CN102344892A - Leachii支原体中国分离株及其分离培养基和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株Leachii支原体中国分离株及其分离培养基和用途。本发明所分离Leachii支原体中国分离株的微生物保藏号是：CGMCC No.3808。本发明还公开了适合于所述Leachii支原体中国分离株的分离或传代培养用的培养基。致病性试验结果表明，本发明支原体分离株的传代培养物关节内接种1～2月龄健康犊牛，可复制出典型的多发性关节炎，并能引起一定的死亡，死亡犊牛具有明显的全身症状，多组织器官具有明显的病理变化。结合临床发病和人工接种犊牛的临床症状和病理变化、疾病的流行特点、追踪性流行病学调查以及分离病原的特异性PCR鉴定和遗传进化分析，确证本发明所分离的支原体为Leachii支原体。

Description

Leachii支原体中国分离株及其分离培养基和用途

技术领域

本发明涉及一株支原体(Mycoplasma)分离株，尤其涉及Leachii支原体中国分离株以及适合于该分离株分离和传代培养的培养基，本发明还涉及该分离株在研制防制或检测由Leachii支原体所致疾病的生物制品中的用途，属于支原体的分离和应用领域。

背景技术

支原体(Mycoplasma)是一类缺乏细胞壁、呈高度多形性、能通过滤菌器、可在无生命培养基中生长繁殖的最小原核细胞型微生物。支原体于1898年由Nocard等首次分离，1956年正式命名为支原体，在微生物分类中建立了一个新的独立的纲-柔膜体纲(Mollicutes)，并成为一门独立的学科，即支原体学。

支原体在分类上属于柔壁菌门(Tenericutes)，柔膜体纲(Mollicutes)，支原体目(Mycoplasmatales)，支原体科(Mycoplasmataceae)成员。支原体科包含4个属，即支原体属(Mycoplasma)，附红细胞体属(Eperythrozoon)，血巴尔通体属(Haemobartonella)和脲原体属(Ureaplasma)。支原体属包含丝状支原体族(Mycoplasma mycoides)等共约119种支原体。

在以前的分类中，丝状支原体族包含2个群，分别为丝状支原体群(M.mycoides group)和山羊支原体群(M.capricolum group)。丝状支原体群包含丝状支原体丝状亚种小菌落型(M.mycoides subsp.mycoides Small Colony，MmmSC)、丝状支原体丝状亚种大菌落型(M.mycoides subsp.mycoides Large Colony，MmmLC)和丝状支原体山羊亚种(M.mycoides subsp.capricolum，Mmc)3个种；山羊支原体群包含山羊支原体山羊亚种(M.capricolum subsp.capricolum，Mcc)、山羊支原体山羊肺炎亚种(M.capricolum subsp.capripneumoniae，Mccp)和牛7型支原体(Mycoplasma sp.bovine group 7，MBG7)3个种。由于在分析MBG7与丝状支原体族中其他5个种的关系时，用不同的方法得出相互矛盾的结果。16S rRNA基因序列同源性分析、血清学交叉反应试验以及一维和二维SDS-PAGE蛋白特性分析结果显示，MBG7与山羊支原体的关系更近，尤其是16S rRNA基因序列同源性分析结果显示，MBG7与山羊支原体之间具有高度同源性，MBG7菌株PG50和Mcc菌株California kid的16S rRNA基因序列仅有4个核苷酸变异。但是，DNA杂交试验以及LppA基因、gtsABS基因和rpoB基因的序列同源性分析却显示，MBG7与MmmSC具有非常近的进化关系。由于血清学试验显示MBG7与Mcc的关系更近，所以以往的研究一直将MBG7作为一个独立的种隶属于山羊支原体群。2009年，Manso-Silvan L等提出丝状支原体新的分类方法，将丝状支原体分成3个群，包括丝状支原体群、山羊支原体群及Leachii支原体新种群(Mycoplasma Leachii sp.nov.)。丝状支原体群包括MmmSC和Mmc 2个种，由于MmmLC与Mmc的亲缘关系非常近，所以将MmmLC作为Mmc的一个血清型归属于Mmc；山羊支原体群包括Mcc和Mccp 2个种；Leachii支原体新种群包含1个种，即MBG7，新的命名为Leachii支原体新种(Mycoplasma leachii sp.nov.)。这样，新的命名分类将丝状支原体分成3个群、5个种。

Leachii支原体最初是由Simmons G C等于1963年在澳大利亚患多发性关节炎犊牛的关节液内分离获得，典型代表菌株为PG50。之后，该病原菌陆续从患乳房炎的母牛、患关节炎和肺炎的犊牛以及流产胎儿的体内获得分离。目前全世界大约有60个Leachii支原体分离株，除6株分离于德国、葡萄牙、尼日利亚和法国外，其余所有菌株均分离自澳大利亚。

Simmons G C等通过关节内注射Leachii支原体分离培养物能够复制出犊牛的多发性关节炎，Connole M D等通过乳头管内灌注Leachii支原体能够复制出轻度乳房炎，证明Leachii支原体能够直接引起犊牛多发性关节炎和泌乳母牛乳房炎。尽管Leachii支原体也从患肺炎犊牛和流产胎儿的体内分离获得，但是其能否直接引起犊牛肺炎和怀孕母牛流产的致病性试验还未见报道。有关Leachii支原体的致病性，目前的研究认为，Leachii支原体能够直接引起犊牛关节炎以及泌乳母牛乳房炎，与犊牛肺炎及母牛流产有关。

Leachii支原体的确切来源以及传播途径目前尚不清楚。Alexander及Hum等认为，犊牛关节炎可能是由于饲喂被Leachii支原体污染的乳汁而引起。本发明人通过大量的调查结果显示，同一批精液配种母牛生产的犊牛多发性关节炎的发生率为100％，而另外来源精液配种的母牛所产的犊牛则不发生这种多发性关节炎。据此认为精液传播至少是本病的传播途径之一。有的犊牛在出生时关节即肿大，这一点也佐证了精液传播的可能性。本发明人对该发病牛场进行追踪性流行病学调查，对患有严重乳房炎的母牛采集鼻拭子、乳汁样品及乳房破溃面拭子，在这些样品中均检测并分离出Leachii支原体。因此推测，该病的垂直传播途径为精液传播，水平传播途径主要是在犊牛出生时经脐带创口直接接触而感染。

迄今为止，在中国尚未分离得到Leachii支原体分离株，因此，分离获得一株Leachii支原体中国分离株，这对于研究Leachii支原体的传播途径以及研制预防或治疗由Leachii支原体所致疾病的生物制品具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株Leachii支原体中国分离株；

本发明目的之二是提供一种适合于该Leachii支原体中国分离株的分离和传代培养的培养基；

本发明目的之三是将所分离的Leachii支原体中国分离株应用于预防或治疗由Leachii支原体所致的疾病。

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一株Leachii支原体(Mycoplasma)中国分离株(GN408)，其微生物保藏号是：CGMCCNo.3808；分类命名是：Mycoplasma Leachii；保藏时间是：2010年5月6日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2009年2月～6月，中国北方一奶牛场300余头母犊牛全部发生严重的多发性关节炎，大部分在出生3～5天后发病，少数在出生时关节即肿大。发病初期，犊牛呈现轻微的四肢僵硬和跛行，发病2～3天后病情迅速恶化，腕关节和跗关节迅速肿大，内有积液，触摸有波动感，后期关节腔内产生大量干酪样纤维素性渗出物，填充整个关节腔，触摸有实质感，常规抗生素治疗没有效果。部分犊牛因多种并发症而死亡，没有死亡的犊牛由于造成了关节的永久损伤、肢体变形，导致卧地不起和生长迟缓，最终被淘汰。为鉴定病原，本发明人无菌采集2份早期发病并具有典型症状犊牛的关节液样品，经常规细菌学检查，均为阴性。然后将病料直接接种于支原体液体培养基，待颜色变黄后将培养物接种下一代。原始样品接种在液体培养基上，2～3天培养基开始变黄，传至2～3代10倍稀释接种24h后开始变黄，并呈轻微浑浊状。之后转到固体培养基上培养，48h开始出现针尖大小的菌落，至96h在普通光学显微镜下可看到圆形、边缘整齐、具有典型的“油煎蛋”形态的菌落(图1)。将在固体琼脂培养基上生长的单菌落经3次克隆进行纯化，作为后续鉴定及其它研究的菌种。根据分离培养物的培养特性以及在固体琼脂培养基上形成的典型菌落形态特征，初步确定本发明从患病犊牛关节液中分离的病原为支原体。

本发明从患病犊牛关节液中分离的病原纯培养物经负染在电子显微镜下观察，可见典型的支原体菌体，呈棒状、丝状等多形性形态。

对本发明从患病犊牛关节液中分离的病原培养物进行16S rRNA基因和LppA基因的PCR扩增，结果均扩增出与预期大小相符的目的条带，16S rRNA基因约为1.5kb(图4)，LppA基因约为1.4kb(图5)。由于扩增LppA基因的引物是Leachii支原体特异性引物，该引物能够对分离菌株进行特异性扩增，由此确定本发明所分离的支原体为Leachii支原体。

生化试验结果显示，本发明从患病犊牛关节液中分离的病原能发酵葡萄糖、需要胆固醇、不水解精氨酸、不分解尿素，这些结果也均符合Leachii支原体的特征。

为进一步确定本研究分离菌株与其它支原体的亲缘关系，对分离株的16S rRNA基因和LppA基因进行遗传进化分析。结果显示，就16S rRNA基因而言，本发明分离株(GN408)与丝状支原体族中的成员亲缘关系较近(图6)，同源性介于97.4％～99.9％之间，与其中的Leachii支原体代表株PG50和山羊支原体山羊亚种(Mcc)同源性最高，达99.9％；与丝状支原体丝状亚种大菌落型菌株(MmmLC)同源性最低，为97.4％。就LppA基因而言，本发明支原体分离株也与PG50的亲缘关系最近(图7)，同源性高达99.6％，而与丝状支原体族中其它成员的同源性在56.3％～95.1％之间；与丝状支原体丝状亚种小菌落型(MmmSC)菌株的亲缘关系较近，同源性为95.1％，而与其他几种支原体的亲缘关系则较远，同源性在56.3％～69.6％之间。序列分析结果确定，本发明所分离的支原体与最初分离的澳大利亚Leachii支原体具有非常近的进化关系，属于同一来源。

现有技术中，常用于支原体的分离及传代培养的培养基多为改良Hayflick培养基(配方1)，其配方组成见表1。用该培养基分离和传代培养Leachii支原体多存在培养周期长、生产成本高等缺陷，有待改进。为此，本发明人对改良Hayflick培养基的组成和用量进行了优化和筛选，在培养基中添加了终浓度为0.4％的丙酮酸钠，将马血清的浓度由20％降为15％，得到了改进后的配方(配方2)。

改进后的配方组成为：按g/ml计，PPLO肉汤2.1％，水解乳蛋白0.5％，葡萄糖1％，酵母浸出物0.5％，醋酸铊0.01％，青霉素0.01％，酚红0.002％，胸腺DNA 0.002％，β NAD 0.009％，丙酮酸钠0.4％，马血清15％，余量为水。

本发明将本发明所分离的支原体菌株(GN408)同时以相同浓度接种两种不同的培养基，进行传代培养，不同时间收获培养物，对每个收获样品测定CCU。试验结果显示，配方1达到最高滴度时的CCU为1×10^-8，而配方2达到最高滴度时的CCU为1×10^-9(图2)；并且配方2的传代培养物达到最高滴度所需的时间比较短，这在实际应用过程中可以大大缩短培养周期，从而降低生产成本。本发明也对不同的马血清浓度进行了摸索，结果显示，在其他条件不变的情况下，马血清的最小添加量为15％，所以改进的培养基减少了马血清的含量，不但可以降低生产成本，而且还可以降低在疫苗应用过程中可能出现的副作用。

致病性试验结果表明，本发明支原体分离株的传代培养物关节内接种1～2月龄健康犊牛，可复制出典型的多发性关节炎，并能引起一定的死亡，死亡犊牛具有明显的全身症状，多组织器官具有明显的病理变化。结合临床发病和人工感染犊牛的临床症状和病理变化、疾病的流行特点、随后的追踪性流行病学调查以及分离病原的特异性PCR鉴定和遗传进化分析，认定引起该次疫情的病原为Leachii支原体。

本发明leachii支原体(GN408株)全菌体经灭活后免疫家兔，免疫期结束后采集血清，以原核表达的leachii支原体1ppA蛋白作为抗原，应用ELISA和Western blot方法检测抗血清的抗体效价。结果表明，抗体的ELISA和Western blot效价均可达1∶800。试验结果说明本发明分离的leachii支原体菌株具有良好的免疫原性，免疫接种动物后能够激发机体的免疫反应，并产生抗体。因此，本发明分离的leachii支原体可作为候选菌株进行疫苗的研制和开发。

附图说明

图1 普通光学显微镜下可看到菌落呈圆形，边缘整齐，大小不一，典型的“油煎蛋”形态(40×)。

图2 同一菌株以相同浓度接种不同培养基的生长曲线。

图3 分离菌株不同浓度接种相同培养基的一步生长曲线。

图4 关节液原始样品及纯培养物16S rRNA基因PCR扩增结果；1：GN407原始样品；2：GN408原始样品；3：GN407纯培养物；4：GN408纯培养物；M：250 bp DNA ladder marker。

图5 关节液原始样品及纯培养物LppA基因PCR扩增结果；M：250 bp DNA ladder marker；1：GN407原始样品；2：GN408原始样品；3：GN407纯培养物；4：GN408纯培养物.

图6 GN407和GN408 16S rRNA基因的遗传进化分析。

图7 GN407和GN408 LppA基因的遗传进化分析。

图8 分离培养物的电子显微镜形态学观察。

图9 截短1ppA基因的PCR扩增产物及重组质粒的鉴定；1：DL15000 DNA Marker；2：DL2000 DNA Marker；3：重组质粒酶切鉴定；4：截短1ppA基因扩增产物。

图10 SDS-PAGE分析重组蛋白在大肠杆菌BL21中的表达；1：阳性重组菌诱导前；2-6：阳性重组菌诱导后2、4、6、8、10h；M：蛋白质分子量Marker。

图11 提纯目的蛋白的SDS-PAGE分析；M：蛋白分子量Marker；1：纯化后蛋白。

图12 兔抗leachii支原体抗体的ELISA检测。

图13 兔抗leachii支原体多抗血清的Western blot分析；M：蛋白质分子量Marker；1：兔抗leachii支原体血清1∶100倍稀释；2：兔抗leachii支原体血清1∶200倍稀释；3：兔抗leachii支原体血清1∶400倍稀释；4：兔抗leachii支原体血清1∶800倍稀释；5：兔免疫前血清1∶100倍稀释。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例

一、试验材料和方法

1.样品来源

2009年2月-6月，中国北方一奶牛场300余头母犊牛全部发生严重的多发性关节炎，从中无菌采集了2份早期发病并具有典型症状的犊牛的关节液，-70℃冻存备用。

2.试验材料

DNA凝胶回收试剂盒，柱式小量组织/细胞基因组DNA抽提试剂盒；Ex Taq DNA聚合酶；Hyclone供体马血清；PPLO肉汤(BD-Difco)；酵母浸液(BD-Bacto)；实验中所用其它化学试剂均为分析纯级别。

3.主要仪器设备

各种规格移液器及5415R、5810R高速台式低温离心机(德国eppendorf公司)；MCO-15AC二氧化碳培养箱、MDF-U32V超低温冰箱(日本SANYO公司)；IX51倒置显微镜(OLYMPUS公司)；生物二级安全柜(美国LABCONCO公司)；DK-8D电热恒温水槽(上海精宏)；空气浴恒温摇床(KYC 100B，上海福玛实验设备有限公司)；旋涡混合器(QL-901，江苏海门麒麟医用仪器厂)；PCR仪(MyCyclerTM型，美国Bio-Rad公司)；GIS-2020全自动凝胶成像系统(上海天能)；YDS60/210液氮罐(新乡豫新航空低温容器)；ASTACUS小型超纯水仪(德国MEMBRAPURE公司)。

4.常规细菌学检查

将无菌采集的关节液样品直接接种在普通肉汤、脑心浸汤、厌氧肉肝汤、血琼脂培养基上，均置于37℃培养箱内培养，2～3天后观察生长情况。

5.支原体分离培养

(1)支原体培养基成份

溶液I：基础肉汤：乳清蛋白水解物，5g；PPLO肉汤，21g；溶于700ml超纯水，调pH 7.8，高压灭菌4℃保存备用。

溶液II：50％(W/V)葡萄糖溶液，过滤除菌4℃保存备用。

溶液III：5％(W/V)酵母浸液，过滤除菌4℃保存备用。

溶液IV：5％(W/V)醋酸铊溶液，过滤除菌-20℃保存备用。

溶液V：100mg/ml青霉素，过滤除菌，-20℃保存备用。

溶液VI：1％酚红溶液：1g酚红置于研钵中，慢慢滴加0.025mol/L NaOH溶液，边加边研磨，直到完全溶解，将溶液倾入100mL量瓶中，以超纯水洗涤研钵数次，洗涤液均倾入量瓶内，加水到100mL，116℃ 20min高压灭菌，4℃保存备用。

溶液VII：0.2％小牛胸腺DNA，现用现配，无菌操作。

溶液VIII：0.9％β NAD，现用现配，无菌操作。

溶液IX：50％丙酮酸钠溶液，过滤除菌，4℃保存备用。

马血清。

(2)支原体培养基配方

配方1：改良Hayflick培养基配方见表1。(PPLO(pleuropneumoniae-like organisms)，胸膜肺炎类微生物)。

表1

配方2：本发明对改良Hayflick培养基进行改进，添加了终浓度为0.4％的丙酮酸钠，马血清的浓度降为15％，其配方见表2。

表2

在基础肉汤中添加约1.4％的琼脂糖，高压灭菌后冷却至60℃左右再添加液体培养基的其他成份，制备成含1％琼脂糖的固体培养基，倒平板，待冷却后置4℃保存备用。

(3)支原体分离培养

将无菌采集的关节液样品直接接种到液体培养基内，置37℃培养箱内静置培养，待培养基颜色变黄后将培养物接种下一代。将稳定传代的培养物接种到支原体固体培养基上，置37℃含有5％CO₂的培养箱内培养，2～3天后在固体培养基上肉眼可见针尖大小的菌落，在普通光学显微镜下呈现支原体菌落典型的“油煎蛋”形态。挑取1个单菌落克隆3次进行纯化。

6.颜色变化单位(CCU)的测定

将液体培养基分装于小管中，每管0.9ml，于第1管加备检液0.1ml，吹吸混匀后取0.1ml至第2管，依次作10倍梯度稀释8～10管，最后1管不加被检液作为阴性对照。置37℃温箱孵育，以培养基不发生颜色改变为阴性，发生颜色改变的最后一管的稀释倍数即为CCU。

7.PCR检测

(1)引物设计：针对支原体16S rRNA基因全长序列(U26053.1)设计一对引物(16S-U：5′AAAATGAGAGTTTGATCCTGG 3′和16S-L：5′AGAAAGGAGGTGATCCATCCG 3′)，用于16S rRNA基因全序列的扩增。应用Frey等研究设计的针对LppA基因的Leachii支原体特异性引物(P67BG7-L：5′GGTAATTCGAATAATGATCCT 3′和P67BG7-R：5′TAAGTTTATTGAATTAAAGCG3′)对LppA基因全序列进行扩增。引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。

(2)DNA提取：应用上海华舜生物工程公司的柱式小量组织/细胞基因组DNA抽提试剂盒提取病料或纯培养物的DNA，操作按说明书进行，简述如下：

a.取待检测样品或纯培养物300μl，加入200μl DS液和25μl proteinase K，温和地来回颠倒离心管彻底混匀，置50℃温育10min，期间来回颠倒离心管数次；

b.加入200μl DLT液和8ul RNase A，迅速来回颠倒离心管彻底混匀，置65℃温育15min，期间来回颠倒离心管数次，12000×g离心2min，将上清全部移入干净的离心管中；

c.加入200μl无水乙醇，混匀后全部移入吸附柱中，9000×g离心30S，倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中；

d.加入500μl WGP液，静置1min，9000×g离心30S，倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中；

e.加入500μl WGP液，9000×g离心30S，倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中；

f.空柱离心1min；

g.将吸附柱移入一个新的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入50μl 65℃预热的超纯水，静置5min，9000×g离心2min，将DNA轻微混匀后，-20℃保存备用。

(3)PCR扩增：25μl反应体系：水16μl，Ex-Taq Buffer 2.5μl，dNTPs(2.5mM)2μl，上、下游引物(10pM/μl)各1.5μl，Ex-Taq DNA聚合酶0.25μl，DNA模板2.5μl。反应条件为：94℃预变性4min，94℃ 45S，55℃ 45S，72℃ 1.5min 30个循环，最后72℃延伸10min。16S rRNA基因预计扩增片段长度约为1.5kb，LppA基因预计扩增片段长度约为1.4kb。

8.序列测定与分析

PCR扩增产物用上海华舜生物工程公司生产的凝胶回收试剂盒回收纯化，纯化产物直接送上海生物工程公司进行测序，用MegAlign软件将测序结果与国际已知菌株的相应基因序列进行比对分析。

9.生化实验

使用北京陆桥技术有限责任公司生产的生化鉴定管对纯培养物进行生化指标鉴定，按说明书进行操作，主要步骤如下：

(1)实验准备：从包装盒中取出安瓿瓶，朝易折点(瓶颈上方蓝点)反方向用力折开安瓿瓶，插入安瓿瓶架中；

(2)接种方法：用接种针从平板上挑取已分离的单一菌落分别接种于需要试验的安瓿瓶中；

(3)培养及判定：将接种好的安瓿瓶置适宜温度下培养，培养24～48h观察结果，按说明书的判定标准进行判定。

10.电镜观察

取1ml本发明所分离的纯培养物，12000r/min离心10分钟，弃去上清液。用50μlPBS缓冲液(pH7.4)重悬沉淀，取混悬液一滴滴在蜡板上，将200目有膜的铜网翻扣插入悬液中，静置20min。用滤纸吸干铜网周围水分，用2％磷钨酸(pH7.0)固定2～5min，将载样铜网进行电子显微镜观察。

11.犊牛接种

4头1月龄健康犊牛，分别编号为1～4号。1、2号牛左趾关节和左腕关节内接种1ml本发明所分离的支原体培养物；3、4号牛左趾关节和左腕关节内接种1ml支原体液体培养基(表3)。4头犊牛饲养在同一个牛舍内，接种后逐日观察每头犊牛身体状况。(接种分离株的CCU为1×10^-8)。

表3 接种犊牛分组

12. 本发明支原体(GN408)的免疫原性试验

12.1 免疫原的制备

在处于对数生长期的支原体(GN408)培养物中加入2‰的甲醛溶液，37℃灭活24小时，收获菌液，10,000rpm于4℃离心30分钟，弃上清，沉淀用NET(pH7.6)洗涤3次，制成1/100的浓缩菌悬液，将浓缩的菌液与等体积法国佐剂VG 206混匀，使之充分乳化。灭活前菌株的CCU为1×10^-9。

12.2 免疫程序的制定

选用两只体重约2kg左右的健康雌性新西兰白兔，免疫前耳缘静脉采集空腹血分离血清，作为阴性血清对照。每只兔子颈背部皮下多点注射，进行免疫，1.5ml/只，间隔2周免疫一次，经3次免疫之后，耳缘静脉采血，分离血清，检测血清抗体效价。

12.3 PCR

12.3.1 引物设计

根据已经测定的leachii支原体GN408株的1ppA蛋白编码基因的核苷酸序列，设计1ppA蛋白原核截短表达的引物，上游和下游引物分别包含EcoR I和Xho I酶切位点，由上海生物工程有限公司合成。上下游引物序列分别为：1ppA-P-U：5′-CCCGAATTCACAACAAGTAGTTCAAATG-3′，1ppA-P-L-288：5′-CCCCTCGAGAAATAAATCTGTTATTTTT-3′，下划线为酶切位点的序列。

12.3.2 DNA提取：同上述步骤7中的“PCR检测”。

12.3.3 PCR扩增：同上述步骤7中的“PCR检测”。

12.4 重组表达质粒的构建

将截短1ppA基因的PCR产物与pET32a载体分别用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切，酶切产物经PCR胶收纯化试剂盒纯化后用T₄DNA连接酶连接，连接产物转化BL21感受态细胞，涂布于氨苄(Amp)抗性的LB培养基平板，37℃培养16h，挑取单菌落，碱裂解法提取质粒，对质粒进行EcoR I和Xho I双酶切鉴定，将鉴定正确的质粒测序。

12.5 目的蛋白的诱导表达及检测

将测序验证正确的阳性克隆菌以1∶50的比例接种于含Amp(100μg/mL)抗性的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值达0.6左右，0.4mM IPTG诱导表达，分别取诱导前及诱导后2h、4h、6h、8h及10h菌液，进行SDS-PAGE检测。

12.6 目的蛋白的纯化

用伯乐公司电洗脱仪纯化目的蛋白，具体操作按说明书进行。电洗脱后所获得的纯化蛋白用分光光度计测定其浓度，-70℃保存。

12.7 间接ELISA

用pH9.6的碳酸盐包被缓冲液稀释纯化的1ppA蛋白，稀释好的抗原加入到96孔酶标板中，每孔100μL，4℃过夜，包被平板；0.5‰PBST洗涤4次，每孔加入200μL 5％脱脂乳，于37℃温箱中封闭1h；洗涤后加入倍比稀释(1∶100、1∶200、1∶400及1∶800)的多抗血清及阴性血清，37℃作用1h；洗涤后分别加入HRP标记的山羊抗兔IgG抗体，37℃作用1h；洗涤后加入TMB显色液60μL，室温避光作用10min；每孔加入60μL终止液终止反应。用酶标仪Zenyth 3100测定OD₄₅₀值。

12.8 Western blot

(1)样品制备：将纯化的1ppA蛋白加入等体积的2×上样缓冲液煮沸10min，12000rpm/min离心1min。

(2)电泳：SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)，PAGE胶的制备见表4。

(3)转膜：电泳结束后小心从制胶板上将凝胶剥下，去除浓缩胶，剪取与凝胶相同大小的硝酸纤维膜(NC膜)，在转膜缓冲液的作用下用转膜仪进行转膜，参数条件为：90V，45min。

(4)封闭：转膜完毕后用PBS缓冲液洗涤NC膜一次，然后将NC膜完全浸没于5％的脱脂乳中，置37℃封闭2h(或4℃过夜)，PBS洗涤3次。

(5)反应：将多抗血清分别进行1∶100、1∶200、1∶400及1∶800倍稀释，将转印完毕并且封闭好的NC膜置稀释好的血清中，37℃作用45～60min。弃掉第一抗体，PBS洗3次后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG，37℃作用60min。

(6)显色：PBS洗3次后加入DAB显色液后进行显色，当硝酸纤维素膜有颜色区带出现时，充分显色后立即将NC膜转移至去离子水中终止显色反应。

表4 SDS-PAGE分离胶和浓缩胶成份及配制比例

二、试验结果

(一)支原体分离培养

1、支原体的分离及传代培养

2009年2月～6月，中国北方一奶牛场300余头母犊牛全部发生严重的多发性关节炎，大部分在出生3～5天后发病，少数在出生时关节即肿大。发病初期，犊牛呈现轻微的四肢僵硬和跛行，发病2～3天后病情迅速恶化，腕关节和跗关节迅速肿大，内有积液，触摸有波动感，后期关节腔内产生大量干酪样纤维素性渗出物，填充整个关节腔，触摸有实质感，常规抗生素治疗没有效果。部分犊牛因多种并发症而死亡，没有死亡的犊牛由于造成了关节的永久损伤、肢体变形，导致卧地不起和生长迟缓，最终被淘汰。

为鉴定病原，本发明无菌采集2份早期发病并具有典型症状犊牛的关节液样品，经常规细菌学检查，均为阴性。然后将病料直接接种于支原体液体培养基，待颜色变黄后将培养物接种下一代。原始样品接种在液体培养基上，2～3天培养基开始变黄，传至2～3代10倍稀释接种24h后开始变黄，并呈轻微浑浊状。之后转到固体培养基上培养，48h开始出现针尖大小的菌落，至96h在普通光学显微镜下可看到圆形、边缘整齐、具有典型的“油煎蛋”形态的菌落(图1)。将在固体琼脂培养基上生长的单菌落经3次克隆进行纯化，作为后续鉴定及其它研究的菌种。根据分离培养物的培养特性以及在固体琼脂培养基上形成的典型菌落形态特征，初步确定本发明从患病犊牛关节液中分离的病原为支原体。

2、本发明改进的培养基配方对Leachii支原体培养的影响

配方1(改良Hayflick培养基配方)和配方2(本发明改进的培养基配方)均可以用于支原体的分离及传代培养。为了比较两种培养基之间的差别，本试验将本发明所分离得支原体菌株(GN408)同时以相同浓度接种两种不同的培养基，进行传代培养，不同时间收获培养物，对每个收获样品测定CCU。结果显示，配方1达到最高滴度时的CCU为1×10^-8，而配方2达到最高滴度时的CCU为1×10^-9(图2)；并且配方2的传代培养物达到最高滴度所需的时间比较短，这在实际应用过程中可以大大缩短培养周期，从而降低生产成本。本研究也对不同的马血清浓度进行了摸索，结果显示，在其他条件不变的情况下，马血清的最小添加量为15％，所以改进的培养基减少了马血清的含量不但可以降低生产成本，而且还可以降低在疫苗应用过程中可能出现的副作用。

(二)分离菌株的培养特性

为确定本发明分离的支原体的体外培养特性，将已经适应传代的分离菌株分别以1×10⁶CCU、1×10⁵CCU和1×10⁴CCU的浓度接种液体培养基。结果显示，适应传代的分离菌株在液体培养基中达到最高生长滴度时的CCU为1×10^-9。初始接种浓度越低，达到最高滴度的速度就越慢，并且最高滴度的维持时间也越短，但不同接种浓度均能够达到CCU为1×10^-9的生长滴度(图3)。

(三)分离物的鉴定

1、PCR鉴定

对关节液病料及其纯培养物进行16S rRNA基因和LppA基因的PCR扩增，结果均扩增出与预期大小相符的目的条带，16S rRNA基因约为1.5kb(图4)，LppA基因约为1.4kb(图5)。由于扩增LppA基因的引物是Leachii支原体特异性引物，该引物能够对分离菌株进行特异性扩增，由此确定本发明分离的支原体为Leachii支原体。

2、序列分析

为进一步确定本发明分离菌株(GN408)与其他支原体的亲缘关系，对分离株的16S rRNA基因和LppA基因进行遗传进化分析。结果显示，就16S rRNA基因而言，本发明分离菌株(GN408)与丝状支原体族中的成员亲缘关系较近(图6)，同源性介于97.4％～99.9％之间，与其中的Leachii支原体代表株PG50和山羊支原体山羊亚种(Mcc)同源性最高，达99.9％；与丝状支原体丝状亚种大菌落型菌株(MmmLC)同源性最低，为97.4％。就LppA基因而言，本发明分离菌株(GN408)与PG50的亲缘关系最近(图7)，同源性达99.6％，与丝状支原体族中其它成员的同源性在56.3％～95.1％之间，与其中的丝状支原体丝状亚种小菌落型(MmmSC)菌株的亲缘关系较近，同源性为95.1％，而与其他几种支原体的亲缘关系则较远，同源性在56.3％～69.6％之间。序列分析结果确定，本发明所分离的支原体与最初分离与澳大利亚的Leachii支原体具有非常近的进化关系。

3、生化实验

生化试验结果显示，本发明分离株(GN408)能发酵葡萄糖、需要胆固醇、不水解精氨酸、不分解尿素，这些结果均符合Leachii支原体的特征。

4、电镜观察

纯培养物经负染在电子显微镜下观察，可见典型的支原体菌体，呈棒状、丝状等多形性形态(图8)。

(四)致病性试验

关节内接种支原体分离物的2头犊牛先后发生了多发性关节炎，并伴有体温升高(39.8℃)、呼吸困难及食欲减退等症状。行走呈缓慢姿态，强行驱赶时出现跛行症状。到病程后期1、2号犊牛不能自行站立，机体极度消瘦，四肢所有关节全部明显肿胀，腕关节和跗关节最严重。其中2号犊牛于接种后第21天死亡。关节内接种支原体培养基的犊牛(即3、4号犊牛)在接种后均未发生多发性关节炎及其它临床病理变化，至试验结束(接种1个月后)健康状况一直良好。对死亡犊牛进行剖检，关节腔内有半透明状关节积液，腔内充满大量的干酪样纤维素性渗出物，关节滑膜囊肿。肺脏、肝脏、脾脏以及肾脏也具有明显的病理变化。在无菌采集的关节液中再次检测并分离到Leachi i支原体，再次分离菌株的16S rRNA基因和LppA基因的核苷酸序列与接种株的同源性为100％。

(五)本发明分离的支原体免疫原性的试验结果

1、目的基因的PCR扩增及重组质粒构建

应用DNA提取试剂盒从leachii支原体GN408株的培养液中提取DNA，用设计好的ippA蛋白截短表达的引物进行PCR扩增，产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析可见大小约为660bp的单一条带，大小与预期相符(图9)。目的片段和载体同时用EcoR I和Xho I进行双酶切，将酶切后的目的片段和载体凝胶纯化后进行连接，连接产物转化BL21感受态细胞，获得的重组质粒经EcoR I和Xho I双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳分析。结果显示，双酶切的重组质粒得到两个片段，大小分别约为5.4kb和660bp(图9)，同预期大小相符，并且经序列测定验证正确。

2、表达产物的SDS-PAGE鉴定

分别收集IPTG诱导前、诱导后2、4、6、8及10h的重组菌，裂解处理后经SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色，在约43.8KD处出现重组蛋白的表达条带，大小与预期结果相符，而诱导前未出现该条带(图10)。重组蛋白表达量在诱导后2h即达到最大值。

3、目的蛋白的电洗脱纯化

融合表达的蛋白经电洗脱纯化后，经过SDS-PAGE分析，在约分子量约为43.8KD处可见清晰蛋白条带(图11)。结果表明，纯化的目的蛋白具有很高的纯度和回收率。

4、兔抗leachii支原体全菌体多抗血清的ELISA效价

采用间接ELISA测定兔抗leachii支原体抗体的效价，用纯化的1ppA蛋白包被ELISA酶标板，多抗血清和阴性血清均分别从100倍开始进行连续2倍稀释，洗涤后加入1∶5000稀释的HRP标记羊抗兔IgG二抗。结果显示，本发明制备的兔抗leachii支原体抗体能够和leachii支原体的1ppA蛋白发生特异性的反应，并且抗体的ELISA效价可达到1∶800；而兔免疫前血清不能够和包被的1ppA蛋白反应(图12)。结果表明，本发明所分离的leachii支原体全菌体GN408株经灭活后免疫家兔，能够激发机体的免疫反应，并产生相应的抗体，说明所分离菌株具有良好的免疫原性。

5、兔抗leachii支原体全菌体多抗血清的Western blot效价

用纯化的leachii支原体1ppA蛋白进行Western blot检测，结果显示，用灭活的leachii支原体免疫家兔制备的多抗血清能够与纯化的1ppA蛋白发生反应，在约43.8KD处有特异性条带(图13)，并且血清进行1∶800倍稀释时仍能够和抗原发生特异性反应。结果表明，本发明所分离的leachii支原体GN408株具有良好的免疫原性，接种动物后能够刺激机体产生相应的抗体。

Claims (5)

1.一株Leachii支原体(Mycoplasma)中国分离株，其微生物保藏号是：CGMCC No.3808。

2.用于分离或传代培养权利要求1所述Leachii支原体中国分离株的培养基，包括：按g/ml计，胸膜肺炎类微生物肉汤2.1％，水解乳蛋白0.5％，葡萄糖1％，酵母浸出物0.5％，醋酸铊0.01％，青霉素0.01％，酚红0.002％，胸腺DNA 0.002％，β-NAD 0.009％，丙酮酸钠0.4％，马血清15％，余量为水。

3.权利要求1所述Leachii支原体中国分离株在制备预防或治疗由Leachii支原体所引起的疾病的生物制品中的用途。

4.权利要求1所述Leachii支原体中国分离株在制备诊断或检测由Leachii支原体所引起的疾病的试剂中的用途。

5.按照权利要求3或4所述的用途，其特征在于：所述的由Leachii支原体所引起的疾病包括犊牛多发性关节炎或犊牛肺炎。

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