CN107753940A - 一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗及其生产方法。本发明制备的产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，系采用经过密码子优化、含有3个氨基酸突变的重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白生产，即最大限度地保留天然毒素蛋白的完整性和空间构象，从而保持其免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患。该疫苗还具有制备工艺简单、免疫剂量低、疫苗效力远高于现有疫苗等优点，较我国目前商品化的产气荚膜梭菌天然毒素灭活疫苗大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险，是我国现行D型产气荚膜梭菌毒素疫苗升级换代的理想候选疫苗；而且在与其它抗原共同制备联苗时，无需增大联苗的使用剂量，即可制备联苗。

Description

一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗及其生产方法
技术领域
本发明涉及一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。
背景技术
产气荚膜梭菌也称魏氏梭菌，是一种重要的人畜共患病，该病原是创伤性气性坏疽和人类食物中毒以及羊快疫、羔羊痢疾、牛羊坏死性肠炎、牛羊肠毒血症的主要病原之一，对畜牧业造成了巨大的经济损失。产气荚膜梭菌主要的致病因素是其分泌的外毒素，该菌可产生至少18种外毒素，并通过其产生的毒素发挥致病作用。根据产生4种主要致死性外毒素α、β、ε和ι的种类，将该菌分为A、B、C、D、E五个毒素型。产气荚膜梭菌病具有发病急、病程短且死亡率极高的特点，一旦发病，往往还来不及治疗就因外毒素中毒而发生猝死，因此免疫接种是防控该病的有效方法。
目前使用的商品化疫苗主要为灭活疫苗，在预防动物产气荚膜梭菌病方面虽然取得了一定的效果，但这些疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起动物局部炎症及毒性反应等；其在制备过程中涉及外毒素的灭活，存在毒素外泄或灭活不彻底等生物安全隐患；此外，培养上清中的各种微小毒素以及细菌的代谢产物往往成为免疫动物的致敏原，接种动物易产生不良反应，导致免疫效果下降甚至免疫失败。因此，开发安全性好、有效抗原含量高、免疫原性强的梭菌毒素基因工程疫苗，是未来的发展方向。
ε毒素是由B型和D型产气荚膜梭菌产生，全长296个氨基酸，以前毒素的形式分泌于菌体外。前毒素被宿主的胰蛋白酶和糜蛋白酶或梭菌自身的蛋白酶作用后，去除N端11-13个以及C端22-29个氨基酸，从而活化为成熟毒素。ε毒素属于β穿孔素家族成员，是产气荚膜梭菌毒素中毒力最强的毒素，其毒力仅次于肉毒杆菌素和破伤风神经毒素，是目前已知第三强的梭菌类毒素。因此，实现毒素的减毒甚至无毒以及构建相关减毒或无毒体，对于开发毒素基因工程亚单位疫苗以及其作为抗原组分的多价亚单位疫苗的研究和应用就显得尤为重要。
现有技术中对产气荚膜梭菌主要外毒素蛋白的表达与纯化方法相对复杂，表达产物通常以不溶性的包涵体形式存在，可溶性蛋白表达的报道在国内外非常少。因为包涵体中的表达产物不具有生物学活性，因而需要进行变性与复性处理。蛋白的变性与复性是一个极其复杂的过程，不同蛋白的复性条件各异，复性率往往很难提高，这是限制其应用的主要制约因素。采用可溶性表达方式可很好的克服这一问题。如何构建可溶性表达载体并且优化可溶性蛋白的高效表达方法，是本领域长期以来一直研究的热点课题。
目前虽然已有产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体的报道，如中国农业科学院哈尔滨兽医研究所于力等(“产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体及其应用”，申请号：201410707351.6)将野生型产气荚膜梭菌ε毒素成熟毒素的第71位酪氨酸突变为非芳香族氨基酸，获得了对于细胞或动物体减毒的ε毒素突变体，由于该申请仅突变1个氨基酸，易发生回复突变而重新成为毒力极强的毒素，从而给未来实际的疫苗大规模生产带来严重的生物安全风险。中国动物疫病预防控制中心宋晓晖等(“抑制产气荚膜梭菌感染的重组ε蛋白及其制备方法与应用”，申请号：201610301989.9)设计了3种重组ε毒素蛋白，但均缺失了野生型ε毒素蛋白的前50个氨基酸残基，这种采用蛋白片段作为免疫原的策略，很可能会导致抗原蛋白的抗原性不完整，从而影响其免疫原性。
本发明制备的产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，系采用经过密码子优化、含有3个氨基酸突变的重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白生产，即最大限度地保留天然毒素蛋白的完整性和空间构象，从而保持其免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患。同时，该疫苗还具有制备工艺简单、免疫剂量低、免疫效力好等优点，是我国现行D型产气荚膜梭菌毒素疫苗升级换代的理想候选疫苗。
发明内容
本发明目的在于制备出产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，用于预防由B型和D型产气荚膜梭菌感染引起的疾病。
本发明技术方案
1.一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠杆菌表达的重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白；制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌ε毒素蛋白的大肠杆菌被命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21/mETX-HYY株，该菌株已于2017年09月21日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.14652。
2.本发明所述产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白，与野生型产气荚膜梭菌ε毒素成熟毒素相比，含有3个氨基酸突变，分别为第30位酪氨酸突变为丙氨酸，第106位组氨酸突变为脯氨酸，以及第196位酪氨酸突变为丙氨酸。
3.本发明所述产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白，其重组表达载体的基因序列经过密码子优化，更易于在大肠杆菌中实现高表达。
4.本发明所述产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白为无毒突变体，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。
5.本发明所述产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白，在大肠杆菌BL21(DE3)中为可溶性表达，既可最大限度地保留天然毒素蛋白的空间构象，从而保持其免疫原性；又避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了疫苗的制备时间和生产成本。
6.本发明所述产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白，其C端含有6组氨酸(6His)标签，便于蛋白的纯化。
7.本发明所述产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗的制备方法，其特征在于用所述表达产气荚膜梭菌ε毒素重组蛋白的埃希氏大肠菌BL21/mETX-HYY株作为疫苗生产菌株，经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后，加双相油乳佐剂混合制成。
本发明具体实施方式
1.产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗的制备
(1)菌种：制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌ε毒素蛋白大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21/mETX-HYY株，该菌种表达的产气荚膜梭菌ε毒素蛋白含有3个氨基酸突变(分别为第30位酪氨酸突变为丙氨酸，第106位组氨酸突变为脯氨酸以及第196位酪氨酸突变为丙氨酸)、C端含有6组氨酸(6His)标签。该菌株已于2017年09月21日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.14652；由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。
(2)一级种子繁殖及鉴定：将冻干菌种用少量LB液体培养基融解，划线接种于含卡那霉素的LB固体平板，置37℃培养12～16小时，选取符合标准的单个菌落，接种含卡那霉素的LB液体培养基，置37℃培养8～12小时，与50％甘油等比例混合后分装，经纯粹检验合格后，作为制苗用一级种子。
(3)二级种子繁殖及鉴定：取一级种子，按1％的量接种含卡那霉素的LB液体培养基，置37℃振荡培养8～12小时，即为二级种子。
(4)制苗用抗原制备：取合格的二级种子，按培养基总量的2％接种含卡那霉素的LB液体培养基，发酵罐内培养。设置培养参数为：培养温度37℃，pH值7.0，溶氧高于20％。当培养物OD600值为10～15时，将温度降至28℃，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导培养10h。
(5)破菌：离心收集菌体，按每克菌体湿重加10ml裂解液(pH值7.2 0.02mol/LTris缓冲液，0.3mol/L NaCl)的比例重悬菌体，用高压均质机以800bar的压力破碎菌体，离心收集上清。
(6)纯化：向收集的上清中加入饱和硫酸铵至30％饱和度，充分混合，2～8℃静置4小时，离心收集沉淀。用与硫酸铵沉淀前上清等体积的缓冲液(pH值6.0、0.01mol/L磷酸缓冲液)重悬沉淀，离心后收集上清，经0.22μm孔径滤膜过滤。
(7)蛋白含量检测：用BCA法检测蛋白含量。应不低于0.5mg/ml。
(8)无菌检验：按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2011，以下称《中国兽药典》)附录进行。应无菌生长。
(7)疫苗配制：将双相油佐剂(如201佐剂)导入油相罐内，以至少121℃高压灭菌30分钟，冷却至室温备用。根据蛋白含量测定结果，用PBS(pH值7.2 0.01mol/L)将检验合格的纯化蛋白适当稀释后混匀。将水相加入乳化罐内，以80～100r/min搅拌，同时按1:1(V/V)的比例，缓慢加入油相，加完后搅拌20～30min。乳化后取样进行检验，合格后分装。
2.产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗的检验
(1)性状
外观 乳白色乳剂。
剂型 呈水包油包水型(W/O/W)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。
稳定性 吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，应不破乳，并且管底析出的水相应不多于0.5ml。
黏度 按《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。
(2)装量检查 按《中国兽药典》附录进行检查，应符合规定。
(3)无菌检验 按《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
(4)安全检验 用体重1.5～2.0kg健康家兔4只，各肌肉或皮下注射疫苗4.0ml，观察10日。应全部健活。
(5)效力检验 用体重1.5～2.0kg健康家兔4只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗2.0ml。接种后14～21日，采血，分离血清。将4只免疫家兔的血清等量混合，取混合血清0.4ml与D型产气荚膜梭菌毒素(含12个小鼠MLD)，混合后置37℃作用40min，然后静脉注射16～20g小鼠2只，0.3ml/只。同时各用同批小鼠2只，分别注射1MLD与毒素血清混合物相同的毒素作对照。观察1日，判定结果。
对照鼠全部死亡，血清中和效价对D型产气荚膜梭菌毒素达到3(0.1ml免疫动物血清中和3MLD毒素)，即判为合格。
附图说明
图1：基因工程重组菌BL21/mETX-HYY株的SDS-PAGE鉴定结果，图中：M1:Proteinmarker；PC1:BSA(1μg)；PC2:BSA(2μg)；NC:未诱导细胞裂解物；1:15℃、16h诱导的细胞裂解物；2:37℃、4h诱导的细胞裂解物；NC1:未诱导细胞裂解上清；NC2:未诱导细胞裂解沉淀；3:15℃、16h诱导的细胞裂解上清；4:15℃、16h诱导的细胞裂解沉淀；5:37℃、4h诱导的细胞裂解上清；6:37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀。
图2：基因工程重组菌BL21/mETX-HYY株的Western blot(采用抗His抗体)鉴定结果图中：M2:Western blot marker；1:15℃、16h诱导的细胞裂解物；2:37℃、4h诱导的细胞裂解物；3:15℃、16h诱导的细胞裂解上清；4:15℃、16h诱导的细胞裂解沉淀；5:37℃、4h诱导的细胞裂解上清；6:37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀。
图3：表达产物SDS-PAGE电泳结果图中：M1:Protein marker；PC1:BSA(1μg)；PC2:BSA(2μg)；NC:未诱导细胞裂解物；1:15℃、16h诱导的细胞裂解物；2:37℃、4h诱导的细胞裂解物；NC1:未诱导细胞裂解上清；NC2:未诱导细胞裂解沉淀；3:15℃、16h诱导的细胞裂解上清；4:15℃、16h诱导的细胞裂解沉淀；5:37℃、4h诱导的细胞裂解上清；6:37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀。图中显示目的蛋白大量存在于菌体裂解液的上清中，呈可溶性表达，表达量良好，表达量可达20mg/L。
图4：目的蛋白的Western blot鉴定结果图中M2:Western blot marker；1:15℃、16h诱导的细胞裂解物；2:37℃、4h诱导的细胞裂解物；3:15℃、16h诱导的细胞裂解上清；4:15℃、16h诱导的细胞裂解沉淀；5:37℃、4h诱导的细胞裂解上清；6:37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀。图中显示37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀中，目的蛋白的表达最高，约占目的蛋白总表达量的70％；37℃、4h诱导的细胞裂解上清中，目的蛋白的表达也不低，约占目的蛋白总表达量的30％。
本发明涉及生物材料资源信息
本发明涉及的微生物为：含有3个氨基酸突变(分别为第30位酪氨酸突变为丙氨酸，第106位组氨酸突变为脯氨酸以及第196位酪氨酸突变为丙氨酸)、C端含有6组氨酸(6His)标签的表达产气荚膜梭菌ε毒素的大肠埃希氏菌BL21/mETX-HYY株。该菌株已于2017年09月21日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.14652。
本发明的积极意义
本发明涉及一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗及其生产方法。本发明将野生型产气荚膜梭菌ε毒素成熟毒素的第30位酪氨酸突变为丙氨酸，第106位组氨酸突变为脯氨酸，第196位酪氨酸突变为丙氨酸获得了对于动物体无毒的ε毒素突变体(BL21/mETX-HYY株)。本发明进一步公开了含有所述产气荚膜梭菌ε毒素无毒突变体编码基因的重组表达载体和重组宿主细胞。本发明重组表达的产气荚膜梭菌ε毒素无毒突变体在小鼠体内完全无毒，且在家兔模型中呈现良好的免疫原性和免疫保护性。本发明的产气荚膜梭菌ε毒素无毒突变体或其编码基因能够应用于制备预防产气荚膜梭菌病的ε毒素亚单位疫苗或多价梭菌毒素亚单位疫苗。采用本发明提出的产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，较我国目前商品化的产气荚膜梭菌天然毒素灭活疫苗具有明显的优势，不但大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险，而且所制备的疫苗效力远高于现有疫苗。此外，凭借疫苗半成品蛋白浓度高的优势，在与其它抗原共同制备联苗时，无需增大联苗的使用剂量，即可制备联苗，极大方便了联苗的开发。
实施例
以下实施例为更好说明本发明的技术方案，但不对本发明技术方案构成限制。
实施例1
——大肠埃希氏菌BL21/mETX-HYY株(本发明又称产气荚膜梭菌ε毒素3氨基酸突变体)的构建、表达及鉴定
1.基因合成
本申请根据产气荚膜梭菌ε毒素天然蛋白基因的序列，经密码子优化后，设计了3个氨基酸突变，分别将野生型产气荚膜梭菌ε毒素成熟毒素的第30位酪氨酸突变为丙氨酸，第106位组氨酸突变为脯氨酸，第196位酪氨酸突变为丙氨酸，从而获得了对于动物体无毒的ε毒素突变体。用化学合成的方法，合成了该段基因序列，共包含912个核苷酸。具体的核酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列见SEQ ID No.2所示。
2.非融合表达载体的构建
以人工合成的产气荚膜梭菌ε毒素全长基因为模板，采用引物对ETX-F/ETX-R(序列3/序列4)进行PCR扩增。
其中上游引物ETX-F序列为：
5’-CGCGGATCCA TGAAAGAAAT CTCCAACACC G-3’31(序列3)，其5’端引入限制性内切酶BamHⅠ位点及保护性碱基；
下游引物ETX-R序列为：
5’-CCGCTCGAGT TAGTGGTGAT GGTGATGATG TTTGAT-3’36(序列4)，其5’端引入限制性内切酶XhoⅠ位点及保护性碱基。
PCR体系为：10×EX Taq Buffer 5μlμl，dNTPs 4μl，上、下游引物各2μl，EX Taq酶0.5μl,全长基因DNA模板2μl，补充ddH2O至50μl体系。PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共33个循环；最后72℃延伸10min。
扩增得到的目的DNA条带，经回收后，采用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切消化，与经过相同酶切消化的pET30a载体连接，得到插入产气荚膜梭菌ε毒素全长基因阳性克隆pET30-mETXHYY。将连接好的质粒转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒备用。
3.重组表达产气荚膜梭菌ε毒素全长基因的基因工程菌株的构建
将提取得到的质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，经PCR鉴定，含有目的DNA片段后，命名为大肠埃希氏菌(E.coli)BL21/mETX-HYY株，并加入等体积的50％甘油LB，-70℃冻存,该菌株已于2017年09月21日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.14652。
4.目的蛋白的表达
将重组的大肠埃希氏菌(E.coli)BL21/mETX-HYY株接种于100ml含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养4h后，将温度降至28℃,加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG溶液诱导培养5h。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体温重加10ml裂解液[0.02mol/LTris缓冲液(pH值7.2)，0.3mol/L NaCl]的比例重悬菌体，在冰水浴中超声破碎菌体30min，破碎条件为：工作9s，间歇9s，超声功率为400W。将破碎后的菌液于4℃，以12000r/min离心10min，收集上清。取30μl上清加入10μl的4×SDS-PAGE上样缓冲液，70℃作用10min，进行12％SDS-PAGE电泳，结果见图1。从图1可以看出，目的蛋白大量存在于菌体裂解液的上清中，呈可溶性表达，表达量良好，表达量可达20mg/L。目的蛋白的最适诱导表达条件为37℃，诱导表达4h。
5.目的蛋白的鉴定
采用上述步骤中不同诱导条件下的目的蛋白表达产物，采用抗His抗体，对目的蛋白进行Western blot鉴定，结果见图2。从图2可知，37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀中，目的蛋白的表达最高，约占目的蛋白总表达量的60％；37℃、4h诱导的细胞裂解上清中，目的蛋白的表达也不低，约占目的蛋白总表达量的40％。由于细胞裂解上清中呈可溶性表达的目的蛋白，空间结构与野生型毒素最为接近。综合SDS-PAGE和Western blot鉴定结果，进一步确定目的蛋白的最适诱导表达条件为37℃，诱导表达4h。
6.目的蛋白的纯化向上述步骤4收集的上清中，加入饱和硫酸铵至30％饱和度，充分混合，2～8℃静置4小时，离心收集沉淀。用与硫酸铵沉淀前上清等体积的缓冲液(0.01mol/L磷酸缓冲液(pH值6.0))重悬沉淀，离心后收集上清，经0.22μm孔径滤膜过滤，即为初步纯化的目的蛋白。
实施例2
——产气荚膜梭菌ε毒素无毒突变体对小鼠的毒力试验
通过测定产气荚膜梭菌ε毒素无毒突变体对小鼠的毒力，以验证该突变体在体内的实际减毒效果。将活化的产气荚膜梭菌ε毒素3氨基酸突变重组蛋白mETX-HYY，以及野生型产气荚膜梭菌ε毒素，分别以不同的剂量，经尾静脉接种16～18g小鼠，每剂量注射5只，0.2ml/只。结果当接种剂量为0.1mg时，所有小鼠均健活且无不良反应，而野生型对照组在接种1ng时即可导致小鼠5/5死亡。该结果表明，产气荚膜梭菌ε毒素无毒突变体小鼠体内是无毒的，被确定为毒素无毒突变体。
表1重组蛋白mETX-HYY对小鼠的毒力
实施例3
——产气荚膜梭菌ε毒素3氨基酸突变体的免疫原性试验
(1)菌液培养：将重组表达产气荚膜梭菌ε毒素蛋白的大肠杆菌基因工程菌BL21/mETX-HYY株培养菌液，按培养基总量的2％接种含卡那霉素的LB液体培养基，发酵罐内培养。设置培养参数为：培养温度37℃，pH值7.0，溶氧高于20％。当培养物OD600值为10～15时，将温度降至28℃，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导培养10小时。
(2)破菌：离心收集菌体，按每克菌体温重加10ml裂解液(0.02mol/L Tris缓冲液(pH值7.2)，0.3mol/L NaCl)的比例重悬菌体，用高压均质机以800bar的压力破碎菌体，离心收集上清。
(3)纯化：向收集的上清中加入饱和硫酸铵至30％饱和度，充分混合，2～8℃静置4小时，离心收集沉淀。用与硫酸铵沉淀前上清等体积的缓冲液(pH值6.0 0.01mol/L磷酸缓冲液)重悬沉淀，离心后收集上清，经0.22μm孔径滤膜过滤。
(4)蛋白含量检测：用BCA法检测蛋白含量。结果蛋白含量为15.5mg/ml。
(5)无菌检验：按《中国兽药典》附录进行。结果均无菌生长。
(6)疫苗配制：将双相油佐剂(201佐剂)导入油相罐内，以至少121℃高压灭菌30分钟，冷却至室温备用。根据蛋白含量测定结果，用PBS(pH值7.2 0.01mol/L)将检验合格的纯化蛋白稀释至终浓度为100μg/ml后混匀。将水相加入乳化罐内，以80～100r/min搅拌，同时按1:1(V/V)的比例，缓慢加入油相，加完后搅拌20～30min。乳化后取样进行检验，合格后分装。
(7)免疫原性试验：按照《中国兽药典》规定的方法进行。具体试验方法为：用体重1.5～2.0kg健康家兔4只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗2.0ml。接种后14日，采血，分离血清。同时，以相同剂量、相同途径对家兔进行二次免疫。二免后21日，采血，分离血清。采用下述方法，分别对一次免疫和二次免疫后，家兔血清中的毒抗体效价进行测定：
将4只免疫家兔的血清等量混合，取混合血清0.4ml与D型产气荚膜梭菌毒素(含12个小鼠MLD)，混合后置37℃作用40min，然后静脉注射16～20g小鼠2只，0.3ml/只。同时各用同批小鼠2只，分别注射1MLD与毒素血清混合物相同的毒素作对照。观察1日，判定结果。若对照鼠全部死亡，血清中和效价对D型产气荚膜梭菌毒素达到3(0.1ml免疫动物血清中和3MLD毒素)，即判为合格。
经测定，一次免疫后，家兔血清中的毒抗体效价为30(即0.1ml家兔血清可中和30MLD的D型产气荚膜梭菌毒素)；二次免疫后，家兔血清中的毒素抗体效价为200(即0.1ml家兔血清可中和200MLD的D型产气荚膜梭菌毒素)。
《中国兽药典》规定，家兔血清中的毒抗体效价对D型产气荚膜梭菌毒素达到3，即可判为疫苗中D型产气荚膜梭菌毒素部分为合格。因此，本申请生产的疫苗，在抗原含量低至50μg/ml的情况下，无论是对家兔一次免疫，还是二次免疫，均远远超过了现行《中国兽药典》的规定，证明该疫苗具有良好的免疫原性。
鉴于我国现有商品化梭菌毒素疫苗须采用甲醛灭活脱毒，存在生物安全隐患，也影响了疫苗在田间使用的安全性；同时现行商品化疫苗在生产过程中，还存在产毒不稳定，导致疫苗效力不稳定的问题。因此，本申请生产的疫苗是我国现行D型产气荚膜梭菌毒素疫苗升级换代的理想候选疫苗。
实施例4
——产气荚膜梭菌ε毒素2氨基酸突变体的表达及鉴定
1.基因合成
本申请根据产气荚膜梭菌ε毒素天然蛋白基因的序列，经密码子优化后，设计了2个氨基酸突变，分别将野生型产气荚膜梭菌ε毒素成熟毒素的第106位组氨酸突变为脯氨酸，第199位苯丙氨酸突变为谷氨酸，从而获得了对于动物体无毒的ε毒素突变体。用化学合成的方法，合成了该段基因序列，共包含912个核苷酸。具体的核酸序列如序列5所示，氨基酸序列见序列6所示。
2.非融合表达载体的构建
以人工合成的产气荚膜梭菌ε毒素全长基因为模板，采用引物对ETX-F/ETX-R(序列3/序列4)进行PCR扩增。
其中上游引物ETX-F序列为：
5’-CGCGGATCCA TGAAAGAAAT CTCCAACACC G-3’31(序列3)，其5’端引入限制性内切酶BamHⅠ位点及保护性碱基；
下游引物ETX-R序列为：
5’-CCGCTCGAGT TAGTGGTGAT GGTGATGATG TTTGAT-3’36(序列4)，其5’端引入限制性内切酶XhoⅠ位点及保护性碱基。
PCR体系为：10×EX Taq Buffer 5μlμl，dNTPs 4μl，上、下游引物各2μl，EX Taq酶0.5μl，全长基因DNA模板2μl，补充ddH2O至50μl体系。PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共33个循环；最后72℃延伸10min。
扩增得到的目的DNA条带，经回收后，采用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切消化，与经过相同酶切消化的pET30a载体连接，得到插入产气荚膜梭菌ε毒素全长基因阳性克隆pET30-mETXHF。将连接好的质粒转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒备用。
3.重组表达产气荚膜梭菌ε毒素全长基因的基因工程菌株的构建
将提取得到的质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，经PCR鉴定，含有目的DNA片段后，命名为大肠埃希氏菌(E.coli)BL21/mETX-HF株，并加入等体积的50％甘油LB，-70℃冻存。
4.目的蛋白的表达与鉴定
将重组表达产气荚膜梭菌ε毒素全长基因的基因工程菌大肠杆菌(E.coli)BL21/mETX-HYY株接种于100ml含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养4h后，将温度降至28℃,加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG溶液诱导培养5h。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体温重加10ml裂解液[0.02mol/L Tris缓冲液(pH值7.2)，0.3mol/L NaCl]的比例重悬菌体，在冰水浴中超声破碎菌体30min，破碎条件为：工作9s，间歇9s，超声功率为400W。将破碎后的菌液于4℃，以12000r/min离心10min，收集上清。取30μl上清加入10μl的4×SDS-PAGE上样缓冲液，70℃作用10min，进行12％SDS-PAGE电泳，结果见图3。从图3可以看出，目的蛋白大量存在于菌体裂解液的上清中，呈可溶性表达，表达量良好，表达量可达20mg/L。目的蛋白的最适诱导表达条件为37℃，诱导表达4h。
5.目的蛋白的Western blot鉴定
采用上述步骤中不同诱导条件下的目的蛋白表达产物，采用抗His抗体，对目的蛋白进行Western blot鉴定，结果见图4。从图4可知，37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀中，目的蛋白的表达最高，约占目的蛋白总表达量的70％；37℃、4h诱导的细胞裂解上清中，目的蛋白的表达也不低，约占目的蛋白总表达量的30％。由于细胞裂解上清中呈可溶性表达的目的蛋白，空间结构与野生型毒素最为接近。综合SDS-PAGE和Western blot鉴定结果，进一步确定目的蛋白的最适诱导表达条件为37℃，诱导表达4h。
6.目的蛋白的纯化向上述步骤4收集的上清中，加入饱和硫酸铵至30％饱和度，充分混合，2～8℃静置4小时，离心收集沉淀。用与硫酸铵沉淀前上清等体积的缓冲液(0.01mol/L磷酸缓冲液(pH值6.0))重悬沉淀，离心后收集上清，经0.22μm孔径滤膜过滤，即为初步纯化的目的蛋白。
7.产气荚膜梭菌ε毒素2氨基酸突变体的对小鼠的毒力试验通过测定产气荚膜梭菌ε毒素无毒突变体对小鼠的毒力，以验证该突变体在体内的实际减毒效果。将活化的产气荚膜梭菌ε毒素3氨基酸突变重组蛋白mETX-HF，以及野生型产气荚膜梭菌ε毒素，分别以不同的剂量，经尾静脉接种16～18g小鼠，每剂量注射5只，0.2ml/只。结果当接种剂量为0.1mg时，所有小鼠均健活且无不良反应，而野生型对照组在接种1ng时即可导致小鼠5/5死亡。该结果表明，产气荚膜梭菌ε毒素无毒突变体小鼠体内是无毒的，被确定为毒素无毒突变体。
表2重组蛋白mETX-HF对小鼠的毒力
8.产气荚膜梭菌ε毒素2氨基酸突变体的免疫原性试验
(1)菌液培养：将重组表达产气荚膜梭菌ε毒素蛋白的大肠杆菌基因工程菌BL21/mETX-HF株培养菌液，按培养基总量的2％接种含卡那霉素的LB液体培养基，发酵罐内培养。设置培养参数为：培养温度37℃，pH值7.0，溶氧高于20％。当培养物OD600值为10～15时，将温度降至28℃，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导培养10小时。
(2)破菌：离心收集菌体，按每克菌体温重加10ml裂解液(0.02mol/L Tris缓冲液(pH值7.2)，0.3mol/L NaCl)的比例重悬菌体，用高压均质机以800bar的压力破碎菌体，离心收集上清。
(3)纯化：向收集的上清中加入饱和硫酸铵至30％饱和度，充分混合，2～8℃静置4小时，离心收集沉淀。用与硫酸铵沉淀前上清等体积的缓冲液(pH值6.0 0.01mol/L磷酸缓冲液)重悬沉淀，离心后收集上清，经0.22μm孔径滤膜过滤。
(4)蛋白含量检测：用BCA法检测蛋白含量。结果蛋白含量为12.4mg/ml。
(5)无菌检验：按《中国兽药典》附录进行。结果均无菌生长。
(6)疫苗配制：将双相油佐剂(201佐剂)导入油相罐内，以至少121℃高压灭菌30分钟，冷却至室温备用。根据蛋白含量测定结果，用PBS(pH值7.2 0.01mol/L)将检验合格的纯化蛋白稀释至终浓度为100μg/ml后混匀。将水相加入乳化罐内，以80～100r/min搅拌，同时按1:1(V/V)的比例，缓慢加入油相，加完后搅拌20～30min。乳化后取样进行检验，合格后分装。
(7)免疫原性试验：按照《中国兽药典》规定的方法进行。具体试验方法为：用体重1.5～2.0kg健康家兔4只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗2.0ml。接种后14日，采血，分离血清。同时，以相同剂量、相同途径对家兔进行二次免疫。二免后21日，采血，分离血清。采用下述方法，分别对一次免疫和二次免疫后，家兔血清中的毒抗体效价进行测定：
将4只免疫家兔的血清等量混合，取混合血清0.4ml与D型产气荚膜梭菌毒素(含12个小鼠MLD)，混合后置37℃作用40min，然后静脉注射16～20g小鼠2只，0.3ml/只。同时各用同批小鼠2只，分别注射1MLD与毒素血清混合物相同的毒素作对照。观察1日，判定结果。若对照鼠全部死亡，血清中和效价对D型产气荚膜梭菌毒素达到3(0.1ml免疫动物血清中和3MLD毒素)，即判为合格。
经测定，一次免疫后，家兔血清中的毒抗体效价为28(即0.1ml家兔血清可中和28MLD的D型产气荚膜梭菌毒素)；二次免疫后，家兔血清中的毒抗体效价为195(即0.1ml家兔血清可中和195MLD的D型产气荚膜梭菌毒素)。
序列表
<120> 一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗及其生产方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 912
<212> DNA
<213> 产气荚膜梭菌ε毒素全长基因（3氨基酸突变体）(人工序列)
<400> 2
atgaaagaaa tctccaacac cgtctctaat gaaatgtcca aaaaagcatc ctacgataat 60
gtcgataccc tgattgaaaa aggtcgctac aacacgaaat acaactacct gaaacgtatg 120
gaaaaatatg ccccgaacgc gatggcctat tttgataaag ttaccattaa cccgcagggt 180
aatgacttct acatcaacaa tccgaaagtg gaactggatg gtgaaccgtc aatgaactat 240
ctggaagacg tgtacgttgg caaagcactg ctgacgaatg atacccagca agaacagaaa 300
ctgaaaagcc aatcttttac ctgcaaaaac acggacaccg tcaccgctac caccaccccg 360
accgtgggta cctcaattca agcaacggct aaatttaccg ttccgttcaa tgaaaccggc 420
gtctcgctga cgaccagtta ttccttcgcg aacaccaata cgaacaccaa tagtaaagaa 480
attacccata acgtgccgtc ccaggatatc ctggttccgg cgaatacgac cgtcgaagtg 540
attgcctatc tgaagaaagt gaacgtcaag ggtaatgtca aactggtggg ccaagtttca 600
ggttcggaat ggggcgaaat cccgtccgct ctggcgtttc cgcgtgatgg ctacaaattc 660
agcctgtctg acacggttaa caaaagcgat ctgaatgaag acggtaccat caacatcaac 720
ggcaagggta actactctgc cgttatgggc gatgaactga ttgtgaaagt tcgcaacctg 780
aataccaaca atgtgcagga atacgtcatc ccggtggata agaaagaaaa aagcaatgac 840
tccaacatcg tgaaataccg cagcctgtcc atcaaagcac cgggcatcaa acatcatcac 900
catcaccact aa 912
<210> 3
<211> 303
<212> PRT
<213> 产气荚膜梭菌ε毒素的氨基酸（3氨基酸突变体）序列(人工序列)
<400> 3
Met Lys Glu Ile Ser Asn Thr Val Ser Asn Glu Met Ser Lys Lys Ala
1 5 10 15
Ser Tyr Asp Asn Val Asp Thr Leu Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asn Thr
20 25 30
Lys Tyr Asn Tyr Leu Lys Arg Met Glu Lys Tyr Ala Pro Asn Ala Met
35 40 45
Ala Tyr Phe Asp Lys Val Thr Ile Asn Pro Gln Gly Asn Asp Phe Tyr
50 55 60
Ile Asn Asn Pro Lys Val Glu Leu Asp Gly Glu Pro Ser Met Asn Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Asp Val Tyr Val Gly Lys Ala Leu Leu Thr Asn Asp Thr Gln
85 90 95
Gln Glu Gln Lys Leu Lys Ser Gln Ser Phe Thr Cys Lys Asn Thr Asp
100 105 110
Thr Val Thr Ala Thr Thr Thr Pro Thr Val Gly Thr Ser Ile Gln Ala
115 120 125
Thr Ala Lys Phe Thr Val Pro Phe Asn Glu Thr Gly Val Ser Leu Thr
130 135 140
Thr Ser Tyr Ser Phe Ala Asn Thr Asn Thr Asn Thr Asn Ser Lys Glu
145 150 155 160
Ile Thr His Asn Val Pro Ser Gln Asp Ile Leu Val Pro Ala Asn Thr
165 170 175
Thr Val Glu Val Ile Ala Tyr Leu Lys Lys Val Asn Val Lys Gly Asn
180 185 190
Val Lys Leu Val Gly Gln Val Ser Gly Ser Glu Trp Gly Glu Ile Pro
195 200 205
Ser Ala Leu Ala Phe Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Phe Ser Leu Ser Asp
210 215 220
Thr Val Asn Lys Ser Asp Leu Asn Glu Asp Gly Thr Ile Asn Ile Asn
225 230 235 240
Gly Lys Gly Asn Tyr Ser Ala Val Met Gly Asp Glu Leu Ile Val Lys
245 250 255
Val Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln Glu Tyr Val Ile Pro Val
260 265 270
Asp Lys Lys Glu Lys Ser Asn Asp Ser Asn Ile Val Lys Tyr Arg Ser
275 280 285
Leu Ser Ile Lys Ala Pro Gly Ile Lys His His His His His His
290 295 300
<210> 3
<211> 31
<212> DNA/RNA
<213> 扩增产气荚膜梭菌ε毒素基因的上游引物ETX-F(人工序列)
<400> 3
cgcggatcca tgaaagaaat ctccaacacc g 31
<210> 4
<211> 36
<212> DNA/RNA
<213> 扩增产气荚膜梭菌ε毒素基因的下游引物ETX-R(人工序列)
<400> 4
ccgctcgagt tagtggtgat ggtgatgatg tttgat 36
<210> 5
<211> 912
<212> DNA/RNA
<213> 产气荚膜梭菌ε毒素全长基因（2氨基酸突变体）序列(人工序列)
<400> 5
atgaaagaaa tctccaacac cgtctctaat gaaatgtcca aaaaagcatc ctacgataat 60
gtcgataccc tgattgaaaa aggtcgctac aacacgaaat acaactacct gaaacgtatg 120
gaaaaatatt acccgaacgc gatggcctat tttgataaag ttaccattaa cccgcagggt 180
aatgacttct acatcaacaa tccgaaagtg gaactggatg gtgaaccgtc aatgaactat 240
ctggaagacg tgtacgttgg caaagcactg ctgacgaatg atacccagca agaacagaaa 300
ctgaaaagcc aatcttttac ctgcaaaaac acggacaccg tcaccgctac caccaccccg 360
accgtgggta cctcaattca agcaacggct aaatttaccg ttccgttcaa tgaaaccggc 420
gtctcgctga cgaccagtta ttccttcgcg aacaccaata cgaacaccaa tagtaaagaa 480
attacccata acgtgccgtc ccaggatatc ctggttccgg cgaatacgac cgtcgaagtg 540
attgcctatc tgaagaaagt gaacgtcaag ggtaatgtca aactggtggg ccaagtttca 600
ggttcggaat ggggcgaaat cccgtcctat ctggcggaac cgcgtgatgg ctacaaattc 660
agcctgtctg acacggttaa caaaagcgat ctgaatgaag acggtaccat caacatcaac 720
ggcaagggta actactctgc cgttatgggc gatgaactga ttgtgaaagt tcgcaacctg 780
aataccaaca atgtgcagga atacgtcatc ccggtggata agaaagaaaa aagcaatgac 840
tccaacatcg tgaaataccg cagcctgtcc atcaaagcac cgggcatcaa acatcatcac 900
catcaccact aa 912
<210> 6
<211> 303
<212> PRT
<213> 产气荚膜梭菌ε毒素的氨基酸（2氨基酸突变体）序列(人工序列)
<400> 6
Met Lys Glu Ile Ser Asn Thr Val Ser Asn Glu Met Ser Lys Lys Ala
1 5 10 15
Ser Tyr Asp Asn Val Asp Thr Leu Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asn Thr
20 25 30
Lys Tyr Asn Tyr Leu Lys Arg Met Glu Lys Tyr Tyr Pro Asn Ala Met
35 40 45
Ala Tyr Phe Asp Lys Val Thr Ile Asn Pro Gln Gly Asn Asp Phe Tyr
50 55 60
Ile Asn Asn Pro Lys Val Glu Leu Asp Gly Glu Pro Ser Met Asn Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Asp Val Tyr Val Gly Lys Ala Leu Leu Thr Asn Asp Thr Gln
85 90 95
Gln Glu Gln Lys Leu Lys Ser Gln Ser Phe Thr Cys Lys Asn Thr Asp
100 105 110
Thr Val Thr Ala Thr Thr Thr Pro Thr Val Gly Thr Ser Ile Gln Ala
115 120 125
Thr Ala Lys Phe Thr Val Pro Phe Asn Glu Thr Gly Val Ser Leu Thr
130 135 140
Thr Ser Tyr Ser Phe Ala Asn Thr Asn Thr Asn Thr Asn Ser Lys Glu
145 150 155 160
Ile Thr His Asn Val Pro Ser Gln Asp Ile Leu Val Pro Ala Asn Thr
165 170 175
Thr Val Glu Val Ile Ala Tyr Leu Lys Lys Val Asn Val Lys Gly Asn
180 185 190
Val Lys Leu Val Gly Gln Val Ser Gly Ser Glu Trp Gly Glu Ile Pro
195 200 205
Ser Tyr Leu Ala Glu Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Phe Ser Leu Ser Asp
210 215 220
Thr Val Asn Lys Ser Asp Leu Asn Glu Asp Gly Thr Ile Asn Ile Asn
225 230 235 240
Gly Lys Gly Asn Tyr Ser Ala Val Met Gly Asp Glu Leu Ile Val Lys
245 250 255
Val Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln Glu Tyr Val Ile Pro Val
260 265 270
Asp Lys Lys Glu Lys Ser Asn Asp Ser Asn Ile Val Lys Tyr Arg Ser
275 280 285
Leu Ser Ile Lys Ala Pro Gly Ile Lys His His His His His His
290 295 300

Claims (7)

1.一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠埃希氏菌表达的重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白；制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌ε毒素蛋白的大肠埃希氏菌，被命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21/mETX-HYY株，该菌株已于2017年09月21日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.14652。
2.如权利要求1所述产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白，与野生型产气荚膜梭菌ε毒素成熟毒素相比，含有3个氨基酸突变，分别为第30位酪氨酸突变为丙氨酸，第106位组氨酸突变为脯氨酸，以及第196位酪氨酸突变为丙氨酸。
3.如权利要求1所述产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白，其重组表达载体的基因序列经过密码子优化，更易于在大肠杆菌中实现高表达。
4.如权利要求1所述产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白为无毒突变体，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险，该无毒突变体，。
5.如权利要求1所述产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白，在大肠杆菌BL21(DE3)中为可溶性表达，既可最大限度地保留天然毒素蛋白的空间构象，从而保持其免疫原性；又避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了疫苗的制备时间和生产成本。
6.如权利要求1所述产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白，其C端含有6组氨酸(6His)标签，便于蛋白的纯化。
7.如权利要求1所述产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗的制备方法，其特征在于用所述表达产气荚膜梭菌ε毒素重组蛋白的大肠埃希氏菌BL21/mETX-HYY株作为疫苗生产菌株，经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后，加双相油佐剂混合制成。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109745554A (zh) * 2019-03-04 2019-05-14 中国兽医药品监察所 一种无毒性的产气荚膜梭菌重组ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗及其生产方法
CN110025779A (zh) * 2019-04-29 2019-07-19 中国兽医药品监察所 一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗及其生产方法
CN110041437A (zh) * 2019-04-29 2019-07-23 中国兽医药品监察所 一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白
CN110051834A (zh) * 2019-03-11 2019-07-26 中国兽医药品监察所 一种无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗及其生产方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN109745554A (zh) * 2019-03-04 2019-05-14 中国兽医药品监察所 一种无毒性的产气荚膜梭菌重组ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗及其生产方法
CN109745554B (zh) * 2019-03-04 2022-05-20 中国兽医药品监察所 一种无毒性的产气荚膜梭菌重组ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗及其生产方法
CN110051834A (zh) * 2019-03-11 2019-07-26 中国兽医药品监察所 一种无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗及其生产方法
CN110025779A (zh) * 2019-04-29 2019-07-19 中国兽医药品监察所 一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗及其生产方法
CN110041437A (zh) * 2019-04-29 2019-07-23 中国兽医药品监察所 一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白

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