CN101236206A

CN101236206A - 一种猪肺炎支原体重组抗原elisa检测试剂盒

Info

Publication number: CN101236206A
Application number: CNA2008100563595A
Authority: CN
Inventors: 沈青春; 宁宜宝; 高和义; 覃青松
Original assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Current assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Priority date: 2008-01-17
Filing date: 2008-01-17
Publication date: 2008-08-06
Anticipated expiration: 2028-01-17
Also published as: CN101236206B

Abstract

本发明公开了一种猪肺炎支原体重组抗原ELISA检测试剂盒。试剂盒内设有抗体检测板，酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，10×浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，该试剂盒的检测板为突变猪肺炎支原体膜蛋白P46基因蛋白抗原包被的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪抗体，阳性对照血清取自通过间接血凝和IDEXX的ELISA检测试剂盒检测为阳性、解剖后肺脏有明显的猪肺炎支原体病变的猪，阴性对照血清取自通过间接血凝和IDEXX的ELISA检测试剂盒检测为阴性、解剖后肺脏有无猪肺炎支原体病变的猪。本发明有益的积极效果是：特异性强、敏感性高、操作简单，易于大规模推广应用，具有广阔的市场前景。

Description

一种猪肺炎支原体重组抗原ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种动物传染病检测用试剂盒，属于兽用生物制品领域。

背景技术

猪肺炎支原体(Mycoplasma hypneumoniae，Mhp)是一种引起猪支原体肺炎(又称喘气病或猪地方性流行性肺炎)的病原微生物。该病以接触性、高度传染性、慢性、高发病率和低死亡率为特点，主要表现为咳嗽、呼吸困难，解剖可见以肺部病变为主，尤以两肺心叶，中间叶和尖叶出现胰样变和肉样变特征。其主要危害是引起猪的生长受阻和饲料转化率大幅下降，加上其高的发病率，严重影响养猪的经济效益。近年的研究发现，猪肺炎支原体与猪繁殖呼吸综合征病毒和其它病原混合感染，导致其发病症状加重，死亡率也大幅度提高。猪喘气病普遍流行于世界各地，在畜牧业发达的美国、澳大利亚等国也普遍存在，也是对我国养猪业造成严重经济损失的主要疾病之一。据初步统计，该病每年给我国造成的直接经济损失高达60亿元以上。目前为止，该病仍是世界上造成养猪经济损失最重要的疾病之一。

猪肺炎支原体基因组全长约1000Kb，G+C％约为28％，通用密码中的终止密码子TGA，在猪肺炎支原体中编码色氨酸(Trp)，几乎其所有结构蛋白中均含有由TGA编码的色氨酸。现已完成全基因组测序的国际标准株232株，基因组长892,758bp，共编码692种蛋白，蛋白平均大小为388个氨基酸，平均编码密度为91％，G+C％含量为28.6％。国内外学者已对猪肺炎支原体多种抗原蛋白进行了研究，其中包括乳糖脱氢酶P36蛋白、热激活蛋白P42、膜蛋白P46、P65、P74，以及结合素蛋白P97。P46蛋白是一种具有种特异性的膜蛋白，是猪肺炎支原体感染早期诱导产生抗体的蛋白之一，是已知抗原蛋白中用于检测用抗原较为理想的蛋白。P46基因的ORF全长1257bp，编码419个氨基酸，并含有三个由TGA编码的色氨酸。

对于猪喘气病的检测，目前国内仅有猪肺炎支原体间接血凝检测试剂，但由于制造成本较高，检测结果容易受到操作人员、环境及材料等因素的影响，很难大面积推广使用。

国内覃青松等人(2005)已将猪肺炎支原体国际标准株232株P46基因ORF中含有3个编码Trp的TGA突变为在大肠杆菌里可以通读的编码Trp的密码子TGG的基因，并对突变后的猪肺炎支原体膜蛋白P46基因在大肠杆菌中进行了表达，但由于目的蛋白的表达水平低，纯化困难，无法用于实际应用(覃青松，宁宜宝，沈青春.猪肺炎支原体表面蛋白P46基因在大肠杆菌中的表达.中国预防兽医学报，2005，27(2)：94-97)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪肺炎支原体重组抗原ELISA检测试剂盒及突变后猪肺炎支原体膜蛋白P46基因表达蛋白(在本发明申请中以下简称P46蛋白)作为抗原(在本发明申请中以下简称重组抗原)包被酶标反应板的制备方法，为临床检测猪肺炎支原体提供快速、准确、简便的检测工具。

本发明的技术方案是：

重组抗原包被酶标反应板的制备方法，通过以下步骤制备而成：

1.猪肺炎支原体经突变处理的膜蛋白P46基因载体的构建：

(1)重组质粒pGEM-T-Easy-P46重组质粒，含有来自猪肺炎支原体国际标准株232株的P46基因ORF全序列，并已完成了其中的三处TGA到TGG的突变，全长1257bp(覃青松，宁宜宝，沈青春，猪肺炎支原体表面蛋白P46基因的克隆与序列比较，中国预防兽医学报，2004，26(4)，266-269)。

(2)P46基因部分亲水区的克隆由pGEM-T-Easy-P46重组质粒中选取的长度为714bp部分亲水区序列，共编码238个氨基酸，引物5’端分别带有一个HindIII和BamH I酶切位点。

用Pyrobest DNAPolymerase进行PCR，为此，设计引物如下：

上游引物为：

5’-CATGGATCCTCAGATTCTAAACCACAAGCCGAGAC-3’，

下游引物为：5’-CACAAGCTTATTACCACCTGCTGGATCTTTGTT-3’。

反应条件为：94℃预变性5min后进入循环，94℃，50s；55℃，30s；72℃，50s；30个循环后72℃延伸5min。将PCR产物用0.8％琼脂糖胶电泳，紫外光下切下目的条带，用DNA回收试剂盒(博亚生物)回收，用HindIII和BamH I对回收产物进行双酶切，同时对pET28a(+)质粒[pET 28a(+)质粒购自Novagen公司]进行HindIII和BamH I双酶切，将酶切产物电泳后回收，然后用T4连接酶连接过夜后，将连接产物转化BL21(DE3)大肠埃希氏菌[大肠埃希氏菌BL21(DE3)购自Novagen公司]，铺于含50mg/L卡那霉素(Kan+)的LB[LB(Kan+)]平板上。培养12h后，挑单个菌落扩大培养后提取重组质粒，用HindIII和BamH I双酶切后电泳检测，将该质粒命名为pET-P46。电泳检测结果同样显示酶切DNA片段大小与预计的714bp相吻合，由此表明P46蛋白亲水区序列成功克隆到pET28a(+)载体中。将含有pET-P46质粒的DH5α大肠埃希氏菌送博亚生物技术公司测序，序列分析结果进一步证明P46蛋白亲水区序列已克隆到pET28a(+)载体的指定位置，并且没有发生移码，符合表达要求。该重组菌命名为：大肠埃希氏菌BL21(DE3)-pET-P46株(E.coli BL21(DE3)-pET-P46)，并于2008年01月10目送交中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为：CGMCC No.2335)。

(3)P46蛋白的表达将BL21(DE3)-pET-P46株菌(CGMCC No.2335)接入到200mL LB(Kan+)液体培养基，37℃震荡培养至OD值为0.6左右，加入IPTG分别至终浓度为1.0mmol/L，继续培养2～3h。离心弃上清，用裂解缓冲液(50mmol/l Tris·Cl，1mmol/l EDTA，100mmol/l NaCl)洗涤一次后，用裂解缓冲液悬浮。冻融数次后，超声波裂解，离心，取上清，并将沉淀恢复原体积，制备成电泳样品。分别取经IPTG诱导前后的BL21(DE3)-pET-P46菌、BL21(DE3)-pET-P46菌裂解上清和沉淀、pET28a(+)转化的BL21(DE3)受体菌经IPTG诱导前后及裂解沉淀，进行SDS-PAGE电泳。

从图1的电泳结果可知重组质粒pET-P46在BL21(DE3)受体菌中实现了P46蛋白的高效表达，表达量约占菌体总蛋白35％，分子量大小约为32kDa，与预计的282个氨基酸(其中包括238个P46蛋白的氨基酸序列和44个载体氨基酸序列)的大小相符合。图1中4、5泳道(4泳道为pET-P46-DE3上清液，5泳道为pET-P46-DE3沉淀)的结果显示表达产物主要集中在裂解沉淀中，可见为包涵体表达。

图1中显示pET-P46在BL21(DE3)受体菌在IPTG诱导前没有表达目的蛋白，图2中相应位置也没有阳性杂交信号，由此可见pET-P46在BL21(DE3)受体菌中实现P46蛋白的表达需要IPTG的诱导。

从图1的结果可知6、7、8泳道(6.pET28a(+)-DE3裂解沉淀，7.pET28a(+)-DE3诱导前，8.pET28a(+)-DE3诱导后)pET28a(+)-DE3无论是否有IPTG诱导电泳结果都没有明显差异。图2中的6、7、8泳道均未出现任何阳性信号。

图1中显示各泳道均可见两条大小分别为37kDa和43kDa的蛋白带，而且能与包涵体一起进入裂解菌体沉淀中，并可能对目的蛋白的纯化带来一定的影响。

(4)Western blotting

将上述各电泳组分转移到硝酸纤维素膜(孔径0.45um，结合力100μg/cm²)上，用5％BSA的TBS缓冲液(10mmol/l Tris·Cl，150mmol/l NaCl，pH＝7.6)4℃封闭过夜，加入兔抗猪肺炎支原体高免血清(1∶200倍稀释)37℃作用1h，用TBS-Tween20(TBS含0.05％Tween20)洗涤3次，每次10min，加入羊抗兔酶标二抗，37℃作用1h时，TBS-Tween20洗涤3次后，在4-氯-1-奈酚溶液中显色。

图2显示结果，兔抗猪肺炎支原体高免血清能特异地与重组菌的表达产物带结合，阳性反应主要集中在沉淀(包涵体)中，上清中在相同位置也有阳性信号，由此进一步证明了表达产物含有猪肺炎支原体的抗原P46部分亲水区序列，具有很好的反应原性。在3、5泳道(3泳道为pET-P46-DE3诱导后，5泳道为pET-P46-DE3诱导后沉淀，)可在目的蛋白带前也可见阳性反应带，可能是目的蛋白被细胞内蛋白酶酶解所致。

(5)表达产物的纯化

取BL21(DE3)-pET-P46株菌(CGMCC No.2335)接入到1000mLLB(Kan⁺)液体培养基，震荡培养至OD值为0.6，加入IPTG分别至1.0mmol/L，继续培养3h。离心弃上清，用裂解缓冲液洗涤一次后，用裂解缓冲液悬浮。冻融数次后，超声波裂解，高速离心，弃上清，沉淀用裂解缓冲液洗涤一次后，分别用100μl含不同浓度尿素(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mol/l)的Tris·Cl缓冲液溶解包涵体，高速离心，将上清和沉淀用于SDS-PAGE，以确定合适的包涵体洗涤条件。将包涵体溶解后，用Ni²⁺柱进行过柱，浓缩，进一步纯化目的蛋白，检测纯化效果。

包涵体洗涤用尿素液浓度为4mol/L，此时目的蛋白基本溶解，大部分杂蛋白在沉淀中，从电泳结果来看上清中目的蛋白含量约为85％以上，经过柱浓缩后，蛋白纯度达98％，电泳结果中几乎看不到杂蛋白条带。此纯化的P46蛋白即为所制备的重组抗原。

(6)ELISA

将纯化后的重组抗原用包被液稀释50、100、200、400、800、1600、3200倍后包酶联板，并设空白对照，包被过夜，用0.01mol/l的PBS(pH＝7.4，含0.1％Tween-20)洗涤3次，用5％脱脂奶粉、1％BSA、10％小牛血清、1％明胶作为封闭剂37℃封闭1h，加入60倍稀释的已知阴阳性血清100μl，37℃孵育1h，洗涤3次后，加入100μl马抗猪酶标抗体(Sigma)工作液，37℃孵育1h，洗涤3次后用TMB显色，2M H₂SO₄终止，用450nm波长检测，620nm作为参考波长。

取64份经间接血凝(HI，相关试剂由中国兽医药品监察所供应)和ELISA(IDEXX检测试剂盒)检测后的临床血清用以上本发明所述ELISA法检测。根据检测结果初步确定阴性/阳性结果判定的P/N值。

重组抗原的最佳稀释倍数为100倍，5％脱脂奶粉最为稀释剂和封闭剂效果最佳。用经HI和ELISA(IDEXX)检测为阳性和阴性的临床血清作为参考血清，检测结果P/N值最高达到5.0。

通过对经HI和ELISA(IDEXX)检测为阳性或阴性的64份猪血清进行检测，初步确定本试验ELISA检测结果的判定方法：当对照组P/N≥3.0时试验成立，待检血清与对照阳性血清分别减去对照阴性血清OD值后的比值：S/P≥0.4，则判为阳性，S/P≤0.3判为阴性，介于二者之间为可疑。

分别使用间接血凝(HI)、IDEXX的ELISA检测试剂盒和用表达的P46蛋白作抗原自制的ELISA试剂对141份猪血清的进行检测，以比较相互间的符合程度。结果为：

1)以HI检测结果为基准，IDEXX的ELISA试剂的符合度为(139-19)/139＝86.3％(3个样品ELISA检测结果为可疑，未计入)，自制的ELISA试剂符合程度为(130-30)/130＝76.92％(11个样品ELISA检测结果为可疑，未计入)；

2)以IDEXX的ELISA试剂检测结果为基准，自制的ELISA试剂符合程度为(127-16)/127＝87.4％(11个样品ELISA检测结果为可疑，未计入)。

2.猪肺炎支原体重组抗原，使用包被液(碳酸盐缓冲液，pH＝9.6)照所测定的最适包板浓度稀释后，按每个样孔100μL重组抗原包被96孔酶标板，置2～8℃放置12～24h。用5％的蔗糖的样品稀释液覆盖后抽空封装，置2～8℃保存。

猪肺炎支原体ELISA检测试剂盒中设有试剂盒内设有抗体检测板，酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，10×浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，该试剂盒的检测板为经突变处理的猪肺炎支原体P46基因表达的P46蛋白(即重组抗原)包被的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪抗体，阳性对照未猪肺炎支原体标准阳性，阴性对照为无猪肺炎支原体标准阴性血清。

附图说明

图1猪肺炎支原体P46蛋白的SDS-PAGE电泳图谱

1泳道为.Maker，2泳道为.pET-P46-DE3诱导前，3泳道为.pET-P46-DE3诱导后，4泳道为.pET-P46-DE3诱导后上清液，5泳道为.pET-P46-DE3诱导后沉淀，6泳道为.pET28a(+)-DE3裂解沉淀，7泳道为.pET28a(+)-DE3诱导前，8泳道为.pET28a(+)-DE3诱导后。

图2猪肺炎支原体P46蛋白表的Western blotting电泳图谱

2泳道为.pET-P46-DE3诱导前，3泳道为.pET-P46-DE3诱导后，4泳道为.pET-P46-DE3诱导后上清液，5泳道为.pET-P46-DE3诱导后沉淀，6泳道为.pET28a(+)-DE3裂解沉淀，7泳道为.pET28a(+)-DE3诱导前，8泳道为.pET28a(+)-DE3诱导后。

本发明有益的积极效果是：特异性强、敏感性高、操作简单，易于大规模推广应用，具有广阔的市场前景。

实施例1

1.溶液的配制

(1)样品稀释液的配制

按照以下配方配制：氯化钠8.0g，KH₂PO₄ 0.3g，Na₂HPO₄.12H₂O 5.33g，KCl 0.2g加注射用水至900mL，加入5％～10％的脱脂奶粉后充分溶解后，调整pH至7.0～7.2，加入0.01％～0.05％叠氮钠，加注射用水定容至1000mL。

(2)酶结合工作液的配制

酶结合工作液为市售商品化辣根过氧化物酶标记的兔抗猪抗体(简称酶标二抗)，按其使用说明的推荐稀释倍数进行验证试验，按试验结果进行矫正。如推荐稀释倍数为20000×，则使用2500×、5000×、10000×、20000×和40000×的工作浓度加入到二抗稀释液中，分别进行ELISA测定，测定阴、阳性对照血清，用阴、阳性对照血清所测定的OD值得比值(P/N)和二抗稀释倍数划曲线图，选用曲线的拐点(P/N下降开始加快)的稀释倍数作为二抗的最适包板浓度(如在10000×处P/N下降开始加快，则二抗的稀释倍数为10000×)。

酶标二抗直接加在二抗稀释液中。一般的ELISA试剂盒的二抗是使用前添加。

按照以下配方配制二抗稀释液：氯化钠8.0g，KH₂PO₄ 0.3g，Na₂HPO₄.12H₂O 5.33g，KCl 0.2g加注射用水至900mL，加入5％～10％的脱脂奶粉后充分溶解后，调整pH至7.2～7.4，加入0.01％～0.05％硫柳汞，加注射用水定容至1000mL。

(3)10×洗涤液的配制

取100mL注射用水，加入1mL Tween-20，加入0.05％硫柳汞，即为10×洗涤液。

(4)显色液的配制

显色液A：200mgTMB加入到100mL无水乙醇中，充分溶解。

显色液B：Na₂HPO₄ 14.6g、柠檬酸9.33g，加注射用水至900mL，调pH至5.0～5.4，补加注射用水定容至1000mL。

工作液：10mL显色液B加入9mL双蒸水，再加入1mL显色液A，混匀后加入50μL 0.75％过氧化氢尿素溶液。

(5)终止液的配制：2mol/L的硫酸溶液。

2.阳性对照和阴性对照的制备

取通过间接血凝和IDEXX的ELISA检测试剂盒检测为阳性的猪，同时作临床解剖后肺脏有明显的猪肺炎支原体病变的猪，取其血清，用样品稀释液进行50倍稀释即为标准阳性血清。

取临床通过间接血凝和IDEXX的ELISA检测试剂盒检测为阴性，同时作临床解剖后肺脏无任何猪肺炎支原体病变的猪，取其血清，用样品稀释液进行50倍稀释即为标准阴性血清。

3.包被用重组抗原的制备

将BL21(DE3)-pET-P46株菌(CGMCC No.2335)接入到1000mL LB(Kan⁺)液体培养基，震荡培养至OD值为0.6，加入IPTG分别至1.0mmol/L，继续培养3h。离心弃上清，用裂解缓冲液洗涤一次后，用裂解缓冲液悬浮。冻融数次后，超声波裂解，高速离心，弃上清，沉淀用裂解缓冲液洗涤一次后，分别用100μl含不同浓度尿素(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mol/l)的Tris·Cl缓冲液溶解包涵体，高速离心，将上清和沉淀用于SDS-PAGE，以确定合适的包涵体洗涤条件。将包涵体溶解后，用Ni²⁺柱进行过柱，浓缩，进一步纯化目的蛋白，检测纯化效果。

包涵体洗涤用尿素浓度为4mol/L，此时目的蛋白基本溶解，大部分杂蛋白在沉淀中，从电泳结果来看上清中目的蛋白含量约为85％以上，经过柱浓缩后，蛋白纯度达98％，电泳结果中几乎看不到杂蛋白条带。将基因工程菌菌体加入裂解缓冲液(50mmol/l Tris·Cl，1mmol/l EDTA，100mmol/l NaCl)洗涤一次后，恢复原体积的1/20，反复冻融3次，超声波裂解后离心去上清。用8M的尿素溶解后离心取上清，缓慢稀释至4M后再次离心取上清，将其装入透析袋逐步透析除去尿素取以上抗原进行SDS-PAGE检测。采用不同浓度的重组抗原对ELISA板进行包被，以确定最适包板的抗原浓度。

重组抗原的最适包板浓度，是将提纯后的重组抗原，通过10×、20×、40×、80×、160×和320倍稀释后分别包板，然后分别进行ELISA测定阴、阳性对照，用阴、阳性对照所测定的OD值得比值(P/N)和表达抗原稀释倍数划曲线图，选用曲线的拐点(P/N下降开始加快)的稀释倍数的前一个稀释倍数作为重组抗原的最适包板浓度(如在80×处P/N下降开始加快，则最适稀释倍数为40×，即为包板浓度)。

2.包板

使用包被液(碳酸盐缓冲液，pH＝9.6)将纯化的重组抗原按照所测定的最适包板浓度稀释后，进行包板，每个样孔100μL抗原，置2～8℃放置12～24h。用5％的蔗糖的样品稀释液覆盖后抽空封装，置2～8℃保存。

3.猪肺炎支原体ELISA检测试剂盒的装配

将P46蛋白基因表达重组抗原按照所测定的最适抗原浓度包板，加入保护剂覆盖，抽干封装。配置样品稀释液、阳性对照、阴性对照、酶结合工作液、显色液和终止液。

最后将以上各组分成分装配成猪肺炎支原体ELISA检测试剂盒。

实施例2

1.试剂盒检测操作程序

实验前的准备：将10×洗涤液加入蒸馏水稀释成1×洗涤工作液。将待检样品用稀释液进行50倍稀释。

(1)在重组抗原包被板上分别设定两个阳性对照和阴性对照孔，并加入相应的对照血清样品(已稀释)，每孔100μL；

(2)在各待检样品加入检测样孔中，100μL每孔，用自封口袋装好后置室温30min；

(3)将各样孔中的液体倒掉后用1×洗涤液洗涤，每孔350μL，洗涤3～5遍；

(4)加入酶标二抗工作液，100μL每孔，用自封口袋装好后置室温30min后重复步骤3)；

(5)加入显色工作液10μL，室温显色15min；

(6)向每个样孔加入终止液50μL终止显色，在450nm下测定其吸光值。

2.结果判断

当阳性对照吸光值/阴性对照吸光值≥3.0时试验成立，待检血清与对照阳性血清分别减去对照阴性血清OD值后的比值：S/P≥0.4，则判为阳性，S/P≤0.3判为阴性，介于二者之间为可疑。

本申请案中所用的LB平板(为LB固体培养基)和LB液体培养基参见(美)J.萨姆布鲁克等著.黄培登等译.分子克隆实验指南(第三版)(下册).北京：科学出版社，2003，p1595.

序列表

上游引物为：

5’-CATGGATCCTCAGATTCTAAACCACAAGCCGAGAC-3’，

下游引物为：5’-CACAAGCTTATTACCACCTGCTGGATCTTTGTT-3’，

Claims

1.一种猪肺炎支原体重组抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于：试剂盒中设有试剂盒内设有抗体检测板，酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，10×浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，该试剂盒的检测板为猪肺炎支原体膜蛋白P46基因突变体蛋白抗原包被的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪抗体，阳性对照未猪肺炎支原体标准阳性，阴性对照为无猪肺炎支原体标准阴性血清。

2.根据权利要求1所述的一种猪肺炎支原体重组抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于：

1)猪肺炎支原体膜蛋白P46基因突变体蛋白抗原的制备为将猪肺炎支原体国际标准株232株P46基因ORF中含有3个编码Trp的TGA已突变为在大肠杆菌里可以通读的编码Trp的密码子TGG的基因，选择其亲水区的714个碱基序列进行扩增后克隆到pET28a(+)载体，并转化到受体菌——大肠埃希氏菌DH5α，该重组菌命名为：大肠埃希氏菌BL21(DE3)-pET-P46株，并于2008年01月10日送交中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为：CGMCC No.2335)，经IPTG诱导高效表达，经裂解、尿素沉淀、透析而获得；

2)抗体检测板的制备条件为，使用pH＝9.6的碳酸盐缓冲液作为包被液，将纯化的P46蛋白作为抗原按照所测定的最适包板浓度稀释后，进行包板，每个样孔100μL抗原，置2～8℃放置12～24h，用5％的蔗糖的样品稀释液覆盖后抽空封装，置2～8℃保存。

3.根据权利要求1所述的一种猪肺炎支原体重组抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于：

1)酶结合物工作液为：商品化的辣根过氧化物酶标记的兔抗猪抗体，按其使用说明的推荐稀释倍数进行验证试验，按试验结果进行矫正，酶标二抗直接加在二抗稀释液中，二抗稀释液为：氯化钠8.0g，KH₂PO₄ 0.3g，Na₂HPO₄.12H₂O 5.33g，KCl 0.2g加注射用水至900mL，加入5％～10％的脱脂奶粉后充分溶解后，调整pH至7.2～7.4，加入0.01％～0.05％硫柳汞，加注射用水定容至1000mL；

2)样品稀释液为：氯化钠8.0g，KH₂PO₄ 0.3g，Na₂HPO₄.12H₂O 5.33g，KCl 0.2g加注射用水至900mL，加入5％～10％的脱脂奶粉后充分溶解后，调整pH至7.0～7.2，加入0.01％～0.05％叠氮钠，加注射用水定容至1000mL；

3)10×洗涤液为100mL注射用水中，加有1mL Tween-20，和含0.05％硫柳汞；

4)显色液A为200mgTMB加入到100mL无水乙醇中；显色液B为含Na₂HPO₄ 14.6g、柠檬酸9.33g，加注射用水至900mL，调pH至5.0～5.4，补加注射用水定容至1000mL；其工作液为10mL显色液B加入9mL双蒸水，再加入1mL显色液A，混匀后加入50μL0.75％过氧化氢尿素；

5)终止液为2mol/L的硫酸溶液。

4.根据权利要求1所述的一种猪肺炎支原体重组抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于：所说的阴性对照、阳性对照是：取临床通过间接血凝和IDEXX的ELISA检测试剂盒检测为阳性，解剖后肺脏有明显的猪肺炎支原体病变的猪血清，用样品稀释液进行50倍稀释即为标准阳性血清；取临床通过间接血凝和IDEXX的ELISA检测试剂盒检测为阴性，解剖后肺脏无任何猪肺炎支原体病变的猪血清，用样品稀释液进行50倍稀释即为标准阴性血清。

5.根据权利要求1所述的一种猪肺炎支原体重组抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于其检测程序为：

1)将10×洗涤液加入蒸馏水稀释成1×洗涤工作液；将待检样品用稀释液进行50倍稀释；

2)在抗原包被板上分别设定两个阳性对照和阴性对照孔，并加入标准阳性血清和标准阴性血清，每孔100μL；

3)在各待检样品加入检测样孔中，100μL每孔，用自封口袋装好后置室温30min；

4)将各样孔中的液体倒掉后用1×洗涤液洗涤，每孔350μL，洗涤3～5遍；

5)加入酶标二抗工作液，100μL每孔，用自封口袋装好后置室温30min后重复步骤3)；

6)加入显色工作液100μL，室温显色15min；

7)向每个样孔加入终止液50μL终止显色，在450nm下测定其吸光值；

8)检测样本的判定标准为：待检血清与对照阳性血清分别减去对照阴性血清OD值后的比值：S/P≥0.4，则判为阳性，S/P≤0.3判为阴性，介于二者之间为可疑。