CN110055276A

CN110055276A - 一种金葡菌靶向抗菌肽细菌诱导型表达载体及其重组细胞

Info

Publication number: CN110055276A
Application number: CN201910081880.2A
Authority: CN
Inventors: 罗艳; 张振仓; 薛增迪; 高睿; 白军; 沈文正
Original assignee: Yangling Vocational and Technical College
Current assignee: Yangling Vocational and Technical College
Priority date: 2019-01-28
Filing date: 2019-01-28
Publication date: 2019-07-26

Abstract

本发明公开了一种金葡菌靶向抗菌肽细菌诱导型表达载体及其重组细胞，金葡菌靶向抗菌肽细菌诱导型表达载体包括IsdB单链抗体基因，HBD3基因，和BCE1‑IL1α复合型启动子；将细菌诱导型表达载体pIsBD转染山羊乳腺上皮细胞，获得重组细胞。本发明提供的一种金葡菌靶向抗菌肽细菌诱导型表达载体及其重组细胞，用于抗乳腺炎。

Description

一种金葡菌靶向抗菌肽细菌诱导型表达载体及其重组细胞

技术领域

本发明涉及动物抗病育种技术领域，更具体的说是涉及一种金葡菌靶向抗菌肽细菌诱导型表达载体及其重组细胞。

背景技术

乳腺炎是由病原菌引起的乳腺炎症反应，该病造成巨大经济损失，给世界奶业的发展带来了巨大的障碍。导致乳腺炎发生的病原菌可达上百种，其中金黄色葡萄球菌是一种最为重要的乳腺炎病原菌。临床上主要采用抗生素治疗乳腺炎，造成了耐药菌产生和药物残留等问题。金葡菌的多重耐药性使传统的抗生素治疗方法无法获得满意的效果，其治愈率较低。疫苗本应成为一种理想的乳腺炎防治措施，但由于细菌的基因遗传变异，而导致疫苗的保护效果不理想。人β-防御素3(humanβ-defensin 3，HBD3)具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有活性，尤其对金黄色葡萄球菌具有强烈的杀伤性，并可杀灭多重耐药的金黄色葡萄球菌，病原微生物对其不易产生耐药性。但HBD3对骨架系统比较发达的哺乳动物细胞无伤害作用，安全性较高。

研究人员利用分子生物学和胚胎体外生产技术，制备了多种抗乳腺炎动物模型，结果表明，乳腺表达抗菌肽能够显著提高动物抗乳腺炎能力，该技术为防治乳腺炎提供了一条重要途径。在上述研究中，乳蛋白启动子用于驱动抗菌肽表达，在泌乳期外源抗菌肽随着乳蛋白表达而表达，从而防止病原菌感染乳腺组织。但是这种策略存在一些问题：首先，除了泌乳期之外，干奶期和转化期也是乳腺炎易感时期，而抗菌肽只在泌乳期表达，不能防止干奶期乳腺炎的发生；其次，HBD3在乳腺泌乳期持续表达，对乳品安全和乳腺生理功能可能存在不安全因素。因此，在抗乳腺炎动物进入生产应用之前，必须解决上述安全性问题。而且，研究发现防御素在体内的半衰期较短，体内注入防御素几分钟到数小时后，血液中的防御素就会被清除，在一定程度上抑制了防御素到达靶标区发挥其活性。

因此，提供一种金葡菌靶向抗菌肽细菌诱导型表达载体及其重组细胞，用于抗乳腺炎，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种金葡菌靶向抗菌肽细菌诱导型表达载体及其重组细胞，用于抗乳腺炎。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种金葡菌靶向抗菌肽细菌诱导型表达载体，包括IsdB单链抗体基因，HBD3基因，和BCE1-IL1α复合型启动子。

进一步，一种金葡菌靶向抗菌肽细菌诱导型表达载体的构建方法，具体步骤如下：

(1)制备IsdB单克隆抗体；

(2)制备抗IsdB单链抗体-HBD3融合蛋白；

(3)优化细菌诱导型启动子，获得BCE1-IL1α复合型启动子；

(4)将IsdB-HBD3融合蛋白基因置换载体pSBD中HBD3基因，BCE1-IL1α复合型启动子置换载体pSBD中IL1α启动子，获得IsdB-HBD3细菌诱导型表达载体pIsBD。

进一步，所述金葡菌靶向抗菌肽细菌诱导型表达载体在抗乳腺炎中的应用。

进一步，一种含有金葡菌靶向抗菌肽细菌诱导型表达载体的重组细胞，将细菌诱导型表达载体pIsBD转染山羊乳腺上皮细胞，获得重组细胞。

进一步，所述含有金葡菌靶向抗菌肽细菌诱导型表达载体的重组细胞，在抗乳腺炎中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种金葡菌靶向抗菌肽细菌诱导型表达载体及其重组细胞，用于抗乳腺炎。

本发明将特异性抗原识别结构域和HBD3融合，利用细菌诱导型启动子调控该融合蛋白表达，防治乳腺炎相关细菌感染；当病原菌侵入乳腺或感染乳腺上皮细胞时，乳腺上皮细胞能够表达多种细胞因子、化学因子和抗菌肽等，对抗乳腺炎相关细菌感染，如Toll-like receptors(TLRs)和Interleukin-1β(IL-1β)；应用这些因子的启动子构建细菌诱导型基因表达载体，实现抗病基因的诱导性表达；铁调控表面决定簇B(iro-regulatedsurface determinant B，IsdB)是一种金黄色葡萄球菌表面蛋白，也是一种葡萄球菌血红蛋白受体；单克隆抗体2H2.BE11是金黄色葡萄球IsdB的特异性单克隆抗体，且其在体内具有较高亲和性；利用细菌诱导型启动子调控抗IsdB单链抗体-HBD3融合蛋白在乳腺组织中表达，在时间和空间上精确控制抗菌肽的表达，既能起到高效抗菌作用，又不影响乳品安全和乳腺生理功能。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明IsdB蛋白与不同的抗IsdB蛋白抗体反应的western-blotting检测结果；

其中，泳道1-10分别是细胞克隆6C4H3、6F2F6、6G7E4、6G10E6、6H12A9、7C2A8、7G6F7、7G12G10、7H1G4、7H2D3分泌的抗体检测结果；泳道11是1:100稀释的IsdB蛋白免疫小鼠抗血清的检查结果；

图2附图为本发明不同的金葡菌裂解产物与不同的单克隆抗体反应的western-blotting检测结果；

其中，泳道1-5分别是金葡菌ATCC25923，CVCC3053，CVCC3054，地方分离株572Q(前面4种菌都是在缺铁培养基RPMI-1640中培养)以及TSB培养基培养的ATCC25923；

图3附图为本发明单克隆抗体6G10E6纯化检测的SDS-PAGE结果；

其中，泳道1是小鼠抗血清，泳道2是单克隆抗体6G10E6；

图4附图为本发明纯化后的单克隆抗体6G10E6western-blotting检测结果图；

其中，泳道1和2分别是100ng IsdB蛋白和50ng IsdB蛋白与纯化后的单克隆抗体6G10E6间的反应结果图；泳道3是100ng IsdB蛋白与1:100稀释的小鼠抗血清间的反应结果图；泳道4是100ng IsdB蛋白与小鼠阴性血清的反应结果图；

图5附图为本发明抗IsdB单链抗体-HBD3融合表达载体pFH在293细胞中的转染；

其中，左图是转染后36h，EGFP在转染细胞中的表达；右图是转染后36h明场下转染细胞的图像；

图6附图为本发明293细胞中表达的抗IsdB单链抗体-HBD3融合蛋白的western-blotting检测结果；

其中，泳道1是非转染的293细胞上清；泳道2是非转染的293细胞裂解物；泳道3和4是转染的293细胞上清；5和6是转染的293细胞裂解物；

图7附图为本发明抗IsdB单链抗体-HBD3融合蛋白纯化检测SDS-PAGE结果；

其中，购自Sigma公司的BSA作为对照；M表示蛋白marker；

图8附图为本发明抗IsdB单链抗体-HBD3融合蛋白抗菌活性的平板计数结果图；

其中，抗菌肽与细菌的作用时间为2h，抗菌肽的浓度为1mg/ml；

图9附图为本发明不同浓度的抗菌肽抗金葡菌活性的对比分析结果；

图10附图为本发明pGL4.10质粒图谱；

图11附图为本发明pGL4.10-α-BCE1质粒图谱；

图12附图为本发明pGL4.10-BCE1质粒图谱；

图13附图为本发明修饰后的细菌诱导启动子在HK293细胞中的蛋白表达调控活性分析；

图14附图为本发明修饰后的细菌诱导启动子在山羊乳腺上皮细胞中的蛋白表达调控活性分析；

图15附图为本发明修饰后的细菌诱导启动子在山羊肺上皮细胞中的蛋白表达调控活性分析；

图16附图为本发明修饰后的细菌诱导启动子在小鼠肠上皮细胞中的蛋白表达调控活性分析；

图17附图为本发明pSBD质粒图谱；

图18附图为本发明pIsdB质粒图谱；

图19附图为本发明转染pIsdB的山羊乳腺上皮细胞克隆；

其中，左图是明场下羊乳腺上皮细胞克隆的图像；右图是EGFP在羊乳腺上皮细胞克隆中的表达图像；

图20附图为本发明细菌感染后转染的山羊乳腺上皮细胞中IsdB单链抗体-HBD3融合蛋白表达的ELISA检测结果；

图21附图为本发明细菌感染后转染的山羊乳腺上皮细胞中IsdB单链抗体-HBD3融合蛋白表达的western-blotting检测结果；

其中，PC表示阳性对照；NC表示阴性对照；E表示大肠杆菌；S表示金葡菌。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1IsdB单克隆抗体的制备

将合成的IsdB蛋白DNA序列(SEQ ID NO.1)插入pET30a构建IsdB蛋白原核表达载体，经转染和诱导使IsdB蛋白在大肠杆菌中得到表达，后经His亲和层析纯化，得到SDS-PAGE纯度大于80％，浓度约为0.6mg/ml的IsdB蛋白。经快速免疫法将纯化浓缩的蛋白IsdB免疫Balb/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0电融合，经HAT培养基选择培养，2次间接ELISA法检测，得到18个疑似阳性母克隆孔，采用梯度稀释法进行亚克隆，7天后每株挑选细胞株的一个子克隆扩增于24孔板，进行效价、类型、浓度和Western blot鉴定，结果显示10个细胞株的抗体效价>1:2,430，其中4个细胞株所产生的抗体类型为IgG2a,k，4个为IgG1,k，2个为IgG2b,k；抗体浓度最高为60.693μg/ml，最低为2.107μg/ml。免疫印迹结果显示该10个抗体都能有效识别纯化的IsdB蛋白，结果如图1所示。而细胞株6G10E6所产生的抗体对限制性培养(缺铁培养基RPMI-1640)的金黄色葡萄球菌裂解物的特异性识别效果最佳，结果如图2所示。最后挑取杂交瘤细胞株6G10E6通过动物体内诱生法进行小鼠腹腔内接种制备大量单克隆抗体。并将获得的腹水经蛋白A亲和层析树脂纯化和浓缩，得到浓度为2.071mg/ml，SDS-PAGE纯度为95％，效价>1:512,000的纯化抗体，结果如图3和图4所示。

实施例2抗IsdB单链抗体-HBD3融合蛋白的制备

将合成的抗IsdB单链抗体-HBD3基因序列(SEQ ID NO.2)插入载体pEGFP-C1中组建抗IsdB单链抗体-HBD3融合表达载体pFH。通过脂质体2000瞬时转染293细胞，结果如图5所示。westernblot对细胞培养液和细胞裂解产物初步检测融合蛋白表达情况，结果如图6所示，在细胞培养液和细胞裂解液中都能检测到融合蛋白的表达。ELISA检测显示，其在293细胞培养液中的融合蛋白浓度为1ug/ml，细胞裂解液中的浓度为10ug/ml。经亲和层析纯化和浓缩，得到SDS-PAGE纯度约为90％，如图7所示，浓度为1mg/ml的纯化融合蛋白。

实施例3融合蛋白的亲和性检测

参照Beatty等建立的非竞争ELISA法测定抗体亲和力常数的方法，计算公式改良为Kaff＝1/{2[Ab']t-[A b]t}，分别用2个浓度的抗原(一个浓度值为1mg/ml，另一个浓度值为0.5mg/ml)检测梯度稀释抗体，测定光密度值。

应用生物学统计软件SPSS18分别分析不同种抗原浓度和抗体浓度的对数与光密度值之间的关系并拟合曲线。根据拟合的两条曲线，分别计算1/2最大D值时抗体的实际浓度[Ab]t和[Ab']t，根据公式Kaff＝1/{2[Ab']t-[A b]t}计算亲和常数。亲和力测定结果显示，融合蛋白的亲和常数Kd为3.31×10^-7mol/L，与抗IsdB蛋白单克隆抗体的亲和力Kd值6.19×10^–8mol/L相比，两组亲和常数存在着近5倍的差异。尽管单链抗体-HBD3融合蛋白对IsdB蛋白的亲和力不及单克隆抗体好，但其对IsdB蛋白仍具有较高的亲和力。

为验证融合蛋白和IsdB蛋白单克隆抗体结合IsdB蛋白位点相同，采用直接竞争ELISA技术进一步检测融合蛋白对IsdB蛋白单克隆抗体结合IsdB蛋白的抑制活性。实验中保持每组抗原IsdB蛋白量(1mg/ml,50ul)不变，再加入50ul不同浓度稀释(1:1,5,10,20,50)的融合蛋白，室温1h，洗涤后，加入HRP标记的抗IsdB单克隆抗体，同时以未加入融合蛋白(加入PBS)的检测结果为对照。实验重复3次，酶联检测仪读取OD450值，结合抑制率是通过计算样品孔平均OD450值与PBS阴性对照孔平均OD450值的百分率来评估。

结果显示，当融合蛋白1∶50稀释时，抗IsdB单克隆抗体的结合抑制率为15.37％；当融合蛋白1∶1稀释时，抗IsdB单克隆抗体的结合抑制率提高到了75.68％。结果表明，融合蛋白和抗IsdB单克隆抗体的抗原结合位点相同。综合亲和常数和抗原位点结合抑制率的检测结果，抗IsdB单链抗体-HBD3融合蛋白具有有效结合金黄色葡萄球菌IsdB蛋白的活性。

实施例4融合蛋白的杀菌活性检测

通过倍比稀释法和琼脂平板细菌菌落计数，检测融合蛋白抗菌活性。实验分为抗IsdB单链抗体-HBD3融合蛋白处理组，HBD3标准品阳性处理组，PBS阴性处理组，每个处理组又分不同浓度，添加1×10⁷cfu/ml金黄色葡萄球菌，处理1，2，6h后，取培养液，经倍比稀释接种于琼脂平板上，培养过夜，计数菌落数。实验重复3次。菌落数统计结果显示，处理时间为2小时时抗IsdB单链抗体-HBD3融合蛋白处理组，HBD3标准品阳性处理组较PBS阴性对照组能达到最佳杀菌效果。实验结果显示，浓度为0.2mg/ml时融合蛋白检测组与PBS阴性处理组(1.3×10⁷cfu/ml)相比较，该融合蛋白(1.5×10⁵cfu/ml)对金黄色葡萄球菌的杀菌效果开始显示显著差异，结果如图8所示；当融合蛋白浓度为1mg/ml时，较阴性对照组其杀菌效果最佳(8×10⁴cfu/ml)，比HBD3对照处理组(4.3×10⁵cfu/ml)高出5倍，结果如图9所示。

实施例5

(1)细菌诱导型启动子的优化

细菌诱导型质粒整合于乳腺之外的组织细胞后，可能会在其他细胞中被诱发启动表达抗菌肽。如果在肠道细胞中表达，可能会导致肠道内正常菌群的失衡，从而影响正常肠道功能。因此，如果所构建的细菌诱导型载体具有乳腺组织特异性，这将可以避免此类情况的发生。对此，我们对细菌诱导型启动子进行优化分析。

根据NCBI网站公布的牛酪蛋白增强子(BCE1)基因序列(SEQ ID NO.3)，设计相应的PCR引物，引物序列如下：

BCE1-F：5’-CGGGGTACCGACAGTCATTAGGAAATTCTCTG-3’；SEQ ID NO.4；

BCE1-R：5’-CGAGCTCTATGTGTTAGCTTTTGGTTGC-3’；SEQ ID NO.5；

引物BCE1-F和BCE1-R序列下划线部分分别是KpnⅠ和SacⅠ酶切位点序列。

以牛基因组DNA为模板，PCR扩增160bp的BCE1，并将其插入构建好的IL1-α启动子荧光素酶检测报告载体pGL4.10-α(图10)和pGL4.10(荧光素酶报告载体)中，分别构建载体pGL4.10-α-BCE1(图11)和pGL4.10-BCE1(图12)。

(2)检测细菌诱导型启动子组织特异性

参照荧光素酶报告系统检测试剂盒说明，将构建好的载体pGL4.10-α和pGL4.10-α-BCE1转染HK293细胞、山羊乳腺上皮细胞(GMEC)、山羊肺上皮细胞(GLEC)和小鼠肠上皮细胞(MIEC)，并以转染pGL4.10和pGL4.10-BCE1的相应细胞为对照。转染中，使用Roche公司的X-tremeGENE HP转染试剂分别将以上三种质粒与内参质粒pGL4.73(海肾荧光素酶报告载体)均以10:1的比例共转HEK293T细胞。在转染36h后，应用灭活的大肠杆菌和金葡菌进行诱导8h。最后，通过perkin ElmerVictorX5系统分别检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性。结果显示为海参荧光素酶/萤火虫荧光素酶活性的比值，处理组再与对照组进行比较。结果显示，在无诱导的HEK293T细胞中pGL4.10-α的活性高于pGL4.10和pGL4.10-BCE1对照组；灭活菌诱导下pGL4.10-α在HEK293T细胞中的活性明显强于对照组pGL4.10和对照组pGL4.10-BCE1；pGL4.10-α的PBS处理组与细菌诱导组相比较，细菌诱导组pGL4.10-α活性增强，差异显著。pGL4.10-α-BCE1PBS处理组与细菌诱导组相比较，诱导后pGL4.10-α-BCE1活性较无诱导组增强，差异显著；但是在诱导和无诱导情况下，pGL4.10-α-BCE1的活性差异大小不如pGL4.10-α组的对比结果，如图13所示。

整体来说，在山羊IL1-α启动子序列中加入BCE1原件后，对IL1-α启动子细菌诱导活性影响不大。在山羊乳腺上皮细胞(GMECs)中，对照组pGL4.10和pGL4.10-BCE1有无细菌诱导，转染细胞的荧光素酶活性基本无差异；无诱导(PBS处理组)情况下，pGL4.10-α和pGL4.10-α-BCE1组的荧光素酶活性相对于pGL4.10组均有所提升，但差异不明显；无诱导情况下pGL4.10-α和pGL4.10-α-BCE1组之间的差异也不明显；pGL4.10-α组在有无细菌诱导下荧光素酶活性差异也不大；而pGL4.10-α-BCE1组在细菌诱导下荧光素酶活性明显高于无诱导组，如图14所示。说明BCE1在GMECs中明显地增强IL1α启动子细菌诱导活性。

在山羊肺上皮细胞(GLEC)中，有无细菌诱导pGL4.10-α和pGL4.10-BCE1对照组以及pGL4.10-α-BCE1组荧光素酶活性变化都不大，pGL4.10-α-BCE1组较两对照组只是略有升高；在有无细菌诱导下，pGL4.10-α组荧光素酶活性较pGL4.10-α-BCE1组增加1倍多；但pGL4.10-α组细菌诱导组较PBS处理组，其荧光素酶活性变化不大，如图15所示。说明在山羊肺上皮细胞中，IL1α启动子的细菌诱导活性较弱，并且BCE1可在一定程度上抑制IL1α启动子活性。

在小鼠肠上皮细胞(MIEC)中，有无细菌诱导，pGL4.10-α-BCE1组和对照组pGL4.10，pGL4.10-BCE1的荧光素酶活性基本无变化；并且pGL4.10-α组较这3组在有无细菌诱导下其荧光素酶活性都显著高于各组；而pGL4.10-α组在细菌诱导下，其荧光素酶活性较PBS处理组也有增强，如图16所示。说明在小鼠上皮细胞中，BCE1抑制了IL1α启动子细菌诱导活性。

综合以上结果表明，BCE1原件可以增强IL1α启动子的乳腺特异性细菌诱导活性，并有效的限制IL1α启动子在小鼠肠上皮细胞中的活性。

实施例6IsdB-HBD3融合蛋白细菌诱导型表达载体的构建

本课题组在前期的研究中，应用phiC31整合酶系统和cHS4绝缘子和β-酪蛋白启动子等基因调控元件构建了HBD3乳腺特异性表达载体pSBD，并在山羊乳腺上皮细胞中对HBD3表达效率进行了检测。将IsdB-HBD3融合蛋白基因置换载体pSBD(图17)中HBD3基因，BCE1-IL1α复合型启动子置换载体pSBD中IL1α启动子，构建IsdB-HBD3诱导型表达载体pIsBD，图谱如图18所示，转染山羊乳腺上皮细胞，筛选表达EGFP的细胞株，如图19所示，用于后续实验。

实施例7融合蛋白在山羊乳腺上皮细胞中的诱导型表达

参照HD转染试剂盒说明书将整合酶表达载体pCMVint和pIsBD共转染山羊乳腺上皮细胞，并经药物G418筛选细胞克隆，应用灭活大肠杆菌和金葡菌进行诱导，不同诱导时间收集的培养液ELISA检测结果显示，转染pIsBD组的灭活大肠杆菌和金葡菌组诱导后3h就能检测到IsdB单链抗体-HBD3融合蛋白表达，灭活大肠杆菌诱导组目的蛋白诱导表达量在诱导3h为最高，表达量约为23mg/L，之后逐渐慢慢下降；而灭活金葡菌诱导组目的蛋白在诱导后6h较3h发生下降，但是9h目的蛋白表达量有有所回升，12h后降低，诱导后9h目的蛋白表达量最高，约为9mg/L，如图20所示。对诱导后3-24h收集的细胞培养液进行westernblot验证，结果显示灭活大肠杆菌诱导后3h、6h、12h和24h都能检测到目的蛋白表达；金葡菌诱导后3h、6h和12h可检测到目的蛋白表达，但24h后检测不到蛋白表达，如图21所示。

上述结果表明，构建的细菌诱导表达载体pIsBD在山羊乳腺上皮细胞中能对灭活的大肠杆菌和金葡菌做出反应，诱导表达IsdB-HBD3融合蛋白。为后续融合蛋白在小鼠乳腺中的功能检测打下了基础。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 杨凌职业技术学院

<120> 一种金葡菌靶向抗菌肽细菌诱导型表达载体及其重组细胞

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1068

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atgaacaaac agcagaaaga attcaaatcg ttttacagca ttcgcaaatc cagcctgggc 60

gtggcgtccg tcgcaatcag caccctgctg ctgctgatgt ctaacggcga agcacaggcg 120

gccgcagaag aaacgggcgg tacgaatacc gaagcgcaac cgaaaaccga agccgtggca 180

tcaccgacca cgacctcgga aaaagcgccg gaaacgaaac cggtggctaa cgcggtgtca 240

gtttcgaata aagaagttga agcgccgacg agcgaaacca aagaagccaa agaagtcaaa 300

gaagtgaaag caccgaaaga aacgaaagct gttaaaccgg ctgccaaagc cacgaacaat 360

acctatccga ttctgaacca ggaactgcgt gaagccatta aaaatccggc aatcaaagat 420

aaagaccata gtgcaccgaa ctcccgcccg atcgatttcg aaatgaaaaa agaaaacggt 480

gaacagcaat tctaccacta cgcgagctct gtgaaaccgg cccgtgttat ttttaccgat 540

agcaaaccgg aaatcgaact gggcctgcag tctggtcaat tttggcgcaa attcgaagtc 600

tatgaaggcg acaaaaaact gccgattaaa ctggtcagtt acgataccgt gaaagactat 660

gcgtacattc gttttagcgt ttctaacggt acgaaagccg ttaaaatcgt cagttccacc 720

catttcaaca acaaagaaga aaaatacgat tacacgctga tggaatttgc acagccgatc 780

tataattccg ctgataaatt caaaaccgaa gaagactaca aagctgaaaa actgctggcg 840

ccgtacaaaa aagccaaaac cctggaacgc caggtgtacg aactgaacaa aatccaagat 900

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ctggacgaac aggttaaaag tgctatcacc gaattccaga atgtccaacc gacgaatgaa 1020

aaaatgaccg acctgcaaga cacgaaatac tggtacgaat ccgttgaa 1068

<210> 2

<211> 996

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ggatccagag ccatgaaggt cctcatcctt gcctgcctgg tggctctggc ccttgcagat 60

attgtgatga cccagtctcc agcaatcatg tctgcatctc caggggagaa gatcaccatg 120

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agtggcggtg ggtctgggac ctctttctct ctcacaatca gcagcatgga ggctgaagat 300

gctgccactt attactgcca gcagtggagt agtaacccac tcacgttcgg tgctgggacc 360

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tcacagaacc tgtccatcac ttgcactgtc tctgggttct cattatcccg ctatggtgta 540

cactgggttc gccagcctcc aggaaagggt ctggagtggc tgggactaat atgggctggt 600

ggagtcacaa tttataattc gactctcatg tccagactga gcatcagcaa agacagctcc 660

aagagccagg ttttcctaaa aatgaacagt ctacaaattg atgacacagc catttactac 720

tgtgccagag aagcatctcg ggaccactac tttgactact ggggccaagg caccactctc 780

acagtctcct cgggtggcgg tggctcgggc ggaggtgggt caggtggtgg cggttcgggt 840

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ggccgaaaat gctgccgaag aaagaaataa ctcgag 996

<210> 3

<211> 160

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gacagtcatt aggaaattct ctgtttattg cacaatatgt aaagcatctt cctgagaaaa 60

gggaaatgtt gaatgggaag gacatgcttt cttttgtatt ccttttctca gaaatcacac 120

ttttttgcct gtggccttgg caaccaaaag ctaacacata 160

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cggggtaccg acagtcatta ggaaattctc tg 32

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

cgagctctat gtgttagctt ttggttgc 28

Claims

1.一种金葡菌靶向抗菌肽细菌诱导型表达载体，其特征在于，包括IsdB单链抗体基因，HBD3基因，和BCE1-IL1α复合型启动子。

2.一种金葡菌靶向抗菌肽细菌诱导型表达载体的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)制备IsdB单克隆抗体；

(2)制备抗IsdB单链抗体-HBD3融合蛋白；

(3)优化细菌诱导型启动子，获得BCE1-IL1α复合型启动子；

3.权利要求1或2所述的金葡菌靶向抗菌肽细菌诱导型表达载体在抗乳腺炎中的应用。

4.一种含有金葡菌靶向抗菌肽细菌诱导型表达载体的重组细胞，其特征在于，将细菌诱导型表达载体pIsBD转染山羊乳腺上皮细胞，获得重组细胞。

5.权利要求4所述的含有金葡菌靶向抗菌肽细菌诱导型表达载体的重组细胞，在抗乳腺炎中的应用。