JP6211702B2 - ヒト殺虫遺伝子およびそれによりコードされた殺虫ペプチドならびに用途 - Google Patents

Description

本発明は、遺伝子工学および生物的防除の分野に関し、特にヒト殺虫遺伝子およびそれによりコードされた殺虫ペプチドならびに用途に関する。

現在、病害虫の生物的防除に世界的に広範に用いられている殺虫遺伝子は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｂｔ）から産生されるＢｔ毒素遺伝子（例えば、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ２Ａａなど）である。バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｂｔ）は、昆虫性病原細菌であり、産生されるＢｔ毒素は、多種の農林害虫に対して特異的な毒殺作用を有する。１９８７年に、ベルギーのプラントジェネティックシステムズ社（Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）が、Ｂｔ遺伝子導入殺虫タバコの取得に成功したことを初めて報告し、現在に至るまで、Ｂｔ遺伝子は、すでにトウモロコシ、イネ、ワタ、トマト、ジャガイモ、タバコなどの主要農作物に遺伝子導入されている。２０１２年国際アグリバイオ事業団の統計によれば、中国で栽培されているＢｔ導入ワタの面積は、すでに３９０万ヘクタールを超えており、ワタ栽培総面積の７１．５％を占める。しかしながら、Ｂｔ遺伝子導入作物の使用および普及に伴い、遺伝子流動、土壌微生物の生態構造の改変、種の薬剤耐性および正常な免疫系への危害などの面で存在する可能性のある潜在的な危害が、徐々に社会的な注目を集めている。学術分野において、「Ｂｔ遺伝子導入トウモロコシの根圏微生物および細菌生理群の多様性」（王敏ら、生態学雑誌、２０１０年０３期）および「Ｂｔ遺伝子導入トウモロコシの土壌細菌数の多様性に対する影響」（劉玲ら、生態・農村環境学報、２０１１年０３期）は、それぞれ屋内、屋外でＢｔ導入トウモロコシを栽培した土壌について、細菌数および多様性の分析を行い、その結果、いずれも、Ｂｔ導入トウモロコシを栽培した群とブランク対照群とを比較し、有意差が認められることがわかった。「Ｃｒｙ１Ａｃ ｐｒｏｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｐ．ｋｕｒｓｔａｋｉ ＨＤ７３ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ」（Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｐａｄｒｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、２０００年０１期）は、動物実験において、マウスが摂取したＢｔ内毒素、外毒素が１０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇに達したときに、マウスのＴ細胞ＡＮＡＥ陽性率、脾臓指数およびマクロファージの食作用に、いずれも著しい抑制反応が認められ、摂取量の増加に伴い、こうした抑制作用が著しくなることがわかった。この試験の結果、動物体内のＢｔ毒素の蓄積係数が６．２４を上回ったときに、肝臓、腎臓および消化管などの損傷がもたらされ、肝臓および腎臓において、細胞膨張および空胞変性といった異常が観察され、糸球体血管上皮細胞の病変がもたらされることがさらにわかった。当然ながら、免疫反応によってもたらされたことを排除することはできない。また、長期的に大用量でＢｔ毒素タンパク質を使用すると、動物白血球総数およびヘモグロビン含量が著しく低減し、このことも、Ｂｔ毒素タンパク質が著しい免疫抑制毒性を有していることを説明している。そのため、Ｂｔ毒素生物活性を有する代替的生物エフェクターを開拓することは、生物農薬開発分野の研究の焦点となっている。

殺虫ペプチドは、生体内で誘導生成される、生物活性を有するポリペプチドであり、Ｂｔ殺虫結晶性タンパク質が昆虫体内で殺虫ペプチドに分解され、殺虫の効果を実現するため、現在、Ｂｔ毒素生物活性の代替的生物エフェクターの発展の新しい方向となっている。抗イディオタイプ抗体（Ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ、以下、Ａｎｔｉ−Ｉｄという）は、このような生物殺虫効果を有するポリペプチドであり、Ａｎｔｉ−Ｉｄとは、抗体分子可変領域に位置するイディオタイプ（Ｉｄｉｏｔｙｐｅ，Ｉｄ）によって産生される特異的な抗体を指し、Ｂｏｎａらは、ＩｄとＡｎｔｉ−Ｉｄの血清学的反応およびＡＩｄの機能に基づき、抗イディオタイプ抗体を４種類（α、β、γおよびε）に分けている。そのうち、β型抗イディオタイプ抗体は、「インターナルイメージ」作用を有する、すなわち、（半）抗原と同じ抗原決定基を有するため、抗原の機能および生物活性を有することができる。

現在、ファージディスプレイ技術が普遍的に用いられており、ファージ抗体ライブラリを構築することによって、特異的な選択を経て、標的抗原類似効果を有する抗イディオタイプ抗体を得ることができる。ファージディスプレイ技術を用いて特異的な抗体を選択するプロセスは、「パンニング（Ｐａｎｎｉｎｇ）」と呼ばれ、主に、結合、洗浄、溶出および増幅の４つのステップを含む。Ｒａａｔｓらは、抗コルチゾールモノクローナル抗体を用いて被覆し、固相抗原として直接選択を行い、選択を行う前に、同じ種属の陰性モノクローナル抗体を用いて負の選択を行い、抗体定常領域と結合した組換え抗体セグメントを選択することを回避し、コルチゾールに対するＡｎｔｉ−Ｉｄの選択に最終的に成功した。Ｇｏｌｅｔｚらは、同様に、ファージ抗体ディスプレイシステムを用いて、異なる溶出方法の抗イディオタイプ抗体セグメント選択結果に対する影響を研究して比較し、最終的に選択した９６個のクローンのうち、２８個が抗イディオタイプ特性を有する陽性クローンであった。現在、代替可能なＢｔ活性エフェクター、特に抗Ｂｔ毒素タイプの抗イディオタイプ一本鎖抗体（以下、Ａｎｔｉ−Ｉｄ ＳｃＦｖｓという）小分子ポリペプチドなどの関連材料および製品について、報告はない。

現在のＢｔ毒素導入作物およびその毒素製剤の広範な使用に存在している安全面でのリスクおよび過敏反応などの問題について、Ｂｔ毒素生物活性を有する代替可能なヒト殺虫遺伝子およびそれによりコードされた殺虫ペプチドを提供し、本発明は次の通り実現する。
ヌクレオチド配列が配列番号１で示される、ヒト殺虫遺伝子。
アミノ酸配列が配列番号２で示される、本発明に記載のヒト殺虫遺伝子にコードされた殺虫ペプチド。
本発明に記載のヒト殺虫遺伝子を含有する原核細胞用担体。
本発明に記載のヒト殺虫遺伝子にコードされた殺虫ペプチドの農作物害虫防除の面の用途。
本発明に記載のヒト殺虫遺伝子にコードされた殺虫ペプチドを含有する殺虫剤。

本発明は、公開されているヒト遺伝子プールにおいて、殺虫活性を有する「β」タイプの抗Ｃｒｙ２Ａａ毒素イディオタイプ一本鎖抗体（殺虫ペプチド）を選択して取得し、アミノ酸およびヌクレオチドシークエンシングを行い、この殺虫ペプチドは、原核系発現を経て、初代培養物はコブノメイガ中腸囲食膜特異性受容体ＢＢＭＶとの結合活性を有し、動物免疫を経ずに得られ、調製周期は短く、アミノ酸配列は小さく、体外での大規模生産に適している。また、この殺虫ペプチドを新しい新殺虫遺伝子資源とし、Ｂｔ毒素を模した生物活性を有する新型殺虫遺伝子資源を探索して開拓し、従来のＢｔ毒素の広範な使用に存在する各種の安全面でのリスクを低減し、ひいては、今後、Ｂｔに代わって農業害虫の生物的防除に用いられる可能性があり、殺虫剤の使用の減少に対し、重要な科学的および現実的な意義を有する。

Ｆ２のＥＬＩＳＡ測定結果の概略図である。 Ｆ２の生物学的測定結果の概略図である。 それぞれＦ２、ＣＫ＋、ＣＫ−に浸したイネの葉を与えた後のコブノメイガ三齢幼虫の死亡状況の概略図である。 それぞれＦ２、ＣＫ＋、ＣＫ−に浸したキャベツを与えた後のコナガ三齢幼虫の死亡状況の概略図である。

実施例で用いた試薬および培地の配合：
（１）２×ＴＹ液体培地：
再蒸留水９００ｍＬにトリプトン１６ｇ、酵母抽出物１０ｇおよびＮａＣｌ ５ｇを加え、撹拌して均等に混合し、再蒸留水で１Ｌに定容し、オートクレーブに入れ、１２１℃で２０分間滅菌し、冷却した後、使用に備えて４℃で保存した。
（２）２×ＴＹ−ＡＧ液体培地：
２×ＴＹの培地に最終濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび質量比１％のグルコースを加えた。
（３）２×ＴＹ−ＡＫ液体培地：
２×ＴＹの培地に最終濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを加えた。
（４）２×ＴＹ−ＡＫＧ液体培地：
２×ＴＹの培地に最終濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび質量比１％のグルコースを加えた。
（５）ＴＹＥ寒天培地：
再蒸留水９００ｍｌにアガロース１５．０ｇ、ＮａＣｌ ８ｇ、トリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇを加え、再蒸留水で１Ｌに定容し、オートクレーブに入れ、１２１℃で２０分間滅菌し、冷却した後、使用に備えて４℃で保存した。
（６）ＴＹＥ−ＡＧ寒天培地：
ＴＹＥ寒天培地に最終濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび質量比１％のグルコースを加えた。

（７）ＰＢＳ溶液
ＮａＣｌ ８．０ｇ、ＫＣｌ ０．２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ ２．９ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２ｇを秤取し、それぞれ蒸留水の中に加え、充分に溶解した後、１Ｌに定容した。
（８）ＰＢＳＴ溶液
０．０５％ＰＢＳＴは、ＰＢＳ溶液に体積比０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を加えたものである。
０．１％ＰＢＳＴは、ＰＢＳ溶液に体積比０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を加えたものである。
（９）ＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液：
ＰＥＧ ８ ０００ ２０ｇ、ＮａＣｌ １４．６１ｇを秤取し、脱イオン水８０ｍｌを加え、１００ｍｌに定容し、オートクレーブに入れ、１２１℃で２０分間滅菌し、冷却した後、使用に備えて４℃で保存した。
（１０）クエン酸塩緩衝液（ＣＰＢＳ、基質緩衝液、ｐＨ５．５）：
Ｃ_６Ｈ_７Ｏ_８（クエン酸）２１ｇ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ ７１．６ｇを取り、それぞれ蒸留水に加え、充分溶解した後、１Ｌに定容した。
（１１）テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液：
テトラメチルベンジジン１０ｍｇを秤取してジメチルスルホキシド１ｍｌに溶かし、光を避け、使用に備えて４℃で保存した。
（１２）基質呈色溶液：
１０ｍｌ配合成分：ＣＰＢＳ ９．８７５ｍｌ、ＴＭＢ溶液 １００μｌ、体積比が２０％のＨ_２Ｏ_２ ２５μｌ。
（１３）３％のＭＰＢＳ溶液：
脱脂粉乳３ｇを秤取し、ＰＢＳ溶液８０ｍｌに溶解し、ＰＢＳ溶液を加え、１００ｍｌに定容した。
実施例に記載のＨＲＰ−ヤギ抗ウサギＩｇＧは、３％のＭＰＢＳ溶液で希釈したものである。

実施例で用いた材料の入手先：
ＢＢＭＶ、関連しない抗イディオタイプ一本鎖抗体、「β」タイプ以外のＡｎｔｉ−Ｉｄ ＳｃＦｖ、キャベツの葉、コナガ三齢幼虫は、いずれも江蘇省農業科学院農業部農産品品質安全制御技術・規格重点実験室が提供した。
陰性血清：１．５〜２．０ｋｇの純種雄ニュージーランドホワイトから採取し、採取時間は免疫の１週間前とした。
抗Ｃｒｙ２Ａａポリクローナル抗体：Ｃｒｙ２Ａタンパク質標準品（上海佑隆生物科技有限公司）を免疫原とし、１．５〜２．０ｋｇの純種雄ニュージーランドホワイト３匹を実験動物として選択し、具体的な免疫手順は次の通りとした。最初の免疫は、１匹あたり２００ｍｇの免疫原を用いて等体積の完全フロイントアジュバントと混合し、乳化して油中水構造にした後、背部皮下多点注射（４０点前後）を行い、２週間後に同様の用量の免疫原を用いて、等体積の不完全フロイントアジュバントと増強を行い、この後、２週間に１回増強した。最後の１回は、等体積の生理食塩水で免疫原を希釈し、直接耳介辺縁に静脈注射し、８日後に心臓採血し、血清を調製した。最終濃度０．０１％のチメロサールを添加した後、血清を、「現代免疫学技術と応用」（巴徳年、北京医科大学、中国協和医科大学聯合出版社、１９９８．３０９−３２２）に記載の方法で精製し、抗Ｃｒｙ２Ａａポリクローナル抗体を得た。

ヒト化されたファージ抗体ライブラリ、ＴＧ１細菌およびヘルパーファージＫＭ１３は、英国Ｓｏｕｒｃｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社から購入した。
ＨＲＰ−ヤギ抗Ｍ１３−ＩｇＧは、武漢博士徳社から購入した。
Ｃｒｙ２Ａａ毒素およびＣｒｙ１Ａｂ毒素は、上海佑隆生物科技有限公司から購入した。
イネの葉およびコブノメイガ三齢幼虫は、揚州緑源生物化工有限公司が提供した。

実施例１ 殺虫ペプチドの選択
（１）ヒト化されたファージ抗体ライブラリ菌液２０μｌを取り、２×ＴＹ−ＡＧ液体培地２００ｍｌに加え、ＯＤ_６００が０．４になるまで３７℃で恒温培養し、菌液５０ｍｌを取り、１×１０^１２ ｐｆｕヘルパーファージＫＭ１３を加え、重複感染を行い、３７℃で３０分間培養した後、３３００ｇで１０分間遠心し、上澄液を廃棄し、２×ＴＹ−ＡＫＧ液体培地１００ｍｌで再懸濁して沈殿させ、３０℃で一晩培養した。翌日、３３００ｇで３０分間遠心し、上澄液を収集し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液２０ｍｌを加え、１時間氷浴した後、再び３３００ｇで３０分間遠心し、ＰＢＳ ４ｍｌを用いて再懸濁して沈殿させた。再懸濁液を１１６００ｇで１０分間遠心し、上澄液を増幅したファージ抗体ライブラリとした。

（２）ステップ１で得た増幅したファージ抗体ライブラリを取り、４回のパンニングを行った。選択方法は、正負の選択を採用し、陰性血清を負の選択とし、抗Ｃｒｙ２Ａａポリクローナル抗体を正の選択とし、負を先、正を後とし、負の細胞培養ボトルの中は陰性血清で被覆し、正の細胞培養ボトルの中は抗Ｃｒｙ２Ａａポリクローナル抗体で被覆し、溶出方法は、４回の競合溶出を採用した。
１回目の選択は、先ず１００μｇ／ｍｌの陰性血清４ｍＬと１００μｇ／ｍｌの抗Ｃｒｙ２Ａａポリクローナル抗体４ｍＬでそれぞれ負の細胞培養ボトルおよび正の細胞培養ボトルの底部を被覆し、４℃で一晩置き、翌日、先ずＰＢＳで負の細胞培養ボトルを３回洗浄した後、ステップ１で得た増幅したファージ抗体ライブラリ１ｍｌ、３％のＭＰＢＳ溶液４ｍｌを加え、シェーカーに置き、室温でゆっくりと１時間振盪し、さらに１時間静置し、ＰＢＳで正の細胞培養ボトルを洗浄し、さらに１時間静置した負の細胞培養ボトルの中の液体を正の細胞培養ボトルの中に吸い入れ、シェーカーに置き、室温でゆっくりと１時間振盪し、さらに１時間静置した後、正の細胞培養ボトルの中の液体を廃棄し、０．０５％ＰＢＳＴ溶液１ｍｌで正のボトルを１０回洗浄し、１０ｍｇ／ｍｌのトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）１ｍｌを加えて、特異的に結合したファージ抗体を溶出し、溶出時間は３０分間とし、溶出液を１回目のパンニングのファージ抗体とした。
２回目、３回目、４回目のパンニングで被覆した抗Ｃｒｙ２Ａａポリクローナル抗体および陰性血清の濃度は、依然として１００μｇ／ｍｌとし、用いたファージ抗体は、前回のパンニングで得られたファージ抗体であり、パンニング方法は、１回目の正負の選択方針を用いた。異なっているのは、２回目では、０．１％ＰＢＳＴ溶液を用いて正のボトルを１０回洗浄し、１０ｍｇ／ｍｌのトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）１ｍｌを加えた後、１時間競合溶出し、３回目、４回目では、いずれも０．１％ＰＢＳＴ溶液を用いて正のボトルを２０回洗浄した後、トリプシンの代わりに濃度１００μｇ／ｍｌのＣｒｙ２Ａａポリクローナル抗体５００μｌを加えて競合溶出し、３回目の競合溶出時間は１時間、４回目の競合溶出時間は３０分間としたことである。
４回目のパンニングのファージ抗体１０μｌを取り、対数増殖期にあるＴＧ１細菌１ｍｌに感染させ、３７℃で１時間培養した後、ＴＹＥ−ＡＧ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。翌日、シングルコロニーを無作為にピックアップし、１００μｌ／ウェルの２×ＴＹ−ＡＧ液体培地を含む９６ウェルプレートに接種し、３７℃で一晩培養した。翌日、ウェルの中から菌液を２μｌ吸い出し、新しい９６ウェルプレートのウェルの中に移し、３７℃で２時間培養した。各ウェルに力価１０^１２のヘルパーファージＫＭ１３を２５μｌ加え、３０℃で２時間培養し、１８００ｇで１０分間遠心し、２×ＴＹ−ＡＫ液体培地１５０μｌで再懸濁し沈殿させた後、３０℃で一晩培養した。翌日、１８００ｇで３０分間遠心し、それぞれ上澄液を取った。

（３）４μｇ／ｍｌの抗Ｃｒｙ２Ａａポリクローナル抗体を取り、９６ウェルプレートの中に加え、１００μｌ／ウェルで、４℃で一晩置き、翌日、各ウェルにそれぞれステップ２で得た上澄液１００μｌを加え、陰性対照は、２×ＴＹ−ＡＫ液体培地を１００μｌ加え、３７℃で２時間水浴し、各ウェルをＰＢＳＴ ２５０μｌで洗浄した後、各ウェルに１：５０００で希釈したＨＲＰ−ヤギ抗Ｍ１３−ＩｇＧを１００μｌ加え、３７℃で２時間培養した。各ウェルに基質呈色溶液を１００μｌ加え、青色が現れるまで室温で１０〜２０分間反応させ、最後に各ウェルに濃度２ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４を５０μｌ加え、反応を素早く終わらせた後、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０値を測定した。溶液のＯＤ４５０値／陰性対照のＯＤ４５０値が２．１を上回った場合、陽性と判断し、この溶液に対応するステップ２の上澄液を、選択された抗Ｃｒｙ２Ａａ毒素イディオタイプ一本鎖抗体、すなわち殺虫ペプチドを含有する上澄液とした。

サンガーシークエンシング法で、選択された殺虫ペプチドを測定し、ヌクレオチド配列が配列番号１であるものは次の通りであった。
ｃｃｇｇｃｃｃｔｔｔ ｇｇｃａｔｇｃａａｔ ｔｔｃｔａｔｔｔｃａ ｇｇａｇａｃａｇｔｃ ａｔａａｔｇａａａｔ ａｃｃｔａｔｔｇｃｃ ６０
ｔａｃｇｇｃａｇｃｃ ｇｃｔｇｇａｔｔｇｔ ｔａｔｔａｃｔｃｇｃ ｇｇｃｃｃａｇｃｃｇ ｇｃｃａｔｇｇｃｃｇ ａｇｇｔｇｃａｇｃｔ １２０
ｇｔｔｇｇａｇｔｃｔ ｇｇｇｇｇａｇｇｃｔ ｔｇｇｔａｃａｇｃｃ ｔｇｇｇｇｇｇｔｃｃ ｃｔｇａｇａｃｔｃｔ ｃｃｔｇｔｇｃａｇｃ １８０
ｃｔｃｔｇｇａｔｔｃ ａｃｃｔｔｔａｇｃａ ｇｃｔａｔｇｃｃａｔ ｇａｇｃｔｇｇｇｔｃ ｃｇｃｃａｇｇｃｔｃ ｃａｇｇｇａａｇｇｇ ２４０
ｇｃｔｇｇａｇｔｇｇ ｇｔｃｔｃａａｇｔａ ｔｔｇａｔｔｃｔｔａ ｔｇｇｔａｃｔａａｔ ａｃａｇａｔｔａｃｇ ｃａｇａｃｔｃｃｇｔ ３００
ｇａａｇｇｇｃｃｇｇ ｔｔｃａｃｃａｔｃｔ ｃｃａｇａｇａｃａａ ｔｔｃｃａａｇａａｃ ａｃｇｃｔｇｔａｔｃ ｔｇｃａａａｔｇａａ ３６０
ｃａｇｃｃｔｇａｇａ ｇｃｃｇａｇｇａｃａ ｃｇｇｃｃｇｔａｔａ ｔｔａｃｔｇｔｇｃｇ ａａａｇｃｔｔｔｔａ ａｔｔｃｔｔｔｔｇａ ４２０
ｃｔａｃｔｇｇｇｇｃ ｃａｇｇｇａａｃｃｃ ｔｇｇｔｃａｃｃｇｔ ｃｔｃｇａｇｃｇｇｔ ｇｇａｇｇｃｇｇｔｔ ｃａｇｇｃｇｇａｇｇ ４８０
ｔｇｇｃａｇｃｇｇｃ ｇｇｔｇｇｃｇｇｇｔ ｃｇａｃｇｇａｃａｔ ｃｃａｇａｔｇａｃｃ ｃａｇｔｃｔｃｃａｔ ｃｃｔｃｃｃｔｇｔｃ ５４０
ｔｇｃａｔｃｔｇｔａ ｇｇａｇａｃａｇａｇ ｔｃａｃｃａｔｃａｃ ｔｔｇｃｃｇｇｇｃａ ａｇｔｃａｇａｇｃａ ｔｔａｇｃａｇｃｔａ ６００
ｔｔｔａａａｔｔｇｇ ｔａｔｃａｇｃａｇａ ａａｃｃａｇｇｇａａ ａｇｃｃｃｃｔａａｇ ｃｔｃｃｔｇａｔｃｔ ａｔｇｃｔｇｃａｔｃ ６６０
ｃｇｃｔｔｔｇｃａａ ａｇｔｇｇｇｇｔｃｃ ｃａｔｃａａｇｇｔｔ ｃａｇｔｇｇｃａｇｔ ｇｇａｔｃｔｇｇｇａ ｃａｇａｔｔｔｃａｃ ７２０
ｔｃｔｃａｃｃａｔｃ ａｇｃａｇｔｃｔｇｃ ａａｃｃｔｇａａｇａ ｔｔｔｔｇｃａａｃｔ ｔａｃｔａｃｔｇｔｃ ａａｃａｇｔａｔａｇ ７８０
ｔｔｃｔａｇｔｃｃｔ ｔｃｔａｃｇｔｔｃｇ ｇｃｃａａｇｇｇａｃ ｃａａｇｇｔｇｇａａ ａｔｃａａａｃｇｇｇ ｃｇｇｃｃｇｃａｃａ ８４０
ｔｃａｔｃａｔｃａｃ ｃａｔｃａｃｇｇｇｇ ｃｃｇｃａｇａａｃａ ａａａａｃｔｃａｔｃ ｔｃａｇａａｇａｇｇ ａｔｃｔｇａａｔｇｇ ９００
ｇｇｃｃｇｃａｔａｇ ａｃｔｇｔｔｇａａａ ｇｔｔｇｔｔｔａｇｃ ａａａａｃｃｔｃａｔ ａｃａｇａａａａｔｔ ｃａｔｔｔａｃｔａａ ９６０
ｃｇｔｃｔｇｇａａａ ｇａｃｇａｃａａａａ ｃｔｔｔａａａｔｃｇ ｔｔａｃｇｃｔａａｃ １０００

サンガーシークエンシング法で、選択された殺虫ペプチドを測定し、アミノ酸配列が配列番号２であるものは次の通りであった。
ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲ ６０
Ｈ−ＣＤＲ２
ＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＤＳＹＧＴＮＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫ １２０
Ｈ−ＣＤＲ３ −−−−−−−−−Ｌｉｎｋ−−−−−−−−−−−
ＡＦＮＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳ １８０
Ｌ−ＣＤＲ１ Ｌ−ＣＤＲ２
ＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＡＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹ ２４０
Ｌ−ＣＤＲ３ Ｈｉｓ−ｔａｇ
ＹＣＱＱＹＳＳＳＰＳＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＡＡＡＨＨＨＨＨＨＧＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡ ２８８
本出願人は、この殺虫ペプチドを自らＦ２と命名した。

実施例２ Ｆ２の初代培養物の調製
実施例１で選択された殺虫ペプチドを含有する上澄液を、体積比１：１００で２×ＴＹ−ＡＧ液体培地１０ｍｌの中に移し、３７℃で２時間培養し、力価１０^１２のヘルパーファージＫＭ１３を１００μｌ加えて救援し、３０℃で２時間培養し、１８００ｇで１０分間遠心し、上澄液を除去し、２×ＴＹ−ＡＫ液体培地を用いて再懸濁して菌種を沈殿させ、３０℃、２５０ｒｐｍで振盪し、一晩培養した。翌日、１８００ｇで３０分間遠心し、その上澄液をＦ２初代培養物を含有する上澄液とした。

実施例３ Ｆ２の亜型同定
（１）競合抑制ＥＬＩＳＡ測定試験
試験は、６個の試験群と対応する対照群に分け、それぞれ表１により溶液を調製した。

それぞれ表１により調製した溶液に、１０μｇ／ｍｌの抗Ｃｒｙ２Ａａポリクローナル抗体を５０μｌ加え、３７℃で２時間培養した後、それぞれ２μｇ／ｍｌ Ｃｒｙ２Ａａ毒素で被覆した９６ウェルプレートの中（前記２μｇ／ｍｌ Ｃｒｙ２Ａａ毒素で被覆した９６ウェルプレートは、前日に２μｇ／ｍｌのＣｒｙ２Ａａ毒素を取り９６ウェルプレートの中に加え、１００μｌ／ウェルとし、４℃で一晩置いた）で２時間反応させた。各ウェルをＰＢＳＴ ２５０μｌで３回洗浄した後、各ウェルにそれぞれ１：５０００で希釈したＨＲＰ−ヤギ抗ウサギＩｇＧを１００μｌ加え、室温で１時間培養した。各ウェルをＰＢＳＴ ２５０μｌで３回洗浄した後、各ウェルにそれぞれ基質呈色溶液を１００μｌ加え、青色が現れるまで室温で１０〜２０分間反応させ、最後に各ウェルにそれぞれ濃度２ｍｏｌ／ＬのＨ_２ＳＯ_４を５０μｌ加え、反応を素早く終了させた。マイクロプレートリーダーでＯＤ_４５０値を測定した。

実験結果は図１に示した通りであり、抑制率はＦ２含量の増加に伴い増大することがわかり、対照群には競合抑制現象がなく、Ｆ２は、β型抗イディオタイプ一本鎖抗体であり、Ｃｒｙ２Ａａ毒素を模して競合し、抗Ｃｒｙ２Ａａ毒素ポリクローナル抗体と結合したことを説明している。

（２）生物学的測定試験
試験は、試験群１、試験群２、試験群３、陽性対照群、陰性対照群１、陰性対照群２、陰性対照群３に分け、試験の手順は次の通りとした。
（ａ）密封：５μｇ／ｍｌのＢＢＭＶを、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートの中に入れ、４℃で一晩置き、翌日、各ウェルをＰＢＳＴ ２５０μｌで３回洗浄した後、それぞれ質量比３％のＢＳＡを２００μｌ加え、室温で２時間培養し、密封した。
（ｂ）試料添加：ステップ１で密封した９６ウェルプレートを、２５０μｌ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄した後、それぞれ９６ウェルプレートに表２により試料を添加した。

（ｃ）ステップｂで試料を添加した９６ウェルプレートを、室温で２時間培養し、各ウェルをＰＢＳＴ ２５０μｌで３回洗浄した後、各ウェルに１０μｇ／ｍｌの抗Ｃｒｙ２Ａａポリクローナル抗体を１００μｌ加え、再び各ウェルをＰＢＳＴ ２５０μｌで３回洗浄し、各ウェルに１：５０００で希釈したＨＲＰ−ヤギ抗ウサギＩｇＧを１００μｌ加え、室温で１時間培養した。各ウェルをＰＢＳＴ ２５０μｌで３回洗浄し、各ウェルに基質呈色溶液を１００μｌ加え、青色が現れるまで室温で１０〜２０分間反応させ、最後に各ウェルに濃度２ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４を５０μｌ加え、反応を素早く終了させた後、マイクロプレートリーダーでＯＤ_４５０値を測定した。

実験結果は図２に示した通りであり、陽性対照に比べ、殺虫ペプチドＦ２（試験群１、２、３）は、Ｃｒｙ２Ａａ毒素とその受容体ＢＢＭＶとの結合を抑制することができたが、「β」タイプ以外の陰性対照には抑制現象がなく、Ｆ２が「β」タイプであることがさらに実証された。

実施例４ 殺虫ペプチドＦ２の殺虫活性の検証
試験は、試験群と対照群に分けて行われた。
試験群は、実施例２で得られたＦ２初代培養物を含有する上澄液（Ｆ２）を用いた。
陽性対照群は、濃度０．２ｇ／ＬのＣｒｙ１Ａｂ毒素（ＣＫ＋）を用いた。
陰性対照群は、「β」タイプ以外のＡｎｔｉ−Ｉｄ ＳｃＦｖｓ（ＣＫ−）を用いた。

試験手順：
試験群、陽性対照群、陰性対照群を各１０ｍｌ取り、滅菌したペトリ皿の中に入れ、それぞれイネの葉６枚およびキャベツの葉６枚を入れ、３０分間浸し、取り出して陰干しした。コブノメイガ三齢幼虫およびコナガ三齢幼虫に、陰干しした葉を与えた。

実験結果は図３、４に示した通りであり、図３は、それぞれ試験群（Ｆ２）、陽性対照群（ＣＫ＋）、陰性対照群（ＣＫ−）に浸したイネの葉を与えた後のコブノメイガ三齢幼虫の死亡状況であり、図４は、それぞれ試験群（Ｆ２）、陽性対照群（ＣＫ＋）、陰性対照群（ＣＫ−）を浸したキャベツを与えた後のコナガ三齢幼虫の死亡状況であり、試験群の殺虫ペプチドＦ２が比較的優れた殺虫効果を有することがわかる。

Claims (5)

1. ヌクレオチド配列が配列番号１で示されるヒト殺虫遺伝子。
2. アミノ酸配列が配列番号２で示される請求項１に記載のヒト殺虫遺伝子にコードされた殺虫ペプチド。
3. 請求項１に記載のヒト殺虫遺伝子を含有する原核細胞用ベクター。
4. 請求項２に記載の殺虫ペプチドを含む殺虫剤又は農業害虫防除剤。
5. 請求項２に記載の殺虫ペプチドを、農業害虫を防除するために使用する農業害虫防除方法。

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