CN102276730A - 金黄色葡萄球菌IsdBid-TRAP融合蛋白制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种金黄色葡萄球菌IsdB_id-TRAP融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明融合蛋白的制备方法包括金黄色葡萄球菌IsdB免疫优势片段(IsdB immunodominant fragment，IsdB_id)的选择和采用重叠引物延伸PCR技术将IsdB_id与trap基因用Linker连接起来，并将IsdB_id-TRAP融合蛋白基因进行原核表达，然后纯化该融合蛋白。利用本发明的IsdB_id-TRAP融合蛋白制备得到的疫苗免疫小鼠后，经检测该融合蛋白疫苗的免疫效果明显优于IsdB和TRAP单独免疫以及IsdB与TRAP混合在一起免疫的免疫效果，是制备金黄色葡萄球菌疫苗理想的候选抗原。

Description

金黄色葡萄球菌IsdB_id-TRAP融合蛋白制备方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种金黄色葡萄球菌IsdB_id-TRAP融合蛋白制备方法及其应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)是一种革兰氏阳性菌，既是引起人类多种感染的主要病原菌，也是引起奶牛乳房炎的主要病原菌。但随着临床上抗生素在S.aureus感染治疗中的普遍使用，已出现了大量S.aureus耐药菌株，致使抗生素治疗收效甚微，甚至毫无效果。因此，对S.aureus感染的免疫预防和免疫治疗成为研究的焦点。在过去的40多年中，人们对S.aureus全菌灭活苗、荚膜多糖结合苗、类毒素、菌体表面粘附素以及菌体结构蛋白亚单位苗等作了大量研究，但免疫保护效果都不令人满意。近年来，随着人们对S.aureus认识的不断深入和对S.aureus苗的研究探索，人们逐渐意识到使用单一抗原分子作为免疫原进行免疫，其所提供的免疫保护作用有限。而使用S.aureus两种以上抗原制成疫苗会使免疫保护作用得到进一步提高。

Isd是S.aureus铁调节表面决定簇(Iron-regulated surfacedeterminant)的缩写，包括IsdB、IsdA、IsdH等多个成分。Kuklin等报导，Isd家族成员——IsdB在各种S.aureus株中高度保守，将表达的IsdB用硫羟磷酸铝佐剂制备免疫原免疫小鼠，证实该苗具有高度的免疫原性，能显著降低金黄色葡萄球菌对小鼠的致死率。TRAP(Targetof RNAIII Activating Protein)是一个由167个氨基酸残基组成的蛋白质，在葡萄球菌中高度保守。它能够被RNAIII激活蛋白(RAP)激活，而且研究认为TRAP在葡萄球菌应激反应中发挥作用，可保护DNA免受氧化损伤、自然突变和适应性突变的影响。本发明人曾对表达的IsdB、TRAP和RAP的免疫保护作用进行了比较研究，结果IsdB、TRAP和RAP均能够刺激小鼠产生良好的体液免疫应答和高水平的细胞因子(IL-4、IFN-γ)，在小鼠败血症模型中用不同菌株攻毒，其免疫保护效果TRAP略优于IsdB，IsdB略优于RAP。到目前为止，有关IsdB与TRAP融合蛋白的免疫原性和免疫保护作用未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种金黄色葡萄球菌IsdB_id-TRAP融合蛋白及其制备方法。

本发明的另一目的是提供上述IsdB_id-TRAP融合蛋白在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种金黄色葡萄球菌IsdB_id-TRAP融合蛋白，其是由金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的IsdB免疫优势片段(IsdB immunodominant fragment，IsdB_id)和TRAP融合而成。该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，将第246位的N替换为H，不会影响融合蛋白的抗原性。

本发明还提供编码上述融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQID No.2所示。

本发明还提供含有上述基因的载体以及含有该载体的宿主细胞。

本发明还提供上述金黄色葡萄球菌IsdB_id-TRAP融合蛋白的制备方法，其是将编码上述金黄色葡萄球菌IsdB_id-TRAP融合蛋白的基因克隆至原核细胞中进行异源表达，并纯化该融合蛋白。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

首先以金黄色葡萄球菌基因组为模板，通过PCR方法扩增获得IsdB和TRAP的基因，然后通过生物信息学分析将IsdB分为3个片段，并通过免疫原性分析和免疫保护作用研究，选择和确定了IsdB免疫优势区(IsdB_id)。在此基础上，设计引物，通过重叠延伸PCR方法扩增获得IsdB_id和Trap的融合基因，并将该基因插入到表达载体pET-32a，转化大肠杆菌，经IPTG诱导后可获得高水平表达的可溶性融合蛋白IsdB_id-Trap。

本发明进一步提供上述融合蛋白在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用。具体为：利用该融合蛋白N末端含有的6个连续His残基能与Ni²⁺柱结合的特性，选用MagneHisTM蛋白纯化系统进行纯化，并将纯化后的融合蛋白与弗氏佐剂混合制备疫苗免疫动物，然后进行抗体和细胞因子水平检测以及采用不同菌株攻毒。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

采用本发明的IsdB_id-TRAP融合蛋白制得的疫苗免疫小鼠后，检测体液和细胞免疫应答水平，并进行攻毒，结果证实该融合蛋白疫苗的免疫效果明显优于IsdB和TRAP单独免疫以及IsdB与TRAP混合在一起免疫的免疫效果，是制备金黄色葡萄球菌疫苗理想的候选抗原，即本发明的融合蛋白具有更好的免疫原性及免疫保护作用。另外，本发明的IsdB_id-TRAP融合蛋白不但进一步提高了抗金黄色葡萄球菌感染的保护作用，而且简化了制备过程，在新型疫苗的开发应用方面具有重要的价值。

附图说明

图1为isdB1、isdB2和isdB3基因的PCR扩增产物的电泳分析结果。其中，M：DL2000DNA Marker，大小从上到下依次为5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1：isdB1(738bp)；2：isdB2(795bp)；3：IsdB3(675bp)。

图2为PCR产物回收纯化电泳结果。其中，M：DL2000 DNAMarker；A：isdB1基因；B：isdB2基因；C：isdB3基因。

图3为重组质粒pMD18T-isdB1、pMD18T-isdB2、pMD18T-isdB3的PCR及双酶切鉴定结果。其中，M：DL2000 DNA Marker；A：isdB1基因PCR产物；B：pMD18T-isdB1双酶切产物；C：isdB2基因PCR产物；D：pMD18T-isdB2双酶切产物；E：isdB3基因PCR产物；F：pMD18T-isdB3双酶切产物。

图4为pET-32a与isdB1、isdB2、isdB3片段纯化回收结果。其中，M：DL2000 DNA Marker；1：pET-32a片段；2：isdB1基因；3：isdB2基因；4：isdB3基因。

图5为重组质粒pET-isdB1、pET-isdB2、pET-isdB3的PCR及双酶切鉴定结果。其中，M：DL2000 DNA Marker；1-3：isdB1、isdB2和isdB3基因PCR产物；4-6：pET-isdB1、pET-isdB2和pET-isdB3双酶切产物。

图6为重组IsdB1蛋白表达及纯化的SDS-PAGE电泳结果。其中，M：蛋白Marker，大小从上到下依次为116.0kDa、66.2KDa、45.0kDa、35.0kDa、25.0kDa、18.4kDa、14.4kDa；1：未诱导的重组菌；2-4：依次为IPTG诱导2、3和4h的重组菌；5：IsdB1蛋白纯化结果。

图7为重组IsdB2蛋白表达及纯化的SDS-PAGE电泳结果。M：蛋白Marker；1：未诱导的重组菌；2-4：依次为IPTG诱导2、3和4h的重组菌；5：IsdB2蛋白纯化结果。

图8为重组ISDB3蛋白表达及纯化的SDS-PAGE电泳结果。其中，M：蛋白Marker；1：未诱导的重组菌；2-5：依次为IPTG诱导2、3、4和5h的重组菌；6：IsdB3蛋白纯化结果。

图9为蛋白免疫血清的Western blot结果。其中，1：IsdB1蛋白组；2：IsdB2蛋白组；3：IsdB3蛋白组；4：IsdB蛋白组；M：蛋白Marker。

图10为isdB_id-trap、isdB_id、trap基因的PCR产物的电泳分析结果。其中，M：DL2000DNA marker；1：isdB_id-trap融合基因PCR产物(1200bp)；2：isdB_id基因PCR产物(699bp)；3：trap基因PCR产物(525bp)。

图11为重组质粒pMD18T-IsdB_id-Trap的PCR及双酶切鉴定结果。

其中，M：DL2000 DNA marker；A：IsdB_id-Trap基因PCR产物；B：pMD18T-IsdB_id-Trap双酶切产物。

图12为重组质粒pET32a-IsdB_id-Trap的PCR及双酶切鉴定结果。其中，M：DL2000 DNA marker；1：IsdB_id-Trap基因PCR产物；2：pET32a-IsdB_id-Trap双酶切产物。

图13为融合蛋白IsdB_id-Trap表达及纯化的SDS-PAGE电泳结果。其中，M：蛋白marker；1：未诱导pET32a载体2：未诱导的重组菌；3-6：依次为IPTG诱导1、2、3和4h的重组菌；7：融合蛋白IsdB_id-Trap纯化结果。

图14为IsdB IgG抗体滴度变化。其中，横坐标为OD450时的吸光值，纵坐标为一免后采血时间(单位：周)。

图15为Trap IgG抗体滴度变化。其中，横坐标为OD450时的吸光值，纵坐标为一免后采血时间(单位：周)。

图16为S.aureus Newman攻毒后小鼠保护率。

图17为S.aureus wood46攻毒后小鼠保护率。

图18为S.aureus 23-1攻毒后小鼠保护率。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1金黄色葡萄球菌IsdB免疫优势片段(IsdB_id)选择和确定

1材料和方法

1.1菌株和实验动物

S.aureus Newman株(由荷兰Eijkman Winkler Laboratory ofUniversity Medical Center Utrecht惠赠；金黄色葡萄球菌凝集因子A的免疫原性.冯昊，朱战波，崔玉东等.生物工程学报，2009，25(8)：1180-1186)、S.aureus Wood46株(由黑龙江八一农垦大学提供；金黄色葡萄球菌凝集因子A的免疫原性.冯昊，朱战波，崔玉东等.生物工程学报，2009，25(8)：1180-1186)、HLJ855-23-1(为从奶牛乳房炎病牛乳中分离的菌株，由黑龙江八一农垦大学提供；金黄色葡萄球菌凝集因子A的免疫原性.冯昊，朱战波，崔玉东等.生物工程学报，2009，25(8)：1180-1186)。pMD18-T载体质粒购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司；昆明系清洁级小鼠购自中国长春生物制品所。

1.2工具酶及主要试剂

限制性内切酶BamH I、Sal I，T4 DNA连接酶，LA Taq DNA聚合酶，DL2000、DL15000，IPTG、dNTP、氨苄青霉素、Tris、EDTA-Na₂、SDS为TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司的产品；蛋白质Marker为Fermentas(MBI)公司产品；TEMED、Tween-20、考马斯亮蓝R-250、Goat anti-mouse IgG-HRP、弗氏完全和不完全佐剂均为Sigma公司产品。丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、DTT、溴酚蓝、脱脂乳购自Ameresco公司。细菌培养用Tryptone及Yerst Extract购自Oxoid公司产品；营养琼脂购自北京奥博星生物技术责任有限公司。Plasmid miniprep kit购自Axygen公司。Gel DNA purification Kit购自上海化舜生物有限公司。DAB底物显色液购自武汉博士德生物工程有限公司。杂交转移膜Nitrocellulose(0.45 Micron)Hybond^TM-C为Amersham公司产品。MagneHis^TM蛋白纯化试剂盒为Promega公司产品。

1.3引物的设计与合成

参照已发表的黄色葡萄球菌isdB基因序列，通过SMART分析软件对该基因氨基酸序列分析后，将该基因序列分为三个片段，即IsdB1区(35-280aa)、IsdB2区(300-564aa)，IsdB3区(129-361aa)。应用Oligo6.67及DNAStar软件设计三对PCR引物，分别为F1、R1(扩增isdB1基因片段)；F2、R2(扩增isdB2基因片段)；F3、R3(扩增isdB3片段)。引物位置、序列及扩增片段长度见表1。为了便于进一步定向克隆，在上游引物5′末端引入BamH I限制性酶切位点，在下游引物3’末端引入SalI限制性酶切位点(下划线所示)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1引物的序列及扩增片段长度

1.4pET32a-isdB重组菌获得、培养及质粒小量制备

将纯化的isdB3基因片段PCR产物连接至克隆载体pMD18-T，测序正确后，用BamH I和SalI进行双酶切，同时双酶切表达载体pET32a，回收产物在T4连接酶作用下连接，构建重组表达载体pET32a-isdB，将其转入到宿主菌大肠杆菌BL21菌株中，获得pET32a-isdB重组菌，该重组菌中isdB基因序列如SEQ ID No.15所示。

用接菌环沾取S.aureus pET32a-isdB重组菌甘油保存菌，于含有Amp⁺的LB固体培养基上划线培养，37℃12h后，挑取中等大小、边缘整齐的菌落，无菌接种于3mL LB/Amp⁺液体培养基中，震荡培养12h，储存备用。

质粒提取使用Axyprep Plasmid miniprep kit，按说明书进行操作。将提取的pET32a-isdB质粒用1％琼脂糖凝胶电泳，同时以pET32a空载体作对照，检查质粒大小。

1.5目的基因扩增

取纯化的S.aureus pET32a-isdB重组质粒为模板，分别PCR扩增各基因片段。isdB1基因片段的扩增反应条件：94℃预变性5min后，94℃变性45s，52℃退火50s，72℃延伸50s，进行30个循环，最后72℃延伸10min；isdB2基因片段的扩增反应条件：94℃预变性5min后，94℃变性45s，59℃退火50s，72℃延伸50s，进行30个循环，最后72℃延伸10min；isdB3基因片段的扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性50s，59℃退火50s，72℃延伸50s，进行30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增完成后，各取5μL PCR扩增产物，于1％琼脂糖凝胶中进行电泳，于紫外灯下观察和拍照。

1.6PCR产物回收与纯化

将PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳后，于紫外灯下切取含有目的DNA片段的凝胶，用DNA凝胶回收试剂盒(DNA Gel ExtractionKit)回收和纯化DNA，具体过程按照说明书进行。

1.7PCR产物与pMD18-T载体的连接转化

在PCR微量反应管中，参照pMD 18-T Vector Kit说明，将纯化的isdB1、isdB2和isdB3基因片段与pMD 18-T Vector摩尔比约为1∶3依加入下列成分：灭菌双蒸水2.3μL，pMD 18-T Vector 0.7μL，Solution I5μL，目的片段2μL，反应总体积为10μL，混匀后，16℃水浴过夜。然后，将连接产物全量加入到感受态细胞中，混匀，冰上放置30min，然后42℃热休克90s，注意不要摇动，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2min，立即加入事先预热到37℃无抗生素的800μL LB培养基，37℃空气摇床温和振荡培养1h，培养物瞬时离心，取200μL上清液，均匀涂布于含50μg/mL Amp⁺的LB平板上，待液体被吸收后倒置平板，37℃温箱中过夜培养。

1.8重组质粒的鉴定

挑取转化板上中等大小、边缘整齐的菌落，接种于3-5mLLB/Amp⁺(Amp⁺终浓度为0.1mg/mL)液体培养基中，振荡培养12h后，用Axyprep Plasmid miniprep kit提取，其具体操作按说明书进行。然后，取提取的重组质粒1μL，作50×稀释后，再用1μL作模板，按照1.5的条件进行PCR扩增；同时，另取重组质，用BamHI和SalI进行酶切。然后，将PCR扩增或酶切产物在1％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果确定重组质粒是否正确。将鉴定为阳性的重组克隆菌分别命名为pMD18T-isdB1、pMD18T-isdB2、pMD18T-isdB3，并送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。应用DNAStar软件及Blast程序将测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行比较。

1.9重组蛋白原核表达载体构建

将pET-32a质粒用限制性核酸内切酶BamHI和SalI进行双酶切，用DNA纯化/回收试剂盒进行回收。同时将重组克隆质粒pMD18T-isdB1、pMD18T-isdB2、pMD18T-isdB3分别用限制性核酸内切酶BamHI和SalI进行双酶切，用DNA纯化/回收试剂盒回收isdB1、isdB2、isdB3基因片段。在3个灭菌的PCR反应管中，分别将isdB1、isdB2、isdB3基因片段与载体pET-32a双酶切片段，在T4 Ligase作用下连接过夜，然后按前述方法进行转化，PCR及酶切检测，确定目的片段正确插入，并将鉴定为阳性的重组克隆命名为pET-isdB1、pET-isdB2和pET-isdB3，送上海生工生物工程公司测序。所获序列用Blast程序与GenBank中已发表的标准序列进行比较。

1.10重组蛋白的诱导表达

分别将测序正确的pET-isdB1、pET-isdB2、pET-isdB3重组菌接种于含Amp⁺的50mL LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀值为0.6时，取1mL菌液于1.5mL eppendorf管中，12000r/min离心1min，倒掉上清。在剩余49mL菌液中加入100mmol/L的诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L，继续剧烈振荡培养，分别在2h、3h、4h取1mL菌液，12000r/min离心1min，倒掉上清，在沉淀中加入90μL 1×上样缓冲液和10μL 1M DTT，吹打混匀，煮沸5min，取10μL在10％的SDS-PAGE进行电泳分离。电泳后取出凝胶，置于考马斯亮蓝R-250染色液中，在脱色摇床上染色1h，弃去染色液，用蒸馏水淋洗凝胶后，加入脱色液，在摇床上脱色1h，待蓝色背景消失、目的条带清晰时，用清水冲洗，照相保存。

1.11重组蛋白的纯化

重组细菌培养物生长A₆₀₀值为0.6，加入IPTG至终浓度1mm/L，继续振荡培养3h测定诱导菌的A₆₀₀值。然后，用Promega公司的MagneHis^TM蛋白纯化试剂盒进行纯化。

1.12重组蛋白的Western blot检测

在SDS-PAGE电泳结束后，将其转移至硝酸纤维膜上，然后加入5％脱脂乳的PBST，室温封闭1.5h，加入稀释的一抗，室温缓慢摇动2h。用PBST洗3次，每次10min，再加入稀释的二抗，室温缓缓摇动1h。再用PBST洗3次，每次10min。将膜浸入显色液中，观察是否有颜色条带的出现，待充分显色后立即将膜转至去离子水中，终止显色反应，记录结果。

1.13动物免疫及攻毒实验

将纯化蛋白和等体积的弗氏佐剂进行乳化，制备免疫原。取体重为18-20g的健康雌性小鼠40只，随机分成5组，分别为重组蛋白IsdB1免疫组，重组蛋白IsdB2免疫组，重组蛋白IsdB3免疫组，重组蛋白IsdB免疫组和对照组，每组8只。每只小鼠采用背部皮下注射100μg重组蛋白抗原，对照组注射等体积的佐剂与PBS混合物，首次免疫后21d进行第二次免疫，二次免疫后15d用小鼠绝对致死量进行攻毒，每日观察小鼠的死亡情况，记录时间为10d。

2结果

2.1 isdB1、isdB2、isdB3基因片段的PCR扩增结果

以重组质粒pET-isdB为模板，用设计的三对引物进行PCR扩增isdB1、isdB2、isdB3基因片段，获得的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，结果，三个PCR扩增产物分子量大小与预期的738bp、795bp、675bp基因片段大小相一致，如图1所示。

2.2 isdB1、isdB2、isdB3基因片段的T-A克隆结果

(1)目的片段回收与纯化结果

PCR扩增产物用Biospin Gel Extraction Kit进行回收和纯化后，经1％琼脂糖凝胶电泳后，电泳条带清晰，与预期大小的目的基因片段相符，如图2所示。

(2)T-A克隆的PCR及双酶切鉴定结果

将纯化的PCR产物酶切后分别连接到pMD18-T载体上，并转化到感受态细胞E.cili DH5α中，经培养后分别以疑似阳性克隆为模板，对重组克隆pMD18T-isdB1、pMD18T-isdB2和pMD18T-isdB3进行PCR鉴定，分别得到约738bp，795bp，675bp的目的基因片段。将PCR鉴定为阳性的质粒用BamHI和SalI双酶鉴定，分别获得预期大小的两个目的基因片段，如图3所示。

(3)测序结果

含pMD18T-isdB1、pMD18T-isdB2和pMD18T-isdB3质粒的重组菌于37℃培养后，送测序公司测序，用Blast软件将测序结果与Genbank上发表的S.aureus isdB基因序列(Accession No.AP009351)进行比对。结果，isdB1的核苷酸序列的Identities＝732/738(99％)，所推演的氨基酸序列Identities＝243/246(98％)，有3个氨基酸突变，即A6G、E76A、A81T。具体结果如下：

NGEAQ

AAEETGGTNTEAQPKTEAVASPTTTSEKAPETKPVANAVSVSNKEVEAPTSETKEAKEVKEVKAPKETK

VKPA

KATNNTYPILNQELREAIKNPAIKDKDHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLA

isdB2的核苷酸序列Identities＝792/795(99％)，所推演的氨基酸序列Identities＝263/265(99％)，有2个氨基酸突变，即T178I、E231A。具体结果如下：

DKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALDEQVKSAITEFQNVQPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSNKKEQQDNSAKKEA

PATPSKPTPSPVEKESQKQDSQKDDNKQLPSVEKENDASSESGKDKTPATKP

KGEVESSSTTPTKVVSTTQNVAKPTTASSKTTK

isdB3的核苷酸序列Identities＝668/675(99％)，所推演的氨基酸序列Identities＝225/225(100％)，没有氨基酸发生突变。具体结果如下：

AIKDKDHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKTLERQVYELNKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALDEQVKSAITEFQNVQPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNES

2.3 isdB1、isdB2、isdB3重组表达载体构建结果

(1)pET-32a与isdB1、isdB2、isdB3基因片段纯化回收结果

将原核表达载体pET-32a与pMD18T-isdB1、pMD18T-isdB2和pMD18T-isdB3重组质粒分别用BamH I和Sal I进行双酶切，回收，产物经1％的琼脂糖凝胶电泳。结果可见PET-32a载体(长约5900bp)及isdB1基因片段(738bp)、isdB2基因片段(795bp)、isdB3基因片段(675bp)回收大小正确，条带清晰、纯净，未见杂DNA混合物，如图4所示。

(2)重组表达载体的PCR及双酶切鉴定结果

对重组质粒pET-isdB1、pET-isdB2、pET-isdB3进行了PCR鉴定，分别得到约738bp，795bp，675bp大小的目的基因片段，将PCR鉴定为阳性的质粒用BamH I和SalI双酶鉴定，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，每组分别获得预期大小的两个目的基因片段，如图5所示。

2.4重组蛋白IsdB1、IsdB2、IsdB3的表达及纯化结果

含重组质粒pET-isdB1、pET-isdB2、pET-isdB3的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导处理后，进行SDS-PAGE分析。与未诱导对照及蛋白质分子量Marker相比，诱导菌分别在相应的位置有一大量表达的蛋白条带，与IsdB1融合蛋白(51kDa)、IsdB2融合蛋白(53kDa)、IsdB3融合蛋白(47kDa)的分子量相一致；通过镍颗粒纯化方法获得比较纯净的重组蛋白，如图6-图8所示。

2.5重组蛋白Western Blot比较结果

以全菌体抗血清为一抗，作1∶100倍稀释；以Goat anti-mouseIgG-Peroxidase为二抗，作1∶2000倍稀释，与各重组菌表达产物及IsdB全蛋白进行Western blot检测，结果IsdB3蛋白和IsdB蛋白能与全菌体免疫血清发生特异性结合，结果见图9。

2.6重组蛋白IsdB1、IsdB2、IsdB3的免疫保护结果

各蛋白免疫组和对照组试验动物在二免后15d，用2.5×10^1OCFUS.aureus Newman株攻毒。攻毒后连续10d观察动物的存活状况。结果，IsdB1免疫组在1d全部死亡，而对照组9d全部死亡时IsdB2组存活2只，IsdB3组存活3只，IsdB全蛋白组存活3只(表2)。从结果中可以看出，IsdB3和IsdB蛋白免疫组具有相同的保护率。

以上说明，IsdB3具有与IsdB相同的免疫原性和免疫保护作用，为免疫优势片段。

表2金黄色葡萄球菌Newman株攻毒结果

实施例2金黄色葡萄球菌IsdB_id-TRAP融合蛋白在大肠杆菌中的表达

1材料

菌株、工具酶、主要试剂及试剂盒等，同实施例1。

2方法

2.1引物的设计与合成

根据已发表的Trap基因序列及上述实施例一试验选择确定的IsdB免疫优势片段(isdB_id)序列，应用Oligo6.67及DNAStar软件设计两对PCR引物，分别命名为F1、R1(用于克隆isdB_id基因片段)和F2、R2(用于克隆trap基因片段)，R1和F2含有互补linker(加黑字母所示)。应用重叠延伸PCR方法，利用含有连接肽的引物F1、R2连接扩增isdB3-trap基因片段。在上游引物F1的5’末端引入限制性酶切位点BamHI(下划线所示)，下游引物R2的5’末端引入限制性酶切位点SalI(下划线)所示。引物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成。

F1：5’-GGATCCAATCAGGAACTTAGAGAAGCGATTA-3’                699bp

R1：5’-

AGATTCGTTATTCTCAACAC-3’

F2：5’-

ATTTATATACATCTTATGGG-3’  525bp

R2：5’-CGGTCGACAATCTATTCTTTTATTGGGT-3’

2.2PCR扩增isdB_id基因和trap基因

isdB_id基因片段的扩增：以IsdB重组质粒为模板，以F1、R1为引物进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变5min；94℃变性50s，58.5℃退火50s；72℃延伸50s，共30个循环；72℃延伸10min。

trap基因片段的扩增：以trap重组质粒为模板，以F2、R2为引物进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性50s，55℃退火45s，72℃延伸50s，共30个循环；72℃延伸10min。

各取5μL PCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶中进行电泳，于紫外灯下观察和拍照。

2.3PCR扩增isdB_id-trap基因

以回收的isdB_id、trap基因PCR扩增产物为模板，以F1、R2为引物进行重叠延伸PCR扩增。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性50s，58.5℃退火50s，72℃延伸50s，共30个循环；72℃延伸10min，PCR产物于4℃保存。

2.4融合基因isdB_id-trap重组克隆质粒的构建、鉴定和测序

具体方法见实施例一。

2.5融合基因isdB_id-trap原核表达载体的构建、鉴定和表达

具体方法见实施例一。

3结果

3.1 isdB_id、trap、isdB_id-trap基因片段的PCR扩增结果

PCR扩增的isdB_id基因和trap基因产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，获得了预期大小含有linker的目的基因片段。再以纯化的isdB_id、trap PCR扩增产物为模板，以F1、R2为引物进行重叠延伸PCR扩增，结果获得了预期大小为1200bp的isdB_id-trap融合基因片段(图10)。

3.2 isdB_id-trap克隆的PCR及双酶切鉴定结果

将纯化的isdB_id-trap融合基因片段克隆到pMD18T上，转化后选取疑似阳性质粒为模板，对重组克隆pMD18T-isdB_id-trap进行PCR和BamH I、Sal I双酶鉴定，酶切产物用1％的琼脂糖凝胶电泳，获得预期大小的两个目的基因片段(图11)。isdB_id-trap融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.3测序结果

所测得的序列用Blast软件与Genbank上发表的S.aureus isdB基因(Accession No.AP009351)及trap基因(Accession No.EU754884)序列进行比较。结果Identities＝1189/1200(99％)。

3.4重组表达载体pET32a-isdB_id-trap的PCR及酶切鉴定结果

将原核表达载体pET-32a与isdB_id-trap基因片段链接后，转化至感受态细胞E.coli DH5α，选取克隆进行PCR鉴定、双酶切(BamH I和Sal I)鉴定。经电泳分析，PCR、双酶切鉴定结果均为阳性(图12)。

3.5重组蛋白IsdB3-Trap的表达及纯化结果

含重组质粒pET32-isdB_id-trap的E.coli，经IPTG诱导处理后，进行SDS-PAGE分析。与未诱导对照及蛋白质分子量Marker相比，诱导菌在约66.2kDa处有一大量表达的蛋白条带，与IsdB3-Trap重组融合蛋白大小(64kDa)相一致；通过镍颗粒纯化方法获得比较纯净的重组蛋白(图13)。

实施例3IsdB3-Trap、IsdB、Trap蛋白免疫效果对比

1材料

1.1重组蛋白：纯化过的IsdB_id-Trap、IsdB、Trap蛋白。

1.2ELISA检测试剂及试剂盒：酶标板为Corning公司产品；Goatanti-mouse IgG-HRP购自北京博奥森生物技术有限公司；goatanti-mouse interleukin 2、4及goat anti-mouseγinterferon细胞因子ELISA定量检测试剂盒为美国R&D公司产品。

1.3试验小鼠、免疫佐剂及其他试剂：同实施例1。

2实验方法

2.1免疫原制备及动物免疫

取18-20g健康雌性小鼠228只，随机分成5组，分别为融合蛋白IsdB_id-Trap免疫组、重组蛋白IsdB免疫组，重组蛋白Trap免疫组，重组蛋白IsdB与Trap混合免疫组(IsdB+Trap)、PBS作对照免疫组，每组45只。注射剂量均为100μg/只。每组的蛋白质抗原与等体积的弗氏佐剂进行充分乳化，然后采用背部皮下注射，第一次免疫后21d加强免疫。于第一次免疫0d取3只小鼠采血，此后于第一次免疫后7d、14d、21d、28d、35d进行采血，每次每组采血3只，分离血清，-20℃保存备用。

2.2抗体水平检测

用间接ELISA检测分离的血清样本中IgG含量。IsdB和TRAP抗原均以10μg/mL浓度，每孔100μL包被96孔酶标板，37℃两小时，然后用PBST洗涤。每孔加100μL5％脱脂乳的PBST封闭液，37℃封闭1h，洗涤；每孔加入PBS稀释的待检免疫血清，37℃孵育1h，洗涤；每孔加入PBS稀释的Goat anti-Mouse IgG-Peroxidase二抗，37℃孵育1h，洗涤；每孔加入100μL TMB显色液，室温显色10min后每孔加入50μL 2M的硫酸终止反应，测OD450nm吸光值。分析结果。当样品OD450值≥(阴性血清的OD450值+3倍标准方差)时即为阳性。

2.3细胞因子检测

对二免14d的蛋白免疫组血清样本中的IL-2、IL-4和IFN-γ浓度进行检测。按细胞因子ELISA定量检测试剂盒的操作步骤进行。

2.4免疫小鼠攻毒试验

在加强免疫后14d，将各组剩余的30只小鼠再随机分为3组，每组10只，分别以S.aureus Newman株为3×10¹⁰CFU的剂量、S.aureusWood46株为3×10⁹CFU的剂量、HLJ/855/23-1株为2×10¹⁰CFU的剂量，以腹腔注射进行攻毒。每日观察小鼠的死亡情况，并从死亡小鼠体内分离细菌。观察记录结果一周。

3结果

3.1免疫小鼠血清抗体滴度变化

将每份待检动物的血清做倍比稀释，每组三只小鼠血清，以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠为二抗，做间接ELISA检测，结果以阴性血清OD₄₅₀平均值加3倍标准差为阳性。将各周采血所得血清按1∶100倍稀释，进行间接ELISA检测，检测结果详见表3、4。根据表3、4的结果绘制图14和图15。

表3各免疫组免疫鼠血清IsdB IgG水平

表4蛋白免疫组免疫鼠血清TRAP IgG水平

3.2免疫组及对照组鼠血清细胞因子含量对比

应用goat anti-mouse interleukin 2、goat anti-mouse interleukin 4及goat anti-mouseγinterferon细胞因子ELISA定量检测试剂盒对蛋白免疫组、及对照组血清中的细胞因子的浓度进行定量检测。按照试剂盒操作要求进行ELISA，获得数据后以标准品A₄₅₀OD值为纵坐标轴，以标准品的浓度为横坐标，为应用Excel 2003软件绘制标准曲线。按照软件生成的标准曲线方程，根据所测样品OD值计算相应细胞因子的浓度见表5，所得结果经t-检验表明蛋白免疫组实验动物的IL-2、IL-4及IFN-γ浓度与对照组比较差异显著(p值均小于0.05)。

表5免疫组及对照组鼠血清细胞因子含量对比(M±SD)

注：*与IsdB、TRAP、IsdB+Trap联合免疫组及PBS(对照)组比较，均有显著性差异(p＜0.05)

3.3融合蛋白免疫保护结果

各蛋白免疫组、全菌体免疫组及对照组实验动物在二免后14d，分别用S.aureus Newman、Wood46、23-1三种菌株攻毒。攻毒后连续7d观察实验动物的死亡状况。结果，Newman株攻毒组中，在对照小鼠全部死亡时，免疫组IsdB_id-Trap、IsdB、TRAP、IsdB+TRAP的保护率均分别为80％、40％、60％、50％；Wood46株攻毒组中，在对照小鼠全部死亡时，免疫组IsdB_id-Trap、IsdB、TRAP、IsdB+TRAP的保护率分别为70％、70％、40％、60％；23-1株攻毒组中，在对照小鼠全部死亡时，免疫组IsdB_id-Trap、IsdB、TRAP、IsdB+TRAP的保护率均分别为60％、40％、30％、40％。(图16-图18)

以上结果表明，本发明IsdB_id-TRAP融合蛋白疫苗的免疫效果优于IsdB和TRAP单独免疫以及IsdB与TRAP混合在一起免疫的免疫效果，是制备金黄色葡萄球菌疫苗理想的候选抗原，即本发明的融合蛋白具有更好的免疫原性及免疫保护作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.金黄色葡萄球菌IsdB_id-TRAP融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述融合蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No.2所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。

6.权利要求1所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，将权利要求2或3的基因克隆至原核细胞中进行异源表达，并纯化该融合蛋白。

7.权利要求1所述融合蛋白在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用。

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