CN109745554B - 一种无毒性的产气荚膜梭菌重组ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种无毒性的产气荚膜梭菌重组ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗及其生产方法。该疫苗含有的无毒性产气荚膜梭菌ETX突变体和CPA的C末端融合蛋白rETX_m3CPA_C是通过将无毒性的ETX突变体ETX_m3和CPA的C末端(CPA_C)进行串联，并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现可溶性表达，既可最大限度地保留天然毒素蛋白的空间构象，从而保持其免疫原性；又避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了疫苗的制备时间和生产成本。在rETX_m3CPA_C的C端含有6个组氨酸(6*His)标签，便于蛋白的纯化；获得的毒素融合蛋白在小鼠体内完全无毒，且在家兔模型中呈现良好的安全性、免疫原性和免疫保护性。疫苗还具有制备工艺简单，疫苗效力优良、同时预防A和D型产气荚膜梭菌病。

Description

一种无毒性的产气荚膜梭菌重组ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗 及其生产方法

技术领域

本发明涉及一种无毒性的产气荚膜梭菌重组ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。

背景技术

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringeris)是一种重要的人畜共患菌，能引起创伤性气性坏疽和人类食物中毒以及羊猝疽、羔羊痢疾、牛羊坏死性肠炎、牛羊肠毒血症，不仅威胁着人类的健康，而且对畜牧业造成了巨大的经济损失。由于产气荚膜梭菌病具有发病急、病程短且死亡率极高的特点，一旦发病，往往还来不及治疗就因外毒素中毒而发生猝死，因此免疫接种是防控该病的有效方法(陆承平.兽医微生物学[M].北京:中国农业出版社，2013:194-196.)。目前，使用的商品化梭菌疫苗主要是灭活疫苗，该类疫苗在预防动物产气荚膜梭菌方面虽然取得了一定的效果，但这些疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起动物局部炎症及毒性反应等；其在制备过程中涉及外毒素的灭活，存在毒素外泄或灭活不彻底等生物安全隐患；此外，培养上清中的各种微小毒素以及细菌的代谢产物往往成为免疫动物的致敏原，接种动物易产生不良反应，导致免疫效果下降甚至免疫失败。因此，开发安全性好、有效抗原含量高、免疫原性强的产气荚膜梭菌毒素基因工程疫苗，是未来的发展方向。

产气荚膜梭菌主要的致病因素是其分泌的外毒素。但目前为止，已发现的外毒素至少有20种，但以α(CPA)、β(CPB)、ε(ETX)和ι(CPI)这4种外毒素最为主要，并可据此将该菌分为A，B，C，D，E 5个毒素型(Revitt-Mills,S；Rood,J；Adams,V.Clostridium perfringensextracellular toxins and enzymes:20and counting.Microbiol.Aust.2015,36,114–117.)。

CPA是由产气荚膜梭菌染色体基因plc编码，plc存在于五个毒素型的菌株，但在A型毒株中表达水平最高。成熟的CPA由370个氨基酸构成，分为N-末端(1-246，CPA_N)和C-末端(247-370，CPA_C)两个结构域。其中，CPA_N是CPA发挥酶活性的主要区域，而CPA_C是毒素与细胞结合的主要区域。研究表明，重组CPA仍存在一定的毒力，而通过甲醛灭活后的天然毒素抗原性会明显降低(Byrne,M.P；Smith,L.A.Development of vaccines for preventionof botulism.Biochimie 2000,82,955-966)。为此，研制无毒力的重组CPA具有重要的意义。已有的研究表明，CPA的无毒区域CPA_C能够对天然CPA起到良好的免疫保护作用，但由于CPA_C蛋白分子量较小，研究者通常选择将CPA_C与GST等大分子量标签蛋白融合表达，从而引入了过多无关的抗原成分。

ETX主要是由B型和D型产气荚膜梭菌产生，是该类菌分泌的毒力最强的外毒素(LiJ H,Adams V,Bannam T L,Miyamoto K,Garcia J P,Uzal F A,Rood J L,McClanea BA.Toxin plasmids of clostridium perfringens,Microbiology and MolecularBiology Reviews,2013,77(2):208-233.)。本课题组前期申请的专利“一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗及其生产方法”(专利申请号：201710981955.8)获得了含有3个氨基酸突变(第30位酪氨酸突变为丙氨酸，第106位组氨酸突变为脯氨酸，以及第196位酪氨酸突变为丙氨酸)的、无毒力的、免疫原性优良的重组ETX突变体，rETX_{Y30A-H106P-Y196A}(rETX_m3)。

发明内容

本发明目的在于采用经过基因工程技术制备无毒性的产气荚膜梭菌重组ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗，要求该疫苗一方面最大限度地保留ETX的完整性和空间构象，从而保持其免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患；另一方面选用抗原性优良的CPA无毒区域CPA_C，避免了CPA的生物安全隐患。同时，该疫苗还具有制备工艺简单、免疫剂量低、免疫效力好等优点，用于预防由A型和D型产气荚膜梭菌引起的疾病。

本发明技术方案

1.一种无毒性的产气荚膜梭菌ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠埃希氏菌表达的产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)突变体(rETX_m3)和产气荚膜梭菌α毒素(CPA)C末端(CPA_C)的毒素融合蛋白；制苗用菌种为重组表达毒素融合蛋白rETX_m3CPA_C的大肠埃希氏菌，被命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL13株，该菌株已于2018年01月18日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.15237；

所述表达的rETX_m3CPA_C与野生型ETX成熟毒素相比，包含多个氨基酸的突变；与野生型CPA成熟毒素相比，只含有毒素的无毒区域C末端；在毒素融合蛋白C端含有便于蛋白的纯化的标签。

2.本发明所述疫苗，其特征在于rETX_m3CPA_C与野生型产气荚膜梭菌ETX成熟毒素相比，含有3个氨基酸突变，分别为第30位酪氨酸突变为丙氨酸，第106位组氨酸突变为脯氨酸，以及第196位酪氨酸突变为丙氨酸；与野生型CPA成熟毒素相比，只含有其无毒区域C末端(第247～370位氨基酸)。

3.本发明所述疫苗，其特征在于rETX_m3CPA_C的编码基因序列经过密码子优化，更易于在大肠杆菌中实现高表达。

4.本发明所述疫苗，其特征在于rETX_m3CPA_C没有毒力，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。

5.本发明所述疫苗，其特征在于rETX_m3CPA_C在大肠杆菌BL21(DE3)中可以实现可溶性表达，既可最大限度地保留天然毒素蛋白的空间构象，从而保持其免疫原性；又避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了疫苗的制备时间和生产成本。

6.本发明所述疫苗，其特征在于所述氨基酸标签，为在rETX_m3CPA_C的C端含有6个组氨酸(6*His)标签，便于蛋白的纯化。

7.本发明所述疫苗，其特征在于该疫苗是用所述表达rETX_m3CPA_C的大肠埃希氏菌BLC13株作为疫苗生产菌株，经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后，加双相油佐剂混合制成。

本发明的有益效果

本发明涉及一种无毒性的产气荚膜梭菌重组ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗及其生产方法。该疫苗含有的ETX突变体和CPA_C的毒素融合蛋白，rETX_m3CPA_C，是通过将无毒性ETX突变体ETX_m3和CPA的C末端(CPA_C)进行串联，并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现可溶性表达，既可最大限度地保留天然毒素蛋白的空间构象，从而保持其免疫原性；又避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了疫苗的制备时间和生产成本。rETX_m3CPA_C的C端含有6个组氨酸(6*His)标签，便于蛋白的纯化；获得的毒素融合蛋白在小鼠体内完全无毒，且在家兔模型中呈现良好的安全性、免疫原性和免疫保护性。此外，本发明进一步公开了含有所述毒素融合蛋白编码基因的重组表达载体和宿主细胞。以上毒素融合蛋白或其编码基因能够应用于制备预防A型和D型产气荚膜梭菌毒素的亚单位疫苗。本发明所述疫苗与我国目前商品化的梭菌类灭活疫苗相比，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险，生产方法稳定性好、耗时短，而且所制备的疫苗一免后的血清中和效价即可达到目前商品化疫苗标准。此外，凭借疫苗一种毒素融合蛋白能够同时预防A和D型产气荚膜梭菌病，不仅能够降低生产成本，而且便与和其它抗原共同制备联苗，极大方便了联苗的开发。

鉴于我国现有商品化梭菌毒素疫苗须采用甲醛灭活脱毒，存在生物安全隐患，也影响了疫苗在田间使用的安全性；同时现行商品化疫苗在生产过程中，还存在产毒不稳定，导致疫苗效力不稳定的问题。因此，本申请生产的疫苗是我国现行梭菌类灭活疫苗升级换代的理想候选疫苗，也为梭菌类联苗的研制提供了重要的候选抗原。

本发明涉及生物材料资源信息

本发明涉及的微生物为：表达含有3个氨基酸突变的ETX突变体和CPA的C末端的毒素融合蛋白，rETX_m3CPA_C，且毒素融合蛋白C端含有6个组氨酸(6*His)标签的大肠埃希氏菌BL13株。该菌株已于2018年01月18日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.15237。

附图说明

图1：原核表达载体pET30a-GETX_m3CPA_C的酶切鉴定，图中：1.DL5000DNA相对分子质量标准；2.pET30a-GETX_m3CPA_C的NdeⅠ和Hind III双酶切鉴定

图2：rETX_m3CPA_C表达的SDS-PAGE鉴定结果，图中：M₁:Protein marker；PC₁:BSA(1μg)；PC₂:BSA(2μg)；pET:空载体细胞裂解物；1:15℃、16h诱导的细胞裂解物；2:37℃、4h诱导的细胞裂解物；pET1:空载体细胞裂解上清；pET2:空载体细胞裂解沉淀；3:15℃、16h诱导的细胞裂解上清；4:15℃、16h诱导的细胞裂解沉淀；5:37℃、4h诱导的细胞裂解上清；6:37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀。

图3：rETX_m3CPA_C表达的Western blot(采用抗His抗体)鉴定结果图中：M2:Westernblotmarker；pET:空载体细胞裂解物；1:15℃、16h诱导的细胞裂解物；2:37℃、4h诱导的细胞裂解物；3:15℃、16h诱导的细胞裂解上清；4:15℃、16h诱导的细胞裂解沉淀；5:37℃、4h诱导的细胞裂解上清；6:37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀。

图4：rETX_m3CPA_C的纯化图中：M:蛋白marker；1：37℃、4h诱导的细胞裂解上清；2：流穿液；3 20mM Imidazole的洗脱液；4:50mM Imidazole的洗脱液；5:500mM Imidazole的洗脱液；6：Ni-IDA介质。

本发明具体实施方式

1.无毒性的产气荚膜梭菌ETX和CPA毒素融合蛋白表达载体的构建

(1)基因合成：根据产气荚膜梭菌ETX和CPA的天然编码基因序列，经密码子优化后，将含有多个氨基酸突变的ETX_m3以及只含有CPA的无毒区域C末端(CPA_C)进行串联，从而获得了对于动物体无毒的毒素融合蛋白。同时，在毒素融合蛋白C端添加纯化所用氨基酸标签。用化学合成的方法，合成了该段基因序列。

(2)融合表达载体的构建

以人工合成的基因为模板，采用设计的引物对进行PCR扩增到的目的DNA条带，经回收后，与原核表达载体同时采用双酶切消化后进行连接，得到插目的基因的原核表达载体。将连接好的质粒转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒备用。

2.表达毒素融合蛋白的基因工程菌株的构建

将提取得到的质粒，转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞内，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，经PCR鉴定，含有目的DNA片段后，获得阳性菌株，并加入等体积的50％甘油LB，-70℃冻存。

3.毒素融合蛋白疫苗的制备

(1)菌种：制苗用菌种为表达毒素融合蛋白的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL13株。

(2)一级种子繁殖及鉴定：将冻干菌种用少量LB液体培养基溶解，划线接种于含卡那霉素的LB固体平板，置37℃培养12～16小时，选取符合标准的单个菌落，接种含卡那霉素的LB液体培养基，置37℃培养8～12小时，与50％甘油等比例混合后分装，置-15℃以下保存，经纯粹检验合格后，作为制苗用一级种子。

(3)二级种子繁殖及鉴定：取一级种子，按1％的量接种含卡那霉素的LB液体培养基，置37℃振荡培养8～12小时，即为二级种子。

(4)制苗用抗原制备：取合格的二级种子，按培养基总量的2％接种含卡那霉素的LB液体培养基，培养温度37℃。当培养物OD₆₀₀值为1.5时，加入终浓度为1.0mM的IPTG诱导培养4h。

(5)破菌：以5000r/min离心5min收集菌体，按每克菌体湿重加10ml裂解液(pH值7.2 0.02mol/L Tris缓冲液，0.3mol/L NaCl)的比例重悬菌体，4℃条件下用低温高压均质机以800bar的压力破碎菌体3次。裂解液经4℃10000r/min离心30min，收集上清液。

(6)纯化：按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒(南京金斯瑞)的使用说明书，对菌体裂解上清中呈可溶性表达的目的蛋白进行纯化，经0.22μm孔径滤膜过滤，-80℃保存备。

(7)蛋白含量检测：用BCA法检测蛋白含量(PierceTM BCA Protein Assay Kit，TG268883)。应不低于0.5mg/ml。经SDS-PAGE检测并对条带进行灰度扫描，蛋白纯度应不低于85％。

(8)无菌检验：按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中国兽药典》)附录进行。应无菌生长。

(7)疫苗配制：将双相油佐剂(如206佐剂)导入油相罐内，以至少121℃高压灭菌30min，冷却至室温备用。根据蛋白含量测定结果，用PBS(pH值7.2 0.01mol/L)将检验合格的纯化蛋白适当稀释后混匀。将水相加入乳化罐内，以80～100r/min搅拌，同时按1:1(V/V)的比例，缓慢加入油相，加完后搅拌20～30min。乳化后取样进行检验，合格后分装。

4.毒素融合蛋白疫苗的检验

(1)性状

外观乳白色乳剂。

剂型呈水包油包水型(W/O/W)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。

稳定性吸取疫苗10mL加入离心管中，以3000r/min离心15min，应不破乳，并且管底析出的水相应不多于0.5mL。

黏度按《中国兽药典》(附录进行测定，应符合规定。

(2)装量检查按《中国兽药典》附录进行检查，应符合规定。

(3)无菌检验按《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

(4)安全检验用体重1.5～2.0kg健康家兔4只，各肌肉或皮下注射疫苗4.0mL，观察10日。应全部健活。

(5)效力检验

血清中和法

用体重1.5～2.0kg健康家兔4只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗2.0mL。接种后21日，采血，分离血清备用。分别取每只家兔血清0.4mL与0.8mL D型(含12个及以上小鼠MLD)的产气荚膜梭菌毒素，取每只家兔的血清0.4mL与0.8mL A型(含4个及以上小鼠MLD)，混合后置37℃作用40min，然后静脉注射16～18g小鼠2只，0.3mL/只。同时各用同批小鼠2只，分别注射1MLD与毒素血清混合物相同的毒素作对照。观察1日，判定结果。

对照鼠全部死亡，血清中和效价对D型产气荚膜梭菌毒素达到3及以上(0.1mL免疫动物血清中和3及以上MLD毒素)，对A型产气荚膜梭菌毒素达到1及以上(0.1mL免疫动物血清中和1及以上MLD毒素)，即判为合格。

免疫攻毒法用体重1.5～2.0kg健康家兔6只，取其4只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗2.0mL，剩余2只作为对照。接种后21日，取4只免疫组家兔和2只对照组家兔，分别静脉注射1MLD的A和D型产气荚膜梭菌毒素，观察5日。

对照兔全部死亡，免疫动物至少保护3只，即判为合格。

实施例

以下实施例为更好说明本发明的技术方案，但不对本发明技术方案构成限制。

实施例1

——大肠埃希氏菌BL13株的构建、表达及鉴定

1.基因合成

本申请根据产气荚膜梭菌ETX和CPA的天然基因序列，经密码子优化后，将含有3个氨基酸突变(Y30A，H106P和Y196A)的ETX和CPA的无毒区域C末端(CPA_C)进行串联表达，从而获得了对于动物体无毒的毒素融合蛋白。同时，在毒素融合蛋白C端添加6×His标签。用化学合成的方法，合成了该段基因序列GETX_m3CPA_C，共包含1326个核苷酸。具体的核酸序列如SEQ IDNo.1所示，氨基酸序列见SEQ ID No.2所示。

序列1(SEQ ID No.1)：

序列2(SEQ ID No.2)：

2.融合表达载体的构建

以人工合成的GETX_m3CPA_C为模板，采用引物对1F/1R(序列3/序列4)进行PCR扩增，其中：

上游引物1F序列为：5’-ggcatatgaa agaaatctcc aac-3’23(序列3)，其5’端引入限制性内切酶NdeⅠ位点及保护性碱基；

下游引物1R序列为：5’-ggaagctttt agtggtgatg at-3’22(序列4)，其5’端引入限制性内切酶HindIII位点及保护性碱基。

PCR体系为：5×

Buffer(Mg2+plus)10μL，dNTPs 4μL，上、下游引物各1μL，

HS聚合酶1μL，DNA模板2μL，补充ddH₂O至50μL体系。PCR反应条件为：98℃预变性1min；98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸90s，共33个循环；最后72℃延伸10min。

扩增得到的目的DNA条带，经回收后，采用NdeⅠ/HindIII双酶切消化，与经过相同酶切消化的pET30a载体连接，将连接好的质粒转化Top10感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒进行PCR和双酶切鉴定，鉴定结果为阳性的质粒送中美泰和公司测序，将双酶切结果和测序结果正确的质粒命名为pET30a-GETX_m3CPA_C。如图1所示，酶切后出现大小约5kb的载体DNA片段，以及大小约1300bp的目的基因片段。将连接好的质粒转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒备用。

3.表达rETX_m3CPA_C的基因工程菌株的构建

将提取得到的质粒，转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞内，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，经PCR鉴定，含有目的DNA片段后，命名为大肠埃希氏菌BL13株，并加入等体积的50％甘油LB，-70℃冻存。

实施例2

——rETX_m3CPA_C的表达与鉴定

1.rETX_m3CPA_C的表达将表达rETX_m3CPA_C的基因工程菌大肠埃希氏菌(E.coli)BL13株接种于3mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养4h后，加入终浓度为0.5M的IPTG溶液诱导培养4h。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体加10mL裂解液[0.02mol/L Tris缓冲液(pH值7.2)，0.3mol/L NaCl]的比例重悬菌体，在冰水浴中超声裂解菌体30min，破碎条件为：工作9s，间歇9s，超声功率为400W。将裂解后的菌液于4℃，以12000r/min离心30min，弃去沉淀，收集上清液。取30μL上清加入10μL的4×SDS-PAGE上样缓冲液，70℃作用10min，进行12％SDS-PAGE电泳，结果见图2。从图2可以看出，在15℃和37℃的条件下，rETX_m3CPA_C均有表达，且可溶性表达的比例较高。综合表达总量和诱导时间，确定rETX_m3CPA_C的最适诱导表达条件为37℃，诱导表达4h。灰度扫描的结果表明，该条件下表达的rETX_m3CPA_C可溶性比例达到30％左右。

2.rETX_m3CPA_C的Western blot鉴定采用上述步骤中不同诱导条件下的rETX_m3CPA_C，采用抗His抗体，对其进行Western blot鉴定，结果见图3。从图3可知，Western blot的鉴定结果与SDS-PAGE凝胶电泳结果相一致，由于细胞裂解上清中呈可溶性表达的目的蛋白，空间结构与野生型毒素最为接近。综合SDS-PAGE和Western blot鉴定结果，进一步确定目的蛋白的最适诱导表达条件为37℃，诱导表达4h。

实施例3

——rETX_m3CPA_C的纯化

将大肠埃希氏菌(E.coli)BL13株接种于1L含有卡那霉素的LB液体培养基中发酵培养，37℃振荡培养OD₆₀₀为0.8时，加入终浓度为0.5M的IPTG溶液诱导培养4h。菌液培养完成后离心收集菌体，以5000r/min离心5min收集菌体，按每克菌体湿重加10ml裂解液(pH值7.2 0.02mol/LTris缓冲液，0.3mol/L NaCl)的比例重悬菌体，4℃条件下用低温高压均质机以800bar的压力破碎菌体3次。裂解液经4℃10000r/min离心30min，收集上清液，按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒的使用说明书，对菌体裂解上清中呈可溶性表达rETX_m3CPA_C进行纯化，经0.22μm孔径滤膜过滤，即为初步纯化的rETX_m3CPA_C。

实施例4

——rETX_m3CPA_C对小鼠毒力的测定

根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)三部(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中国兽药典》)中的规定，选择尾静脉注射的方法来检测毒素融合蛋白对小鼠的毒力。同时，设置蛋白洗脱液、胃肝肉酶消化汤两个阴性对照和无突变的重组ETX(rETX)作为阳性对照。结果显示，当接种剂量为100μg时，所有小鼠均健活且无不良反应，而rETX在接种0.005μg时即可导致小鼠5/5死亡。该结果表明，rETX_m3CPA_C在小鼠体内是无毒的，被确定为无毒力的毒素融合蛋白。

表1rETX_m3CPA_C对小鼠的毒力

实施例5

——rETX_m3CPA_C的免疫原性试验

按照《中国兽药典》规定的方法进行。

(1)血清中和法为：用体重1.5～2.0kg健康家兔4只，各颈部皮下注射疫苗2.0mL(毒素融合蛋白的浓度为100μg/mL)。接种后21d，采血，分离血清后，取每只家兔血清0.4mL分别与D型产气荚膜梭菌毒素(含12及以上个小鼠MLD)和A型产气荚膜梭菌毒素(含4及以上个小鼠MLD)，混合后置37℃作用40min，然后静脉注射16～18g小鼠2只，0.3mL/只。同时各用同批小鼠2只，分别注射1MLD与毒素血清混合物相同的毒素作对照，观察1日，判定结果。

对照鼠全部死亡，血清中和效价对D和A型产气荚膜梭菌毒素分别达到3(0.1mL免疫动物血清中和3MLD毒素)和1(0.1mL免疫动物血清中和1MLD毒素)，即判为合格。

(2)免疫攻毒法：用体重1.5～2.0kg健康家兔6只，其中4只家兔颈部皮下注射疫苗2.0mL，接种后21日，分别静脉注射1MLD的D型和A型产气荚膜梭菌，观察3～5日。对照组家兔应该全部死亡，免疫组家兔至少保护3只。

经测定，一次免疫后，家兔血清中的毒素中和抗体效价对D型和A型产气荚膜梭菌毒素分别达到25～50MLD(0.1mL免疫动物血清中和25～50MLD毒素)和1～2MLD(0.1mL免疫动物血清中和1～2MLD毒素)。攻毒结果显示，对照组家兔全部死亡，免疫组家兔100％保护。《中国兽药典》规定，梭菌类灭活苗家兔血清中的毒素抗体效价对D型和A型产气荚膜梭菌产气荚膜梭菌分别达到3(0.1mL免疫动物血清中和3MLD毒素)和1(0.1mL免疫动物血清中和1MLD毒素)，即判为合格。因此，本申请生产的疫苗对家兔一次免疫后血清中和效价均超过了现行《中国兽药典》的规定的标准，证明该疫苗具有良好的免疫原性。

序列表

<110> 中国兽医药品监察所

<120> 一种无毒性的产气荚膜梭菌重组ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗及其生产方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1326

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

catatgaaag aaatctccaa caccgtctct aatgaaatgt ccaaaaaagc atcctacgat 60

aatgtcgata ccctgattga aaaaggtcgc tacaacacga aatacaacta cctgaaacgt 120

atggaaaaat atgccccgaa cgcgatggcc tattttgata aagttaccat taacccgcag 180

ggtaatgact tctacatcaa caatccgaaa gtggaactgg atggtgaacc gtcaatgaac 240

tatctggaag acgtgtacgt tggcaaagca ctgctgacga atgataccca gcaagaacag 300

aaactgaaaa gccaatcttt tacctgcaaa aacacggaca ccgtcaccgc taccaccacc 360

ccgaccgtgg gtacctcaat tcaagcaacg gctaaattta ccgttccgtt caatgaaacc 420

ggcgtctcgc tgacgaccag ttattccttc gcgaacacca atacgaacac caatagtaaa 480

gaaattaccc ataacgtgcc gtcccaggat atcctggttc cggcgaatac gaccgtcgaa 540

gtgattgcct atctgaagaa agtgaacgtc aagggtaatg tcaaactggt gggccaagtt 600

tcaggttcgg aatggggcga aatcccgtcc gctctggcgt ttccgcgtga tggctacaaa 660

ttcagcctgt ctgacacggt taacaaaagc gatctgaatg aagacggtac catcaacatc 720

aacggcaagg gtaactactc tgccgttatg ggcgatgaac tgattgtgaa agttcgcaac 780

ctgaatacca acaatgtgca ggaatacgtc atcccggtgg ataagaaaga aaaaagcaat 840

gactccaaca tcgtgaaata ccgcagcctg tccatcaaag caccgggcat caaaggtggc 900

ggtggttctg gtggtggcgg ttccggcggt ggtggcagcg ttggtaagaa cgtaaaggaa 960

ctggttgcgt acatttctac ttctggtgag aaagatgctg gcaccgatga ttacatgtat 1020

ttcggtatca agactaaaga tggtaagact caggaatggg aaatggacaa tccgggtaac 1080

gactttatga ctggtagcaa ggatacttac accttcaaac tgaaggacga gaacctgaag 1140

atcgacgaca tccagaatat gtggattcgt aagcgcaaat acaccgcatt cccggatgca 1200

tacaagccgg agaacatcaa actgattgcg aacggtaaag tggtagtaga caaggacatt 1260

aacgaatgga tctccggtaa ctctacctac aatatcaaac atcatcacca tcaccactaa 1320

aagctt 1326

<210> 5

<211> 439

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

His Met Lys Glu Ile Ser Asn Thr Val Ser Asn Glu Met Ser Lys Lys

1 5 10 15

Ala Ser Tyr Asp Asn Val Asp Thr Leu Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asn

20 25 30

Thr Lys Tyr Asn Tyr Leu Lys Arg Met Glu Lys Tyr Ala Pro Asn Ala

35 40 45

Met Ala Tyr Phe Asp Lys Val Thr Ile Asn Pro Gln Gly Asn Asp Phe

50 55 60

Tyr Ile Asn Asn Pro Lys Val Glu Leu Asp Gly Glu Pro Ser Met Asn

65 70 75 80

Tyr Leu Glu Asp Val Tyr Val Gly Lys Ala Leu Leu Thr Asn Asp Thr

85 90 95

Gln Gln Glu Gln Lys Leu Lys Ser Gln Ser Phe Thr Cys Lys Asn Thr

100 105 110

Asp Thr Val Thr Ala Thr Thr Thr Pro Thr Val Gly Thr Ser Ile Gln

115 120 125

Ala Thr Ala Lys Phe Thr Val Pro Phe Asn Glu Thr Gly Val Ser Leu

130 135 140

Thr Thr Ser Tyr Ser Phe Ala Asn Thr Asn Thr Asn Thr Asn Ser Lys

145 150 155 160

Glu Ile Thr His Asn Val Pro Ser Gln Asp Ile Leu Val Pro Ala Asn

165 170 175

Thr Thr Val Glu Val Ile Ala Tyr Leu Lys Lys Val Asn Val Lys Gly

180 185 190

Asn Val Lys Leu Val Gly Gln Val Ser Gly Ser Glu Trp Gly Glu Ile

195 200 205

Pro Ser Ala Leu Ala Phe Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Phe Ser Leu Ser

210 215 220

Asp Thr Val Asn Lys Ser Asp Leu Asn Glu Asp Gly Thr Ile Asn Ile

225 230 235 240

Asn Gly Lys Gly Asn Tyr Ser Ala Val Met Gly Asp Glu Leu Ile Val

245 250 255

Lys Val Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln Glu Tyr Val Ile Pro

260 265 270

Val Asp Lys Lys Glu Lys Ser Asn Asp Ser Asn Ile Val Lys Tyr Arg

275 280 285

Ser Leu Ser Ile Lys Ala Pro Gly Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly

290 295 300

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Gly Lys Asn Val Lys Glu

305 310 315 320

Leu Val Ala Tyr Ile Ser Thr Ser Gly Glu Lys Asp Ala Gly Thr Asp

325 330 335

Asp Tyr Met Tyr Phe Gly Ile Lys Thr Lys Asp Gly Lys Thr Gln Glu

340 345 350

Trp Glu Met Asp Asn Pro Gly Asn Asp Phe Met Thr Gly Ser Lys Asp

355 360 365

Thr Tyr Thr Phe Lys Leu Lys Asp Glu Asn Leu Lys Ile Asp Asp Ile

370 375 380

Gln Asn Met Trp Ile Arg Lys Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Pro Asp Ala

385 390 395 400

Tyr Lys Pro Glu Asn Ile Lys Leu Ile Ala Asn Gly Lys Val Val Val

405 410 415

Asp Lys Asp Ile Asn Glu Trp Ile Ser Gly Asn Ser Thr Tyr Asn Ile

420 425 430

Lys His His His His His His

435

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

ggcatatgaa agaaatctcc aac 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

ggaagctttt agtggtgatg at 22

Claims (2)

1.一种无毒性的产气荚膜梭菌ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗，其特征在于所述疫苗含有融合蛋白rETX_m3CPA_C，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2的第2-439位，其是由表达rETX_m3CPA_C的宿主细胞大肠杆菌（Escherichia coli）的BL21(DE3)细胞株作为生产菌株制备的，该菌株被命名为大肠埃希氏菌BL13株，并已于2018年01月18日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.15237；

所述疫苗中含有的rETX_m3CPA_C是用来添加双相油佐剂混合制成同时预防A型产气荚膜梭菌病和D型产气荚膜梭菌病的疫苗。

2.如权利要求1所述一种无毒性的产气荚膜梭菌ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗的生产方法，其特征在于所述疫苗中含有的rETX_m3CPA_C是用生产菌株大肠埃希氏菌BL13株经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后获得。

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