgG-辣根过氧化物酶结合物50 μl，置湿盒中37℃温箱内孵育1 小时。

〈7〉 弃去孔中液体，用洗涤液洗涤4次，方法同上。

〈8〉 孔加新配制的底物溶液50 μl（底物溶液的配置：临用前将15μl底物溶液B加入10 ml底物溶液A中混匀），置37℃温箱内避光反应10～15 分钟。

〈9〉 每孔加终止液50 μl，混匀后10分钟内测定结果。

（2）判定

在酶标仪上测各孔OD490值。试验成立的条件是：阳性对照孔OD490值均应≥0.6，阴性对照孔OD490值均应≤0.3。

按下列公式计算S/N：

如果样品S/N≥3，判为阳性；如果S/N≤2.5，判为阴性，S/N介于2.5和3之间者为可疑，应重测，重测后S/N≥3判为阳性，S/N＜3判为阴性。

1.  敏感性检验

用健康山羊血清、山羊支原体山羊肺炎亚种感染血清和免疫血清各40份，按上述方法进行检测，同时与间接血凝实验方法（IHA）进行比较。ELISA方法检测结果显示，健康山羊血清40/40S/N≤2.5，感染血清40/40S/N≥3，免疫血清39/40S/N≥3，IHA方法检测结果显示，健康山羊血清40/40阴性，感染血清37/40阳性，免疫血清35/40阳性，说明ELISA方法比IHA方法具有更好的敏感性。本发明敏感性检验结果见附表1。

2．特异性检验

用健康山羊血清、丝状支原体山羊亚种阳性血清、绵羊肺炎支原体阳性血清、溶血曼氏杆菌阳性血清、猪肺炎支原体阳性血清按上述方法进行检测，结果均为阴性，见附表2。

3. 重复性检验

（1）批内重复性检验：用同一批次的3个试剂盒重复检测40份健康山羊血清、40份免疫血清，根据健康血清阴性数和免疫血清阳性数计算变异系数。结果该试剂盒批内对健康血清的变异系数为0，对免疫血清的变异系数为0.01468，表明试剂盒批内重复性好，见附表3。

（2）批间重复性检验：用3个不同批次的试剂盒对40份健康山羊血清、40份免疫血清进行重复检测，根据健康血清阴性数和免疫血清阳性数计算变异系数。结果该试剂盒批间对健康血清的变异系数为0，对免疫血清的变异系数为0.01468，表明试剂盒批间重复性也很好，见附表3。

Claims (5)

1.用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的ELISA试剂盒，其特征在试剂盒中包括包被有从山羊支原体山羊肺炎亚种M2301株培养物提取的多糖为抗原的酶标板。

2.根据权利要求1所述的用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的ELISA试剂盒，其特征在试剂盒中还包括有：

（1）阳性对照血清；

（2）阴性对照血清；

（3）兔抗羊IgG-辣根过氧化物酶结物；

（4）25倍浓缩洗涤液；

（5）血清稀释液； 

（6）由柠檬酸、Na₂HPO₄.和邻苯二胺构成的底物溶液A； 

（7）作为底物溶液B的双氧水；

（8）终止液 。

3.权利要求1或2所述的用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的ELISA试剂盒中抗原的制备方法，其特征在于从山羊支原体山羊肺炎亚种培养物上清中提取多糖。

4.根据权利要3所述的用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的ELISA试剂盒中抗原的制备方法，其特征在于：

（1）将山羊支原体山羊肺炎亚种菌种按5%量接种于Thicaucourt’s培养基，37℃下经3~5次连续扩大培养，当培养物pH值下降至6.8~7.0，培养基颜色变为黄色，12000 rpm离心30 min，取上清液；

（2）用冰醋酸调节培养物上清pH值到5.0，煮沸60 min，等冷却后用滤纸过滤去除杂质，得到滤液；将两倍体积量的无水乙醇加入到滤液中混匀，4℃过夜，5000rpm离心20 min，去上清，将沉淀物溶解在适量灭菌水中；

（3）加入等体积60％苯酚（V/V），混匀，68℃水浴1 h，取出置4℃过夜后，6000 rpm离心30min，取上清；

（4）将上清装入透析袋中，用自来水透析48 h；

（5）向透析液中加入两体积的无水乙醇，混匀，置4℃过夜后，7000rpm离心30 min，

弃上清，收集沉淀物；

（6）将沉淀物溶于适量无菌水，装入透析袋中，用灭菌水透析48 h，每4h换一次水；

（7）取出透析液，在常温下进行适宜倍数浓缩，即得到粗多糖提取物，

Thicaucourt’s培养基为每1000ml培养基包含：PPLO 21 g，葡萄糖1g，25%（m/v）酵母浸液100 ml，健康马血清200 ml，1%醋酸铊溶液1 ml，青霉素200 IU/ml，0.4%酚红0.18 ml，用氢氧化钠溶液调整pH值至7.4~7.6。

5.权利要求1或2的试剂盒非疾病诊断使用方法，其特征在于：

〈1〉取被检动物全血血清；

〈2〉 洗涤液用去离子水作25倍稀释，混匀；

〈3〉将待检血清和对照血清按1∶64的比例稀释；

〈4〉 将试剂盒中的抗原包被板用洗涤液洗板后，再将稀释好的待检血清和对照血清各取50 μl加入抗原包被板相应孔中，每份待检血清加2孔，阴性对照和阳性对照各2孔，轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37℃温箱内孵育1 小时；

〈5〉 弃去孔中液体，用洗涤液洗涤后在吸水纸上拍干；

〈6〉 每孔加兔抗羊IgG-辣根过氧化物酶结合物50 μl，置湿盒中37℃温箱内孵育1 小时；

〈7〉 弃去孔中液体，用洗涤液洗涤；

〈8〉 在孔中加经配制的底物溶液50 μl，置37℃温箱内避光反应10～15 分钟，其中配制的底物溶液为：15μl底物溶液B加入10 ml底物溶液A中混匀；

〈9〉 每孔加终止液50 μl，混匀后10分钟内测定结果； 

〈10〉判定

在酶标仪上测各孔OD490值，试验成立的条件是：阳性对照孔OD490值均应≥0.6，阴性对照孔OD490值均应≤0.3；

按下列公式计算S/N：

如果样品S/N≥3，判为阳性；如果S/N≤2.5，判为阴性，S/N介于2.5和3之间者为可疑，应重测，重测后S/N≥3判为阳性，S/N＜3判为阴性。