CN111944028B - 产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白及其制备方法、应用和疫苗 - Google Patents

产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白及其制备方法、应用和疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白及其制备方法、应用和疫苗，涉及生物制品领域。该产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白包括：将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的野生型产气荚膜梭菌β毒素的第212位精氨酸和266位酪氨酸突变为丙氨酸，该产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白相比于野生型产气荚膜梭菌β毒素的毒性显著降低，同时还保留了良好的免疫原性。

Description

产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白及其制备方法、应用和疫苗
技术领域
本发明涉及生物制品领域，尤其是涉及一种产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白及其制备方法、应用和疫苗。
背景技术
产气荚膜梭菌（Clostridium Perfringens）也称产气荚膜杆菌或魏氏梭菌，是临床上气性坏疽病原菌中最多见的一种梭菌，能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿，继而影响血液供应，造成组织大面积坏死。产气荚膜梭菌也是羊快疫、羔羊痢疾、牛羊坏死性肠炎、牛羊肠毒血症的主要病原之一，对畜牧业造成了巨大的经济损失。产气荚膜梭菌主要的致病因素是其分泌的外毒素。根据产生4种主要致死性外毒素α、β、ε、ι的种类，将该菌分为A、B、C、D、E五个毒素型。
B、C型产气荚膜梭菌分泌β毒素，该毒素是主要的免疫原，能够刺激机体产生中和性抗体。因此，β毒素是预防C型产气荚膜梭菌感染疫苗的主要抗原。目前制备β毒素疫苗，有两种方法。一种是使用C型产气荚膜梭菌接种到厌气肉肝汤中厌氧培养24h，粗提β毒素，测定毒力，然后加入甲醛灭活，再按照一定比例与氢氧化铝佐剂混合制成。由于制备过程中使用的厌气肉肝汤成分复杂，难于进行质量控制，导致制备的疫苗批间差异大；由于抗原来源于灭活的菌体，除了有效抗原外还含有杂蛋白，进一步影响了不同批次间疫苗质量的稳定性；传统疫苗毒素难以定量，只能通过小鼠毒力试验测定，不方便且不准；由于毒力强，毒素灭活过程中甲醛含量高，灭活时间长；更重要的C型产气荚膜梭菌分泌的β毒素含量低，需要浓缩5~8倍，才能达到疫苗中抗原含量。
另外一种是基因工程表达方法，β毒素基因和结构研究的比较清楚，它有336个氨基酸组成，对小鼠LD50约为400ng/kg，毒性很强。因此，研究者利用基因工程技术将毒素去毒性，作为抗原研制疫苗是目前的热点。
目前产气荚膜梭菌β毒素主要由大肠杆菌表达。虽然大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、操作简便、生产周期短、表达水平高、成本低和易于大规模培养等优点，是最常用、最经济的外源蛋白表达系统。但是其表达的外源蛋白通常在胞内以不可溶性的包涵体或胞内的可溶性蛋白表达，包涵体不具有生物活性，需进行变性、复性处理；胞内的可溶性蛋白具有生物活性，但含杂蛋白较多，需进行复杂的纯化过程；由于大肠杆菌是阴性菌，含有大量的LPS（内毒素），造成疫苗副反应，因此疫苗生产中需要去除内毒素，但是其内毒素的去除工艺复杂，生产成本高，目前是兽用生物制品生产中的难点。
目前，已有关于产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗的报道，如一种无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗及其生产方法（CN109701007A）和大量外文文献报道。这些报道中，均采用IPTG作为诱导剂在大肠杆菌系统中表达，同时加入促融标签，导致蛋白结构发生变化，免疫原性不好；同时β毒素重组蛋白均在胞内表达，需要进行超声破碎及镍柱纯化等复杂的过程。因此一种能够作为疫苗抗原的荚膜梭菌β毒素及其制备方法是目前市场需要的。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白，该产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白相比于野生型产气荚膜梭菌β毒素的毒性显著降低，同时还保留了良好的免疫原性。
本发明的第二目的在于提供上述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的制备方法，该制备方法能够使产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白分泌表达，还具有工艺简单、成本低和过程可控的优点。
本发明的第三目的在于提供含有上述荚膜梭菌β毒素突变体蛋白，或能够表达该荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的前提物质的疫苗。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白，包括：将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的野生型产气荚膜梭菌β毒素的第212位精氨酸和266位酪氨酸突变为丙氨酸。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种核酸，该核酸含有编码所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的区域。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的制备方法，该制备方法包括在革兰氏阳性菌表达系统中表达编码所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的基因。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种生物材料，所述生物材料为表达盒、载体、重组微生物或细胞系中的至少一种；所述生物材料表达所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白，和/或含有所述核酸。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白，所述核酸，所述制备方法，或所述生物材料在如下（x1）~（x3）中至少一种的应用；
（x1）制备产气荚膜梭菌基因工程疫苗；
（x2）制备产气荚膜梭菌病诊断抗原；
（x3）制备单克隆抗体。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种疫苗，所述疫苗包含所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白，所述核酸或所述生物材料；以及任选的辅料。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白对HL60细胞毒性与野生成熟β毒素相比，降低了6000倍，100μg的重组蛋白对小鼠无毒力，减毒成功，毒素安全；在兔子和牛模型呈现良好的免疫原性和免疫保护性，能够应用于制备预防产气荚膜梭菌亚单位疫苗或多价梭菌毒素亚单位疫苗。
本发明提供的上述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的制备方法，通过在革兰氏阳性菌表达系统中表达目的蛋白，实现了目的蛋白分泌表达在培养基中，易纯化的效果。采用革兰氏阳性菌表达系统中制备产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白，蛋白含量不低于300μg/ml，蛋白纯度不低于80%，高于大肠杆菌表达5~10倍。
本发明提供的疫苗，以产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白或能够产生其的前体物质为免疫原，具有工艺简单、生产成本低、过程可控、无需去除内毒素和疫苗有效性佳的优点，能够有效避免现有菌苗和大肠杆菌基因工程疫苗生产工艺复杂、成本高、抗原复杂、副反应大、有效抗原含量低、疫苗批间差异大和副作用大等缺点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中酶切产物的电泳结果；
图2为实施例1中重组载体的目的基因PCR扩增产物；
图3为实施例2重组菌株SE/PYL-CPBR239A-Y293A诱导表达后上清中产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的SDS-PAGE电泳结果；
图4为实施例2重组菌株SE/PYL-CPBR239A-Y293A诱导表达后上清中产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的Western blot鉴定结果；
图5为产气荚膜梭菌β毒素突变体对MDCK细胞的毒力试验结果；
图6为产气荚膜梭菌β毒素突变体疫苗抗体持续期试验结果；
图7为优化后发酵条件发酵制备得到的产气荚膜梭菌β毒素突变体的SDS-PAGE电泳结果；
图8为表达质粒PYL的结构图谱示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白，包括：将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的野生型产气荚膜梭菌β毒素的第212位精氨酸和266位酪氨酸突变为丙氨酸。将产气荚膜梭菌β毒素的第212和266位突变为丙氨酸，可以将毒素的致死活性丧失而本身生物学活性不变，实现了产气荚膜梭菌β毒素在体外细胞水平以及体内水平完全减毒、甚至无毒，同时在动物体内呈现良好的免疫原型和免疫保护性。所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的氨基酸序列优选含有如SEQ ID NO.1所示序列。更优选地，所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.2所示，其中SEQ ID NO.2所示序列和SEQ ID NO.1所示序列相比，在蛋白的N段含有一段信号肽。更优选地，所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白由革兰氏阳性菌表达系统表达，由革兰氏阳性菌表达系统表达的产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的结构更接近天然结构，使产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的免疫原性更佳。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种核酸，该核酸含有编码所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的区域。所述核酸的核苷酸序列含有SEQ ID NO.4所示序列；优选地，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示，SEQ ID NO.5所示和SEQID NO.4所示序列相比，其还含有编码信号肽的区域。“核酸”指的是任何长度的核苷酸的聚合物形式，核苷酸包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。核酸的实例包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的制备方法，该制备方法包括在革兰氏阳性菌表达系统中表达编码所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的基因。
采用革兰氏阳性菌表达系统表达所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白具有如下有益效果：能够使目的蛋白以“胞外分泌”的形式表达，即目的蛋白分泌至细胞外的培养基中，蛋白能够直接以可溶的形式分泌释放到培养基中，获得具生物活性的蛋白质，从而避免了因包涵体复性带来的困难，降低了工艺成本；杂蛋白少，目的蛋白的回收简单；表达系统无内毒素的产生，减少疫苗纯化内毒素的成本和副反应，也不含有类似脂多糖的毒性化合物，这使得它们特别适合宿主来生产医学和药学上的蛋白；保留蛋白的天然构象。所述革兰氏阳性菌表达系统优选包括（c1）~（c3）中的任意一种；
（c1）葡萄球菌表达系统；
（c2）枯草芽孢杆菌表达系统；
（c3）谷氨酸棒状杆菌表达系统。
在一些优选的实施方式中，包括将含有编码所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的基因克隆至载体，得到重组载体；然后将重组载体转化至大肠杆菌，筛选后将重组载体阳性克隆经金黄色葡萄球菌RN4220转化，将重组载体转化进入表皮葡萄球菌中，然后经诱导表达得到所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白。其中载体优选包括pYL质粒载体，所述pYL质粒载体是将Xyl/tet片段、ori区域和Erm抗性基因插入pRB373质粒的多克隆位点及抗性区域中，得到的重组质粒pYL。重组质粒pYL有两个复制子：pUC18的复制子保证此载体能在大肠杆菌中复制；pE194复制子保证质粒在葡萄菌中复制。同时由于在其多克隆位点上游加入了可诱导表达的Xyl/tet片段，为四环素抗性基因表达调控元件，外源基因的表达受四环素诱导，使其下游基因限制性表达（严谨型表达），避免本底性表达造成表型的不可控性。Erm抗性基因则赋予质粒及克隆子方便快捷的抗生素筛选表型。
金黄色葡萄球菌RN4220来源NCTC8325-4，是一株限制性内切酶缺陷菌株，能够接受来源于外部的其他物种的DNA质粒。RN4220体内没有其他质粒，对大部份抗生素都敏感。RN4220是用来转化大肠杆菌质粒DNA的金黄色葡萄球菌菌株。该菌株在基因Sau1 HsdR上有突变，该突变的产生可以导致RN4220成为限制修饰系统基因缺陷型，可以用来作为大肠杆菌质粒DNA和葡萄球菌质粒转化的中间宿主菌。
表皮葡萄球菌（S.epidermidis）一般不产生外毒素（溶血毒素）、杀白细胞毒素和肠毒素，故侵袭力较弱，属于非致病性葡萄球菌，在中国医学细菌保藏管理中心和ATCC官网中均规定生物安全等级1，非常适合作为受体菌。
在一些优选地实施方式中，所述诱导表达的条件为：使用终浓度为300~700ng/mL的诱导剂脱水四环素（ATC）在36~38℃诱导16~28小时。诱导剂浓度例如可以为但不限于为300、350、400、450、500、550、600、650或700 ng/mL，优选为500ng/mL；诱导时间例如可以为但不限于为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28小时，优选为24小时；诱导温度例如可以为但不限于为36、36.5、37、37.5或38℃，优选为37℃。种子液的接种量优选为0.1~5%（v/v），例如可以为但不限于为0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5%（v/v），更优选为1%（v/v）。补料碳源优选包括葡萄糖和/或甘油，更优选为甘油。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种生物材料，所述生物材料为表达盒、载体、重组微生物或细胞系；所述生物材料表达所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白，和/或含有所述核酸。具体的实例包括但不限于含有编码所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白基因的表达盒；含有编码所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白基因的重组质粒或病毒载体，例如含有编码所述产气荚膜梭菌β毒素突变体核酸的pYL质粒载体，所述pYL质粒载体是将Xyl/tet片段、ori区域和Erm抗性基因插入pRB373质粒的多克隆位点及抗性区域中，得到的重组质粒pYL；含有编码所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白基因的重组质粒的大肠杆菌，以实现所述重组质粒的克隆；含有编码所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白基因的重组质粒的表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒状杆菌，以实现所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的表达。所述生物材料可以用于作为疫苗的活性成分，例如表达盒和载体可以作为核酸疫苗的活性成分；重组微生物和细胞系可以用于扩增编码所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白基因，或用于表达所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述荚膜梭菌β毒素突变体蛋白，所述核酸，所述制备方法或所述生物材料在如下（x1）~（x3）中至少一种的应用；
（x1）制备产气荚膜梭菌基因工程疫苗；
（x2）制备产气荚膜梭菌病诊断抗原；
（x3）制备单克隆抗体。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种疫苗，所述疫苗包含所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白，所述核酸或所述生物材料；以及任选的辅料；本发明提供的疫苗具有工艺简单、生产成本低、过程可控、无需要去除内毒素和疫苗有效性佳的优点，能有效避免现有菌苗和大肠杆菌基因工程疫苗生产工艺复杂、成本高、抗原复杂、副反应大、有效抗原含量低、疫苗批间差异大和副作用大等缺点。
本发明提供的疫苗具体的实例包括但不限于以所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白作为主要抗原物质的亚单位疫苗；以含有编码所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的RNA为主要免疫原的核酸疫苗；以含有编码所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的重组质粒为主要免疫原的核酸疫苗。可以理解的是，所述疫苗中还可以含有其他产气荚膜梭菌毒素，包括但不限于产气荚膜梭菌α、ε和ι毒素中的一种或几种；或者含有其他病原微生物的抗原物质。所述疫苗中除去含有作为免疫原的物质外还可以含有任选的辅料，其中“任选的”指的是所述疫苗中可以含有辅料也可以不含有辅料，辅料包括但不限于疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种。优选含有疫苗佐剂，佐剂可以增强疫苗中免疫原的抗原性，可以充当缓慢释放抗原的组织储存，还可以增强非特异性的免疫应答，佐剂可选择本领域可接受的佐剂，本发明对此不作限制。
在一些优选的实施方式中，所述疫苗包含所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白和佐剂。所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的浓度优选为50~100μg/mL，例如可以为但不限于为50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μg/mL，优选为50μg/mL。其中佐剂包括但不限于弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、氢氧化铝胶、MF59佐剂、白油佐剂或Montanide ISA系列佐剂，优选使用Montanide ISA系列佐剂中的ISA35A佐剂，实验发现ISA35A佐剂和所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白配合使用，对实验动物的保护效力较高。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
实验材料：
质粒载体pYL和RN4220感受态细胞由发明人实验室冻存；菌株RN4220、表皮葡萄球菌购自ATCC；E.coli DH5α感受态细胞购自宝生物工程（大连）有限公司。
高保真FastPfu DNA聚合酶和dNTPs购自全式金公司；限制性内切酶（AscⅠ；PmeⅠ）、DL2000 DNA Marker、10×Loading Buffer、4×Protein SDS PAGE Loading Buffer、PCR产物回收纯化试剂盒，均购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。
HL60细胞系由发明人实验室冻存；产气荚膜梭菌β毒素抗体检测试剂盒购自BIO-XDiagnostics。C产气荚膜梭菌C59-2购自中国兽医药品监察所菌种保藏中心；体重15～20g的小鼠、体重1.5～2.0kg的兔均购自新疆医科大学实验动物中心。
实施例1
1. pYL表达质粒的构建：
1.1 合成启动子、ori区域和Erm抗性基因：根据对表达载体的需求，人工化学合成可使用四环素进行表达调控的Xyl/tet片段、ori区域及可使用抗生素进行筛选的Erm抗性基因。
1.2 PYL表达质粒的构建：将上述1.1合成的基因片段通过分子生物学的方法插入到PRB373质粒中，测序正确，获得表达质粒PYL，质粒的结构图谱如图8所示。
2. 获取目的基因：
对野生型产气荚膜梭菌β毒素编码基因进行优化设计，野生型产气荚膜梭菌β毒素的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示（含有信号肽），对其进行突变，得到的核苷酸序列如SEQID NO.5所示（含有信号肽）。
SEQ ID NO.5所示核苷酸序列翻译的蛋白为产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示（含有信号肽），SEQ ID NO.2的氨基酸序列为将SEQ IDNO.3（不含有信号肽）的野生型产气荚膜梭菌β毒素的第212位精氨酸和266位酪氨酸突变为丙氨酸，同时添加信号肽氨基酸序列得到。
SEQ ID NO.3氨基酸序列的第212位精氨酸和266位酪氨酸突变为丙氨酸后的序列如SEQ ID NO.1所示。
人工合成SEQ ID NO.5所示核苷酸序列，命名为GCPBR239A-Y293A（含有信号肽的蛋白突变位点为第239位和第293位）。以GCPBR239A-Y293A为模板，利用引物进行PCR扩增，PCR扩增引物如下所示：
上游引物：5’-AACTATGTCAAAAAAATCTTTTGCT-3’ （SEQ ID NO.7）；
下游引物：5’-TTGGCGCGCCTTATATATTATTAATTAATATC-3’ （SEQ ID NO.8）。
PCR扩增体系如下：
DNA Temple 1.0μl
Primer 1 0.5μl
Primer 2 0.5μl
Premix Ex Taq 12.5μl
ddH2O 10.5μl
PCR反应程序为：
Figure 633445DEST_PATH_IMAGE001
扩增目的DNA条带并回收，然后与载体pYL一起进行双酶切（AscⅠ/PmeⅠ），回收酶切产物并电泳，结果如图1所示。图1中泳道1为质粒；泳道2为经双酶切的质粒；泳道M1和M2为DNA Marker。
连接和转化：将线性化的载体pYL与目的片段连接，10μl连接体系如下：
DNA Ligase Buffer 1μl
目的片段回收产物 4μl
载体pYL回收产物 2μl
T4 DNA Ligase 1μl
ddH2O 2μl
将体系中各组分加入PCR管中，轻弹管壁将各组分混合均匀，瞬时离心后置于16℃温度条件下过夜连接，然后将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中，涂布于含300μg/ml Erm的LB固体培养板上，置36~38℃恒温培养箱中培养16~24小时。挑选阳性单菌落，提取重组表达质粒并进行PCR鉴定和测序，PCR鉴定结果如图2所示，图2中泳道M为DNAMarker；泳道1为目的基因PCR扩增产物；泳道2为阴性对照；泳道3位C型产气荚膜梭菌β毒素。将测序正确重组质粒再电转转化至RN4220后，置于36～38℃恒温培养箱培养20～24小时，从平板上挑取5个菌落转接到10ml TSB液体培养基（含5μg/ml红霉素）中，置于36～38℃恒温振荡培养箱，以200r/min振荡培养16～20小时，将菌液按照核酸提取试剂盒说明书进行操作，提取RN4220中的质粒电转转化表皮葡萄球菌(SE)中，获得最终用于诱导表达的克隆子SE/pYL-CPBR239A-Y293A。
实施例2
产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的表达和鉴定：将实施例制备得到的重组菌株SE/PYL-CPBR239A-Y293A接种于TSB液体培养基（含5μg/ml Erm）中，接种比例为1%，使用终浓度为500ng/ml的诱导剂ATC，在温度36～37℃的条件下以200r/min振荡培养18~24小时。
将制备好的重组菌株按1%的比例接种含5μg/ml Erm的TSB液体培养基中，按500ng/ml加入诱导剂ATC置36～37℃恒温振荡培养箱中，以200r/min振荡培养18~24小时，然后高速离心培养物以收集上清，进行SDS-PAGE电泳鉴定和Western Blot鉴定。
SDS-PAGE鉴定：取上清进行SDS-PAGE电泳，观察记录产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白含量和蛋白的纯度，SDS-PAGE电泳结果如图3所示。图3中泳道M为蛋白分子量Marker；泳道a~d依次为浓度1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml和125μg/ml的BSA；泳道1为上清中产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白。
Western Blot鉴定：产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白经SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜上，以HRP标记的β毒素的特异性单抗（1∶20）为进行孵育，按照底物显色试剂盒说明进行显色，检测产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白反应原性，实验结果如图4所示，图4中泳道M为蛋白分子量Marker；泳道1为诱导后培养基上清；泳道2为诱导前培养基。
实施例3
产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的小鼠毒力实验，实验方法参照《中华人民共和国兽药典》（2015年版）三部规定。实验动物为18±2g小鼠，每组5只，随机分为六组。实验分组如下：实验组三组，分别以1μg、10μg以及100μg三个注射剂量免疫小鼠；阴性对照为培养基；阳性对照为1个MLD的天然毒素；以及空白对照。样品用明胶缓冲液进行稀释，采用尾静脉注射样品，注射的液体总体积为200μL，观察1～3日并记录小鼠死亡情况。实验结果：阴性对照组和实验组小鼠均存活，阳性对照组小鼠全部死亡。
实施例4
重组蛋白HL60细胞毒力试验：
将浓度为2×105个/ml的HL60细胞加入96孔板，每孔100μl细胞悬液，37℃，5% CO2过夜培养。将实施例2制备得到的产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白和野生型产气荚膜梭菌β毒素蛋白使用0.2μm的滤器，将蛋白进行2倍倍比稀释，共稀释12个浓度，每个浓度设置三个重复；阴性对照接种培养基，37℃，5% CO2培养24h，并记录细胞病变的时间，实验结果如图5所示，图5中A为浓度为100μg/ml产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白处理后的细胞，B为浓度为1μg/ml野生型产气荚膜梭菌β毒素蛋白处理后的细胞。
MTS检测：将培养24h后细胞弃去上清，然后每孔加入100μL培养基和20μLMTS试剂，37℃，5% CO2培养1~2h，酶标仪读取A490nm下的OD值，产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白处理的细胞半数病变量CT50=140.75μg/ml；野生型产气荚膜梭菌β毒素蛋白处理后的细胞半数病变量CT50=0.038μg/ml，细胞死亡情况按照如下公式计算：
细胞死亡率（%）=（1-实验组A490nm/阴性对照组A490nm）100%；
CT50=㏒-1[Xm-i(∑P-0.5)]+i/4(1-Pm-Pn)。
实施例5
（1）表达产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白：将重组菌株SE/PYL-CPBR239A-Y293A接种于TSA平板（含5μg/ml Erm）培养16~18h，培养温度36～37℃。挑取单菌落接种于TSB液体培养基（含5μg/ml Erm），200r/min，36～37℃培养12~14h，然后接种于TSB液体培养基（含5μg/mlErm），接种比例为1%，加入诱导剂ATC，诱导剂ATC终浓度为300ng/ml，200r/min，36～37℃培养12~14h后高速离心收集培养基上清，获取蛋白纯度和含量。
蛋白的纯度和含量按照如下方法获得：
将蛋白Marker、培养基上清和BSA标准品进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳后考马斯亮蓝R250染色30min，脱色液脱色至条带清晰，拍照保存。然后使用Launch Vision Works LS软件绘制标准曲线，当R2≥0.99时，可进行待检样品的测定。以标准曲线作为参照，分析培养基上清中蛋白浓度。
蛋白纯度使用AlphaEaseFC软件测定，利用软件“Aanlysis Tools”功能得出培养基上清所有条带百分比含量，记录目的蛋白百分比含量，即为目的蛋白纯度结果。
（2）抗原处理：使用甲醛处理产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白样品，以灭活样品中的残留菌体，甲醛按照样品总量的0.2%比例加入，36～37℃，100r/min振荡24～48h，置于2～8℃冷藏备用。然后按照现行《中国兽药典》附录进行无菌检测，具体的：使用18±2g小白鼠2只，各静脉注射离心上清0.4ml，观察24小时，均应健活。将通过无菌检测的产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白样品与水包油佐剂充分混合制成疫苗，疫苗中抗原含量为100μg/ml，共制备疫苗400ml。
（3）兔子免疫实验：
（3.1）中和抗体实验：向兔子肌肉注射上述制备得到的疫苗0.5ml，共注射4只兔子（体重1.5～2.0kg），注射疫苗21天后采血并分离血清，将四只兔子的血清等量混合均匀。取混合后的血清0.4ml和含12个小鼠MLD的C型产气荚膜梭菌毒素0.8ml在36～37℃的条件下作用40min，然后静脉注射小鼠（15～20g）各2只，注射量为0.3ml/只；同时用对照小鼠2只，以静脉注射1MLD产气荚膜梭菌β毒素作对照，观察小鼠3日后判定结果。
（3.2）免疫攻毒实验：兔子免疫21日后，连同条件相同的对照兔2只，分别耳缘静脉注射1个兔MLD的C型产气荚膜梭菌毒素。观察1日，记录家兔死亡情况。
（4）牛免疫实验：
（4.1）中和抗体实验：向牛肌肉注射上述制备得到的疫苗2ml，牛选用3～6月龄左右健康犊牛，每组3只，注射疫苗21天后按照相同途径进行第二次免疫，二免后14日采血并分离血清，取每只动物血清0.4ml分别与0.8ml的C型产气荚膜梭菌毒素（含12个小鼠MLD），置36～37℃作用40min，然后静脉注射小鼠（15～20g）各2只，注射量为0.3ml/只；同时用对照小鼠2只，以静脉注射1MLD产气荚膜梭菌β毒素作对照。小鼠观察1日，判定结果。
（4.2）免疫攻毒实验：二免后14日，连同条件相同的对照牛3只，分别静脉注射1个牛最小致死剂量（MLD）的C型产气荚膜梭菌毒素。观察3日，记录牛死亡情况。
（5）实验结果：
（5.1）家兔免疫试验结果：各代次免疫组血清中和效价对C型产气荚膜梭菌毒素的效价均达到5（0.1ml免疫动物血清中和3MLD毒素）；静脉注射1兔MLD的C型产气荚膜梭菌毒素，免疫组全部存活，对照组全部死亡，结果如表1所示。
表1. 家兔血清中和效价和攻毒试验结果
Figure 377279DEST_PATH_IMAGE002
（5.2）牛免疫试验结果：结果显示，重组蛋白100μg/头免疫组血清中和效价对C型产气荚膜梭菌毒素的效价均达到3（0.1ml免疫动物血清中和3MLD毒素），结果如表2所示。
表2. 牛血清中和效价和攻毒试验结果
Figure 644312DEST_PATH_IMAGE003
实施例6
产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白亚单位疫苗免疫持续期试验：
将产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白亚单位疫苗（100μg/ml）肌肉接种于4只健康易感兔子，接种量为0.5ml/只，并于免疫后180日静脉注射1个兔MLD的C型产气荚膜梭菌毒素，接种疫苗后分别于第14、28、60、90、120、160和190日采血并分离血清，将分离得到的血清进行抗体检测，检测方法参照检测试剂盒说明书。
阻断率计算公式如下：
样品阻断率=[（阴性血清OD值－样品血清OD值）/阴性对照OD值]×100%。
阳性血清阻断率=[（阴性血清OD值－阳性血清OD值）/阴性血清OD值]×100%。
试验成立的标准：阳性血清阻断率>30%，且阴性血清OD值－阳性血清OD值>0.7。
实验结果如图6所示，从图6可以看出，使用50μg/只剂量免疫兔子180日后免疫兔血清阻断率仍可达到80%以上。且C型产气荚膜梭菌毒素攻毒后对照组兔2/2死亡，免疫组4/4存活，说明疫苗对实验动物具有较好的保护作用。
实施例7
蛋白表达优化：
（1）配置培养基：
TSA固体培养基：按胰蛋白大豆琼脂粉（Tryptic Soy Agar，TSA）40g，注射用水940ml，将TSA溶解于注射用水后121℃高压蒸汽灭菌15分钟，冷却至约50℃，根据需要加入红霉素，至终浓度为5μg/ml，倒平板后备用。
TSB液体培养基：胰蛋白大豆肉汤粉（Tryptic Soy Broth，TSB） 30g，注射用水940ml，将TSB溶解于注射用水后121℃高压蒸汽灭菌15分钟，冷却至约50℃，根据需要加入红霉素，至终浓度为5μg/ml。
（2）菌种复苏：
一级生产种子制备：表面消毒后取出重组菌种SE/PYL-CPBR239A-Y293A，加入少量TSB液体培养基后在含有红霉素的TSB平板上划线，36~38℃培养12~16h后挑取单菌落接种至红霉素终浓度为5μg/ml的TSB液体培养基中，36~38℃，200r/min培养16~24h后作为一级生产种子。
二级生产种子制备：将一级生产种子接种于200ml红霉素终浓度为5μg/ml的TSB液体培养基中，接种量为0.2%（v/v），36~38℃，200r/min培养8~12h后作为二级生产种子。
（3）发酵罐实验：对发酵条件进行优化和筛选，包括补料碳源的选择，诱导剂浓度的选择，诱导时间的选择和种子液接种量的选择，分别不同时间取样检测SE/PYL-CPBR239A-Y293A蛋白的表达量。其余发酵条件为：发酵罐体积为15L，采用无菌过滤的方式注入5L培养基，红霉素终浓度为5μg/ml，并加入0.01%的消泡剂；培养温度：36～37℃；pH值：7.0，自动添加1mol/L盐酸或30%氨水来控制pH值；溶氧：20%，手动调节搅拌速度及通气量维持溶氧。
（3.1）补料碳源：分别以葡萄糖和甘油作为补料碳源，发酵过程采用葡萄糖（1g/L）或甘油（6-8小时添加1%）作为补料碳源。具体的：15L发酵罐发酵，培养基5L，按照接种量为1%接种种子液，以终浓度为500ng/ml的ATC诱导剂进行诱导表达。其结果见下表3，添加甘油组蛋白表达量高。
表3 补料碳源对rCPB蛋白表达的影响
Figure 46475DEST_PATH_IMAGE004
（3.2）诱导剂浓度：分别以300、500、700ng/ml的终浓度加入ATC诱导剂诱导表达，采用甘油作为补料碳源，其余发酵条件同（3.1）。表达结果见表4，500ng/ml浓度诱导剂表达量高。
表4 诱导剂浓度对rCPB表达的影响
Figure 715354DEST_PATH_IMAGE005
（3.3）诱导时间：以终浓度为500ng/ml的ATC诱导剂进行诱导表达，分别在诱导不同时间时取样检测SE/PYL-CPBR239A-Y293A蛋白的表达量，采用甘油作为补料碳源，其余发酵条件同（3.1）。结果见表5，在24-28h表达量最高。
表5 不同诱导时间对rCPB的影响
Figure 895668DEST_PATH_IMAGE006
备注：“—”表示未进行
（3.4）种子液接种量：分别按照0.2%、1%、5%的接种量接种种子液，采用甘油作为补料碳源，其余发酵条件同（3.1）。1%的接种量比较适合蛋白表达。
表6 种子接种量对rCPB表达的影响
Figure 649998DEST_PATH_IMAGE007
参考优化的条件：用15L发酵罐进行4次分批补料发酵试验，初始体积为5L，按1%接种量接种种子液。采甘油作为补料碳源，加入终浓度为500ng/ml的诱导剂ATC进行诱导表达，诱导表达24小时结束发酵，检测重组菌株SE/PYL-CPBR239A-Y293A蛋白表达情况和纯度。
发酵优化结果：用15L发酵罐进行了4次重组菌株SE/PYL- CPBR239A-Y293A发酵表达，具体参数为：补料碳源为甘油、诱导剂ATC的终浓度为500ng/ml、诱导时间为24h、种子液接种量为1%。其目的蛋白为蛋白含量均不低于300μg/ml，蛋白纯度不低于80%。制备得到的产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的SDS-PAGE结果如图7所示，图7中泳道M为蛋白分子量Marker，泳道a为1000μg/ml BSA；泳道b为500μg/ml BSA；泳道c为250μg/ml BSA；泳道d为125μg/ml BSA；泳道1~4为采用优化后的发酵参数发酵得到的产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白。
实施例8
佐剂筛选：
将产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白分别与佐剂混合至终浓度为100μg/ml，佐剂分别为水包油佐剂疫苗（ISA 35A）、氢氧化铝胶疫苗、水包油包水佐剂疫苗（ISA 201）和油包水佐剂疫苗（ISA 61）。然后选用8只350~450g的豚鼠，每组2只，共分成4组，用于检测采用不同佐剂制备得到的疫苗的安全性。将各组疫苗肌肉注射豚鼠，注射量为2ml/只，观察注射部分是否有坏死以及豚鼠是否死亡。实验发现注射后各组豚鼠注射疫苗后注射部位没有坏死，且各组豚鼠均为发生死亡，健康状况良好，说明制备得到的疫苗是安全的。
选用18只体重为1.8-2.0kg的兔子，共分成5组，其中实验组4组，每组4只兔，分别注射含有不同佐剂的疫苗，注射计量为每只0.25ml；以及1空白组对照组，空白对照组2只兔。免疫后21日使用C型产气荚膜梭菌强毒毒素（C59-2）攻毒。实验结果如表7所示，从表7可以看出，使用水包油佐剂疫苗（ISA 35A）疫苗保护效果最好，实验动物全部存活。
表7. 攻毒试验结果
Figure 387009DEST_PATH_IMAGE008
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 天康生物股份有限公司
<120> 产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白及其制备方法、应用和疫苗
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Asn Asp Ile Gly Lys Thr Thr Thr Ile Thr Arg Asn Lys Thr Ser Asp
1 5 10 15
Gly Tyr Thr Ile Ile Thr Gln Asn Asp Lys Gln Ile Ile Ser Tyr Gln
20 25 30
Ser Val Asp Ser Ser Ser Lys Asn Glu Asp Gly Phe Thr Ala Ser Ile
35 40 45
Asp Ala Arg Phe Ile Asp Asp Lys Tyr Ser Ser Glu Met Thr Thr Leu
50 55 60
Ile Asn Leu Thr Gly Phe Met Ser Ser Lys Lys Glu Asp Val Ile Lys
65 70 75 80
Lys Tyr Asn Leu His Asp Val Thr Asn Ser Thr Ala Ile Asn Phe Pro
85 90 95
Val Arg Tyr Ser Ile Ser Ile Leu Asn Glu Ser Ile Asn Glu Asn Val
100 105 110
Lys Ile Val Asp Ser Ile Pro Lys Asn Thr Ile Ser Gln Lys Thr Val
115 120 125
Ser Asn Thr Met Gly Tyr Lys Ile Gly Gly Ser Ile Glu Ile Glu Glu
130 135 140
Asn Lys Pro Lys Ala Ser Ile Glu Ser Glu Tyr Ala Glu Ser Ser Thr
145 150 155 160
Ile Glu Tyr Val Gln Pro Asp Phe Ser Thr Ile Gln Thr Asp His Ser
165 170 175
Thr Ser Lys Ala Ser Trp Asp Thr Lys Phe Thr Glu Thr Thr Arg Gly
180 185 190
Asn Tyr Asn Leu Lys Ser Asn Asn Pro Val Tyr Gly Asn Glu Met Phe
195 200 205
Met Tyr Gly Ala Tyr Thr Asn Val Pro Ala Thr Glu Asn Ile Ile Pro
210 215 220
Asp Tyr Gln Met Ser Lys Leu Ile Thr Gly Gly Leu Asn Pro Asn Met
225 230 235 240
Ser Val Val Leu Thr Ala Pro Asn Gly Thr Glu Glu Ser Ile Ile Lys
245 250 255
Val Lys Met Glu Arg Glu Arg Asn Cys Ala Tyr Leu Asn Trp Asn Gly
260 265 270
Ala Asn Trp Val Gly Gln Val Tyr Ser Arg Leu Ala Phe Asp Thr Pro
275 280 285
Asn Val Asp Ser His Ile Phe Thr Phe Lys Ile Asn Trp Leu Thr His
290 295 300
Lys Val Thr Ala Ile
305
<210> 2
<211> 336
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Lys Lys Lys Phe Ile Ser Leu Val Ile Val Ser Ser Leu Leu Asn
1 5 10 15
Gly Cys Leu Leu Ser Pro Thr Leu Val Tyr Ala Asn Asp Ile Gly Lys
20 25 30
Thr Thr Thr Ile Thr Arg Asn Lys Thr Ser Asp Gly Tyr Thr Ile Ile
35 40 45
Thr Gln Asn Asp Lys Gln Ile Ile Ser Tyr Gln Ser Val Asp Ser Ser
50 55 60
Ser Lys Asn Glu Asp Gly Phe Thr Ala Ser Ile Asp Ala Arg Phe Ile
65 70 75 80
Asp Asp Lys Tyr Ser Ser Glu Met Thr Thr Leu Ile Asn Leu Thr Gly
85 90 95
Phe Met Ser Ser Lys Lys Glu Asp Val Ile Lys Lys Tyr Asn Leu His
100 105 110
Asp Val Thr Asn Ser Thr Ala Ile Asn Phe Pro Val Arg Tyr Ser Ile
115 120 125
Ser Ile Leu Asn Glu Ser Ile Asn Glu Asn Val Lys Ile Val Asp Ser
130 135 140
Ile Pro Lys Asn Thr Ile Ser Gln Lys Thr Val Ser Asn Thr Met Gly
145 150 155 160
Tyr Lys Ile Gly Gly Ser Ile Glu Ile Glu Glu Asn Lys Pro Lys Ala
165 170 175
Ser Ile Glu Ser Glu Tyr Ala Glu Ser Ser Thr Ile Glu Tyr Val Gln
180 185 190
Pro Asp Phe Ser Thr Ile Gln Thr Asp His Ser Thr Ser Lys Ala Ser
195 200 205
Trp Asp Thr Lys Phe Thr Glu Thr Thr Arg Gly Asn Tyr Asn Leu Lys
210 215 220
Ser Asn Asn Pro Val Tyr Gly Asn Glu Met Phe Met Tyr Gly Ala Tyr
225 230 235 240
Thr Asn Val Pro Ala Thr Glu Asn Ile Ile Pro Asp Tyr Gln Met Ser
245 250 255
Lys Leu Ile Thr Gly Gly Leu Asn Pro Asn Met Ser Val Val Leu Thr
260 265 270
Ala Pro Asn Gly Thr Glu Glu Ser Ile Ile Lys Val Lys Met Glu Arg
275 280 285
Glu Arg Asn Cys Ala Tyr Leu Asn Trp Asn Gly Ala Asn Trp Val Gly
290 295 300
Gln Val Tyr Ser Arg Leu Ala Phe Asp Thr Pro Asn Val Asp Ser His
305 310 315 320
Ile Phe Thr Phe Lys Ile Asn Trp Leu Thr His Lys Val Thr Ala Ile
325 330 335
<210> 3
<211> 309
<212> PRT
<213> 产气荚膜梭菌（Clostridium Perfringens）
<400> 3
Asn Asp Ile Gly Lys Thr Thr Thr Ile Thr Arg Asn Lys Thr Ser Asp
1 5 10 15
Gly Tyr Thr Ile Ile Thr Gln Asn Asp Lys Gln Ile Ile Ser Tyr Gln
20 25 30
Ser Val Asp Ser Ser Ser Lys Asn Glu Asp Gly Phe Thr Ala Ser Ile
35 40 45
Asp Ala Arg Phe Ile Asp Asp Lys Tyr Ser Ser Glu Met Thr Thr Leu
50 55 60
Ile Asn Leu Thr Gly Phe Met Ser Ser Lys Lys Glu Asp Val Ile Lys
65 70 75 80
Lys Tyr Asn Leu His Asp Val Thr Asn Ser Thr Ala Ile Asn Phe Pro
85 90 95
Val Arg Tyr Ser Ile Ser Ile Leu Asn Glu Ser Ile Asn Glu Asn Val
100 105 110
Lys Ile Val Asp Ser Ile Pro Lys Asn Thr Ile Ser Gln Lys Thr Val
115 120 125
Ser Asn Thr Met Gly Tyr Lys Ile Gly Gly Ser Ile Glu Ile Glu Glu
130 135 140
Asn Lys Pro Lys Ala Ser Ile Glu Ser Glu Tyr Ala Glu Ser Ser Thr
145 150 155 160
Ile Glu Tyr Val Gln Pro Asp Phe Ser Thr Ile Gln Thr Asp His Ser
165 170 175
Thr Ser Lys Ala Ser Trp Asp Thr Lys Phe Thr Glu Thr Thr Arg Gly
180 185 190
Asn Tyr Asn Leu Lys Ser Asn Asn Pro Val Tyr Gly Asn Glu Met Phe
195 200 205
Met Tyr Gly Arg Tyr Thr Asn Val Pro Ala Thr Glu Asn Ile Ile Pro
210 215 220
Asp Tyr Gln Met Ser Lys Leu Ile Thr Gly Gly Leu Asn Pro Asn Met
225 230 235 240
Ser Val Val Leu Thr Ala Pro Asn Gly Thr Glu Glu Ser Ile Ile Lys
245 250 255
Val Lys Met Glu Arg Glu Arg Asn Cys Tyr Tyr Leu Asn Trp Asn Gly
260 265 270
Ala Asn Trp Val Gly Gln Val Tyr Ser Arg Leu Ala Phe Asp Thr Pro
275 280 285
Asn Val Asp Ser His Ile Phe Thr Phe Lys Ile Asn Trp Leu Thr His
290 295 300
Lys Val Thr Ala Ile
305
<210> 4
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aatgatatag gtaaaactac tactataact agaaataaga catcagatgg ctatactata 60
attacacaaa atgataaaca gataatatca tatcaatctg ttgactcttc aagtaaaaat 120
gaagatggtt ttactgcatc tatagatgct agatttatcg atgataaata ttcatctgaa 180
atgacaactt taataaactt aactggattt atgtcttcaa aaaaagaaga tgttataaaa 240
aaatacaatt tgcatgatgt tactaattct actgcaatta attttccggt tagatactcg 300
atttctattt taaatgaaag tattaatgaa aatgtaaaaa tagttgatag tattcctaaa 360
aatacaattt ctcaaaaaac tgtatccaat acaatgggat acaaaatagg aggttcaatt 420
gaaatagaag aaaataaacc taaagcttca attgaaagcg aatatgctga atcatctaca 480
atagaatatg tccaacctga tttttctact atacagacag atcattcaac ctctaaagct 540
tcatgggata caaaatttac agaaactact cgtggtaatt ataatttaaa atcaaacaac 600
cctgtatatg gaaatgaaat gtttatgtac ggagcatata ctaatgttcc tgcaactgaa 660
aatataattc cagattatca aatgtcaaaa ttaataacag gtggtttaaa ccctaatatg 720
tctgtagttc taactgctcc taatggtact gaagaatcta taataaaagt taaaatggag 780
cgtgaaagaa actgtgctta tcttaattgg aatggtgcta actgggtagg acaagtctat 840
tccaggctag cttttgatac cccaaatgta gatagtcata tatttacatt caaaataaat 900
tggcttactc acaaagtaac agctatttag 930
<210> 5
<211> 1011
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgaagaaaa aatttatttc attagttata gttagttcac ttttaaacgg atgcctatta 60
tcaccaactt tagtgtatgc aaatgatata ggtaaaacta ctactataac tagaaataag 120
acatcagatg gctatactat aattacacaa aatgataaac agataatatc atatcaatct 180
gttgactctt caagtaaaaa tgaagatggt tttactgcat ctatagatgc tagatttatc 240
gatgataaat attcatctga aatgacaact ttaataaact taactggatt tatgtcttca 300
aaaaaagaag atgttataaa aaaatacaat ttgcatgatg ttactaattc tactgcaatt 360
aattttccgg ttagatactc gatttctatt ttaaatgaaa gtattaatga aaatgtaaaa 420
atagttgata gtattcctaa aaatacaatt tctcaaaaaa ctgtatccaa tacaatggga 480
tacaaaatag gaggttcaat tgaaatagaa gaaaataaac ctaaagcttc aattgaaagc 540
gaatatgctg aatcatctac aatagaatat gtccaacctg atttttctac tatacagaca 600
gatcattcaa cctctaaagc ttcatgggat acaaaattta cagaaactac tcgtggtaat 660
tataatttaa aatcaaacaa ccctgtatat ggaaatgaaa tgtttatgta cggagcatat 720
actaatgttc ctgcaactga aaatataatt ccagattatc aaatgtcaaa attaataaca 780
ggtggtttaa accctaatat gtctgtagtt ctaactgctc ctaatggtac tgaagaatct 840
ataataaaag ttaaaatgga gcgtgaaaga aactgtgctt atcttaattg gaatggtgct 900
aactgggtag gacaagtcta ttccaggcta gcttttgata ccccaaatgt agatagtcat 960
atatttacat tcaaaataaa ttggcttact cacaaagtaa cagctattta g 1011
<210> 6
<211> 1011
<212> DNA
<213> 产气荚膜梭菌（Clostridium Perfringens）
<400> 6
atgaagaaaa aatttatttc attagttata gttagttcac ttttaaacgg atgcctatta 60
tcaccaactt tagtgtatgc aaatgatata ggtaaaacta ctactataac tagaaataag 120
acatcagatg gctatactat aattacacaa aatgataaac agataatatc atatcaatct 180
gttgactctt caagtaaaaa tgaagatggt tttactgcat ctatagatgc tagatttatc 240
gatgataaat attcatctga aatgacaact ttaataaact taactggatt tatgtcttca 300
aaaaaagaag atgttataaa aaaatacaat ttgcatgatg ttactaattc tactgcaatt 360
aattttccgg ttagatactc gatttctatt ttaaatgaaa gtattaatga aaatgtaaaa 420
atagttgata gtattcctaa aaatacaatt tctcaaaaaa ctgtatccaa tacaatggga 480
tacaaaatag gaggttcaat tgaaatagaa gaaaataaac ctaaagcttc aattgaaagc 540
gaatatgctg aatcatctac aatagaatat gtccaacctg atttttctac tatacagaca 600
gatcattcaa cctctaaagc ttcatgggat acaaaattta cagaaactac tcgtggtaat 660
tataatttaa aatcaaacaa ccctgtatat ggaaatgaaa tgtttatgta cggaagatat 720
actaatgttc ctgcaactga aaatataatt ccagattatc aaatgtcaaa attaataaca 780
ggtggtttaa accctaatat gtctgtagtt ctaactgctc ctaatggtac tgaagaatct 840
ataataaaag ttaaaatgga gcgtgaaaga aactgttatt atcttaattg gaatggtgct 900
aactgggtag gacaagtcta ttccaggcta gcttttgata ccccaaatgt agatagtcat 960
atatttacat tcaaaataaa ttggcttact cacaaagtaa cagctattta g 1011
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aactatgtca aaaaaatctt ttgct 25
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ttggcgcgcc ttatatatta ttaattaata tc 32

Claims (23)

1.一种产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白，其特征在于，所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白，其特征在于，所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白由革兰氏阳性菌表达系统表达。
3.核酸，其特征在于，编码权利要求1或2所述的产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的区域。
4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
5.权利要求1或2所述的产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的制备方法，其特征在于，包括在革兰氏阳性菌表达系统中表达编码所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的基因。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述革兰氏阳性菌表达系统包括（c1）~（c3）中的任意一种；
（c1）葡萄球菌表达系统；
（c2）枯草芽孢杆菌表达系统；
（c3）谷氨酸棒状杆菌表达系统。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括将编码所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的基因克隆至载体，得到重组载体；然后将重组载体转化至大肠杆菌，筛选后将重组载体阳性克隆经金黄色葡萄球菌RN4220转化，将重组载体转化进入表皮葡萄球菌中，然后经诱导表达得到所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述载体包括pYL质粒载体，所述pYL质粒载体是将Xyl/tet片段、ori区域和Erm抗性基因插入pRB373质粒的多克隆位点及抗性区域中，得到的重组pYL质粒载体。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述诱导表达的条件为：使用终浓度为300~700ng/mL的脱水四环素诱导剂在36~38℃诱导16~28小时。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述诱导表达的条件为：使用终浓度为500ng/mL的脱水四环素诱导剂在37℃诱导24小时。
11.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，表皮葡萄球菌种子液的接种量为0.1~5%（v/v）。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，表皮葡萄球菌种子液的接种量为1%（v/v）。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，表皮葡萄球菌补料碳源包括葡萄糖和/或甘油。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，表皮葡萄球菌补料碳源为甘油。
15.生物材料，所述生物材料为表达盒、载体、重组微生物或细胞系；所述生物材料表达权利要求1或2所述的产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白，和/或含有权利要求3或4所述的核酸。
16.根据权利要求15所述的生物材料，其特征在于，所述载体包括含有权利要求3或4所述的核酸的pYL质粒载体，所述pYL质粒载体是将Xyl/tet片段、ori区域和Erm抗性基因插入pRB373质粒的多克隆位点及抗性区域中，得到的重组质粒pYL。
17.权利要求1或2所述的产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白，权利要求3或4所述的核酸，权利要求5-14任一项所述的制备方法，或权利要求15或16所述的生物材料在如下（x1）~（x3）中至少一种的应用；
（x1）制备C型产气荚膜梭菌基因工程疫苗；
（x2）制备产气荚膜梭菌病诊断抗原；
（x3）制备单克隆抗体。
18.疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求1或2所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白，权利要求3或4所述核酸或权利要求15或16所述生物材料；以及任选的辅料。
19.根据权利要求18所述的疫苗，其特征在于，所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的浓度为50~100μg/mL。
20.根据权利要求19所述的疫苗，其特征在于，所述产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的浓度为50μg/mL。
21.根据权利要求18所述的疫苗，其特征在于，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种。
22.根据权利要求21所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、MF59佐剂或Montanide ISA系列佐剂。
23.根据权利要求22所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗佐剂为Montanide ISA系列佐剂。
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