WO2007023782A1 - キラートキシン様タンパク質に対する中和抗体、およびその利用 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a neutralizing antibody against a killer toxin-like protein, a method for producing the neutralizing antibody, and a method for producing an antibody using the neutralizing antibody as an antigen.
- HM-1 Killatoxin is a potent anti-yeast polypeptide produced by the yeast Willopsis saturnus Var. Mrakii IFO 0895, previously called Hansenula mra kii, K9 It belongs to the type of Kiratoxin group.
- HM-1 consists of 88 amino acids and has a molecular weight of about 9500 daltons (see Non-Patent Document 1). The three-dimensional structure of HM-1 protein has been elucidated using NMR ⁇ vectors (see Non-Patent Document 2). HM-1 is very stable among heat-treated and wide range of pH values among killer toxins.
- HM-1 killer toxin is involved in maintaining a round shape in Saccharomyces cerevisiae yeast spheroplasts (see Non-Patent Document 4).
- HYI killer toxin produced by Hansenula saturnus having homology with HM-1 is also known (see Non-Patent Document 5).
- HYI killer toxin from Viriopus saturnus var. Saturnus also inhibits cell wall synthesis and exerts a cytolytic effect on the budding of sensitive yeast cells. This mechanism is similar to the HM-1 toxin of Williopsis saturnus var. Mrakii (see Non-Patent Document 6).
- HM-1 selectively inhibits cell wall synthesis of sensitive Saccharomyces cerevisiae (see Non-Patent Document 7) and interacts with cell wall taglucan (non-specific). (See Permissible Literature 8). HM-1 also inhibits glucan synthase at low concentrations (see Non-Patent Document 9). Saccharomyces cerevisiae-derived ⁇ -glucan synthase (1,3-beta-D-glucan synthase) has been purified and cloned. (See Non-Patent Document 10). HM-1 itself can be quantified with a monoclonal antibody and a sandwich ELIS (see Non-Patent Document 11).
- Candida albicans homologue to Saccharomyces cerevisiae GSC1 also known as glucan synthase of S. cerevisiae 1; FK SI
- Candida albicans GSC1 Is known to be a gene for the subunit of beta-1,3-glucan synthase (see Non-Patent Document 12).
- yeast gene RHK1 is involved in the synthesis of a cell wall receptor for HM-1 killer toxin (see Non-Patent Document 13).
- HM-1 has a broad spectrum of killer toxin activity and can be widely used in therapy. However, its use is limited due to toxicity and antigenicity.
- HKR1 that can confer HM-1 killer toxin resistance to Saccharomyces cerevisiae cells by overexpression has also been cloned into the genomic library of Saccharomyces cerevisiae (see Non-Patent Document 14) ).
- This HKR1 encodes a cell surface protein that regulates cell wall-specific taglucan synthesis and budding patterns in the yeast Saccharomyces cerevisiae (see Non-Patent Document 15).
- HM-1 killer toxin derivatives having killer activity will be used in new therapeutic methods.
- the killer activity of HM-1 killer toxin is due to inhibition of glucan synthase, which synthesizes taglucan on the fungal cell wall.
- the detailed molecular mechanism is not fully understood, and the target of these killer molecules is probably the external region of the glucan synthase main body that exists through the cell membrane, or is nascent.
- the possibility of targeting ancillary molecules is also denied.
- HM-1 killoxin inhibits glucan synthesis by the outer force of the fungal cell membrane. By doing so, killer activity is exhibited (see FIGS. 7A and B).
- idiotype is an epitope specific to an antibody and is associated with the heavy or light chain of an antibody, and usually requires variable region involvement for activity.
- the anti-idiotypic antibody network can recognize antigenic determinants that overlap with the part of the idiotypic antibody binding site that contacts the original antigen, as suggested by Neils Jerne.
- the binding site of an anti-idiotypic antibody may have an “internal image” of the original antigen. This idea further led to the hypothesis that the anti-idiotypic antibody's antigenic mimicry could be used to elicit antibodies with the biological characteristics of yeast killer toxin.
- Anti-idiotypic antibodies corresponding to the internal image of the antigenic determinant have been proposed as binding to toxins in surrogate vaccines or cancer immunotherapy.
- the amino acid sequence homology between the protein antigen and the anti-idiotype antibody variable region has been clarified, and it is possible to further enhance the function of the antibody by appropriately modifying the sequence. is there.
- Polonelli et al Produced anti-idiotype antibodies having antibacterial activity in the form of polyclonal, monoclonal, and single-chain recombinant antibodies (see Non-Patent Document 16). These antibodies have the activity of yeast killer toxin produced by the widely studied Pichia anomala. Killer strains have these common phenotypes, but each killer toxin differs between species or strains and exhibits different characteristics in terms of structural genes, molecular weight, mature structure and immunity, and the mechanism to recognize and kill sensitive cells . In fact, the yeast killer toxin produced by Pichia anomala used by Polonelli et al.
- each killer toxin has unique properties and uses that vary greatly by species and strain.
- Non-Patent Document 1 Yamamoto T. et al., “Application of monoclonal antibodies to the i solation and characterization of a killer toxin secreted by Hansenula mraku.J, FEBS Lett.t 1986 Jan 20, Vol.l95 (l— 2 ), P.253-257
- Non-Patent Document 2 Antuch W. and 2 other authors, “Ancestral beta gamma-crystallin precursor stru cture in a yeast killer toxin”, Nat. Struct. Biol., 1996, p.662-665
- Non-Patent Document 3 Kimura T. 6 others, ⁇ N-glycosylation is involved in the sensitivity of
- Non-Patent Document 4 Komiyama T. and two other authors, "Round shape enlargement of the yeast spher oplast of Saccaromyces cerevisiae by HM-1 toxin", Biol. Pharm. Bull., 2002 Aug, Vol. 25 (8), p.959-65
- Non-Patent Document 5 Komiyama T. et al., “Structure and activity of HYI killer toxin fro m Hansenula saturnus”, Biol. Pharm. Bull., 1995 Aug ⁇ Vol.18 (8), p.1057-9
- Patent Document 6 Komiyama T. and 6 other authors, "Action properties of HYI killer toxin from Wil liopsis saturnus var.saturnus, and antibiotics, aculeacin A and papulacandin B.”, Biol. Pharm. Bull., 1998 Oct, Vol. .21 (10), p.1013- 9
- Non-Patent Document 7 Yamamoto T. and 4 other authors, "Killer toxin from Hansenula mraku selective l y inhibits cell wall synthesis in a sensitive yeast.”, FEBS Lett., 198b, Mar. 3, Vol. 197 (1-2) , P.50-54
- Patent Document 8 Kasahara S. et al., 8 authors, “Involvement of cell wall beta—glucan in the acti on of HM—1 killer toxin”, FEBS Lett. ⁇ 1994 Jul 4, 348 (1), p.27-32
- Non-Patent Document 9 Takasuka T. and three others, "Cell wall synthesis specific cytocidal effect of Hansenula mrakii toxin-1 on Saccharomyces cerevisiae.”, Cell Mol. Biol. Res., 1995, Vol. 41 (6), p. .575-581
- Non-Patent Document 10 Inoue SB. 9 authors, ⁇ Characterization and gene cloning of 1,3-beta- glican synthase from Saccharomycec cerevisiae '', Eur.J.Biochem., 1995 Aug, Vol.2 31 (3), p.845-54
- Non-patent literature ll Komiyama T. et al., 4 authors, "Monoclonal antibodies and sandwich ELISA for quantitation of HM-1 killer toxin.”, Biol. Pharm. Bull., 2004 May, Vol. 27 (5), p6 91- Three
- Non-Patent Document 12 Mio T. et al., 9 authors, “Cloning of the Candida albicans homolog of Sacch aromyces cerevisiae GSC1 / FK3 ⁇ 41 and its involvement in beta— 1, J glucan synthesisj, J. Bacteriol., 1997 Jul, Vol. 179 (13), p.4096—105
- Non-Patent Document 13 Eight authors by Kimura T., “A novel yeast gene, RHKl, is involved in the s ynthesis of the cell wall receptor for the HM— 1 killer toxin that inhibits beta— 1,3— glu can synthesisj, 1997 Mar26, Vol.254 (2), p.139- 47
- Non-Patent Document 14 Kasahara S. et al., 8 authors, “Cloning of the Saccharomyces cerevisiae gen e whose overexpression overcomes the effects of HM— 1 killer toxin, which inhibits b eta-glucan synthesis.”, J. BacterioL, 1994 Mar ⁇ 176 (5), p.1488-99
- Non-Patent Document 15 Yabe T. et al., 7 authors, "HKR1 encodes a cell surface protein that regulat es both cell wall beta—glucan synthesis ana budding pattern in the yeast Saccharomy ces cerevisiae.”, Bacteriol., 1996 Jan, Vol. 178 (2), p.477- 83
- Non-Patent Document 16 L. Polonelli, et al., “Therapeutic potential of antiidiotypic single chain antibodies with yeast killer toxin activity”, Nature Biotech., 1997, Vol. 15, p. 15 5-158
- An object of the present invention is to provide an immunogen that can be used for the production of an anti-idiotype antibody having the same activity as HM-1 killer toxin that exhibits antifungal activity by inhibiting ⁇ -glucan synthase. More specifically, it is an object to provide an antibody having neutralizing activity against a killer toxin-like protein, a method for producing the antibody, and a method for producing an antibody using the antibody as an antigen. Means for solving the problem
- nmAb-KT an antibody that has an activity of binding to HM-1 and neutralizing the killer activity of HM-1.
- the present inventors successfully immunized mice with the above-mentioned nmAb-KT and produced a soluble anti-idiotype-chain variable region fragment antibody (ScFv) of HM-1 by recombinant DNA technology. .
- the purified ScFv was found to inhibit glucan synthase at low concentrations and to exhibit a strong HM-1-like activity with a broad spectrum of antifungal activity.
- nmAb-KT as an immunogen (antigen)
- the antibody (nmAb-KT) that can neutralize HM-1 killer toxin activity was actually an anti-idiotype antibody. It has been demonstrated for the first time that it can be used as an immunogen for the production of
- the present inventors tried to identify an HM-1 epitope recognized by the nmAb-KT. As a result, we succeeded in determining the HM-1 epitope region that can be recognized by mAB-KT by using various synthetic peptides derived from HM-1 and HYI killer toxins.
- an antibody having an epitope in this region is expected to be an antibody that can neutralize killer toxin activity, and the neutralizing antibody is an anti-idiotype antibody having killer toxin activity. It is very useful as an immunogen.
- antibodies that use the HM-1 region as epitopes are anti-idiotypes. It is expected to be usable as an immunogen for the production of antibodies.
- the antibody has a high binding affinity for a region responsible for the killer toxin activity of a killer toxin protein, and an anti-idiotype antibody using the antibody as an antigen has an internal image of killer toxin, It is considered that the antibody has a region responsible for activity 1 and a highly mimicking amino acid sequence.
- the antibody prepared using the above-mentioned nmAb-KT as an immunogen has a remarkable ⁇ -glucan synthase inhibitory action. Furthermore, the antibody was confirmed to actually have antifungal activity against fungi having 8 glucan synthase.
- the antibody produced by using the neutralizing antibody of the present invention has an effective antifungal effect against Candida-albicans strain Aspergillus fomigatos strain, which is less effective with existing antifungal agents. Demonstrating the power to demonstrate. That is, by using the antibody of the present invention as an immunogen, a Candida-albicans strain or a Kaspergillus-Fumigatos strain that causes deep mycosis, which is an important medical problem, can be killed. It has been demonstrated that antibodies with antifungal activity can be produced.
- HM-1 inhibits ⁇ -glucan synthase present on the cell membrane surface of yeast cells, and the growing yeast It became clear that cell death was caused by acting on the budding area of the cell, opening a hole by suppressing its ⁇ -glucan synthesis, and leaking cellular material.
- Komiya ma T.7 "Pore formation on proliferating yeast 3 ⁇ 4accharomyces cerevisiae cell b uds by HM-1 killer toxin", J. Biochem., 1996 Apr ⁇ Vol.119 (4), p.731-6
- HM— 1 For killer activity of killer toxin, two distinct argin residues in the C-terminal region of HM-1 toxin are involved (Shirai T. et al., “The involvement of two specinc arginine”). residues in the action of HM— ⁇ killer toxin was deduced from site—d irected mutagenesis], Biol. Pharm. Bull., 2000 Aug Vol. 23 (8), p.998-1000).
- the anti-idiotypic antibody produced using the neutralizing antibody of the present invention as an immunogen against a fungus having ⁇ -glucan synthase, inhibits ⁇ -glucan synthase by the mechanism described above. It is thought to kill cells.
- the present invention provides an antibody as an immunogen that can be used for the production of an anti-idiotype antibody having killer toxin activity. Specifically, an antibody having neutralizing activity against a killer toxin-like protein, And a method for producing the antibody, and a method for producing an antibody using the antibody as an antigen. More specifically,
- An antigen for producing an anti-idiotype antibody comprising the following antibody (a) or (b) as an active ingredient:
- a method for producing an antibody having ⁇ -dulcan synthase inhibitory activity and sputum or antifungal activity characterized by using the following antibody (a) or (b) as an antigen:
- a method for producing an antifungal agent comprising the step of producing an antibody using the following antibody (a) or (b) as an immunogen;
- a partial fragment polypeptide of HM-1 protein comprising the amino acid sequence of positions 39 to 48 in the HM-1 protein of SEQ ID NO: 1.
- a partial fragment polypeptide of HYI protein comprising a polypeptide comprising an amino acid sequence of positions 39 to 47 in the HYI protein of SEQ ID NO: 3.
- An immunogenic composition capable of inducing neutralizing antibodies comprising the polypeptide according to [17] or [18] as an active ingredient,
- the present invention provides an immunogen (antigen) that can be used to produce an anti-idiotype antibody having HM-1 killer toxin activity and / 3 glucan synthase inhibitory activity.
- Anti-idiotype antibodies that mimic the biological function of killer toxin exhibit antifungal activity against opportunistic pathogens that are sensitive to killer toxin, and are expected to be used as novel antifungal agents.
- the present inventors have succeeded in specifically identifying an epitope region to which an antibody that neutralizes HM-1 killer toxin activity can bind.
- the neutralizing antibody nmAb- ⁇ is classified as IgGl ( ⁇ ), and the HYI toxin produced by the related yeast Williopsis saturnus var. Saturnus IFO 0117 is very similar in structure and mode of killer toxin action to HM-1.
- nmAb-KT has been shown to be ineffective against HYI toxins.
- 12 peptide sequences were synthesized based on the amino acid sequence of HM-1.
- nmAb-KT is the three peptides P6 ( 33 NVHWMVTGGST 43 , SEQ ID NO: 14), P7 ("DGKQG CATIWEGS 56 , SEQ ID NO: 15), and P9 ( 44 ) that represent the central part of the HM-1 molecule. Reacted with DGKQGCATIWEGSGCV 59 , SEQ ID NO: 17)
- HM-1 decapeptide P10 39 TGGSTDGKQG 48 , SEQ ID NO: 2 force nmAb-KT overlapping with P6, P7, and P9 peptides.
- nmAb-KT is located in the corresponding region of HYI. It was revealed that a specific epitope within P10 of HM-1 was recognized. The strong binding activity of nmA b-KT against HM-1 but not against HYI was also confirmed by SPR analysis. These results strongly suggested that nmAb-KT is most likely to bind to HM-1 in the sequence 41 GSTDGK 46 (SEQ ID NO: 21) different from the HYI sequence at the same position.
- FIG. 1 shows the effect of nmAb-KT on yeast growth and HM-1 and HYI killer toxin activity. The process and conditions are described in the examples. The activity was expressed as nmAb-KT and no HM-1 and HYI! /, With the control sample as 100%. Each experiment was performed in triplicate, and the results were calculated as average values.
- FIG. 2 is a photograph showing Western blot analysis of HM-1 and HYI. Purified HM-1 and HYI were electrophoresed and then immunoblotted and detected using nmAb-KT as the primary antibody as described in the Examples. M: Standard markers (lanes 1 and 4), HM-1 (lane 2), and HYI (lane 3).
- FIG. 3 shows quantification of HM-1 and HYI by sandwich ELISA.
- a calibration curve was obtained by ELISA as described in the examples. Square (black), HM-1; Circle (black), HYI.
- FIG. 4 shows SPR analysis of HM-1 and HYI.
- the preparation and analysis procedure of immobilized n mAb-KT on CM5 sensor chip is described in the examples.
- FIG. 5A-C are diagrams showing peptide analysis of nmAb-KT. Growth inhibitory activity and HM-1 killer toxin activity on yeast growth are described in the Examples. Activity was expressed as 100% control sample without peptide and nmAb-KT. Each experiment was performed in triplicate, and the results were calculated as average values.
- Figure 5A shows the effect on growth of S. cerevisiae A451 The influence of a peptide is shown.
- FIG. 5B shows the effect of nmAb-KT and preincubated peptide on HM-1 killer toxin activity.
- FIG. 5C shows the effect of HM-1 decapeptide and HYI nanopeptide on HM-1 killer toxin activity.
- FIG. 6 is a photograph showing specific binding of nmAB-KT to an epitope on HM-1 peptide. Dot blotting and detection using nmAb-KT as the primary antibody were described in the examples.
- Figure 6A shows 12 peptides adsorbed on the membrane
- Figure 6 (B) shows HM-1 decapeptide and HYI nanopeptide adsorbed on the membrane.
- FIG. 7 A diagram schematically showing the action of HM-1 toxin on yeast glucan synthase and B on glucan synthase.
- FIG. 8 is a diagram comparing the full-length amino acid sequences of HM-1 and HYI.
- the present invention provides an antibody against a killer toxin-like protein, which has a function of inhibiting the activity of the killer toxin-like protein.
- the killer toxin-like protein is preferably a protein having the following activities (a) and Z or (b):
- the antibacterial activity of (a) above includes, for example, antifungal activity against Candida albicans strains. be able to.
- the activity can be evaluated as appropriate by, for example, CFU assay.
- the ⁇ -glucan synthase inhibitory activity of (b) above can be appropriately measured by various known methods (for example, a method for detecting ⁇ -glucan labeled with a radioactive substance). Those skilled in the art can appropriately evaluate the activity of inhibiting
- the antibody of the present invention has a function of neutralizing the activity of a killer toxin-like protein (for example, the above (a) or (b)) (the above antibody of the present invention is referred to as "the neutralizing antibody of the present invention”). May be described).
- the neutralizing antibody of the present invention is suitably used as an immunogen (antigen) for producing, for example, an anti-idiotype antibody having a killer toxin-like protein activity.
- the anti-idiotype antibody has killer toxin activity or ⁇ -glucan synthase inhibitory activity, and is expected to have remarkable antifungal activity against fungi having ⁇ 8 glucan synthase.
- an anti-idiotype antibody produced using the neutralizing antibody of the present invention is expected to have an antibacterial spectrum equivalent to or broader than that of a killer toxin-like protein.
- an anti-idiotype antibody refers to an antibody that recognizes an idiotype determinant (idiotope) of an antibody variable region.
- Antibody molecules are usually composed of a heavy chain (chain chain) and a light chain (L chain), and their antigen specificity is determined by the structure of the variable region (V region) of the chain and L chain, which are antigen binding sites. Is done. The structure of this part is unique to antibody molecules and is called idiotype. This idiotype itself also has antigenicity, and an anti-idiotype antibody can be produced using this idiotype as an immunogen.
- the antibody produced using the neutralizing antibody of the present invention as an immunogen preferably binds to the idiotype determinant of the neutralizing antibody of the present invention (anti-killer toxin-like protein antibody) against a killer toxin-like protein (Anti-idiotype antibody (with affinity).
- the anti-idiotype antibody is an antibody having an internal image (image) of a killer toxin-like protein and having the same function (activity) as the killer toxin-like protein.
- the neutralizing antibody of the present invention is usually an anti-killer toxin-like protein antibody, and preferably has an activity (eg, ⁇ -glucan synthase inhibition) of the killer toxin-like protein (eg, HM-1 etc.). Activity, antifungal activity, etc.).
- the anti-killer toxin-like protein antibody is preferably a monoclonal neutralizing antibody.
- Specific examples of the neutralizing antibody of the present invention include an antibody having neutralizing activity against HM-1 called nmAb-b (Yamamoto ⁇ . 3 others, [Application or monoclonal antibodies to the isolation and character J. FEBS Lett., 1986 Jan 20, Vol.l95 (l-2), p.253-257) can be suitably shown.
- the nmAb-KT is a monoclonal antibody that neutralizes in vitro the activity of killer toxin produced from yeast (Williopsis saturnus) Var. Mrakii, and was produced by standard immuno- and hybridoma techniques. Yes, high antigen specificity
- This nmAb-KT can be appropriately produced by those skilled in the art using a general antibody production technique with reference to the literature described in this specification.
- a killer toxin-like protein refers to a proteinaceous antibacterial substance produced by a fungus, and is particularly limited as long as it is a protein having the activities (a) and Z or (b) described above.
- a protein derived from the genus Williopsis saturnus is preferable.
- examples of the killer toxin-like protein of the present invention include HM-1 killer toxin and HYI protein.
- HM-1 killer toxin is a polypeptide having a strong antifungal activity produced by the fermentation mother Williopsis saturnus, also called Hansenula mrakii.
- Hansenula 'Muraki strains that produce HM-1 killer toxin include IFO 0895 and IFO 8075.
- amino acid sequence of HM-1 killer toxin is already known (FEBS LETT., 195, 253-257, 1 986).
- a preferred embodiment of the neutralizing antibody of the present invention is a neutralizing antibody against HM-1, preferably within positions 33 to 59 in the amino acid sequence of HM-1 protein (SEQ ID NO: 1), more preferably An antibody characterized in that the amino acid region within positions 39 to 48 is an epitope.
- a preferred embodiment of the neutralizing antibody of the present invention is a partial fragment polypeptide of HM-1 protein, usually 30 to 60 positions, preferably 33 to 59 positions in SEQ ID NO: 1.
- the antibody recognizes the amino acid sequence contained in positions 39 to 48 as an epitope.
- the neutralizing antibody of the present invention is, for example, a neutralizing antibody against HYI, which is within 30 to 60 positions in the amino acid sequence of the HYI protein (SEQ ID NO: 3), more preferably within 39 to 47 positions.
- An antibody characterized in that the amino acid region of is an epitope.
- the neutralizing antibody of the present invention is a partial fragment polypeptide of HYI protein, and is usually contained in positions 30 to 60, more preferably positions 39 to 47 in SEQ ID NO: 3. It is an antibody that recognizes an amino acid sequence as an epitope.
- the sequence of HYI nanopolypeptide (“TGESNGQQG”) which is a partial fragment polypeptide of HYI protein and also has amino acid region power corresponding to positions 39 to 47 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3, Shown in
- the neutralizing antibody of the present invention can recognize the peptide of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 as an epitope as described above, and therefore has a strong binding affinity with the peptide. Is preferred. Therefore, the neutralizing antibody of the present invention is not necessarily essential, but can be characterized as an antibody having binding affinity with the peptide described in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
- the neutralizing antibody bound to the peptide of SEQ ID NO: 2 or 4 is the above-mentioned (a) or (b) possessed by a killer toxin-like protein (for example, HM-1, HYI, etc.) It is thought that the function of neutralizing the activity of the protein is reduced or lost. Therefore, the antibody of the present invention is characterized by being an antibody capable of reducing or losing the function of the killer toxin-like protein, for example, by reacting with the peptide of SEQ ID NO: 2 or 4. Is possible.
- the present inventors have succeeded in producing an anti-idiotype antibody having an actual antifungal activity by using the neutralizing antibody nmAb-KT as an immunogen.
- the antibody is a so-called single chain polypeptide antibody called ScFv.
- the polypeptide includes a variable region of an anti-idiotype antibody having an HM-1 killer toxin activity and an antifungal activity against a fungus having a ⁇ -glucan synthase. It is a peptide.
- the polypeptide has a region corresponding to a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL), and has a structure in which these VH and VL are linked by a linker having an amino acid strength. .
- preferred embodiments of the antibody of the present invention include, for example, the above polypeptides (Vs of SEQ ID NOs: 5 to 8, It can be characterized as an antibody having a binding affinity to a peptide consisting of the amino acid sequence described in any one of the above.
- the binding affinity is not particularly limited as long as it exhibits an affinity that allows the neutralizing antibody of the present invention and the above polypeptide to substantially bind. and a force X 10 6 M- 1 or greater, preferably, the affinity constant Ka is not less 1.0 ⁇ 10 6 ⁇ - 1 or more, preferably 3.0 x 10 6 M- 1 or greater, more preferably 4.0 ⁇ 10 6 ⁇ - 1 Or more, more preferably 4.4 xl0 6 M_1 or more.
- the neutralizing antibody of the present invention is preferably an antibody having a function of inhibiting the activity of the polypeptide by binding to the polypeptide.
- the neutralizing antibody of the present invention is characterized as having a function of suppressing (inhibiting) the ⁇ -glucan synthase inhibitory activity of the polypeptide by binding to the polypeptide.
- the neutralizing antibody of the present invention can be obtained by a general antibody production technique using a killer toxin-like protein or a polypeptide containing an epitope region found by the present inventors as an immunogen. Is possible. Even when various antibodies are produced by this technique, the above-described polypeptides (for example, the peptides described in SEQ ID NOs: 5 to 8) are used to bind the affinity or killer as described above.
- a person skilled in the art can appropriately select the neutralizing antibody of the present invention without undue trial using the presence or absence of the activity of the toxin-like protein as an index.
- An antibody produced using the neutralizing antibody of the present invention as an immunogen (antigen) is expected to have a function equivalent to that of a killer toxin-like protein.
- 8 glucan synthesis It is expected to have antifungal activity against fungi with enzymes, and Z or 8) glucan synthase inhibitory activity.
- the term "antibody” is used in the broadest sense.
- a monoclonal antibody a polyclonal antibody, an antibody variant (a chimeric antibody, a humanized antibody, a low molecular weight antibody (including antibody fragments)) Multispecific antibodies, etc.
- the “antibody” may be either a polypeptide or a heterologous multimer (eg, an IgG type antibody).
- Preferred antibodies are monoclonal antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and low molecular weight antibodies (such as single-chain Fv polypeptides) such as antibody fragments.
- the amino acid sequence of the above-described antibody is further modified by amino acid substitution, deletion, attachment, and Z or insertion, or chimerization or humanization. Things are included. A person skilled in the art can modify amino acid sequences such as amino acid substitution, deletion, addition and / or insertion, and human or chimerization. Similarly, the variable region or constant region of an antibody used when producing the antibody of the present invention as a recombinant antibody is also changed by amino acid substitution, deletion, addition and Z or insertion, or chimerization or humanization. The amino acid sequence may be altered.
- a modified antibody having a substituted amino acid sequence such as a chimeric antibody, particularly a humanized antibody may be used.
- a modified antibody, an antibody fragment, a low molecular weight antibody and the like to which various molecules are bound may be used.
- a “chimeric antibody” is an antibody produced by combining sequences derived from different animals. For example, a mouse antibody heavy chain and light chain variable (V) region and a human antibody heavy chain and light chain constant (C) region can be exemplified.
- V antibody heavy chain and light chain variable
- C human antibody heavy chain and light chain constant
- the production of a chimeric antibody is known, for example, by linking DNA encoding an antibody V region with DNA encoding a human antibody C region, incorporating this into an expression vector, introducing it into a host, and producing it.
- Antibody can be obtained
- Humanized antibody refers to a complementarity determining region (CDR) of a non-human mammal-derived antibody, such as a mouse antibody, also called a reshaped human antibody. Those transplanted into antibody CDRs are known. In addition, for example, by using a general gene recombination technique, a CDR of a mouse antibody is determined, and DNA encoding an antibody in which the CDR and a framework region (FR) of a human antibody are linked is obtained. , Hitoi The antibody can be produced by a system using a normal expression vector. Such DNA can be synthesized by PCR using several oligonucleotides prepared as primers with overlapping portions in both CDR and FR terminal regions.
- CDR complementarity determining region
- the C region of these antibodies is preferably derived from a human antibody. Further, in order to improve the stability of the antibody or its production, the human antibody C region may be modified as necessary.
- the constant region derived from a human antibody usually has a unique amino acid sequence for each isotype such as IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD, and IgE.
- the constant region used for the humanized antibody in the present invention may be a constant region of an antibody belonging to any isotype.
- the constant region of HgG is used, but the present invention is not limited to this, and it may be a case where there is no constant region as described above.
- variable region and constant region of the chimeric antibody or humanized antibody in the present invention may be modified by deletion, substitution, insertion and / or addition as long as they exhibit the function (activity) of the original antibody. Good.
- Chimeric antibodies and humanized antibodies that utilize human-derived sequences are useful to be prepared outside the body and administered for therapeutic purposes to patients with reduced ability to produce antibodies in the body.
- low molecular weight antibodies can be produced at low cost using Escherichia coli, plant cells, etc., and are economically superior.
- low-molecular-weight antibodies for example, ScFv, Diabody, etc.
- an antibody fragment such as ScFv
- a neutralizing antibody against the polypeptide is produced by an immune reaction in the body. It is considered that the activity of the peptide decreases.
- normal antibodies complete antibodies
- they may be complete antibodies rather than antibody fragments when administered into the body by a method other than local administration. preferable.
- An antibody fragment is a kind of low molecular weight antibody.
- antibody fragments Antibodies that are part of the structure are also included.
- the structure, production method and the like of the low molecular weight antibody produced using the neutralizing antibody of the present invention are not particularly limited.
- Low molecular weight antibodies usually have a higher specific activity than full-length antibodies.
- Examples of antibody fragments that can be prepared using the neutralizing antibody of the present invention as an immunogen include Fab, F (ab ') 2, Fab', and Fv.
- the amino acid sequence of VH or VL in the antibody fragment may be modified by substitution, deletion, addition and / or insertion.
- variable region is the smallest antibody fragment including a complete antigen recognition site and a binding site.
- Fv is a dimer (VH-VL dimer) in which one VH and one VL are strongly bound by a covalent bond.
- the three complementary determining regions (CDRs) of each variable region interact sterically to form an antigen binding site on the surface of the VH-VL dimer.
- Six CDRs confer antigen binding sites on the antibody.
- one variable region or half of an Fv containing only three CDRs specific to the antigen
- the variable region of the antibody fragment may be chimerized or humanized.
- the low molecular weight antibody contains both VH and VL.
- the low molecular weight antibody include antibody fragments such as Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 and Fv, and ScFv (single chain Fv) which can be prepared using the antibody fragment.
- An antibody fragment can also be obtained by treating an antibody with an enzyme, for example, a protease such as papain or pepsin.
- a low molecular weight antibody having a structure obtained by modifying an antibody fragment can be constructed using an antibody fragment obtained by enzyme treatment or gene recombination.
- a gene encoding the entire low molecular weight antibody can be constructed, introduced into an expression vector, and then expressed in an appropriate host cell.
- the above-mentioned "ScFv” produced using the neutralizing antibody of the present invention is a single-chain polypeptide in which two variable regions are bound via a linker or the like as necessary. May be.
- the two variable regions contained in a ScFv may usually be one VH and one VL force two VHs or two VLs.
- ScFv polypeptides have a linker between the VH and VL domains. One, thereby forming the VH and VL paired portions necessary for antigen binding.
- the linker that links VH and VL is generally a peptide linker having a length of 10 amino acids or more.
- the ScFv linker in the present invention is not limited to such a peptide linker as long as it does not prevent the formation of ScFv.
- any peptide linker that can be introduced by genetic engineering, a synthetic compound linker, or the like can be used as a linker that links two variable regions of an antibody.
- the length of the peptide linker is not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose.
- diabody (Db) refers to a bivalent antibody fragment constructed by gene fusion.
- Diabodies are dimers composed of two polypeptide chains, each of which is a position where the light chain variable region (VL) and heavy chain variable region (VH) cannot bind to each other in the same chain. For example, about 5 amino acid residues. Since VL and VH encoded on the same polypeptide chain cannot form a single-chain V region fragment due to the short linker between them, a dimer forms a dimer. Will have.
- the diabody contains two molecules of ScFv, it contains four variable regions, resulting in two antigen-binding sites.
- the linker that connects VH and VL in each ScFv molecule is usually 5 to It should be about 20 amino acids.
- the ScFv linker that forms the diabody is not limited to such a peptide linker as long as it does not interfere with the formation of the diapod.
- variable region of an antibody can be expressed as a single-chain antibody (ScFv) on the surface of the phage by the phage display method, and a phage that binds to the antigen can be selected.
- a phage that binds to the antigen can be selected.
- the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined. If the DNA sequence of ScFv that binds to the antigen is clarified, an appropriate expression vector can be prepared based on the sequence to obtain a human antibody.
- a residue encoding a hyperpridoma antibody The method for obtaining a gene can be basically performed using a known technique.
- cells expressing the neutralizing antibody of the present invention for example, nmAb-KT are used as a sensitizing antigen and immunized according to a normal immunization method. These cells are fused with known parental cells by the cell fusion method, and monoclonal antibody-producing cells (hypridoma) are screened by the usual screening method. It can be obtained by synthesizing the cDNA of the region (V region) and ligating it with the DNA encoding the desired antibody constant region (C region).
- phage display technology includes a powerful enrichment procedure that allows for quick and easy selection of reagents with desired properties and also provides a stable source of genes.
- ScFv fragments can be produced in large quantities in bacteria.
- the ScFv gene can be engineered to introduce mutations that enhance the binding properties of the antibody reagent.
- the phage display method is a reliable technique for cloning functional immunoglobulin genes (Falmacia Vol.40, No.8, 2004) o
- Antibody-producing cells can be obtained by immunizing an animal with a sensitizing antigen (the neutralizing antibody of the present invention). Alternatively, antibody-producing cells can be obtained by immunizing in vitro lymphocytes capable of producing antibodies.
- various rodents that can use various mammals are generally used. Examples include rodents such as mice, rats, and hamsters, maggots such as magpies, and primates such as monkeys such as power-quiz, monkey, baboon and chimpanzee.
- transgenic animals having a repertoire of human antibody genes are also known, and human antibodies can be obtained by using such animals.
- human lymphocytes are sensitized (immunized) with the neutralizing antibody (antigen) of the present invention or cells expressing the antibody in vitro, and the sensitized lymphocytes are used.
- a human antibody having binding activity to the antigen can also be obtained by fusing with human myeloma cells such as U266.
- the neutralizing antibody (sensitizing antigen) of the present invention is appropriately diluted and suspended in Phosphate-Buffered Sline (PBS) or physiological saline, and an adjuvant is mixed as necessary. After emulsifying together, the injection is carried out intraperitoneally or subcutaneously in the animal. Thereafter, the sensitizing antigen mixed with Freund's incomplete adjuvant is preferably administered several times every 4 to 21 days. Confirmation of antibody production can be performed by measuring the desired antibody titer in the serum of an animal by a conventional method.
- PBS Phosphate-Buffered Sline
- an adjuvant is mixed as necessary. After emulsifying together, the injection is carried out intraperitoneally or subcutaneously in the animal. Thereafter, the sensitizing antigen mixed with Freund's incomplete adjuvant is preferably administered several times every 4 to 21 days. Confirmation of antibody production can be performed by measuring the desired antibody titer in the serum of an animal by a conventional method.
- ibridomas antibody-producing cells obtained from animals or lymphocytes immunized with the neutralizing antibody (antigen) of the present invention are used as myeloma cells using a conventional fusion agent (for example, polyethylene glycol). And can be made by fusing.
- a conventional fusion agent for example, polyethylene glycol.
- a gene encoding the selected antibody can be cloned from a hybridoma or an antibody-producing cell (such as sensitized lymphocyte) using a probe that can specifically bind to the antibody.
- mRNA force can also be crawled by RT-PCR.
- H and L chains can be modified by genetic engineering techniques.
- genetically engineered antibodies that have been artificially modified to reduce xenoantigenicity to humans, such as mouse antibodies, rat antibodies, rabbit antibodies, hamster antibodies, Hedge antibodies, camel antibodies, etc.
- chimeric antibodies, humanized antibodies and the like can be appropriately prepared.
- a chimeric antibody is an antibody consisting of the variable regions of the non-human mammal, for example, the H chain and L chain of a mouse antibody, and the constant regions of the H chain and L chain of a human antibody, and encodes the variable region of a mouse antibody.
- the DNA to be obtained can be obtained by ligating the DNA encoding the constant region of a human antibody, incorporating it into an expression vector, introducing it into a host, and producing it.
- the human rabbit antibody is also called a reshaped human antibody, and has a DNA sequence designed to link the complementarity determining regions (CDRs) of non-human mammals such as mouse antibodies.
- CDRs complementarity determining regions
- Several oligonucleotides prepared so as to have overlapping parts are synthesized by the PCR method.
- the obtained DNA is obtained by ligating with DNA encoding the constant region of a human antibody, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it.
- FR framework region
- FR complementarity determining region that forms a favorable antigen-binding site
- amino acid in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site.
- modifications may be considered to improve the biological properties of the antibody, such as binding to the antigen. Such modification can be performed by site-directed mutagenesis (for example, see Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488), PCR mutation, cassette mutation, and the like.
- antibody variants with improved biological properties are 70% or more relative to the amino acid sequence of the variable region of the underlying antibody (eg, the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 5 to 8). More preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more (for example, 95% or more, 97%, 98%, 99%, etc.) amino acid sequence homology and / or similarity.
- sequence homology and / or similarity is homologous to the underlying antibody residue after aligning the sequence and introducing gaps as necessary to maximize sequence homology. Defined as the percentage of amino acid residues that are (same residues) or similar (amino acid residues that fall into the same group based on the general amino acid side chain properties).
- amino acid residues are based on the properties of their side chains.
- Hydrophobic lanine, isoleucine, norleucine, norin, methionine and leucine
- neutral hydrophilicity Asparagine, glutamine, cysteine, threonine and serine
- Acidity Aspartic acid and glutamic acid
- Basicity Arginine, histidine and lysine
- Residues affecting chain orientation Glycine and Proline
- Aromaticity classified into tyrosine, tributophan and phenylalanine groups.
- amino acid modification is not particularly limited, but it is preferable to modify the amino acid having the same properties as described above.
- the neutralizing antibody of the present invention as an immunogen, for example, a human chromosome-transfected mouse (Kazuhiro Motoki, Ayumi Medical, Vol.211, No.7, p.733-740, 2004) ) Can be used to produce a desired human antibody.
- a nucleic acid encoding the neutralizing antibody of the present invention is also included in the present invention.
- the base sequence of the nucleic acid encoding the amino acid sequence can be easily known.
- the nucleic acid of the present invention is usually carried (inserted) in an appropriate vector and introduced into a host cell.
- the vector is special if it can stably hold the inserted nucleic acid.
- E. coli is used as the host, the pBluescript vector (Stratagene) is preferred as the cloning vector! /, But it is possible to use various commercially available vectors. it can.
- An expression vector is particularly useful when a vector is used for the purpose of producing the antibody of the present invention.
- the expression vector is not particularly limited as long as it is a vector that expresses the polypeptide in vitro, in E. coli, in cultured cells, or in an individual organism.
- pBEST vector manufactured by Promega
- E. coli PET vector manufactured by Invitrogen
- pME18S-FL3 vector GenBank Accession No. AB009864
- pME18S vector Mol Cell Biol. 8: 466-472 (1988)
- the nucleic acid of the present invention can be inserted into the vector by a conventional method, for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site.
- the host cell is not particularly limited, and various host cells can be used depending on the purpose.
- Examples of cells for expressing the polypeptide include bacterial cells (eg, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis), insect cells (eg, Drofophila S2, Spodoptera SF9), animal cells ( Examples: CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HE K293, Bowes melanoma cells) and plant cells.
- Vector introduction into host cells can be performed by, for example, calcium phosphate precipitation, electric pulse perforation (Current protocol in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9), lipophectamine method ( GIBCO-BRL) and microinjection can be used.
- an appropriate secretion signal can be incorporated into the polypeptide of interest.
- These signals may be endogenous to the polypeptide of interest or they may be heterologous signals.
- the polypeptide is collected when the polypeptide of the present invention is collected in the medium.
- the polypeptide of the present invention is produced in a cell, the cell is first lysed, and then the polypeptide is recovered.
- the ability of recombinant cell culture to recover and purify the polypeptides of the present invention also includes ammonium sulfate.
- ammonium sulfate including precipitation or acid precipitation, acid extraction, ion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography and lectin chromatography The method can be used.
- the present invention also provides an antigen (immunogen) for producing an anti-idiotype antibody comprising the neutralizing antibody of the present invention (for example, nmAb-KT etc.) as an active ingredient. (It may be described as “antigen of the present invention” in the present specification.)
- the antigen of the present invention may be a composition (immunogenic composition) to which a pharmaceutically acceptable solvent or carrier is added.
- the antigen of the present invention can also be expressed as, for example, “immune inducer”, “immune inducer for anti-idiotype antibody production”, or the like.
- antibodies that can be used as the antigen in the present invention include nmAb-KT. It is a finding first found by the present inventors that the nmAb-KT is useful as an immunogen for the production of an effective anti-idiotype antibody.
- the antibody produced using the antigen of the present invention is useful as an antifungal agent.
- the fungi considered to be effective for the antifungal agent are usually fungi having glucan synthase, such as Saccharomyces (yeast), Candida albicans, ryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatos, etc.
- an anti-idiotype antibody can be preferably prepared as described above.
- the anti-idiotype antibody is, for example, an antibody characterized by having
- any fungi those skilled in the art can appropriately know whether or not they have the ability to have j8 glucan synthase by various known literatures. Even if it is unclear whether or not it has a j8 glucan synthase according to known literature, etc., the method for detecting ⁇ -glucan synthase activity as described above is already known. For any fungus, ⁇ -dulcan is used by a contractor using a known general method. It is possible to check whether or not the product has a synthase as appropriate.
- An antibody production method using the neutralizing antibody of the present invention (for example, nmAb-KT) as an immunogen is also included in the present invention.
- the above method is, for example, a method comprising a step of administering a neutralizing antibody of the present invention (eg, nmAb-KT) to an animal.
- an antibody itself produced using the neutralizing antibody of the present invention as an immunogen is also included in the present invention.
- the inventors have determined an epitope region on a killer toxin-like protein that can be recognized by the neutralizing antibody of the present invention.
- polypeptide containing the epitope region is useful as an antigen for producing the neutralizing antibody of the present invention. Accordingly, the present invention relates to the following polypeptides.
- a polypeptide comprising a partial fragment polypeptide of HM-l protein, the amino acid sequence of positions 39 to 48 in the HM-1 protein of SEQ ID NO: 1.
- a polypeptide comprising a partial fragment polypeptide of the HYI protein, the amino acid sequence of positions 39 to 47 in the HYI protein of SEQ ID NO: 3.
- polypeptide having an amino acid sequence of positions 39 to 48 in the HM-1 protein set forth in SEQ ID NO: 1 or the HYI set forth in SEQ ID NO: 3 In the protein, mention is made of a polypeptide having an amino acid sequence at positions 39 to 47.
- polypeptide can be suitably used as an immunogen (antigen) for the production of an antibody that neutralizes the activity of a killer toxin-like protein. That is, the polypeptide can be used as a drug for inducing an antibody that neutralizes the activity of a killer toxin-like protein.
- the present invention provides an immunogenic composition (neutralizing antibody inducer) that can induce neutralizing antibodies, containing the polypeptide of the present invention as an active ingredient.
- An antibody having the above polypeptide of the present invention as an epitope is, for example, an antibody having a function of inhibiting j8 glucan synthetase inhibitory activity.
- the present invention relates to a method for producing a neutralizing antibody of the present invention, which comprises using the immunogenic yarn composition of the present invention (for example, a polypeptide having the above epitope) as an antigen.
- the method includes various methods (steps) using a general antibody production technique using the immunogenic composition of the present invention as an antigen.
- the above-described production method of the present invention can include a method including the following steps.
- the method is not necessarily limited to this method.
- the antifungal agent produced using the neutralizing antibody of the present invention is effective for the treatment or prevention of mycosis.
- mycosis include dermatomycosis (such as ringworm mycosis (aquatic worms, worms, and shirakumo)), subcutaneous mycosis (mycosis, actinomycosis, etc.), mucosal mycosis (candidiasis, aspergillosis, Mucormycosis, etc.), pulmonary mycosis (taryptococcosis, histoplasmosis, etc.).
- dermatomycosis such as ringworm mycosis (aquatic worms, worms, and shirakumo)
- subcutaneous mycosis mycosis, actinomycosis, etc.
- mucosal mycosis candidiasis, aspergillosis, Mucormycosis, etc.
- the mycosis which is a target of the antifungal agent produced using the neutralizing antibody of the present invention is not particularly limited, but is preferably a mycosis caused by a Candida or Aspergillus fungus. More specific examples include deep mycosis caused by fungi of the genus Candida or Aspergillus. The treatment of deep mycosis, which is often serious and has a high fatality rate, is an important medical issue. The drug is expected to have an effective therapeutic effect on, for example, deep mycosis.
- the present invention can also produce protein antibiotics against pathogenic fungi such as molds by an antibody production method using the neutralizing antibody of the present invention as an antigen.
- the substance can also be used as a detergent, antifungal agent or antifungal material for the purpose of removing mold or preventing adhesion.
- the present invention relates to a composition
- a composition comprising the neutralizing antibody of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
- the agent or composition of the present invention or the antibody produced using the neutralizing antibody of the present invention can be formulated by methods known to those skilled in the art.
- it can be used parenterally in the form of a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or as an injection in suspension.
- a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterile water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspension, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative
- a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterile water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspension, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative
- the drug by combining it in an appropriate combination with a drug, a binder, etc. in the unit dosage form generally required for the practice of the drug.
- the amount of active ingredient in these preparations is set so that an appropriate volume within the indicated range can be obtained.
- Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
- Aqueous solutions for injection include isotonic solutions containing, for example, physiological saline, glucose and other adjuvants (eg D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride).
- a suitable solubilizing agent such as alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80 (TM), HCO-50, etc.) may be used in combination.
- oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, and benzyl benzoate and Z or benzyl alcohol may be used in combination as a solubilizing agent. It can also be combined with buffers (eg, phosphate buffer and sodium acetate buffer), soothing agents (eg, pro-chlorine hydrochloride), stabilizers (eg, benzyl alcohol and phenol), and antioxidants. Good.
- buffers eg, phosphate buffer and sodium acetate buffer
- soothing agents eg, pro-chlorine hydrochloride
- stabilizers eg, benzyl alcohol and phenol
- antioxidants antioxidants. Good.
- the prepared injection is usually filled into a suitable ampoule.
- a drug containing the drug of the present invention or an antibody produced using the neutralizing antibody of the present invention is preferably administered by parenteral administration.
- the composition can be an injection, nasal administration, pulmonary administration, or transdermal administration.
- it can be administered systemically or locally by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, or subcutaneous injection.
- the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
- the dose of the pharmaceutical thread or the composition containing the antibody or the polynucleotide encoding the antibody can be set, for example, in the range of 0.0001 mg to 1000 mg per kg body weight at a time. Or, for example, the power that can be a dose of 0.001 to 100,000 mg per patient.
- the present invention is not necessarily limited to these values.
- the dosage and administration method vary depending on the patient's weight, age, symptoms, etc., but those skilled in the art can set an appropriate dosage and administration method in consideration of these conditions.
- the drug of the present invention can be formulated in combination with other medicinal ingredients.
- the present invention also provides a nucleic acid encoding the neutralizing antibody of the present invention. Furthermore, a vector carrying the nucleic acid is also included in the present invention.
- the present invention provides a host cell having the nucleic acid.
- the host cell is not particularly limited, and examples thereof include E. coli and various animal cells.
- the host cell can be used, for example, as a production system for production and expression of the antibody or polypeptide of the present invention.
- Production systems for polypeptide production include in vitro and in vivo production systems. Examples of in vitro production systems include production systems that use eukaryotic cells and production systems that use prokaryotic cells.
- Examples of eukaryotic cells that can be used as host cells include animal cells and plant cells.
- Animal cells include mammalian cells such as CH0 (J. Exp. Med. (1995) 108: 94 5), COS, 3T3, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero and the like amphibian cells such as Examples are Xenopus oocytes (Valle et al., Nature (1981) 291: 338-340), and insect cells such as S19, Sf21, Tn5.
- CHO-DG44, CH0-DX11B, COS7 cells, and BHK cells are preferably used.
- CHO cells are particularly preferred for the purpose of mass expression.
- Host details The vector can be introduced into the cell by a method such as a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, an electroporation method, a lipofussion method, or the like.
- a plant cell for example, it is known as a cell force S protein production system derived from Nicotiana tabacum, and the antibody of the present invention can be produced by a method of culturing this cell. .
- prokaryotic cells When prokaryotic cells are used, there are production systems using bacterial cells.
- a bacterial cell As a bacterial cell, a production system using Bacillus subtilis in addition to the above-mentioned E. coli is known and can be used for the production of the antibody of the present invention.
- a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide encoding the antibody of the present invention is cultured to express the polynucleotide.
- the culture can be performed according to a known method. For example, when animal cells are used as hosts, for example, DMEM, MEM, RPMI1640, and IMDM can be used as a culture solution. At that time, the cells may be cultured by serum-free culture, even in combination with serum supplements such as FBS and fetal calf serum (FCS).
- the pH during culture is preferably about 6-8. Cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 200 hours, with medium exchange, aeration, and agitation as necessary.
- examples of a system for producing a polypeptide in vivo include a production system using animals and a production system using plants.
- the target polynucleotide is introduced into these animals or plants, and the polypeptide is produced in the body of the animals or plants and recovered.
- the “host” in the present invention includes these animals and plants.
- mammals When animals are used, there are production systems using mammals and insects. Examples of mammals that can be used include goats, pigs, hidges, mice, mice, mice, horses, horses, etc. (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)). In addition, when a mammal is used, a transgenic animal can be used.
- the polynucleotide encoding the neutralizing antibody of the present invention is prepared as a fusion gene with a gene encoding a polypeptide inherently produced in milk such as goat ⁇ -casein.
- the polynucleotide fragment containing the fusion gene is then injected into a goat embryo, and the embryo is transferred to a female goat.
- Transjenical goats are also born to receive the embryos
- the desired antibody can be obtained from the milk produced by the offspring.
- Transformer goats Hormones may be administered to Transgenic goats as appropriate to increase the amount of milk containing the antibodies produced.
- a silkworm can be used as an insect that produces the neutralizing antibody of the present invention.
- the target antibody can be obtained from the body fluid of the silkworm by infecting the silkworm with a baculovirus into which a polynucleotide encoding the target antibody is inserted.
- a plant when a plant is used for production of the neutralizing antibody of the present invention, for example, tobacco can be used.
- tobacco a polynucleotide encoding the antibody of interest is inserted into a plant expression vector, such as pMON 530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens. .
- This bacteria can be infected with tobacco, for example, Nicotiana tabacum, and desired antibodies can be obtained from the leaves of this tapaco.
- the antibody thus obtained can be isolated from the inside of the host cell or outside the cell (medium, milk, etc.) and purified as a substantially pure and homogeneous antibody. Separation and purification of antibodies are not limited in any way as long as separation and purification methods used in usual polypeptide purification are used. For example, select chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. In combination, antibodies can be separated and purified.
- chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography. These chromatography can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
- Columns used in the affinity chromatography include protein A columns and protein G columns. Examples of the column using protein A include Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia) and the like.
- an appropriate protein modifying enzyme is allowed to act before or after antibody purification. Thus, it is possible to arbitrarily modify or partially remove the peptide.
- the protein modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, lysyl endopeptidease, protein kinase, darcosidase and the like.
- nmAb-KT The purified neutralizing monoclonal antibody
- polyclonal sagi antiserum against HM-1 are available from Technology Incubation & Transfer Ltd. (Japan, Saitama) and Japan Biotest Laboratories (Tokyo, Japan), respectively. Preparation of ⁇ .
- Purified HM-1 and HYI killer toxin proteins are described in the literature (Ohta, Y., Tsukada, Y., and Sugi mori, T. (1984) Production, purification and characterization of HYI, an anti-yeast s ubstance, produced by Hansenula Saturnus. Agric. Biol. Chem.
- mice (1994) and loning of the Saccharomyces cere visiae gene whose overexpression overcomes the effects of HM— 1 killer toxin, which inhibits beta— glucan synthesis. J. Bacteriol. 176 , 1488-1499.).
- the mouse monoclonal isotyping kit was purchased from Amersham Biosciences (Tokyo, Japan). Horse scab peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG and anti-mouse goat IgG, and alkaline phosphatase-conjugated anti-mouse goat Ig G were purchased from Sigma (St. Louis, MO, USA).
- Biocore X system CM5 chip, and amino coupling kit are products of Biocore AB (Uppsala, Sweden).
- the peptide is synthesized by Sigma Dienosis.
- YPD medium is 1% yeast Consists of extract and 2% peptone and glucose each.
- the subclass of the neutralizing monoclonal antibody was determined using an antibody isotyping kit (Amersham Pharmacia Biotech) according to the procedure provided by the manufacturer. Specifically, the isotyping stick was incubated with 3 ⁇ g / ml nmAb dissolved in TBS for 15 minutes at room temperature with moderate agitation. The sticks were soaked in a solution of horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse goat IgG diluted 1: 500 at room temperature for 15 minutes with moderate shaking.
- the subclass of nmAb-KT was defined by adding 4-chloro-1-naphthol dissolved in cold methanol and 0.1% hydrogen peroxide / hydrogen peroxide.
- HM-1 and HYI protein 0.1 / zg were subjected to 15% polyacrylamide gel electrophoresis. Protein was transferred from the gel to a ProBlott membrane (Applied Biosystems). The membrane was blocked with 4% low fat dry milk dissolved in TBS-T buffer. The membrane was soaked in 3 ⁇ g / ml nmAb-KT dissolved in blocking solution for 2 hours. After washing 3 times with TBS-T, the membrane was further incubated for 1 hour in alkaline phosphatase-conjugated anti-mouse goat IgG solution. After washing, Western blue (Promega) was added as a substrate to visualize the protein on the membrane. Colored wide area standard material 51 was used as a standard marker.
- Killatoxin protein was diluted with blocking buffer, HM-1 and HYI solutions 50 1 were added to each well, incubated at room temperature for 2 hours, and then washed 3 times with TBS-T.
- Gib serum 100 1 was added to the well and incubated at room temperature for 1 hour. After washing the well with TBS-T, it was bound by incubating at 30 ° C for 30 minutes with 1: 1000 diluted horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG solution and then washing with TBS-T. Protein was detected.
- a 10% 0-phenolamine solution containing 0.1% hydrogen peroxide was added to each well and incubated for 10 minutes at 30 ° C for color development.
- IN HC1 100 ⁇ 1 was added to stop the reaction, and finally the absorbance at 490 nm was measured using a microplate reader.
- HBS-EP buffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% polysorbate 20 (pH 7.4)
- Immobilization of nmAb-KT to the CM5 sensor chip was performed according to the standard procedure of the amine coupling method, except for the activity.
- a biosensor surface activated with a 1: 1 mixture of 200 mM N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride and 50 mM N-hydroxysuccinimide 120 1 was used. Inject 35 ⁇ g / ml nmAb-KT diluted in preconcentration buffer (10 mM sodium acetate (pH 5.0)), then inject 1M ethanolamine (pH 8.5) 120 1 to unreacted reagent. Inactive. Approximately 3,000 resonance units (RU) of nmAb-KT were immobilized.
- HM-1 and HYI proteins were analyzed at concentrations between 6.25 nM and 100 nM. Each injection sample (301) of purified protein was contacted with the antigen. Assess the kinetic sensorgram curve using BlAevaluation 3.0 to determine the association rate constant k and dissociation rate constant
- the killer toxin activity of HM-1 and HYI proteins is determined using S. cerevisiae A451 Measured by liquid culture ( Komiyama, T., Ohta, T., Urakami, H., Shiratori, Y., Takasuka, T., Satoh, M., Watanabe, T., and Furuichi, Y. (1996) Pore formation on proliferating yeast Saccharomyces cerevisiae cell buds by HM—1 killer toxin. J. Biochem. (Tokyo). 119, 731-736.). Approximately 4 ⁇ 10 6 cells / ml of S. cerevisiae A451 were incubated for 8 hours at 30 ° C. in YPD medium containing 15 ⁇ g / ml nmAb- ⁇ or 40 ng / ml HM-1 or HYI. Yeast growth was measured by absorbance at 600 °.
- nmAb-KT epitope In order to determine the nmAb-KT epitope, the inhibitory effect of HM-1 or HYI-derived peptides on the neutralizing activity of nmAb-KT was measured. In order to identify the sequence of nmAb-KT epitopes, 12 peptides (P1 to P12) with N-terminal force up to C-terminal were prepared based on the amino acid sequence of HM-1 (Table 1). Incubate n mAb-KT with 10 / z M peptide and 40 ng / ml HM-1 in YPD medium containing approximately 4 x 10 6 cells / ml of S. cerevisiae A451 at 4 ° C. The experiment was conducted. After incubation for 8 hours at 30 ° C, yeast growth was measured by monitoring absorbance at 600 nm.
- Table 1 shows the peptides used in the nmAb-KT epitope analysis.
- HM-1 Decapeptide 39 TGGSTDGKQG 48 (SEQ ID NO: 2)
- Peptide name numbers are based on the HM-1 amino acid sequence.
- the amino acid position number is the N-terminal amino acid power counted.
- HM-1 decapeptide which shows the amino acid sequence of 39-48 of HM-1
- HYI nanopeptide Table 1 of 39-47 of HYI
- the epitope site was identified.
- the ProBlott membrane was placed in a dot blot apparatus (Bio-Craft Inc.) and a given area was coated with 0.1 ⁇ g of each of 12 HM-1 peptides, HM-1 decapeptides or HYI nanopeptides. Membrane was blocked for 1 hour at room temperature with 2% low fat dry milk dissolved in TBS.
- the membrane was incubated with nmAb-KT as the primary monoclonal antibody for 2 hours at room temperature, and then washed 3 times with TBS-T solution. Bound peptides were detected by incubation with 1: 5,000 diluted alkaline phosphatase-conjugated anti-mouse goat IgG solution for 1 hour at room temperature. Western blue dye was added to complete the detection.
- nmAb-KT idiotype immunogen
- nmAb-KT is a monoclonal antibody that neutralizes in vitro the activity of killer toxin produced from the yeast Williopsis' Saturnus var. mrakii, and was produced by standard Hyperidoma technology (Yamamoto et al., 1986, FEBS letter).
- mice Female Balb / c mice (3 weeks of age, approximate body weight 10 grams) were treated with nmAb-KT 50 ⁇ g and complete Freund's adjuvant (CFA) (l / l: v / v) on days 0 and 14 Immunization was subcutaneously followed by booster injections intraperitoneally with nmAb-KT and incomplete Freund's adjuvant (IFA) on days 28, 42, and 56. Three days after the last booster injection, the mice were sacrificed and the spleen was removed.
- CFA complete Freund's adjuvant
- the antibody variable region The gene was constructed.
- ScFv gene cDNA was prepared by reverse transcription from mRNA isolated from the spleen of the hyperimmune mouse immunized with the above-mentioned nmAb-KT.
- the gene product thus constructed was gel purified and quantified with a spectrophotometer. After ethanol precipitation, the constructed gene was digested with Sfil and Notl restriction enzymes. The digested ScFv fragment was gel purified, cleaved with the same restriction enzymes, and ligated to the phagemid expression vector pCANTAB 5E (Falmacia). The ligated product was then added to 1 ng of plasmid. At the efficiency of 1 x 10 9 transformants, the cells were introduced into suppressor E. coli TG1 cells (Falmacia) by electoral position.
- the cells were transferred to SOBAG medium containing 2% glucose and ampicillin at a concentration of 100 ⁇ g / ml and incubated at 30 ° C. After incubation, colonies were scraped and placed in 5 ml of 2 XYT medium containing 10% glycerol and then stored at -80 ° C.
- phage culture medium 50 1 was added with 2% glucose and 100 ⁇ g / ml ampicillin. 2 In XYT-AG medium containing 50 ml, add OD force of 0.5-0.7
- M13 K07 (Falmacia) helper phage was added with 20: 1 (phage particle: bacterial cell number) and left at 37 ° C for 1 hour without shaking. Cells were collected by centrifugation, suspended in fresh 2 XYT-AK medium containing 100 ⁇ g / ml ampicillin and 50 ⁇ g / ml kanamycin, and incubated overnight at 30 ° C. with shaking.
- Bacteria cells are removed by centrifugation, 1/5 volume of PEG-NaCl (20% PEG8000, 2.5 M NaC1) is added, the phage particles in the supernatant are purified and concentrated, incubated on ice for 30 minutes, Centrifuge at 10,000 g for 30 minutes at 4 ° C. The supernatant was discarded and the pellet was resuspended in 5 ml PBS. The phage suspension was again treated with PEG-NaCl for 30 minutes on ice and centrifuged as described above. After this, the supernatant was discarded and the pellet was resuspended in 2 ml of PBS containing 10% glycerol and then stored at 4 ° C.
- PEG-NaCl 20% PEG8000, 2.5 M NaC1
- the recombinant ScFv phage obtained as described above was rescued from individual clones of Escherichia coli containing the phage by a method using helper phage, and further ELIS as described below. Selection screening was performed using the difference in ability to bind to nmAb-KT by the A method as an index. Microtiter wells were coated with nmAB-KT as described above and blocked with 3% dry milk solution dissolved in PBS for 1 hour at 37 ° C. After washing, the recombinant ScFv phage was placed in a well, incubated at 37 ° C for 2 hours, and then washed 6 times with PBS-T.
- phage selected after four rounds of screening were used to detect non-sublesser E. coli HB2151 (Amersham) that recognizes the amber stop codon between the ScFv coding region and the M13 gene III fragment region. Infected with Falmasia Bioscience). E. coli at 30 ° C until OD force reaches 5-0.9
- Microtiter wells were coated with 10 g / ml nmAb-KT or 1F1 mAb or 4A2 mAb and BSA (negative control) as described above, 1% at room temperature with 3% dry milk solution each in PBS. Time blocked. After washing, soluble ScFv antibody was placed in the well and incubated for 2 hours at room temperature, after which the well was washed three times with PBS-T. A small peptide epitope (E-Tag) is incorporated at the carboxy terminus of ScFv, so the bound ScFv antibody can be combined with HRP-conjugated anti-E-Tag antibody (Falmacia) (1: 1000) for 1 hour at room temperature. After the incubation, it can be detected by the ELISA method described above. As a result, it was confirmed that ScF V antibody was extracted from Escherichia coli in a soluble form.
- E-Tag small peptide epitope
- Escherichia coli HB2151 containing the phage gene encoding the ScFv antibody is soluble by growing in 2 X YT medium containing 1 mM isopropyl ⁇ , -D-thiogalatatopyranoside (IPTG) at 22 ° C for 16 hours. Production of ScFv antibody was induced.
- the ScFv antibody was also extracted from the periplasma of E. coli HB2151 cells using the method described above, and was activated with an anti-E-Tag N-hydroxysuccinimide Sepharose column (Neutrap anti-E-Tag (Tag) Pharmacia) and purified by affinity chromatography. The yield of purified ScFv antibody was 1.0-3.0 mg / 1.
- Membranes were blocked with 3% dry milk in PBS for 1 hour at room temperature, then incubated with HRP-conjugated anti-E-Tag antibody (Falmacia) for 1 hour to reveal ScFv protein on the membrane.
- HRP-conjugated anti-E-Tag antibody Falmacia
- the molecular weight of ScFv was measured using a pre-colored broad range standard (BIO-RAD) 4 / zl.
- the protein concentration of ScFv antibody was measured using the BCA-peptide binding method.
- Nucleic acid sequencing of selected clones was performed using the CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing kit (BECKMAN COULTER) and the products were analyzed by CEQ TM 2000XL DNA analysis system .
- Primers used pCANTAB 5E vector Rl, S3, S4, and S6 sequencing primers (Falmacia). Sequence alignment and manipulation was performed with DNASIS and Genetyx software.
- the V gene has a different sequence.
- ScFv-Al For the four purified ScFv-Al, ScFv-A2, ScFv_A3, and ScFv_A4, these ScFvs were found to inhibit ⁇ -glucan synthase from yeast Saccharomyces.
- ⁇ -glucan synthase is extracted from yeast cells in the growth phase (Yamamoto T. et al., FEBS Lett. 1986; 197: 50-54) and 13 glucan in a reaction solution containing the substrate UDPG (Uridine diphosphate glucose).
- Yamamoto et al. Yamamoto T. et al., FEBS Lett. 1986; 197: 50-54.
- HM-1 purified HM-1 was used as a positive control (positive symmetry) and BSA (bovine albumin protein) was used as a negative control (negative symmetry) for comparison.
- BSA bovine albumin protein
- SPR Surface plasmon resonance
- BIAcore X (Biacore, Uppasala, Sweden) was used to measure the binding rate of ScFv to immobilized antigen by surface plasmon resonance (SPR) analysis according to the manufacturer's instructions.
- Antigen is diluted with a preconcentration buffer of 10 mM sodium acetate (pH 5.0) at a concentration of 35 ⁇ g / ml nmAb-KT or 1F1 mAb or 4A2 mAb and supplied by the manufacturer.
- Use binding kit with contact time 7 minutes and flow rate 10 ⁇ l / min Then, it was fixed to the CM5 sensor chip, and the non-reactive part on the surface was blocked with ethanolamine.
- the following resonance units 1000 resonance units correspond to a surface concentration of 1 ng / mm 2 ) could be measured. They are 3000, 1F1 mAb for the fixed nmAb-KT, 2854, 1825 for the 4A2 mAb.
- Biacore sensorgrams for the interaction of various concentrations of ScFv-Al, ScFv-A2, ScFv-A3, and ScFv-A4 with immobilized nmAb-KT were analyzed.
- the anti-Candida activity of the purified ScFv clone was measured by CFU Atsey (colony forming unit assay).
- Candida albicans was distributed on the surface of Sabouraud dextrose agar plates, spread, then incubated at 30 ° C and CFU counted 48 hours later. This experiment was repeated three times for confirmation. For statistical analysis, the results were expressed as mean standard deviation. Differences in CFU numbers were assessed using Student's t test.
- CFU Atsei showed that the growth of Candida albicans treated with four types of ScFv KTIdAb at 25 ⁇ gml— 1 was inhibited by about 95% or more.
- Table 3 Growth inhibitory activity of ScFv antibodies against yeast (Saccharomyces) and Candida albicans strains).
- the ScFv of the present invention exerts an effective antifungal effect not only on normal yeast (Saccharomyces) but also on Candida albicans strains, which are not effective with existing antifungal agents. It was. That is, it was demonstrated that the anti-idiotype antibody (ScFv) produced using the neutralizing antibody of the present invention has a strong antifungal activity that can kill even Candida albicans strains.
- the neutralizing antibody of the present invention is very useful as an immunogen for the production of an antibody having remarkable antifungal activity.
- nmAb-KT was classified as an IgGl ( ⁇ ) subtype. SDS-PAGE showed only heavy and light chain bands with molecular weights of about 57 kDa and 25 kDa, respectively, suggesting the accuracy of the antibody.
- the effect of nmAB-KT on yeast killer toxin activity of HM-1 and H YI is shown in FIG. The effect of adding nmAb-KT on yeast growth was not shown. HM-1 and HYI showed strong killer toxin activity.
- nmAb-KT prevents growth inhibition of yeast cells by HM-1! When the cells are treated with HYI, nmAb-KT is sensitive to cytocidal activity even at high concentrations (15 ⁇ g / ml). Helped to prevent yeast cells.
- nmAb-KT specifically neutralizes HM-1 killer toxin activity, and HYI killer toxin activity, although these two toxins share high homology in amino acid sequence, It was shown not to be disturbed by nmAb-KT.
- HM-1 and HYI proteins were electrophoresed by 15% SDS-PAGE, transferred to a PVDF membrane, and then nmAb-KT was used as the primary antibody. Alkaline phosphatase binding anti Mouse goat IgG and Western Blue were added to visualize the protein on the membrane.
- a clear single band corresponding to the expected molecular weight of HM-1 of about 9500 Da was shown, whereas HYI showed no band on the membrane.
- a typical calibration curve can be obtained by sandwich ELISA that quantifies HM-1 so that small amounts of HM-1 in the range of 0.25-5 ng (i.e., 50-100 ng / ml solution 50 1) can be measured.
- Figure 3 Under sandwich ELISA conditions using mAB- ⁇ as the primary antibody, HYI (5 ng) was not detected despite high (87%) homology with HM-1 in the primary structure. This result showed that the binding of nmAb-KT was strictly specific for HM-1.
- HM-1 and HYI The binding specificity and kinetic parameters of purified HM-1 and HYI were determined by SPR analysis (Figure 4).
- the Biacore sensorgram showed the extent of interaction between immobilized nmAb-KT and HM-1 or HYI.
- SPR analysis power The obtained kinetic data showed that HM-1 force 3 ⁇ 4 mAb-KT was strong and showed affinity, whereas HYI showed no binding to nmAb-KT. .
- Table 4 shows the calculated values of k, k and K. HM on off d
- K value of -1 is 5.48 X 10- 9 ⁇ - 1. Therefore, again, nmb-KT is d vs. HM-1.
- Table 4 shows the kinetic parameters of the binding of nmAb-KT to HM-1 and HYI measured by SPR analysis.
- nmAb-KT Peptide analysis of nmAb-KT was performed by yeast growth inhibition assay.
- P1 is the first peptide covering the HM-1 molecule ⁇ GDGYLIMCKN ⁇ sequence number: 9
- P12 is the last peptide ( 78 GFYIRSYRRVE 88 , SEQ ID NO: 20) Yes (Table 1).
- the effect of the peptide on yeast growth is shown in Figure 5A. From this result, the inhibition of nmAb-KT on almost all 12 peptides on HM-1, except for P6 and the neighboring peptide, which show significant inhibition. It was shown that the effect is not disturbed!
- HYI nanopeptide 39 TGESNGQQG 47 , SEQ ID NO: 4
- HYI nanopeptide 39 TGESNGQQG 47 , SEQ ID NO: 4
- HYI nanopeptide 39 TGESNGQQG 47 , SEQ ID NO: 4
- HYI nanopeptide 39 TGESNGQQG 47 , SEQ ID NO: 4
- HYI nanopeptide 39 TGESNGQQG 47 , SEQ ID NO: 4
- HYI nanopeptide 39 TGESNGQQG 47 , SEQ ID NO: 4
- HM-1 Addition of peptide ( 39 TGGSTDGKQG 48 , SEQ ID NO: 2) reduces the neutralizing activity of nmAb-KT, which prevents the peptide from blocking the binding of nmAb-KT to HM-1, and free It is suggested that HM-1 molecule kills yeast cells ( Figure 5C), while HYI nanopeptide ( 39 TGESNGQQG 47 , SEQ ID NO: 4) affects the HM-1 neutralizing activity of nmAb-KT.
- Killatoxin has been found to be an interesting antibacterial protein that controls growth competition between yeast and fungi.
- the killer phenomenon was discovered in yeast in 1963, and since then, the number of yeast killer factors in terms of detection of double-stranded RNA virus-like particles, the mechanism of action of killer factors, and the involvement of nuclear genes in the expression of killer single factor genes.
- Many molecular biological and microbiological studies have been performed. These studies with the killoxin system have been used for a variety of purposes, including the development of antifungal drugs and protein-protein interaction studies.
- Identifying and characterizing antibody epitopes that neutralize killer activity is to understand the relationship between killer toxin structure and function, and to utilize killer proteins or antibodies in agriculture and clinical fields. Inevitably important.
- Killatoxin itself has been shown to be a candidate antifungal agent (Yamamot 0, T., Imai, M., Tachibana, K., and Mayumi, M. (1986) Application of monoclonal an tibodies to the isolation and characterization of a killer toxin secreted by Hansenula mrakii. FEBS Lett. 195, 253-257.).
- the proteinous and immunogenic properties of killer toxin have made it difficult to apply directly to treat systemic infections of pathogenic fungi.
- the antifungal activity of killer toxin is powerful enough to efficiently handle the growth of pathogens, or the antibacterial spectrum addresses various pathogenic strains It was unclear whether it was wide enough to do.
- the present inventors have identified nmAb-KT that can neutralize HM-1 killer toxin activity and other types of monoclonals that bind to HM-1 but do not neutralize HM-1 killer toxin activity.
- Antibodies 1F1 and 4A2 were prepared ( Komiyama, T., Zhang, QZ, Miyamoto, M., Selvakumar, D., and Furuichi, Y. (2004) Monoclonal antibodies and sandwich ELISA for quant itation of HM-1 killer toxin. Biol. Pharm. Bull. 27, 691-693.).
- the present inventors succeeded in characterizing the active site of HM- involved in glucan synthase inhibition and the epitope site to which nmAb-KT binds.
- nmAb-KT was characterized as an IgGl ( K ) antibody, and a new sandwich ELISA method was created using nmAb-KT so that submicron amounts of HM-1 could be quantified.
- HM-1 epitope recognized by nmAb-KT, which inhibits (intermediates) HM-1 glucan synthase inhibitory activity and killer activity.
- Synthetic peptide scan analysis shows that the nmAb-KT epitope is located within HM-1 decapeptide 39 TGGSTDGKQG 48 (SEQ ID NO: 2), which is part of the active site of HM-1 killer function. It was shown that there is a possibility.
- the monoclonal antibodies, 1F1 and 4A2, originally produced against HM-1 bind to both HM-1 and HYI as shown by dot blot analysis ( Figures 6A and B).
- HYI were suggested to have the same 3D structure with a high amino acid sequence homology of 87%. From the fact that nmAb-KT 9 TGGSTDGKQG 48 (SEQ ID NO: 2) binds only to HM-1 and neutralizes killer activity, 39 TGESNGQQ in the same region G 47 (SEQ ID NO: 4) that recognize HYI antibodies to neutralize the killer toxin activity and glucan synthase inhibitory activity of HYI as NmAb- KT was suggested. Such an antibody can be used for anti-idiotype immunization for producing an anti-idiotype antibody having an activity similar to that of HYI.
- the present inventors also used anti-idiotype that mimics the internal image of HM-1 killer toxin by recombinant DNA technology or phage display technology using nmAb-KT after idiotype vaccination.
- the antibody was actually made.
- the inventors have succeeded in obtaining ScFv anti-idiotype antibodies that exhibit potent killer toxin activity against various clinically important pathogens.
- nmAb-KT epitope could be determined by using a soluble peptide. Considering the homology between HM-1 and HYI, the final epitope of nmAb-KT was suggested. The amino acids 39 TG 4 ° and 47 QG 48 in the HM-1 decapeptide are similar to HYI (Table 1). It can therefore be concluded that the final epitope of nmAb-KT is at position 41 GSTDGK 46 (SEQ ID NO: 21).
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Abstract
本発明者らは、HM-1に対して中和活性を有するnmAb-KTをマウスに免疫することにより、HM-1の抗イディオタイプ抗体(ScFv)を作製することに成功した。該nmAb-KTを免疫原(抗原)として用いることにより、実際にキラートキシン活性を有する抗体分子を効率的に作製することが可能であることを見出した。
さらに本発明者らは、該nmAb-KTによって認識されるHM-1のエピトープ(アミノ酸領域)を決定することに成功した。該領域をエピトープとする抗体は、抗イディオタイプ抗体の製造において免疫原として非常に有用である。
Description
明 細 書
キラートキシン様タンパク質に対する中和抗体、およびその利用
技術分野
[0001] 本発明は、キラートキシン様タンパク質に対する中和抗体、および該中和抗体の作 製方法、並びに、該中和抗体を抗原として利用した抗体の作製方法に関する。
背景技術
[0002] ある種の酵母は、他の種の酵母に対して抗酵母 (キラー)活性を示すタンパク質 (キ ラートキシン)を分泌する。 HM-1キラートキシンは、ハンゼヌラ 'ムラキ(Hansenula mra kii)と以前に呼ばれて 、た酵母ウイリオプシス ·サチュルヌス(Williopsis saturnus) Var. mrakii IFO 0895により産生される強力な抗酵母ポリペプチドであり、 K9型キラートキ シン群に属している。 HM-1は 88アミノ酸からなり、約 9500ダルトンの分子量を有する( 非特許文献 1参照)。 HM-1タンパク質の三次元構造は NMR ^ベクトルを用いて解明 されている(非特許文献 2参照)。 HM-1は、キラートキシンの中では熱処理および広 範囲の pH値にわたって非常に安定である。
[0003] また、 HM-1キラートキシンに関しては、以下のような種々の知見が報告されている。
サッカロマイセス ·セレビジェ (Saccaromyces cerevisiae)のノヽンゼヌラ ·ムラキ IF O08 95由来の HM-1キラートキシンに対する感受性には、 N-グリコシレーシヨンが関与して いる(非特許文献 3参照)。また、 HM-1キラートキシンは、サッカロマイセス 'セレビジ ェの酵母スフエロプラストにおける、丸い形状の維持に関与している(非特許文献 4 参照)。
[0004] この HM-1と相同性を有する、ハンゼヌラ 'サチュルヌス(Hansenula saturnus)によつ て産生される HYIキラートキシンも知られて ヽる (非特許文献 5参照)。ウイリオプシス · サチュルヌス var.saturnus由来の HYIキラートキシンも、細胞壁合成を阻害し、感受性 酵母細胞の出芽に細胞破壊効果を及ぼす。このメカニズムはウイリオプシス ·サチュ ルヌス var.mrakiiの HM-1トキシンと類似して!/、る(非特許文献 6参照)。
[0005] HM-1は、感受性サッカロマイセス 'セレビジェの細胞壁合成を選択的に阻害し (非 特許文献 7参照)、細胞壁べ一タグルカンと相互作用することが報告されている(非特
許文献 8参照)。また、 HM-1は、グルカン合成酵素を低濃度で阻害する (非特許文 献 9参照)。サッカロマイセス 'セレビジェ由来の βグルカン合成酵素(1,3-ベータ- D- グルカン合成酵素)については、精製と遺伝子のクローユングが行われている。 (非 特許文献 10参照)。 HM-1自体については、モノクローナル抗体とサンドウイツチ ELIS Αによって定量が可能である(非特許文献 11参照)。
[0006] また、サッカロマイセス 'セレビジェの GSC1 (glucan synthase of S. cerevisiae 1; FK SIとも呼ばれている)に対するカンジダ'アルビカンス(Candida albicans)の相同体が クロー-ングされ、カンジダ 'アルビカンス GSC1については、ベータ- 1,3-グルカン合 成酵素のサブユニットに対する遺伝子であることが知られている(非特許文献 12参照
) o
また酵母遺伝子である RHK1は、 HM-1キラートキシンに対する細胞壁受容体の合 成に関与している (非特許文献 13参照)。
HM-1は広いスペクトルのキラートキシン菌活性を有し、治療に広く使用することが できる。しかし、毒性および抗原性があるので、用途が限られている。
[0007] また、過剰発現することによって、サッカロマイセス 'セレビジェ細胞に HM-1キラート キシン耐性を与えることができる遺伝子(HKR1)がサッカロマイセス 'セレビジェのゲノ ムライブラリー力もクローユングされている(非特許文献 14参照)。この HKR1は、酵母 サッカロマイセス.セレビジェにおける細胞壁べ一タグルカン合成および出芽パター ンを調節する細胞表面のタンパク質をコードしている(非特許文献 15参照)。
[0008] これらの結果から、キラー活性を有する HM-1キラートキシン誘導体を新たな治療法 に用いることが期待される。 HM-1キラートキシンのキラー活性は、真菌類の細胞壁べ 一タグルカン合成するグルカン合成酵素を阻害することに起因する。しかし、その詳 細な分子機構は十分に理解されておらず、これらキラー分子の標的は、恐らくは細 胞膜を貫通して存在するグルカン合成酵素本体の外部領域であったり、あるいはま た、新生グルカン鎖を持つ「グルカン合成酵素一新生グルカン鎖複合体」の細胞外 領域であると予想される力 この他、グルカン合成酵素と結合して存在し、グルカン合 成のために必須な働きをする補助的分子を標的にして 、る可能性も否めな 、。 Vヽず れにしろ、 HM-1キラートキシンは真菌の細胞膜の外側力ゝらグルカン合成機能を抑制
することによりキラー活性を発揮する(図 7Aおよび B参照)。
[0009] Neils Jerneは、免疫調節のネットワークにおけるイディォタイプ決定基の生物学的 重要性について提唱した。イディォタイプは、抗体に特有のェピトープで、抗体の重 鎖または軽鎖に関連し、通常、活性には可変領域の関与が必要とされる。抗イディォ タイプ抗体ネットワークは、 Neils Jerneが提唱したように、元の抗原と接触するイディォ タイプ抗体結合部位の一部と重なる抗原決定基を認識できる。従って、抗ィディオタ ィプ抗体の結合部位は、元の抗原の「内部イメージ (internal image)」を有する可能 性がある。この考えによって更に、抗イディォタイプ抗体の抗原模倣性を、酵母キラ 一トキシンの生物学的特徴を有する抗体の誘発に使用できるという仮説が導かれた 。抗原決定基の内部イメージに相当する抗イディォタイプ抗体は、代用ワクチン、ある いは癌免疫療法では毒素と結合するものとして提案されている。ある場合には、タン ノ^質抗原と抗イディォタイプ抗体可変領域とのアミノ酸配列相同性は明らかにされ ており、該配列を適宜改変することにより、該抗体の機能をさらに強化することが可能 である。抗ィディオタイブ抗体による生物学的受容体のリガンドの機能的模倣性に関 しては広く研究がされて 、る。
[0010] 最近、 Polonelliらは、ポリクローナル、モノクローナル、および単鎖組換え抗体の形 をした、抗菌活性を有する抗ィディォタイプ抗体を作製した (非特許文献 16参照)。こ れらの抗体は、広く研究されているピチア-ァノマラ(Pichia anomala)により産生される 酵母キラートキシンの活性を有する。キラー株はこれらの共通の表現型を有するが、 各キラートキシンは種間または株間で異なり、構造遺伝子、分子量、成熟構造および 免疫、ならびに感受性細胞を認識および殺傷する機構の点で異なる特徴を示す。実 際、 Polonelliらが用いたピチア-ァノマラ(Pichia anomala)により産生される酵母キラー トキシンは、ダルカナーゼ活性を持つとキラートキシンとされ、本発明者らが研究の末 に明らかにした"グルカン合成酵素を阻害する酵母キラートキシン HM— 1や HYI"とは 異なっている。このように、各キラートキシンには独特の特性および用途があり、これ らは種および株によって大きく異なる。
[0011] さらに、微生物の抗生物質耐性の広がりは大きな公衆衛生問題になっている。抗 生物質耐性株が感染の原因になることが多ぐ結果として死亡率、罹患率、および医
療費が増加する。これらの感染の予防および管理には新たな抗菌剤が必要である。 真菌感染の発生は世界中で増力 tlしており、 AIDS患者、癌患者、または臓器移植を受 けた免疫無防備状態の患者や老齢者人口の増加が原因とされている。総合的に、 新規な抗菌剤のための新しい戦略の開発が緊急に必要とされている。
非特許文献 1: Yamamoto T.外 3名著、「Application of monoclonal antibodies to the i solation and characterization of a killer toxin secreted by Hansenula mraku.J、 FEBS Lett.ゝ 1986年 Jan 20、 Vol.l95(l— 2)、 p.253-257
非特許文献 2 : Antuch W.外 2名著、「Ancestral beta gamma- crystallin precursor stru cture in a yeast killer toxin.」、 Nat. Struct. Biol.、 1996年、 p.662- 665
非特許文献 3 : Kimura T.外 6名 、「N- glycosylation is involved in the sensitivity of
Saccharomyces cerevisiae to HM— 1 killer toxin secreted from Hansenula mrakii IFO
0895.」、 Appl.Microbiol.Biotechnol.、 1999年 Feb、 Vol.51(2)、 p.176-84
非特許文献 4 : Komiyama T.外 2名著、「Round shape enlargement of the yeast spher oplast of Saccaromyces cerevisiae by HM- 1 toxin」、 Biol. Pharm. Bull.、 2002年 Aug、 V ol.25(8)、 p.959-65
非特許文献 5 : Komiyama T.外 4名著、「Structure and activity of HYI killer toxin fro m Hansenula saturnus」、 Biol. Pharm. Bull.、 1995年 Augゝ Vol.18(8), p.1057-9
特許文献 6 : Komiyama T.外 6名著、「Action properties of HYI killer toxin from Wil liopsis saturnus var. saturnus, and antibiotics, aculeacin A and papulacandin B.」、 Bi ol.Pharm.Bull.、 1998年 Oct、 Vol.21(10)、 p.1013- 9
非特許文献 7 : Yamamoto T.外 4名著、「Killer toxin from Hansenula mraku selectivel y inhibits cell wall synthesis in a sensitive yeast.」、 FEBS Lett.、 198b年、 Mar.3、 Vol. 197(1-2)、 p.50-54
特許文献 8 : Kasahara S.外 8名著、「Involvement of cell wall beta— glucan in the acti on of HM— 1 killer toxin」、 FEBS Lett.ゝ 1994年 Jul 4、 348(1)、 p.27-32
非特許文献 9 : Takasuka T.外 3名 、「Cell wall synthesis specific cytocidal effect of Hansenula mrakii toxin- 1 on Saccharomyces cerevisiae.」、 Cell Mol. Biol. Res.、 1995 年、 Vol.41(6)、 p.575-581
非特許文献 10 : Inoue SB.外 9名著、「Characterization and gene cloning of 1,3- beta- glican synthase from Saccharomycec cerevisiae」、 Eur.J.Biochem.、 1995年 Aug、 Vol.2 31(3)、 p.845-54
非特許文献 l l : Komiyama T.外 4名著、「Monoclonal antibodies and sandwich ELISA for quantitation of HM- 1 killer toxin.」、 Biol. Pharm. Bull.、 2004年 May、 Vol.27(5)、 p6 91-3
非特許文献 12 : Mio T.外 9名著、「Cloning of the Candida albicans homolog of Sacch aromyces cerevisiae GSC1/FK¾1 and its involvement in beta— 1,J glucan synthesisj 、 J.Bacteriol.、 1997年 Jul、 Vol.179(13)、 p.4096— 105
非特許文献 13 : Kimura T.外 8名著、「A novel yeast gene, RHKl, is involved in the s ynthesis of the cell wall receptor for the HM— 1 killer toxin that inhibits beta— 1,3— glu can synthesisj、 1997年 Mar26、 Vol.254(2)、 p.139— 47
非特許文献 14 : Kasahara S.外 8名著、「Cloning of the Saccharomyces cerevisiae gen e whose overexpression overcomes the effects of HM— 1 killer toxin, which inhibits b eta-glucan synthesis.] , J.BacterioL, 1994年 Marゝ 176(5)、 p.1488-99
非特許文献 15 :Yabe T.外 7名著、「HKR1 encodes a cell surface protein that regulat es both cell wall beta— glucan synthesis ana budding pattern in the yeast Saccharomy ces cerevisiae.」、 Bacteriol.、 1996年 Jan、 Vol.178(2), p.477— 83
非特許文献 16 : L.Polonelli,ら著、「Therapeutic potential of antiidiotypic single chain antibodies with yeast killer toxin activity」、 Nature Biotech.、 1997年、 Vol.15、 p.15 5-158
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
本発明は、 βグルカン合成酵素を阻害することにより抗真菌活性を発揮する HM— 1キラートキシンと同様の活性を有する抗ィディオタイブ抗体の作製に利用可能な免 疫原の提供を課題とする。より詳しくは、キラートキシン様タンパク質に対して中和活 性を有する抗体、および該抗体の作製方法、並びに、該抗体を抗原として用いた抗 体の作製方法の提供を課題とする。
課題を解決するための手段
[0014] 上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意研究を行った。まず本発明者らは、実際 に HM-1キラートキシン活性を有する抗ィディオタイブ抗体の作製を試みた。該抗体 の作製のための抗原として、本発明者らは nmAb- KTと称する抗体を選択した。この n mAb-KTは、 HM-1に結合し、 HM-1のキラー活性を中和する活性を有する HM-1に 対するモノクローナル抗体(nmAb-KT)である。(Yamamoto et al.によって調製された (Yamamoto, T., Imai, M., Tachibana, K., and Mayumi, M. (1986) Application of mon oclonal antibodies to the isolation and characterization of a killer toxin secreted by Hansenula mrakii. FEBS Lett. 195, 253—257.) )。
[0015] 本発明者らは、上記 nmAb- KTをマウスに免疫して、組換え DNA技術により HM-1の 可溶性抗ィディオタイプー本鎖可変領域断片抗体 (ScFv)を作製することに成功した 。そして、精製された該 ScFvは、グルカン合成酵素を低濃度で阻害し、 HM-はりも広 い抗真菌活性スペクトルを有する強力な HM-1様活性を示すことを明らかにした。
[0016] 即ち、該 nmAb- KTを免疫原 (抗原)として用いることにより、実際に βグルカン合成 酵素を阻害することにより抗真菌活性を表す抗体分子を効率的に作製することが可 能であることを見出した。
[0017] 該應 Ab- ΚΤは、 βグルカン合成酵素阻害活性を持つ抗真菌性の抗体分子の作製 のために大いに有用であることが本発明者らによって初めて見出された。
[0018] つまり、該 nmAb- ΚΤ抗体を用いることによって有効な抗イディォタイプ抗体が作製 できたことから、 HM-1のキラートキシン活性を中和し得る抗体 (nmAb- KT)は実際に 抗イディォタイプ抗体を作製するための免疫原として利用可能であることが初めて実 証された。
[0019] さらに本発明者らは、該 nmAb- KTによって認識される HM-1のェピトープの同定を 試みた。その結果、 HM-1キラートキシンおよび HYIキラートキシン由来の種々の合成 ペプチドを用いることにより、 mAB-KTによって認識され得る HM-1のェピトープ領域 を決定することに成功した。
[0020] 即ち、該領域をェピトープとする抗体は、キラートキシン活性を中和し得る抗体であ ることが期待され、該中和抗体はキラートキシン活性を有する抗イディォタイプ抗体の
免疫原として非常に有用である。
[0021] また、該中和抗体が結合し得るキラートキシン上のェピトープ領域が決定されたこと により、該ェピトープを含むポリペプチドを利用して効率的に中和抗体を作製すること が可能となった。
[0022] さらに、ェピトープを同定することに成功したことにより、 nmAb- KT抗体はもちろん、 nmAb-KT以外の抗体であっても、 HM-1の該領域をェピトープとする抗体は、抗イデ ィォタイプ抗体の作製のための免疫原として利用可能であることが期待される。
[0023] 該抗体は、キラートキシンタンパク質のキラートキシン活性を担う領域に対して高い 結合親和性を有し、該抗体を抗原とする抗ィディォタイプ抗体は、キラートキシンの 内部イメージを有し、 HM-1の活性を担う領域と極めて模倣性の高 ヽアミノ酸配列を 有する抗体であるものと考えられる。
[0024] 本発明者らによって見出された知見に基づいて、抗真菌剤として有用な抗体イディ ォタイプ抗体を効率的に作製することが可能となった。
上記 nmAb-KTを免疫原として作製される抗体は、顕著な βグルカン合成酵素阻害 作用を有することを見出した。さらに該抗体は、)8グルカン合成酵素を有する真菌に 対して実際に抗真菌活性を有することが確認された。本発明の中和抗体を利用して 作製される抗体は、既存の抗真菌剤では効きめが弱いカンジダ-アルビカンス株ゃァ スペルギルス-フミガトス(Aspergillus fomigatos)株に対しても、有効な抗真菌作用を 発揮することが分力つた。即ち、本発明の抗体を免疫原として用いることにより、現在 、医療上の重要な課題となっている深在性真菌症を引き起こすカンジダ-アルビカン ス株ゃァスペルギルス-フミガトス株までも殺傷し得る強力な抗真菌活性を有する抗 体を作製可能なことが実証された。
[0025] これまでの本発明者らによる独自の研究から、 HM-1の抗菌メカニズムについては、 HM-1が、酵母細胞の細胞膜表面に存在する βグルカン合成酵素を阻害し、増殖中 の酵母細胞の出芽領域に働き、その βグルカン合成を抑えることにより穴を開けて、 細胞物質を漏出させることにより細胞死を招いていることが明ら力となった。 (Komiya ma T.7名着、「Pore formation on proliferating yeast ¾accharomyces cerevisiae cell b uds by HM-1 killer toxin」、 J.Biochem.、 1996年 Aprゝ Vol.119(4), p.731— 6)。この HM—
1キラートキシンのキラー活性については、 HM-1トキシンの C末領域にある 2つの特 異的なアルギ-ン残基が関与している(Shirai T.外 3名著、「The involvement of two specinc arginine residues in the action of HM—丄 killer toxin was deduced from site— d irected mutagenesis] , Biol.Pharm.Bull., 2000年 Aug Vol.23(8)、 p.998- 1000)。
[0026] 従って、本発明の中和抗体を免疫原として作製される抗イディォタイプ抗体は、 β グルカン合成酵素を有する真菌に対して、 βグルカン合成酵素を阻害することにより 、上述のメカニズムによって該真菌細胞を殺傷するものと考えられる。
[0027] 本発明者らによって得られた知見により、カンジダ 'アルビカンス菌を含む、これま で感染により人類を苦しめてきた βグルカン合成酵素を持つ多くの真菌に対して、 β グルカン合成酵素阻害活性をもつ抗体を効率的に作成することによって対抗し得る 道が拓かれたといえる。
また、これまであまり明ら力となっていな力つた HM-1キラートキシンの機能の解明に も、本発明者らによって見出された知見は大いに有用である。
[0028] 本発明は、キラートキシン活性を有する抗イディォタイプ抗体の作製に利用可能な 免疫原となる抗体を提供するものであり、詳しくは、キラートキシン様タンパク質に対し て中和活性を有する抗体、および該抗体の作製方法、並びに、該抗体を抗原として 用いた抗体の作製方法に関する。より具体的には、
〔1〕 以下の(a)および Zまたは (b)の活性を有するキラートキシン様タンパク質に対 する抗体であって、該活性を阻害する機能を有することを特徴とする抗体、
(a) グルカン合成酵素を有する真菌に対する抗菌活性
(b)真菌の βグルカン合成酵素を阻害する活性
〔2〕 モノクローナル抗体である、〔1〕に記載の抗体、
〔3〕 前記キラートキシン様タンパク質が酵母 Williopsis saturnus属由来のタンパク質 である、〔1〕または〔2〕に記載の抗体、
〔4〕 前記キラートキシン様タンパク質カ¾\1-1である、〔3〕に記載の抗体、
[5] 配列番号: 1で示される HM-1タンパク質の 39位〜 48位内にェピトープを有する ことを特徴とする、〔4〕に記載の抗体、
〔6〕 配列番号 : 2に記載のペプチドと反応させることにより前記機能が低下する、〔3
〕〜〔5〕の 、ずれかに記載の抗体、
〔7〕 配列番号: 5〜8のいずれかに記載のペプチドと結合親和性を有する、〔3〕〜〔 5〕の!、ずれかに記載の抗体、
〔8〕 3.0xl07M— 1以上の親和定数 (Ka)を有する、〔7〕に記載の抗体、
〔9〕 配列番号: 5〜8のいずれかに記載のペプチドと結合し、該ペプチドが有する β グルカン合成酵素阻害活性を抑制し得る抗体である、〔7〕または〔8〕に記載の抗体、
〔10〕 前記キラートキシン様タンパク質カ¾丫1である、〔3〕に記載の抗体、
〔11〕 配列番号: 3で示される ΗΥΙタンパク質の 39位〜 47位内にェピトープを有する ことを特徴とする、〔10〕に記載の抗体、
〔12〕 配列番号 :4に記載のペプチドと反応させることにより前記機能が低下する、〔 10〕または〔11〕に記載の抗体、
〔13〕 以下の(a)または (b)の抗体を有効成分として含む、抗イディォタイプ抗体作 製用抗原、
(a) nmAb-KTと称するモノクローナル抗体
(b)〔1〕〜〔12〕のいずれかに記載の抗体
〔14〕 前記抗ィディオタイブ抗体が、 |8グルカン合成酵素阻害活性および Zまたは 抗真菌活性を有することを特徴とする抗体である、〔13〕に記載の抗イディォタイプ抗 体作製用抗原、
〔15〕 以下の(a)または (b)の抗体を抗原として用いることを特徴とする、 βダルカン 合成酵素阻害活性および Ζまたは抗真菌活性を有する抗体の作製方法、
(a) nmAb-KTと称するモノクローナル抗体
(b)〔1〕〜〔12〕のいずれかに記載の抗体
〔16〕 以下の (a)または (b)の抗体を免疫原として抗体を作製する工程、を含む抗 真菌剤の製造方法、
(a) nmAb-KTと称するモノクローナル抗体
(b)〔1〕〜〔12〕のいずれかに記載の抗体
〔17〕 HM-1タンパク質の部分断片ポリペプチドであって、配列番号: 1に記載の HM -1タンパク質において 39位〜 48位のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
〔18〕 HYIタンパク質の部分断片ポリペプチドであって、配列番号: 3に記載の HYIタ ンパク質において 39位〜 47位のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
〔19〕 〔17〕または〔18〕に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、中和抗体 を誘導し得る免疫原組成物、
〔20〕 前記中和抗体が βグルカン合成酵素阻害活性を阻害する機能を有すること を特徴とする、〔19〕に記載の免疫原組成物、
〔21〕 〔19〕または〔20〕に記載の免疫原組成物を抗原として用いることを特徴とする 、 HM-1タンパク質の中和抗体の作製方法、
を、提供するものである。
発明の効果
[0029] 本発明によって、 HM-1キラートキシン活性並びに /3グルカン合成酵素阻害活性を 有する抗ィディォタイプ抗体を作製するために利用可能な免疫原 (抗原)が提供され た。キラートキシンの生物学的な機能を模倣する抗イディォタイプ抗体は、キラートキ シンに対して感受性を有する日和見病原体等に対して抗真菌活性を発揮し、新規な 抗真菌剤としてその利用が期待される。
[0030] さらに本発明者らは、 HM-1キラートキシン活性を中和する抗体が結合し得るェピト ープ領域を具体的に同定することに成功した。
中和抗体の nmAb- ΚΤは、 IgGl( κ )として分類され、関連酵母 Williopsis saturnus va r. saturnus IFO 0117の産生する HYIトキシンは、その構造およびキラートキシン作用 の様式が HM-1と非常に類似しているものの、 nmAb- KTは HYIトキシンには無効であ ることが示された。 nmAb- KTのェピトープを決定するため、 HM-1のアミノ酸配列に基 づいて 12のペプチド配列を合成した。これらのうち、 nmAb-KTは、 HM-1分子の中央 部分を示す 3つのペプチド P6 (33NVHWMVTGGST43、配列番号: 14)、 P7 ("DGKQG CATIWEGS56、配列番号: 15)、および P9 (44DGKQGCATIWEGSGCV59、配列番号: 17)と反応した。さらに、本発明者らは、 P6、 P7、および P9ペプチドと重複する HM-1 デカペプチド P10 (39TGGSTDGKQG48、配列番号: 2)力 nmAb-KTと最も強く反応す ることを見出した。ウェスタンブロッテイング、サンドイッチ ELISA、および酵母増殖阻 害アツセィを用いて併せて解析した結果、 nmAb- KTは、 HYIの相当する領域内に存
在しない、 HM-1の P10内の特異的ェピトープを認識することが明らかになった。 nmA b-KTの HM-1に対する、しかし HYIに対しては示さない強い結合活性は、 SPR解析に よっても確認された。これらの結果から、 nmAb-KTが、同じ位置の HYI配列とは異なる 配列41 GSTDGK46 (配列番号: 21)において、 HM-1と結合する可能性が最も高いこと が強く示唆された。
[0031] 本発明者らによって見出されたキラートキシン様タンパク質の上記アミノ酸領域をェ ピトープとする抗体を作製し、該抗体を免疫原とすることにより、キラートキシン活性を 有する種々の抗体分子を新たに作出することが可能である。また、該領域を適宜改 変することにより、より強力な、あるいはより特異性の高い有用な抗体分子を作出する ことも可能である。
図面の簡単な説明
[0032] [図 1]酵母の増殖および HM-1および HYIのキラートキシン活性に及ぼす nmAb-KTの 効果を示す図である。アツセィ法および条件は実施例に記載する。活性は、 nmAb-K Tおよび HM-1および HYIを含まな!/、対照試料を 100%として表した。各実験は三つ組 で行い、結果は平均値として算出した。
[図 2]HM-1および HYIのウェスタンブロット解析を示す写真である。精製 HM-1および HYIを電気泳動し、その後免疫ブロッテイングし、実施例に記載したように nmAb-KT を一次抗体として用いて検出した。 M :標準マーカー(レーン 1および 4)、 HM-1 (レー ン 2)、および HYI (レーン 3)。
[図 3]サンドイッチ ELISAによる HM-1および HYIの定量を示す図である。実施例に記 載した通りに ELISA法により検量線を得た。四角(黒)、 HM- 1;丸(黒)、 HYI。
[図 4]HM-1および HYIの SPR解析を示す図である。 CM5センサーチップ上の固定化 n mAb- KTの調製および分析手法は、実施例に記載する。 (A) 100 nMでの HM-1およ び HYIの結合および解離。 (B)種々の濃度での HM-1シグナル。
[図 5A]図 5A-Cは、 nmAb- KTのペプチド解析を示す図である。増殖阻害アツセィぉ よび酵母増殖に及ぼす HM-1のキラートキシン活性は、実施例に記載した。活性は、 ペプチドおよび nmAb- KTを含まな 、対照試料を 100%として表した。各実験は三つ組 で行い、結果は平均値として算出した。図 5Aは、 S.セレピシェ A451の増殖に及ぼす
ペプチドの影響を示す。
[図 5B]nmAb- KTとプレインキュペートしたペプチドの、 HM-1のキラートキシン活性に 及ぼす効果を示す図である。
[図 5C]HM-1のキラートキシン活性に及ぼす HM-1デカペプチドおよび HYIナノぺプ チドの効果を示す図である。
[図 6]HM-1ペプチド上のェピトープに対する nmAB-KTの特異的結合を示す写真で ある。ドットブロッテイングおよび一次抗体として nmAb-KTを用いた検出は、実施例に 記載した。図 6Aは、メンブレン上に吸着した 12のペプチド、図 6 (B)は、メンブレン上 に吸着した HM-1デカペプチドおよび HYIナノペプチド。
[図 7]Aは酵母グルカン合成酵素、 Bはグルカン合成酵素に対する HM-1トキシンの働 きを模式的に示す図である。
[図 8]HM-1および HYIの全長アミノ酸配列を比較した図である。
発明を実施するための最良の形態
[0033] 本発明は、キラートキシン様タンパク質に対する抗体であって、該キラートキシン様 タンパク質の活性を阻害する機能を有することを特徴とする抗体を提供する。
上記キラートキシン様タンパク質は、以下の(a)および Zまたは (b)の活性を有する タンパク質であることが好まし 、。
(a) グルカン合成酵素を有する真菌に対する抗菌活性
(b)真菌の βグルカン合成酵素を阻害する活性( j8グルカン合成酵素阻害活性) [0034] 上記(a)の抗菌活性としては、例えば、カンジダ 'アルビカンス (Candida albicans) 株に対する抗真菌活性を挙げることができる。該活性は、例えば、 CFUアツセィによ つて、適宜評価することができる。
[0035] 上記 (b)の βグルカン合成酵素阻害活性は、公知の種々の方法 (例えば、放射性 物質によって標識された βグルカンを検出する方法等)によって、適宜測定すること が可能であり、当業者であれば、 |8グルカン合成酵素阻害活性について適宜評価す ることができる。一例を示せば、 Takasukaらの文献 (Takasuka T. et al., Cell Mol. Biol . Res. 1995; 41: 575-581)に記載の方法によって、 j8ダルカン合成酵素阻害活性を 評価することが可能である。
[0036] 本発明の上記抗体は、キラートキシン様タンパク質の活性 (例えば、上記 (a)または (b) )を中和する機能を有する (本発明の上記抗体を「本発明の中和抗体」と記載す る場合あり)。
[0037] 本発明の中和抗体は、例えば、キラートキシン様タンパク質の活性を有する抗イデ ィォタイプ抗体を作製する際の免疫原 (抗原)として好適に利用される。該抗イディォ タイプ抗体は、キラートキシン活性、あるいは βグルカン合成酵素阻害活性を有し、 ι8グルカン合成酵素を有する真菌に対して顕著な抗真菌活性を有することが期待さ れる。また、本発明の中和抗体を利用して作製される抗イディォタイプ抗体は、キラ 一トキシン様タンパク質と同等、もしくはより広い抗菌スペクトルを有することが期待さ れる。
[0038] 一般的に抗イディォタイプ抗体とは、抗体可変部のイディォタイプ決定基 (イディォ トープ)を認識する抗体を言う。抗体分子は通常、重鎖 (Η鎖)と軽鎖 (L鎖)から構成さ れ、その抗原特異性は、抗原結合部位である Η鎖および L鎖の可変領域 (V領域)の 構造により決定される。この部分の構造は抗体分子の固有のものであり、イディォタイ プと呼ばれる。このイディォタイプ自体も抗原性を有し、このイディォタイプを免疫原と して、抗イディォタイプ抗体を作製することができる。
[0039] 本発明の中和抗体を免疫原として作製される抗体は、好ましくは、キラートキシン様 タンパク質に対する本発明の中和抗体 (抗キラートキシン様タンパク質抗体)のィディ ォタイプ決定基と結合する (親和性を有する)抗イディォタイプ抗体である。
[0040] 該抗イディォタイプ抗体は、キラートキシン様タンパク質の内部像 (イメージ)を有し 、該キラートキシン様タンパク質と同様の機能 (活性)を有することを特徴とする抗体 である。
[0041] 本発明の中和抗体は、通常、抗キラートキシン様タンパク質抗体であり、好ましくは 、該キラートキシン様タンパク質 (例えば、 HM-1等)の有する活性 (例えば、 βグルカ ン合成酵素阻害活性、抗真菌活性等)を中和する抗体である。該抗キラートキシン様 タンパク質抗体は、好ましくは、モノクローナル中和抗体である。本発明の中和抗体 の具体例としては、 nmAb- ΚΤと称する HM-1に対して中和活性を有する抗体 (Yamam oto Γ.外 3名 、 [Application or monoclonal antibodies to the isolation and character
ization of a killer toxin secreted by Hansenula mrakii.J、 FEBS Lett.、 1986年 Jan 20、 Vol.l95(l- 2)、 p.253-257)を好適に示すことができる。
[0042] 該 nmAb-KTは、酵母 (Williopsis saturnus) Var. mrakiiから産生されるキラートキシン の活性をインビトロで中和するモノクローナル抗体であり、標準的なノ、イブリドーマ技 術によって作製されたものであり、抗原特異性が高ぐ |8グルカン合成酵素阻害活性 を中和する活性も高い。この nmAb- KTは、当業者においては、本明細書に記載され た文献等を参考に、一般的な抗体作製技術を用いて適宜作製することが可能である
[0043] 本発明にお 、てキラートキシン様タンパク質とは、真菌が生成するタンパク質性抗 菌物質を指し、上述の (a)および Zまたは (b)の活性を有するタンパク質であれば特 に制限されないが、例えば、酵母 Williopsis saturnus属由来のタンパク質であることが 好ましい。具体的には、本発明のキラートキシン様タンパク質として、 HM-1キラートキ シン、または HYIタンパク質を例示することができる。
[0044] HM-1キラートキシンは、ハンゼヌラ 'ムラキ(Hansenula mrakii)とも呼ばれている酵 母ウイリオプシス 'サチュルヌス(Williopsis saturnus)により産生される強力な抗真菌 活性を有するポリペプチドである。 HM-1キラートキシンを産生する好まし 、ハンゼヌ ラ 'ムラキ株としては、例えば、 IFO 0895または IFO 8075等をあげることができる。また 、 HM-1キラートキシンのアミノ酸配列は既に公知である (FEBS LETT., 195, 253-257,1 986)。
[0045] 本発明の中和抗体の好ましい態様としては、 HM-1に対する中和抗体であって、 H M-1タンパク質のアミノ酸配列(配列番号: 1)における 33〜59位内、より好ましくは 39 〜48位内のアミノ酸領域をェピトープとすることを特徴とする抗体である。
[0046] 即ち、本発明の中和抗体の好ましい態様としては、 HM-1タンパク質の部分断片ポ リペプチドであって、通常、配列番号: 1における 30〜60位、好ましくは 33〜59位、より 好ましくは 39〜48位に含まれるアミノ酸配列をェピトープとして認識する抗体である。 HM-1タンパク質の部分断片ポリペプチドであって、配列番号: 1に記載のアミノ酸配 列において 39〜48位に相当するアミノ酸領域力もなる HM-1デカペプチド(「TGGST DDGKQG」)の配列を、配列番号: 2に示す。
[0047] また本発明の中和抗体は、例えば、 HYIに対する中和抗体であって、 HYIタンパク 質のアミノ酸配列(配列番号: 3)における 30〜60位内、より好ましくは 39〜47位内の アミノ酸領域をェピトープとすることを特徴とする抗体である。
[0048] 即ち、本発明の中和抗体の好ましい態様としては、 HYIタンパク質の部分断片ポリ ペプチドであって、通常、配列番号: 3における 30〜60位、より好ましくは 39〜47位に 含まれるアミノ酸配列をェピトープとして認識する抗体である。 HYIタンパク質の部分 断片ポリペプチドであって、配列番号: 3に記載のアミノ酸配列において 39〜47位に 相当するアミノ酸領域力もなる HYIナノポリペプチド(「TGESNGQQG」 )の配列を、配 列番号: 4に示す。
[0049] 本発明の中和抗体は、上述のように配列番号: 2もしくは配列番号: 4に記載のぺプ チドをェピトープとして認識し得ることから、該ペプチドと強固な結合親和性を有する ことが好ましい。従って、本発明の中和抗体は、必ずしも必須ではないが、上記の配 列番号: 2もしくは配列番号: 4に記載のペプチドと結合親和性を有する抗体であると 特徴づけることができる。
[0050] また、これらの配列番号: 2もしくは 4に記載のペプチドと結合した中和抗体は、キラ 一トキシン様タンパク質 (例えば、 HM-1、 HYI等)の有する上記 (a)または (b)の活性 を中和する機能が低下もしくは喪失しているものと考えられる。従って、本発明の抗 体は、例えば、配列番号: 2もしくは 4に記載のペプチドと反応させることにより、キラ 一トキシン様タンパク質の有する前記機能を低下もしくは喪失させ得る抗体であると 特徴づけることが可能である。
[0051] また本発明者らは、中和抗体の nmAb-KTを免疫原として利用することにより、実際 に抗真菌活性を有する抗ィディォタイプ抗体を作製することに成功した。(後述の実 施例参照)該抗体は、所謂 ScFvと呼ばれる一本鎖ポリペプチド抗体である。
[0052] 本発明者らによって作製された一本鎖ポリペプチド抗体のアミノ酸配列を、配列番 号: 5〜8に示す。 (ScFv-Al (配列番号: 5)、 ScFv-A2 (配列番号: 6)、 ScFv-A3 (配 列番号: 7)、 ScFv-A4 (配列番号: 8) )
[0053] 上記ポリペプチドは、 HM-1キラートキシン活性を有し、 βグルカン合成酵素を有す る真菌に対して抗真菌活性を有する抗ィディオタイブ抗体の可変領域を含むポリべ
プチドである。該ポリペプチドは、重鎖可変領域 (VH)および軽鎖可変領域 (VL)に相 当する領域を有し、これらの VHおよび VLがアミノ酸力 なるリンカ一によつて連結さ れた構造を有する。
[0054] これらのポリペプチドは、中和抗体の nmAb- KTと結合親和性を有することから、本 発明の抗体の好ましい態様としては、例えば、上記ポリペプチド (配列番号: 5〜8の V、ずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド)と結合親和性を有する抗体である と特徴づけることができる。
[0055] この結合親和性とは、本発明の中和抗体と上記ポリペプチドが実質的に結合し得 る程度の親和性を示すものであればよいが、一例を示せば、通常、親和定数力 X 106M— 1以上であり、好ましくは、親和定数 Kaが 1.0 χ106Μ— 1以上であり、好ましくは 3.0 x 106M— 1以上であり、より好ましくは 4.0 χ106Μ— 1以上であり、さらに好ましくは 4.4 xl06M_1 以上である。
[0056] また本発明の中和抗体の好ま 、態様にぉ 、ては、上記ポリペプチドと結合するこ とにより、該ポリペプチドの有する活性を阻害する機能を有する抗体であることが好ま しい。例えば、本発明の中和抗体は、上記ポリペプチドと結合することによって、該ポ リペプチドが有する βグルカン合成酵素阻害活性を抑制(阻害)する機能を有するも のと特徴付けられる。
[0057] また、当業者においては一般的な免疫工学技術を用いて、本発明の中和抗体を免 疫原 (抗原)とする抗体を、適宜作製することが可能である。例えば、キラートキシン様 タンパク質、もしくは本発明者らによって見出されたェピトープ領域を含むポリべプチ ドを免疫原として用いて、一般的な抗体作製技術により、本発明の中和抗体を取得 することが可能である。該技術により、種々の抗体が作製された場合であっても、上 述のポリペプチド (例えば、配列番号: 5〜8に記載のペプチド)を利用して、上述のよ うに結合親和性もしくはキラートキシン様タンパク質の有する活性の有無を指標として 、当業者においては過度の試行を伴うことなぐ適宜、本発明の中和抗体を選択する ことが可能である。
[0058] 本発明の中和抗体を免疫原 (抗原)として作製される抗体は、キラートキシン様タン ノ^質と同等の機能を有することが期待される。例えば、該抗体は、 |8グルカン合成
酵素を有する真菌に対する抗真菌活性、および Zまたは、 )8グルカン合成酵素阻害 活性を有することが期待される。
[0059] 本発明において「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、例えば、モノクロ一 ナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体変異体 (キメラ抗体、ヒト化抗体、低分子化抗体 (抗体断片も含む)、多特異性抗体等)が含まれる。また、本発明において「抗体」は 、ポリペプチドあるいは異種多量体 (例えば、 IgG型抗体)のいずれであってもよい。 好ましい抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、並びに、抗体断片等 の低分子化抗体 (一本鎖 Fvポリペプチド等)である。
[0060] 本発明における「抗体」には、上述の抗体に対してさらにアミノ酸の置換、欠失、付 カロ、および Zもしくは挿入、またはキメラ化やヒト化等により、そのアミノ酸配列が改変 されたものが含まれる。アミノ酸の置換、欠失、付加および/または挿入、並びにヒト ィ匕、キメラ化などのアミノ酸配列の改変は、当業者が公知の方法により行うことが可能 である。同様に、本発明における抗体を組換え抗体として作製する際に利用する抗 体の可変領域もしくは定常領域も、アミノ酸の置換、欠失、付加および Zもしくは挿入 、またはキメラ化やヒト化等によりそのアミノ酸配列を改変してもよい。さらに、例えば、 キメラ抗体、中でもヒト化抗体などのアミノ酸配列を置換した改変抗体でもよい。また、 各種分子を結合させた抗体修飾物、抗体断片、低分子化抗体等でもよい。
[0061] 「キメラ抗体」とは、異なる動物由来の配列を組合わせて作製される抗体である。例 えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変 (V)領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常 (C)領 域力 なる抗体を例示することができる。キメラ抗体の作製は公知であり、例えば、抗 体 V領域をコードする DNAをヒト抗体 C領域をコードする DNAと連結し、これを発現べ クタ一に組み込んで宿主に導入し産生させることによりキメラ抗体を得ることができる
[0062] 「ヒト化抗体」とは、再構成 (reshaped)ヒト抗体とも称される、ヒト以外の哺乳動物由 来の抗体、例えばマウス抗体の相補性決定領域(CDR;complementarity determining region)をヒト抗体の CDRへ移植したものが公知である。また、一般的な遺伝子組換 え手法により、例えば、マウス抗体の CDRを決定し、該 CDRとヒト抗体のフレームヮー ク領域 (framework region ;FR)とが連結された抗体をコードする DNAを取得し、ヒトイ匕
抗体を通常の発現ベクターを用いた系により産生することができる。このような DNAは 、 CDRおよび FR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した 数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて PCR法により合成することができる
[0063] 本発明における抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体である場合には、これらの抗体 の C領域は,好ましくはヒト抗体由来のものが使用される。また、抗体またはその産生 の安定性を改善するために、ヒト抗体 C領域を必要に応じ修飾してもよい。ヒト抗体由 来の定常領域は、通常、 IgG (IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4)、 IgM、 IgA、 IgDおよび IgE等 のアイソタイプごとに固有のアミノ酸配列を有する。本発明におけるヒト化抗体に用い られる定常領域は、どのアイソタイプに属する抗体の定常領域であってもよい。好まし くは、ヒ HgGの定常領域が用いられるが、これに限定されず、上述のように定常領域 を全く有さな 、場合であってもよ 、。
[0064] 本発明におけるキメラ抗体またはヒト化抗体の可変領域および定常領域は、元の抗 体の機能 (活性)を示す限り、欠失、置換、挿入および/または付加等により改変され ていてもよい。
[0065] ヒト由来の配列を利用したキメラ抗体およびヒト化抗体は、体内において抗体産生 能力が低下している患者に対して、体外で作製し治療目的に投与することが有用で ある。
[0066] また、低分子化抗体は、体内動態の性質の面からも、大腸菌、植物細胞等を用い て低コストで製造することが可能であり、経済的にも優れて 、る。
[0067] 本発明の中和抗体を利用して、適宜、低分子抗体 (例えば、 ScFv、ダイァボディ等) を作製することができる。
[0068] ScFv等の抗体断片(ポリペプチド)を局所投与以外の方法、例えば、静脈投与にて 体内へ注入した場合、体内の免疫反応により該ポリペプチドに対する中和抗体が産 生され、該ポリペプチドの活性が低下することが考えられる。一方、通常の抗体 (完全 抗体)であれば、中和抗体の産生が起こりにくいことから、局所投与以外の方法にて 体内へ投与する場合には、抗体断片よりも、完全抗体であることが好ましい。
[0069] 抗体断片は低分子化抗体の一種である。また、低分子化抗体には、抗体の断片を
その構造の一部とする抗体も含む。本発明の中和抗体を利用して作製される低分子 化抗体は、特にその構造、製造法等は限定されない。低分子化抗体は、通常、全長 抗体と比較して、高い比活性を有することが多い。
[0070] 本発明の中和抗体を免疫原として作製可能な抗体断片としては、例えば、 Fab, F(a b')2、 Fab'、 Fvなどを挙げることができる。抗体断片中の、 VHまたは VLのアミノ酸配列 は、置換、欠失、付加および/または挿入により改変されていてもよい。
[0071] 例えば、前述の抗体断片のうち「Fv」は、完全な抗原認識部位と結合部位を含む最 小の抗体断片である。「Fv」は、 1つの VHおよび 1つの VLが共有結合により強く結合 したダイマー (VH-VLダイマー)である。各可変領域の 3つの相補鎖決定領域 (compl ementarity determining region ;CDR)が立体的に相互作用し、 VH- VLダイマーの表 面に抗原結合部位を形成する。 6つの CDRが抗体に抗原結合部位を付与して 、る。 しかしながら、 1つの可変領域 (または、抗原に特異的な 3つの CDRのみを含む Fvの 半分)であっても、全結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し、結合する能力 を有する。従って、このような Fvより小さい分子も本発明における抗体断片に含まれる 。又、抗体断片の可変領域はキメラ化ゃヒト化されていてもよい。
[0072] 低分子化抗体は、 VHと VLの両方を含んで 、ることが好ま 、。低分子化抗体の例 としては、 Fab、 Fab'、 F(ab')2および Fv等の抗体断片、並びに、抗体断片を利用して 作製され得る ScFv (シングルチェイン Fv)等を挙げることができる。抗体断片は、抗体 を酵素、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼにより処理して取得することも可 能である。
[0073] 抗体断片を改変した構造を有する低分子化抗体は、酵素処理若しくは遺伝子組換 えにより得られた抗体断片を利用して構築することができる。あるいは、低分子化抗 体全体をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主 細胞で発現させることもできる。
[0074] また、本発明の中和抗体を用いて作製される上記「ScFv」は、 2つの可変領域を、必 要に応じリンカ一等を介して、結合させた一本鎖ポリペプチドであってもよい。 ScFvに 含まれる 2つの可変領域は、通常、 1つの VHと 1つの VLである力 2つの VHまたは 2つ の VLであってもよい。一般に ScFvポリペプチドは、 VHおよび VLドメインの間にリンカ
一を含み、それにより抗原結合のために必要な VHおよび VLの対部分が形成される 。通常、同じ分子内で VHおよび VLの間で対部分を形成させるために、一般に、 VH および VLを連結するリンカ一を 10アミノ酸以上の長さのペプチドリンカ一とする。しか しながら、本発明における ScFvのリンカ一は、 ScFvの形成を妨げない限り、このような ペプチドリンカ一に限定されるものではない。
[0075] また、抗体の 2つの可変領域を連結させるリンカ一としては、遺伝子工学により導入 し得る任意のペプチドリンカ一、または合成化合物リンカ一等を用いることができる。 ペプチドリンカ一の長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択すること が可能である。
[0076] また、「ダイァボディ (diabody; Db)」は、遺伝子融合により構築された二価 (bivalent) の抗体断片を言う。ダイァボディは、 2本のポリペプチド鎖カゝら構成されるダイマーで あり、ポリペプチド鎖は各々、同じ鎖中で軽鎖可変領域 (VL)および重鎖可変領域 (V H)が、互いに結合できない位に短い、例えば、 5アミノ酸残基程度のリンカ一により結 合されている。同一ポリペプチド鎖上にコードされる VLと VHとは、その間のリンカ一 が短いため単鎖 V領域フラグメントを形成することが出来ず二量体を形成するため、 ダイアポディは 2つの抗原結合部位を有することとなる。
[0077] ダイァボディは、 2分子の ScFvを含むことから、 4つの可変領域を含み、その結果、 2 つの抗原結合部位を持つこととなる。ダイマーを形成させな 、ScFvの場合と異なり、 ダイアポディの形成を目的とする場合、通常、各 ScFv分子内の VHおよび VL間を結 ぶリンカ一は、ペプチドリンカ一とする場合には、 5〜20アミノ酸程度のものとする。し 力しながら、ダイァボディを形成する ScFvのリンカ一は、ダイアポディの形成を妨げな い限り、このようなペプチドリンカ一に限定されない。
[0078] また、抗体の可変領域を一本鎖抗体 (ScFv)としてファージディスプレイ法によりファ ージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択され たファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードする DNA配列を決定することができる。抗原に結合する ScFvの DNA配列が明らかになれ ば、当該配列を基に適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。
[0079] 本発明の中和抗体を免疫原として用いて、ハイプリドーマ力 抗体をコードする遺
伝子を取得する方法は、基本的には公知技術を使用して実施することができる。一 例を示せば、本発明の中和抗体 (例えば、 nmAb-KT)を発現する細胞を感作抗原と して使用して、これを通常の免疫方法に従って免疫し、得られる免疫細胞を通常の 細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノク ローナルな抗体産生細胞 (ハイプリドーマ)をスクリーニングし、得られたハイプリドーマ の mRNA力 逆転写酵素を用いて抗体の可変領域 (V領域)の cDNAを合成し、これを 所望の抗体定常領域 (C領域)をコードする DNAと連結することにより得ることができる
[0080] 抗体工学における最近の進歩は、細菌およびファージディスプレイシステムにおけ る抗体フラグメントの発現に向けられてきた。そして、生物医学および製薬 (特に、臨 床での治療および診断)の分野における様々な出願の増加を導いた。ファージディ スプレイシステムが抗体フラグメントを発現する能力は、ハイプリドーマ技術より優れ たいくつかの重要な利点をもたらす。従って、本発明の抗体を免疫原として用いて作 製する場合、ファージディスプレイ技術を利用することが好ましい。第一に、ファージ ディスプレイ技術は、望まし ヽ特性を有する試薬の迅速で簡単な選択を可能にする 強力な濃縮手順を含み、また、安定した遺伝子供給源を提供する。第二に、 ScFvフ ラグメントを細菌内で大量に産生することができる。第三に、抗体試薬の結合特性を 高める変異を導入するように、 ScFv遺伝子を操作することができる。ファージディスプ レイ法は、機能的な免疫グロブリン遺伝子をクローユングするための信頼性の高 ヽ技 法である(フアルマシア Vol.40, No.8, 2004) o
[0081] 本発明の中和抗体を用いた抗イディォタイプ抗体作製の一例として、中和モノクロ ーナル抗体の nmAb- KTを用いて、ファージディスプレイ法により作製する手順を以 下に示す。ただし、以下に示す手順は、本発明の抗体を免疫原として利用して抗体 を作製するための一例を簡潔に示すものであり、この方法に特に制限されるものでは ない。
(1)マウス HM- 1中和モノクローン抗体(nmAb- KT)→
(2)マウスへ注射→
(3)脾臓細胞から、抗体 H&L鎖 mRNAを抽出、 cDNAィ匕(H鎖 DNA-リンカ一 L鎖 DNA
ライブラリーを構築)→
(4) cDNAをファージ DNAへ組み込んだファージライブラリーを構築→
(5)大腸菌中でファージタンパクを発現→
(6) HM-1中和モノクローン抗体(nmAb- KT)を指標にしたパンユング'スクリーニング を繰り返し、中和抗体と強く結合するファージクローンを選別→
(7)個別クローンによるタンパク発現と、 目的とするファージの選別→
(8)選ばれたファージの DNAの塩基配列 'アミノ酸配列を解析し、 H鎖、 L鎖の確認→
(9)抗体 (ペプチド)タンパクの発現並びに精製→
(10) Sc酵母あるいは病原真菌を用いての抗菌力の測定
[0082] また本発明の中和抗体を免疫原として利用し抗体産生細胞を作製することにより、 所望の抗体を取得することも可能である。
[0083] 抗体産生細胞は感作抗原 (本発明の中和抗体)を用いて動物を免疫化すること〖こ より得ることができる。または、抗体を産生し得るリンパ球を in vitroで免疫化して抗体 産生細胞とすることもできる。免疫化する動物としては、各種哺乳動物を使用できる 力 ゲッ歯目、ゥサギ目、霊長目の動物が一般的に用いられる。マウス、ラット、ハムス ター等のゲッ歯目、ゥサギ等のゥサギ目、力-クイザル、ァカゲザル、マントヒヒ、チン パンジー等のサル等の霊長目の動物を例示することができる。その他、ヒト抗体遺伝 子のレパートリーを有するトランスジェニック動物も知られており、このような動物を使 用することによりヒト抗体を得ることもできる。このようなトランスジエニック動物の使用に 代えて、例えば、ヒトリンパ球を in vitroで本発明の中和抗体 (抗原)または該抗体を 発現する細胞で感作 (免疫)し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えば U266と融 合させることにより、該抗原への結合活性を有するヒト抗体を得ることもできる。
[0084] 動物の免疫化は、例えば、本発明の中和抗体 (感作抗原)を Phosphate-Buffered S aline(PBS)または生理食塩水等で適宜希釈、懸濁し、必要に応じてアジュバントを混 合して乳化した後、動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。その後 、好ましくは、フロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を 4〜21日毎に数回 投与する。抗体の産生の確認は、動物の血清中の目的とする抗体力価を慣用の方 法により測定することにより行うことができる。
[0085] ノ、イブリドーマは、本発明の中和抗体 (抗原)で免疫化した動物またはリンパ球より 得られた抗体産生細胞を、慣用の融合剤 (例えば、ポリエチレングリコール)を使用し てミエローマ細胞と融合して作製することができる。必要に応じハイプリドーマ細胞を 培養 '増殖し、免疫沈降、放射免疫分析 (RIA)、酵素結合免疫吸着分析 (ELISA)等の 公知の分析法により該ノ、イブリドーマより産生される抗体の結合特異性を測定する。 その後、必要に応じ、 目的とする特異性、親和性または活性が測定された抗体を産 生するハイプリドーマを限界希釈法等の手法によりサブクローユングすることもできる
[0086] 続 、て、選択された抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマまたは抗体産生細胞 ( 感作リンパ球等)から、抗体に特異的に結合し得るプローブを用いてクロー-ングする ことができる。また、 mRNA力も RT-PCRによりクローユングすることも可能である。
[0087] また、 H鎖および L鎖をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法により改変することも 可能である。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ゥサギ抗体、ハムスター抗体、ヒッジ抗 体、ラクダ抗体等の抗体について、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目 的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等 を適宜作製することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗 体の H鎖、 L鎖の可変領域とヒト抗体の H鎖、 L鎖の定常領域からなる抗体であり、マウ ス抗体の可変領域をコードする DNAをヒト抗体の定常領域をコードする DNAと連結し 、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができ る。ヒトイ匕抗体は、再構成 (reshaped)ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえ ばマウス抗体の相補性決定領域 (CDR; complementary determining region)を連結 するように設計した DNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作 製した数個のオリゴヌクレオチドカゝら PCR法により合成する。得られた DNAをヒト抗体 定常領域をコードする DNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主 に導入し産生させることにより得られる。 CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームヮ ーク領域 (FR)は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択さ れる。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成 するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよ 、。
[0088] 上述のヒト化以外に、例えば、抗原との結合性等の抗体の生物学的特性を改善す るために改変を行うことも考えられる。このような改変は、部位特異的突然変異 (例え ば、 Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488参照)、 PCR変異、カセット変 異等の方法により行うことができる。一般に、生物学的特性の改善された抗体変異体 は、基となった抗体の可変領域のアミノ酸配列(例えば、配列番号: 5〜8に記載のァ ミノ酸配列)に対して、 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上 (例えば、 95%以上、 97%、 98%、 99%等)のアミノ酸配列相同性および/または類似 性を有する。本明細書において、配列の相同性および/または類似性は、配列相同 性が最大の値を取るように必要に応じ配列を整列化、およびギャップ導入した後、基 となった抗体残基と相同 (同じ残基)または類似 (一般的なアミノ酸の側鎖の特性に基 づき同じグループに分類されるアミノ酸残基)するアミノ酸残基の割合として定義され る。
[0089] 通常、天然のアミノ酸残基は、その側鎖の性質に基づ 、て (1)疎水性:了ラニン、イソ ロイシン、ノルロイシン、ノ リン、メチォニンおよびロイシン; (2)中性親水性:ァスパラギ ン、グルタミン、システィン、スレオニンおよびセリン; (3)酸性:ァスパラギン酸およびグ ルタミン酸; (4)塩基性:アルギニン、ヒスチジンおよびリシン; (5)鎖の配向に影響する 残基:グリシンおよびプロリン;ならびに (6)芳香族性:チロシン、トリブトファンおよびフ ェニルァラニンのグループに分類される。従って、本発明においてアミノ酸の改変を 行う場合には、特に制限されないが、上述のように同様の性質を有するアミノ酸へ改 変することが好ましい。
[0090] また、本発明の中和抗体を免疫原として用いて、例えば、ヒト染色体導入マウス (元 木一宏、医学のあゆみ、 Vol.211, No.7、 p.733-740, 2004年)を利用して所望のヒト抗 体を作製することも可能である。
[0091] 本発明の中和抗体をコードする核酸もまた、本発明に含まれる。当業者においては
、アミノ酸の縮重を考慮して、該アミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列を容易に 知ることができる。
[0092] また、本発明における核酸は、通常、適当なベクターへ担持 (挿入)され、宿主細胞 へ導入される。該ベクターとしては、挿入した核酸を安定に保持するものであれば特
に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローユング用ベクターと しては pBluescriptベクター (Stratagene社製)などが好まし!/、が、市販の種々のべクタ 一を利用することができる。本発明の抗体を生産する目的としてベクターを用いる場 合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌 内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれば特に制限 されないが、例えば、試験管内発現であれば pBESTベクター(プロメガ社製)、大腸菌 であれば pETベクター(Invitrogen社製)、培養細胞であれば pME18S- FL3ベクター( GenBank Accession No. AB009864)、生物個体であれば pME18Sベクター(Mol Cell Biol. 8:466-472(1988))などを例示することができる。ベクターへの本発明の核酸の 挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことが できる。
[0093] 上記宿主細胞としては特に制限はなぐ 目的に応じて種々の宿主細胞が用いられ る。ポリペプチドを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞 (例:ストレブトコ ッカス、スタフイロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌)、昆虫細胞(例:ドロソフ イラ S2、スポドプテラ SF9)、動物細胞(例: CHO、 COS, HeLa、 C127、 3T3、 BHK、 HE K293、 Bowesメラノーマ細胞)および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へ のベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法 (Current pr otocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons . Section 9.1- 9.9)、リポフエクタミン法(GIBCO- BRL社製)、マイクロインジェクション 法などの公知の方法で行うことが可能である。
[0094] 宿主細胞において発現したポリペプチドを小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、また は細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに 組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であ つても、異種シグナルであってもよい。
[0095] 上記製造方法におけるポリペプチドの回収は、本発明のポリペプチドが培地に分 泌される場合は、培地を回収する。本発明のポリペプチドが細胞内に産生される場 合は、その細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する。
[0096] 組換え細胞培養物力も本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アンモ
-ゥムまたはエタノール沈殿、酸抽出、ァ-オンまたはカチオン交換クロマトグラフィ 一、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ァフィ- ティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマト グラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。
[0097] また本発明は、本発明の中和抗体 (例えば、 nmAb-KT等)を有効成分として含有す る抗イディォタイプ抗体作製用抗原 (免疫原)を提供する。(本明細書にぉ ヽて「本発 明の抗原」と記載する場合あり)
[0098] なお、本発明の抗原は、薬学的に許容される溶媒もしくは担体等が添加された組 成物 (免疫原組成物)であってもよい。また、本発明の上記抗原を、例えば、「免疫誘 導剤」、または、「抗イディォタイプ抗体作製用免疫誘導剤」等と表現することもできる
[0099] 本発明にお 、て上記抗原として利用可能な抗体としては、具体的には、 nmAb-KT 等を挙げることができる。該 nmAb-KTが効果的な抗イディォタイプ抗体の作製のため の免疫原として有用であることは、本発明者らによって初めて見出された知見である
[0100] 本発明の上記抗原を利用して作製される抗体は、抗真菌剤として有用である。該 抗真菌剤が有効と考えられる真菌は、通常、 グルカン合成酵素を有する真菌であ る力 一例を示せば、サッカロミセス(酵母)、カンジダ 'アルビカンス(Candida albican s)、し ryptococcus neoformans、 Aspergillus fumigatos等を f列 すること力 21 (?さる力、必 ずしもこれらに限定されない。
[0101] また、本発明の抗原を用いて、上述のように抗イディォタイプ抗体を好適に作製す ることができる。該抗イディォタイプ抗体は、例えば、 |8グルカン合成酵素阻害活性、 および Zまたは抗真菌活性を有することを特徴とする抗体である。
[0102] なお、任意の真菌について、 j8グルカン合成酵素を有する力否かについては、当 業者であれば、公知の種々の文献等によって、適宜知ることができる。公知の文献等 によって、 j8グルカン合成酵素を有するカゝ否かについて不明な場合であっても、上 述のよう〖こ βグルカン合成酵素活性を検出する方法は既に知られていることから、当 業者においては公知の一般的な手法を用いて、任意の真菌について、 βダルカン
合成酵素を有するカゝ否かを適宜調べることが可能である。
[0103] 本発明の中和抗体 (例えば、 nmAb-KT)を免疫原として利用する抗体作製方法もま た、本発明に含まれる。上記方法は、例えば、本発明の中和抗体 (例えば、 nmAb-K T)を、動物へ投与する工程を含む方法である。
[0104] さらに、本発明の中和抗体を免疫原として利用して作製される抗体自体もまた、本 発明に含まれる。
[0105] また、上述のように本発明者らによって、本発明の中和抗体が認識し得る、キラート キシン様タンパク質上のェピトープ領域が決定された。
[0106] 該ェピトープ領域を含むポリペプチドは、本発明の中和抗体を作製するための抗 原として有用である。従って本発明は、以下のポリペプチドに関する。
(1) HM-lタンパク質の部分断片ポリペプチドであって、配列番号: 1に記載の HM-1 タンパク質において 39位〜 48位のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(2) HYIタンパク質の部分断片ポリペプチドであって、配列番号: 3に記載の HYIタン パク質において 39位〜 47位のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
[0107] 本発明の上記ポリペプチドの一例として、配列番号: 1に記載の HM-1タンパク質に おいて 39位〜 48位のアミノ酸配列力 なるポリペプチド、または、配列番号: 3に記載 の HYIタンパク質において 39位〜 47位のアミノ酸配列力 なるポリペプチドを挙げるこ とがでさる。
[0108] また、上記ポリペプチドは、キラートキシン様タンパク質の活性を中和する抗体の作 製のための免疫原 (抗原)として好適に用いることができる。即ち、上記ポリペプチド は、キラートキシン様タンパク質の活性を中和する抗体を誘導するための薬剤として 利用可能である。
[0109] 従って本発明は、本発明の上記ポリペプチドを有効成分として含有する、中和抗体 を誘導し得る免疫原組成物(中和抗体誘導剤)を提供する。
[0110] 本発明の上記ポリペプチドをェピトープとする抗体は、例えば、 j8グルカン合成酵 素阻害活性を阻害する機能を有することを特徴とする抗体である。
[0111] さらに本発明は、本発明の免疫原糸且成物(例えば、上記ェピトープを有するポリべ プチド等)を抗原として用いることを特徴とする、本発明の中和抗体の作製方法に関
する。該方法には、本発明の免疫原組成物を抗原とする一般的な抗体作成技術を 用いた各種方法 (工程)が含まれる。
[0112] 一例を示せば、本発明の上記作製方法として、以下の工程を含む方法を挙げるこ とができる力 必ずしもこの方法に限定されない。
(a)本発明の免疫原組成物(例えば、上記ェピトープを有するポリペプチド等)で免 疫した動物の抗体産生細胞と骨髄腫細胞との間にハイプリドーマを形成させる工程
(b)該ハイブリドーマをクローンィ匕して、該免疫原に対する抗体を産生するクローンを 選択する工程
(c)該クローンから所望の中和抗体を調製する工程
[0113] また、上述のようにハイプリドーマ力 モノクローナル抗体を作製する方法以外にも 、例えば、ファージディスプレイヒト型 1本鎖抗体ライブラリーを用いた方法 (伊藤文昭 、フアルマシア、 Vol.40, No.8、 p.709- 713、 2004年)により、本発明の中和抗体を作製 することが可能である。この方法においては、動物に免疫する必要がなぐファージを 用いて in vitroでスクリーニングを行うため、操作は容易かつ迅速である。また、目的と する抗体が発現して ヽるファージが得られると、抗体タンパク質と併せて抗体遺伝子 も単離することができるため、大腸菌や酵母において大量に抗体を発現させたり、抗 体遺伝子を操作することにより所望の改変を実施することが可能である。
[0114] 本発明の中和抗体を用いて作製される抗真菌剤は、真菌症の治療もしくは予防に 有効である。例えば、真菌症に対する外用,内用治療薬として有用である。真菌症と しては、例えば、皮膚真菌症(白癬菌症 (水虫、たむし、しらくも)等)、皮下真菌症 (菌 腫、放線菌症等)、粘膜真菌症 (カンジダ症、ァスペルギルス症、ムコール菌症等)、 肺真菌症 (タリプトコッカス症、ヒストプラズマ症等)等が挙げられる。本発明の中和抗 体を用いて作製される抗真菌剤の対象となる真菌症としては、特に制限されないが、 好ましくは、カンジダ属もしくはァスペルギルス属の真菌を原因とする真菌症である。 より具体的には、カンジダ属もしくはァスペルギルス属の真菌を原因とする深在性真 菌症を挙げることができる。深在性真菌症の多くは重篤であり致命率も高ぐ深在性 真菌症の治療は医療上の重要な課題となっている。上記薬剤は、例えば、深在性真 菌症に対して有効な治療効果が期待される。
[0115] また本発明は、本発明の中和抗体を抗原として用いる抗体作製法により、カビ等の 病原性真菌に対するタンパク質性抗生物質を作製することも可能である。該物質は、 カビの除去もしくは付着の防止を目的とする洗剤、防カビ剤 ·防カビ素材として利用 することも可會である。
[0116] さらに本発明は、本発明の中和抗体と医薬的に許容される担体とを含む組成物に 関する。
[0117] また、本発明の薬剤もしくは組成物、または、本発明の中和抗体を用いて作製され る抗体は、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくは それ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤の注射剤の形 で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的に は、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤 、賦形剤、べヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製 薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えら れる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られる ように設定する。
[0118] 注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなべヒクルを用いて通常の製剤実 施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬 (例えば D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マン-トール、塩化ナトリウム)を含む等張液が挙 げられる。適当な溶解補助剤、例えばアルコール (エタノール等)、ポリアルコール( プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等)、非イオン性界面活性剤(ポリソル ペート 80 (TM)、 HCO- 50等)を併用してもよい。
[0119] 油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジルぉ よび Zまたはべンジルアルコールを併用してもよい。また、緩衝剤(例えば、リン酸塩 緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液)、無痛化剤 (例えば、塩酸プロ力イン)、安定剤 ( 例えば、ベンジルアルコールおよびフエノール)、酸化防止剤と配合してもよい。調製 された注射液は通常、適当なアンプルに充填する。
[0120] 本発明の薬剤、もしくは本発明の中和抗体を用いて作製される抗体を含有する薬
剤 (組成物)は、好ましくは非経口投与により投与される。例えば、注射剤型、経鼻投 与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型の組成物とすることができる。例えば、静脈内注 射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与するこ とがでさる。
[0121] 投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。抗体または抗体 をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬糸且成物の投与量は、例えば、一回につ き体重 1 kgあたり 0.0001 mgから 1000 mgの範囲に設定することが可能である。または 、例えば、患者あたり 0.001〜100000 mgの投与量とすることもできる力 本発明はこれ らの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量および投与方法は、患者の体 重、年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な 投与量および投与方法を設定することが可能である。
また、必要に応じ本発明の薬剤を、その他の薬効成分と組み合わせて製剤化する ことちでさる。
[0122] また本発明は、本発明の中和抗体をコードする核酸を提供する。さらに該核酸を担 持するベクターもまた、本発明に含まれる。
[0123] さらに本発明は、上記核酸を有する宿主細胞を提供する。該宿主細胞は、特に制 限されず、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを挙げることができる。宿主細胞は 、例えば、本発明の抗体もしくはポリペプチドの製造や発現のための産生系として使 用することができる。ポリペプチド製造のための産生系には、 in vitroおよび in vivoの 産生系がある。 in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系および原核細 胞を使用する産生系が挙げられる。
[0124] 宿主細胞として使用できる真核細胞として、例えば、動物細胞、植物細胞等が挙げ られる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、 CH0 (J. Exp. Med. (1995) 108: 94 5)、 COS, 3T3、ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney)、 HeLa、 Vero等、両生類細 胞、例えばアフリカッメガエル卵母細胞(Valle et al., Nature (1981) 291: 338-340)、 および昆虫細胞、例えば、 S19、 Sf21、 Tn5が例示される。本発明の抗体の発現におい ては、 CHO-DG44、 CH0-DX11B、 COS7細胞、 BHK細胞が好適に用いられる。動物 細胞において、大量発現を目的とする場合には特に CHO細胞が好ましい。宿主細
胞へのべクタ一の導入は、例えば、リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法、エレク トロポレーシヨン法、リポフエクシヨンなどの方法で行うことが可能である。
[0125] 植物細胞としては、例えば、ニコチアナ 'タパカム(Nicotiana tabacum)由来の細胞 力 Sタンパク質生産系として知られており、この細胞をカルス培養する方法により本発 明の抗体を産生させることができる。
[0126] 原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、上 述の大腸菌(E. coli)に加えて、枯草菌を用いた産生系が知られており、本発明の抗 体産生に利用できる。
[0127] 本発明の宿主細胞を用いて抗体を産生する場合、本発明の抗体をコードするポリ ヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞の培養を行 ヽ、ポリ ヌクレオチドを発現させればよい。培養は、公知の方法に従って行うことができる。例 えば、動物細胞を宿主とした場合、培養液として、例えば、 DMEM、 MEM, RPMI1640 、 IMDMを使用することができる。その際、 FBS、牛胎児血清 (FCS)等の血清補液を 併用しても、無血清培養により細胞を培養してもよい。培養時の pHは、約 6〜8とする のが好ましい。培養は、通常、約 30〜40°Cで約 15〜200時間行い、必要に応じて培 地の交換、通気、攪拌を加える。
[0128] 一方、 in vivoでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生 系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物または植物に目的とするポリ ヌクレオチドを導入し、動物または植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。 本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
[0129] 動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物として は、ャギ、ブタ、ヒッジ、マウス、ノ、ムスター、ゥマ、ゥシ等を用いることができる(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications (1993))。また、哺乳類動物を用いる 場合、トランスジエニック動物を用いることができる。
[0130] 例えば、本発明の中和抗体をコードするポリヌクレオチドを、ャギ βカゼインのような 乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調 製する。次いで、この融合遺伝子を含むポリヌクレオチド断片をャギの胚へ注入し、こ の胚を雌のャギへ移植する。胚を受容したャギカも生まれるトランスジエニックャギま
たはその子孫が産生する乳汁から、 目的の抗体を得ることができる。トランスジェ-ッ タヤギカ 産生される抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトラン スジエニックャギに投与してもよ 、。
[0131] また、本発明の中和抗体を産生させる昆虫としては、例えばカイコを用いることがで きる。カイコを用いる場合、 目的の抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入したバキュ ロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的の抗体を得るこ とがでさる。
[0132] さらに、植物を本発明の中和抗体の産生に使用する場合、例えばタバコを用いるこ とができる。タバコを用いる場合、 目的とする抗体をコードするポリヌクレオチドを植物 発現用ベクター、例えば pMON 530に挿入し、このベクターをァグロバタテリゥム 'ッメ ファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のようなバクテリアに導入する。このバクテ リアをタバコ、例えば、ニコチアナ'タパカム(Nicotiana tabacum)に感染させ、本タパ コの葉より所望の抗体を得ることができる。
[0133] このようにして得られた抗体は、宿主細胞内または細胞外 (培地、乳汁など)から単 離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は 、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよぐ何 ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過 、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳 動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせて抗体を分離、精 製することができる。
[0134] クロマトグラフィーとしては、例えばァフィ二ティクロマトグラフィー、イオン交換クロマ トグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロ マトグラフィ一等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー 、例えば HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。ァフィ- ティクロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテイン Aカラム、プロテイン Gカラム が挙げられる。例えば、プロテイン Aを用いたカラムとして、 Hyper D, POROS, Sephar ose F. F. (Pharmacia製)等が挙げられる。
[0135] 必要に応じ、抗体の精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させ
ることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパ ク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリブシン、リシルエンドべプチダー ゼ、プロテインキナーゼ、ダルコシダーゼなどが用いられる。
なお本明細書において引用されたすベての先行技術文献は、参照として本明細書 に組み入れられる。
実施例
[0136] 以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により制限 されるものではない。
なお、本実施例にお!ヽて用いられた材料および各種実験手法を以下に示す。
[0137] <材料 >
ァフィユティー精製した中和モノクローナル抗体 (nmAb- KT)および HM-1に対する ポリクローナルゥサギ抗血清は、それぞれ Technology Incubation & Transfer Ltd. (日 本、埼玉)および株式会社日本バイオテスト研究所(日本、東京)の調製〖こよる。精製 HM- 1および HYIキラートキシンタンパク質は、文献(Ohta, Y., Tsukada, Y., and Sugi mori, T. (1984) Production, purification and characterization of HYI, an anti-yeast s ubstance, produced by Hansenula saturnus. Agric. Biol. Chem. 48, 903—908.; Kom iyama, T., Ohta, T., Furuichi, Y., Ohta, Y., and Tsukada, Y. (1995) Structure and a ctivity of HYI killer toxin from Hansenula saturnus. Biol. Pharm. Bull. 18, 1057—105 9.; Kasahara, S., Yamada, H., Mio, T., Sniratori, Y., Miyamoto, C, Yabe, T., Nak ajima, T., Ichishima, E., and Furuichi, Y. (1994)し loning of the Saccharomyces cere visiae gene whose overexpression overcomes the effects of HM— 1 killer toxin, which inhibits beta— glucan synthesis. J. Bacteriol. 176, 1488—1499.)に記載の手法によつ て調製した。マウスモノクローナルァイソタイピングキットは、アマシャムバイオサイェン ス株式会社(日本、東京)から購入した。西洋ヮサビペルォキシダーゼ結合抗ゥサギ ャギ IgGおよび抗マウスャギ IgG、ならびにアルカリホスファターゼ結合抗マウスャギ Ig Gは、 Sigma (米国、ミズーリ州、セントルイス)から購入した。 Biocore Xシステム、 CM5 チップ、およびァミノカップリングキットは、 Biocore AB (スウェーデン、ウプサラ)の製 品である。ペプチドはシグマジエノシス株式会社の合成による。 YPD培地は、 1%酵母
エキス、ならびそれぞれ 2%のペプトンおよびグルコースからなる。
[0138] <抗体のアイソタイプ決定 >
抗体ァイソタイピングキット(アマシャムフアルマシアバイオテック社)を使用し、製造 業者の提供する手順に従って、中和モノクローナル抗体のサブクラスを決定した。具 体的には、ァイソタイピングスティックを TBSに溶解した 3 μ g/ml nmAbと共に、適度に 撹拌しながら室温で 15分間インキュベートした。スティックを 500倍に希釈した西洋ヮ サビペルォキシダーゼ結合抗マウスャギ IgGの溶液中に、適度に振盪しながら室温 で 15分間浸した。冷メタノールに溶解した 4-クロ口- 1-ナフトールおよび 0.1%過酸ィ匕水 素を添カ卩して、 nmAb- KTのサブクラスを規定した。
[0139] < SDS- PAGEおよびウェスタンブロッテイング〉
HM-1および HYIタンパク質 0.1 /z gを、 15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した 。タンパク質をゲルから ProBlottメンブレン(Applied Biosystems)に転写した。 TBS-T 緩衝液に溶解した 4%ローファットドライミルクでメンブレンをブロッキングした。メンブレ ンを、ブロッキング溶液に溶解した 3 μ g/ml nmAb- KT中に 2時間浸した。 TBS-Tで 3 回洗浄した後、メンブレンをアルカリホスファターゼ結合抗マウスャギ IgG溶液中でさ らに 1時間インキュベートした。洗浄した後、基質としてウェスタンブルー (Western blu e) (Promega)を添加して、メンブレン上のタンパク質を可視化した。着色広域標準物 質 5 1を標準マーカーとして使用した。
[0140] <サンドイッチ ELISAによる HM- 1および HYIの定量 >
HM-1および HYIを検出するため、以前に報告されている通りにサンドイッチ ELISA 法 確 した (Komiyama, T., Zhang, w.Z., Miyamoto, M., Selva umar, D., and Furu ichi, Y. (2004) Monoclonal antibodies and sandwich ELISA for quantitation of HM-1 killer toxin. Biol. Pharm. Bull. 27, 691-693.)。マイクロタイタープレートのゥエルを、 5 0 mM重炭酸ナトリウム緩衝液 (pH9.6)に溶解した 10 μ g/ml nmAb-KT 50 μ 1で 4°Cで ー晚コーティングし、 TBに溶解した 1% BSAで室温で 1時間ブロッキングし、 TBS-Tで 洗浄した。キラートキシンタンパク質をブロッキング緩衝液で希釈し、 HM-1および HYI 溶液 50 1を各ゥエルに添カ卩して室温で 2時間インキュベートし、その後 TBS-Tで 3回 洗浄した。次いで、ブロッキング緩衝液で 1:1000希釈したポリクローナル抗 HM-1ゥサ
ギ血清 100 1をゥエルに添カ卩し、室温で 1時間インキュベートした。 TBS-Tでゥエルを 洗浄した後、 1:1000希釈した西洋ヮサビペルォキシダーゼ結合抗ゥサギヤギ IgG溶 液と共に 30°Cで 30分間インキュベートし、次いで TBS-Tで洗浄することにより、結合し たタンパク質を検出した。 0.1%過酸化水素を含む 10% 0-フエ-レンジァミン溶液を各 ゥエルに添加し、発色のため 30°Cで 10分間インキュベートした。 IN HC1 100 μ 1を添 加して反応を停止し、最終的にマイクロプレートリーダーを用いて 490 nmの吸光度を 測定した。
[0141] く SPR解析〉
nmAB- KTと HM-1または HYIとの間の相互作用のリアルタイム測定は、 25°Cで BIAc ore Xバイオセンサーを用いて行った。固定化実験において、 HBS-EP緩衝液(10 m M HEPES、 150 mM NaCl、 3 mM EDTA、 0.005%ポリソルベート 20 (pH 7.4))を溶出緩 衝液として、流束 10 1/minで使用した。 CM5センサーチップへの nmAb- KTの固定 化は、活性ィ匕を除いて、ァミンカップリング法の標準的な手順に従って行った。具体 的には、 200 mM N-ェチル -N'-(3-ジメチルァミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩と 50 mM N-ヒドロキシスクシ-ミドの 1:1混合物 120 1で活性化したバイオセンサー表面に 、前濃縮緩衝液(10 mM酢酸ナトリウム (pH 5.0))に希釈した 35 μ g/ml nmAb- KTを注 入し、次いで 1Mエタノールァミン (pH 8.5) 120 1を注入して未反応の試薬を不活ィ匕 した。約 3,000レゾナンスユニット (RU)の nmAb- KTが固定化された。 1つのチャネルは 、 10 mM酢酸ナトリウム (pH 5.0)の注入によって活性化し、その後エタノールァミンで 不活ィ匕した各センサーチップに使用した。このチャネルは、カルボキシルメチル化デ キストラン表面に対する HM-1または HYIの非特異的結合の対照として用いた。それ ぞれ測定した後、 1 mM HC1 20 1を用いてチップ表面を再生した。
[0142] 精製 HM-1および HYIタンパク質は、 6.25 nM〜100 nMの濃度で解析した。精製タ ンパク質の各注入試料 (30 1)を抗原と接触させた。 BlAevaluation 3.0を用いて動力 学的センサーグラム曲線を評価して、結合速度定数 k および解離速度定数
on k を決
off 定した。解離定数 κは、式 κ = k Λ 用いて計算した。
d d off on
[0143] く nmAb- KTを用いた場合の HM-1および HYIのキラートキシン活性 >
HM-1および HYIタンパク質のキラートキシン活性は、 S.セレピシェ A451を用いて、
液体培養法によって測定した(Komiyama, T., Ohta, T., Urakami, H., Shiratori, Y., Takasuka, T., Satoh, M., Watanabe, T., and Furuichi, Y. (1996) Pore formation on p roliferating yeast Saccharomyces cerevisiae cell buds by HM— 1 killer toxin. J. Bioch em. (Tokyo). 119, 731-736.)。約 4 x 106細胞/ mlの S.セレピシェ A451を、 15 μ g/ml nmAb- ΚΤまたは 40 ng/ml HM-1もしくは HYIを含む YPD培地中、 30°Cで 8時間インキ ュペートした。 600應の吸光度により酵母の増殖を測定した。
[0144] く nmAb- KTのペプチド解析 >
nmAb- KTのェピトープを決定するため、 nmAb- KTの中和活性に対する HM-1また は HYI由来ペプチドの阻害効果を測定した。 nmAb-KTのェピトープの配列を同定す るため、 HM-1のアミノ酸配列に基づいて、 N末端力も C末端まで 12のペプチド(Pl〜 P12)を調製した(表 1)。約 4 X 106細胞/ mlの S.セレピシェ A451を含む YPD培地中、 n mAb- KTを、 10 /z Mペプチドおよび 40 ng/ml HM-1と供に 4°Cでー晚インキュベート する方法で、実験を行った。 30°Cで 8時間インキュベートした後、 600 nmの吸光度を モニタリングすることによって酵母の増殖を測定した。
nmAb- KTのェピトープ解析に使用したペプチドを表 1に示す。
[0145] [表 1]
ペプチド名 HM-1 ペプチド配列
PI iGDGYLIMCKN10 (配列番号: 9)
P2 "CDPN14 (配列番号: 1 0)
P3 ^•GDGYLIMCKNCDPN14 (配列番号: 1 1 )
P4 15TGSCDWK21 (配列番号: 1 2)
P5 22QNWNTCVGIGA32 (配列番号: 1 3)
P6 33NVHWMVTGGST43 (配列番号: 1 4)
P7 44DGKQGCATIWEGS56 (配列番号: 1 5)
P8 57GCV」9(配列番号: 1 6)
P9 44DGKQGCATIWEGSGCV59 (配列番号: 1
P10 6t)GRSTTMCCPA69 (配列番号: 1 8)
Pll 7 TCCNINT'7 (配列番号: 1 9)
P12 7。GFYIRSYRRVE88 (配列番号: 20)
HM-1 デカペプチド 39TGGSTDGKQG48 (配列番号: 2)
HYIナノペプチド 39TGESNGQQG47 (配列番号: 4)
[0146] ペプチド名の番号は HM-1アミノ酸配列に基づく。アミノ酸位置の番号は、 N末端の アミノ酸力 数えたものである。
[0147] <ドットブロッテイング解析によるペプチド結合アツセィ >
12のペプチドに加えて、 HM-1の 39〜48位のアミノ酸配列を示す HM-1デカぺプチ ド、および HYIの 39〜47位の HYIナノペプチド(表 1)を合成し、 HM-1のェピトープ部 位を同定した。 ProBlottメンブレンをドットブロット装置(Bio- Craft Inc)に設置し、所定 の区域を 12の HM-1ペプチドまたは HM-1デカペプチドまたは HYIナノペプチドそれ ぞれ 0.1 μ gでコーティングした。 TBSに溶解した 2%ローファットドライミルクで、メンブ レンを室温で 1時間ブロッキングした。洗浄した後、メンブレンを一次モノクローナル抗 体としての nmAb-KTと共に室温で 2時間インキュベートし、その後 TBS-T溶液で 3回 洗浄した。 1:5,000希釈したアルカリホスファターゼ結合抗マウスャギ IgG溶液と室温 で 1時間インキュベートして、結合したペプチドを検出した。ウェスタンブルー色素を 添加して、検出を完了した。
[0148] 〔実施例 1〕 nmAb-KTを免疫原として用いる抗イディォタイプ抗体の作製
(1) 免疫化
抗イディォタイプ抗体は、マウスをイディォタイプ免疫原 (nmAb- KT)で免疫化する ことによって作製した。 nmAb- KTは、酵母ウイリオプシス 'サチュルヌス var.mrakiiから 産生されるキラートキシンの活性をインビトロで中和するモノクローナル抗体であり、 標準的なハイプリドーマ技術によって作製した(Yamamotoら, 1986,FEBS letter)。雌 B alb/cマウス(3週齢、概算体重 10グラム)を、 0日目および 14日目に、 nmAb- KT 50 μ gと完全フロイントアジュバント(CFA) (l/l:v/v)で皮下に免疫化し、その後に、 28日 目、 42日目、および 56日目に、 nmAb- KTと不完全フロイントアジュバント(IFA)を腹腔 内に追加免疫注射した。最後の追加免疫注射の 3日後に、マウスを屠殺し、脾臓を 取り出した。
[0149] (2) mRNA単離
RNA抽出キットを使用し、製造業者 (フアルマシア (Pharmacia) )により提供されたプ ロトコールに従って、総 RNAを過免疫マウスから単離し、エタノール沈殿によって精製 した。ポリ(AT)トラタトシステム(poly (AT) tract system) (プロメガ(Promega) )を用い て、総 RNAから mRNAを単離した。
[0150] (3) 抗体可変領域遺伝子のクローニング
糸且換 X·ファ ~~ン抗体ンス" 7"ム ¾cFvモンュ ~~ノレ (recombinant phage antibody system -ScFv module) (フアルマシア)を使用し、製造業者により提供されたプロトコールを用 いて、抗体可変領域遺伝子を構築した。
[0151] (4) ScFvライブラリーの構築
ScFv遺伝子の cDNAは、上記 nmAb- KTで免疫化された過免疫マウスの脾臓から単 離された mRNAからの逆転写によって作製した。
ScFv遺伝子を、 Vフラグメントおよび Vフラグメントをテンプレートとしたオーバーラ
H L
ップ PCR(overlap PCR)によって構築し、等量の V y Ser)リンカ
H、 V、および(Gl
L 4 3 一配 列 (配列番号: 22)を融合した。
[0152] このように構築した遺伝子産物をゲル精製し、分光光度計で定量した。エタノール 沈殿の後、構築した遺伝子を Sfilおよび Notl制限酵素で消化した。消化された ScFvフ ラグメントをゲル精製し、同じ制限酵素で切断されて 、るファージミド発現ベクター pC ANTAB 5E (フアルマシア)に連結した。次いで、連結された産物は、プラスミド 1 ngに
つき 1 X 109形質転換体の効率で、エレクト口ポレーシヨンによってサプレッサー大腸 菌 TG1細胞(フアルマシア)に導入した。エレクト口ポレーシヨンの後、細胞を、 2%グル コースおよび 100 μ g/mlの濃度のアンピシリンを含む SOBAG培地へ移し、 30°Cで一 晚インキュベートした。インキュベーションの後、コロニーをこそぎ取って、 10%グリセ ロールを含む 2 XYT培地 5 mlに入れ、その後- 80°Cで保存した。
[0153] (5) ファージレスキュー
nmAb- KTと結合する ScFvをファージ粒子の表面に発現するファージ(以下 ScFvフ ァージと略す)をレスキューするために、ファージ培養液 50 1を、 2%グルコースおよ び 100 μ g/mlアンピシリンを含む 2 XYT-AG培地 50 ml中へ加え、 OD 力 0.5〜0.7の
600
値に達するまで 37°Cで振盪した。 M13 K07 (フアルマシア)ヘルパーファージを 20:1 ( ファージ粒子:細菌細胞数)の ΜΟΙで添カ卩し、振盪せずに 37°Cで 1時間放置した。細 胞を遠心分離で収集し、 100 μ g/mlアンピシリンおよび 50 μ g/mlカナマイシンを含 む新鮮な 2 XYT-AK培地に懸濁し、振盪しながら 30°Cで一晩インキュベートした。細 菌細胞を遠心分離によって除去し、 1/5体積の PEG- NaCl (20%PEG8000,2.5 M NaC 1)を添加し上清中のファージ粒子を精製および濃縮し、氷上で 30分間インキュベート し、 4°Cで 30分間、 10,000 gで遠心分離した。上清を捨て、ペレットを PBS 5 mlに再懸 濁した。ファージ懸濁液を再度、 PEG-NaClで氷上で 30分間処理し、前記のように遠 心分離した。このあと、上清を捨て、ペレットを 10%グリセロールを含む PBS 2 mlに再 懸濁し、その後、 4°Cで保存した。
[0154] (6) nmAb- KTと結合する ScFvファージのパンユングによるスクリーニング
nmAb- KTに特異的に結合する ScFvを産生するファージ(ScFvファージ)を選択的 に捕獲するために、以下に述べるパンユングスクリーニングを数回繰り返して実施し た。 ScFvポリペプチドライブラリーを表面上に発現する組換えファージを、ヘルパーフ ァージを用いるレスキューによって産生し、固定ィ匕した nmAb- KTに対する結合を利用 してスクリーニングし、濃縮した。
[0155] (7) ELISA- ScFvファージ抗体
以上のようにして得られた組換え ScFvファージを、これを含む大腸菌の個々のクロ ーンからヘルパーファージを用いる方法によりレスキューし、更に、下記のように ELIS
A法によって nmAb- KTと結合する能力差を指標にして、選抜スクリーニングを行った 。マイクロタイターゥエルを前記のように nmAB-KTでコーティングし、 PBSに溶解した 3 %ドライミルク液を用いて 37°C1時間ブロックした。洗浄後、組換え ScFvファージをゥェ ル内へ入れ 37°Cで 2時間インキュベートし、次いで、 PBS-Tで 6回洗浄した。ゥエル内 で nmAB-KTと結合している ScFvファージは、 HRP結合抗 M13ファージ抗体(フアル マシア) (1:1000)と 37°Cで 1時間インキュベートすることによって検出した。その際、ゥ エルを徹底的に洗浄した後、クェン酸に溶解した ABTSを基質として添加することによ つて発色結合したウィルスを発色させ、吸光度を A405nmで測定した。
[0156] この結果、パンユングスクリーニング以前には、 nmAb- KTと結合する ScFvファージ はライブラリープール中ごく僅かであつたが、 4回のパンユングスクリーニングによる選 抜 ·増殖の後では nmAb- KTと特異的に結合するウィルスは著しく増加した。 ScFvファ ージと nmAb- KT力 真に特異的に結合していることは、 nmAb- KTに替えて BSA(Bovi ne serum albumine)を用いたコントロール実験から証明されている。
[0157] 4回のパンニング後に選抜された ScFvファージプールを大腸菌(TG1)細胞に感染 させた後、アンピシリン含有寒天培地に移し、ファージを含む大腸菌コロニーを増殖 させた。このように単一種ィ匕された各ファージクローンを得ることが出来た。このように して得られた ScFvが特異的に nmAb-KTに結合することは、 ELISA法により確認して!/ヽ る。
[0158] (8) 可溶性 ScFv抗体の作製
可溶性 ScFv抗体を作製するために、 4回のパンユングスクリーニング後に選抜され たファージを、 ScFvコーディング領域と M13遺伝子 IIIフラグメント領域との間にあるァ ンバー停止コドンを認識する非サブレッサー大腸菌 HB2151 (アマシャムフアルマシア バイオサイエンス)に感染させた。大腸菌は、 OD 力 5〜0.9に達するまで、 30°Cで
600
振盪培養した。ファージミドを含む増殖期大腸菌を 1 mMイソプロピル |8 ,- D-チォガラ タトビラノシド(IPTG)とインキュベートし、さらに 22°Cで 16時間インキュベートすること により ScFv抗体フラグメントのタンパク合成を行い、これにより、ペリブラズムに分泌さ れる可溶型 ScFv抗体フラグメントを産生させることが出来た。
[0159] 細胞を遠心分離によってペレット化し、一方、細胞外へ分泌した可溶性 ScFvを含む
上清は、 0.45 μ mフィルターに通して濾過し、それぞれ、 - 20°Cで保存した。細胞の ペリブラズムカも ScFv抗体フラグメントを調製するために、細胞を、氷冷した 1 X TES ( 0.2 M Tris- HCl (pH8.0)、 0.5 mM EDTA、および 0.4Mスクロース) 20 mlに懸濁して遠 心洗浄し、次に、氷冷 1/5 X TES緩衝液 30 mlに再懸濁し、 1時間氷上でインキュベー トし、 10,800gで 30分間遠心分離した。可溶ィ匕した ScFv抗体フラグメントは上清中に存 在する。このようにして得られた可溶性 ScFv抗体フラグメントは滅菌チューブに移し、 - 20°Cで保存した。
[0160] (9) ScFv抗体の ELISA法による解析
マイクロタイターゥエルを、前記のように 10 g/mlの nmAb- KTまたは 1F1 mAbまた は 4A2 mAbおよび BSA (負の対照)でコーティングし、それぞれ PBSに溶解した 3%ドラ ィミルク液により室温で 1時間ブロックした。洗浄後、可溶性 ScFv抗体をゥエル内に入 れ、室温で 2時間インキュベートし、この後、ゥエルは、 PBS-Tで 3回洗浄した。 ScFvの カルボキシ末端には小さなペプチドェピトープ(E-Tag)が組み込まれているので、結 合した ScFv抗体は、 HRP結合抗 E-Tag抗体 (フアルマシア)(1:1000)と室温で 1時間ィ ンキュペートした後、先に述べた ELISA法により検出することができる。この結果、 ScF V抗体を可溶ィ匕した形で大腸菌から抽出した事を確認した。
[0161] (10) ScFv抗体の精製
ScFv抗体をコードするファージ遺伝子を含む大腸菌 HB2151を、 1 mMイソプロピル β ,-D-チォガラタトピラノシド(IPTG)を含む 2 X YT培地中で 22°Cで 16時間増殖させ ることによって、可溶性 ScFv抗体の産生を誘導した。 ScFv抗体は、先に述べた方法 により大腸菌 HB2151細胞のペリプラズムカも抽出し、抗 E-Tag N-ヒドロキシスクシン イミドで活性化したセファロースカラム(ノヽイトラップ抗 E- Tag (Hi trap antト E- Tag)ファ ルマシア)を用いたァフィ-ティクロマトグラフィーによって精製することが出来た。精 製された ScFv抗体の収率は 1.0〜3.0 mg/1であった。
[0162] (11) ゲル電気泳動およびィムノブロッテイングによる ScFvの検証
ァフィ-ティクロマトグラフィーによって得られた精製 ScFv抗体の純度を確かめるた めに、クロマトグラフィーの溶出画分につ!、てウェスタンブロッテイング分析を行った。 ScFv抗体タンパク質の確認は 15%SDS-PAGEで分離した後に、クマシ一ブリリアント
ブルーもしくは硝酸銀による染色により行った。ウェスタンプロット分析の際は、 ScFv 抗体をゲル電気泳動後、ィムノトランスファー緩衝液を含むセミドライ装置(1時間, 0.8 mA/cm2)を用いて、ニトロセルロースフィルター(プロブロット(ProBlott)膜、アプライド バイオシステム(Applied Biosystems) )に転写した。膜は、 PBSに溶解した 3%ドライミ ルク液により室温で 1時間ブロックし、その後、 HRP結合抗 E-Tag抗体 (フアルマシア) と 1時間インキュベートし、膜上の ScFvタンパク質を明らかにした。ゲル電気泳動の際 の分子量マーカーとしては、予め着色された広範囲標準(broad range standard) (バ ィオラド(BIO- RAD) ) 4 /z lを使用して、 ScFvの分子量を測定した。また、 ScFv抗体の タンパク質濃度は BCA-ペプチド結合法を用いて測定した。
[0163] この結果、大腸菌 HB2151細胞のペリプラズムから得られる ScFv抗体のタンパク質 は約 30 Kdaの分子量をもつことがわかった。一方、ほぼ同じサイズの ScFv抗体が培 養液内にも観察され、このことから、抽出'精製の行程で、 ScFvの一部は大腸菌ペリ ブラズム部分力 漏出することも分力つた。
[0164] (12) ScFv-DNA配列決定
ELISAにより nmAb- KTと強い結合反応性を示す 9個のクローンについて、 V鎖およ
H
び V鎖をコードするヌクレオチド配列を決定した。 CEQ 2000ダイターミネータ一サイ
L
クルシークェンシングキット(CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing kit) (べッ クマンコールター(BECKMAN COULTER) )を用いて、選択されたクローンの核酸配 列決定を行い、産物を CEQ™ 2000XL DNA分析システムによって分析した。プライマ 一は、 pCANTAB 5Eベクターの Rl、 S3、 S4、および S6配列決定用プライマー(フアル マシア)を用いた。配列アラインメントおよび操作は DNASISおよび Genetyxソフトゥェ ァによって行った。
[0165] その結果、これらのクローンのうち 4個は、 V遺伝子については共通したヌクレオチ
H
ド配列およびアミノ酸配列を持ち、 V遺伝子については、それぞれ異なる配列を持つ し
ことが判明した。この結果、これらの 4種類のクローンはそれぞれ独立したクローンか ら由来していることが判り、 ScFv-Al、 ScFv-A2、 ScFv-A3、および ScFv-A4と名付け た。
[0166] (13) nmAb-KTとの結合特異性
4種類の ScFv-Al、 ScFv-A2、 ScFv-A3、および ScFv-A4について、先に述べた方 法により精製し、生化学的特徴について調べた。その結果、 4種類の ScFv抗体はす ベて分子量 29〜30 Kdaであり、 nmAb-KTと特異的に結合する活性を持つことがわか つた o
[0167] 1F1および 4A2モノクローナル抗体は HM-1に対して産生され、 HM-1と結合すること が出来るが、 HM-1の抗菌活性を中和する事は出来ない。更なる生化学的実験によ り、今回得られた 4種類の精製 ScFvは、この 2種類のモノクローン抗体、 1F1 mAbと 4A 2 mAb,に結合しないことが分かり、これらの実験事実から総合して、 4種類の ScFvは HM-1の活性部位と相同の機能を持つことが推定された。
[0168] ( 14) |8グルカン合成酵素阻害活性の検出
精製した 4種類の ScFv-Al、 ScFv-A2、 ScFv_A3、および ScFv_A4について、これら の ScFvは、酵母サッカロミセスの βグルカン合成酵素を阻害することがわかった。 β グルカン合成酵素は増殖期の酵母細胞から抽出し (Yamamoto T. et al. , FEBS Lett. 1986; 197: 50-54)、基質である UDPG (Uridine diphosphate glucose)を含む反応液 中における 13グルカンの合成量を山本らの報告に従い(Yamamoto T. et al. , FEBS L ett. 1986; 197: 50-54)、発色反応によって測定した。その際、精製した HM-1をポジ ティブコントロール(陽性対称)として、また、 BSA (牛アルブミンタンパク)をネガテエブ コントロール(陰性対称)として用いて比較した。この測定条件下において、 ScFv-Al 、 ScFv-A2、 ScFv-A3、および ScFv-A4は、 HM-1と同等の j8グルカン合成酵素阻害 活性を示した。
[0169] ( 15) 表面プラズモン共鳴 (SPR)分析
表面プラズモン共鳴 (SPR)分析を用いて、精製 ScFv抗体の結合特異性および速度 論パラメータを測定した。
ビアコア(BIAcore) X (ビアコア, Uppasala,Sweden)を使用し、製造業者の説明書に 従って、表面プラズモン共鳴 (SPR)分析により、固定ィ匕抗原に対する ScFvの結合速 度を測定した。抗原を、 35 μ g/ml nmAb- KTまたは 1F1 mAbまたは 4A2 mAbの濃度 で、 10 mM酢酸ナトリウム(pH5.0)の前濃縮(preconcentration)緩衝液で希釈し、製 造業者により供給されたァミン結合キットを接触時間 7分および流速 10 μ 1/分で用い
て CM5センサーチップに固定ィ匕し、表面上の反応しな力つた部分をエタノールァミン でブロックした。この結果、以下のレゾナンスユニット(1000レゾナンスユニットは 1 ng/ mm2の表面濃度に相当する)を測定することができた。それらは、固定ィ匕 nmAb- KTの 場合、 3000、 1F1 mAbの場合、 2854、 4A2 mAbの場合、 1825という値である。
[0170] それぞれのセンサーチップの 1個のチャンネルを、活性化後に、 10 mM酢酸ナトリウ ム(PH5.0)を注入するのに使用し、その後に、エタノールァミンで非活性ィ匕した。この チャンネルは、 ScFvとカルボキシメチルイ匕デキストラン表面との非特異的結合を制御 するのに使用した。表面プラズモン共鳴分析の全ての場合において、測定は、流速 1 0 μ 1/分、 25°C、 HBS-EP中で行った。それぞれの測定の後、チップ表面を 1 mM HC1 10 μ 1で再生した。
[0171] 単量体 ScFv抗体の分析は 15.75 nM〜250 nMの濃度で行った。組換え抗体フラグ メントのそれぞれの注入試料 (30 1)と抗原を 5分間接触させた。続いて解離が 10分 間生じた。速度定数 k および K を求めるために、速度論センサーグラム曲線をビア on off
エバリュエーション(BIAevaluation) 3.0で評価した。速度論親和定数(k )は =k / K
a a on の式を用いて計算した。
off
様々な濃度の ScFv-Al、 ScFv-A2、 ScFv-A3、および ScFv-A4と固定化 nmAb- KTと の相互作用に関するビアコアセンサーグラムを解析した。
[0172] この結果、 ScFvは固定ィ匕 nmAb- KTに結合することが分力つた。速度論データの分 祈から、 ScFvのアミノ酸配列は異なる力 これらの抗体は mAb- KTに対して同様の親 和性、あるいは結合力を示すことが明らかになった。対照的に、これらの抗体は nmAb -KTには結合する力 1F1 mAbや 4A2 mAbや BSA (負の対照)とは測定可能な結合を 示さない。会合速度定数 (k )および解離速度定数 (K )ならびに親和定数 (K )の計 on off a 算値を表 2に示す。 K = K /Κ
a on off
[0173] [表 2]
抗体断片 kon koff Ka
(x 105 M_1 s'1) (x lO^s-1) (x 107 "1)
ScFv -A1 2.43 5.07 4.79
ScFv -A2 3.05 4.58 6.66
ScFv -A3 2.29 7.51 3.05
ScFv -A4 2.24 5.0 4.48
[0174] ScFv-A2の親和定数(K ) (6.65 X
a lo 1)は、 ScFv-A3の親和定数(3.04 X lo 1)
、または ScFv-Alの親和定数(4.8 X lo 1)、または ScFv-A4の親和定数(4.48 X 107 M—1)の約 2倍または 1.2倍であった。これらの選択された抗体の速度論親和定数 (K )
a によって、抗体が nmAb-KTに高親和性で結合すると結論付けられる。
[0175] (16) ScFvの抗カンジダ活性測定
CFUアツセィ (colony forming unit assay)によって、精製 ScFvクローンの抗カンジダ 活性を測定した。
約 5 X 102細胞/ mlのカンジダ'アルビカンス ATCC 10231またはカンジダ'アルビカン ス IFM 40213またはカンジダ'ァルビカンスじ 11細胞株を1¾3 10 1に懸濁し、精製 S cFv KTIdAb (25 μ g/ml)および PBS (対照) 100 μ 1〖こ添加した。対照実験として、 nm Ab-KTで予め吸着された ScFv KTIdAbにも等量のカンジダ'アルビカンス菌を添カロし た。それぞれの ScFv抗体と 37°Cで 16時間インキュベートした後、カンジダ 'アルビカン ス菌をサブローデキストロース寒天プレートの表面に分配し、広げ、次いで 30°Cでィ ンキュペートし、 CFUを 48時間後に数えた。この実験は、確認のため 3回繰り返した。 統計解析を行うために、結果は平均士標準偏差で表した。 CFUの数値の差を、ス チューデント t検定を用いて評価した。
[0176] その結果、 CFUアツセィによって、 25 μ gml—1の 4種類の ScFv KTIdAbで処理された カンジダ.アルビカンス菌の増殖は約 95%、あるいはそれ以上の阻害をうけることが明 らかになつた (表 3 :酵母 (サッカロミセス)、およびカンジダ 'アルビカンス株に対する S cFv抗体の増殖阻害活性)。
[0177] [表 3]
抗体断片 サッカロミセス ATCC 10231 IFM 40213 CAI 4
コロニー数 阻害 コロニ一数 阻害 コロニー数 阻害 コロニー数 阻害
(%) (%) (%) (%) コントロール 600 0 553 0 567 0 559 0
ScFv - A1 0 100 25 95.5 32 94.4 30 94.6
ScFv - A2 0 100 15 97.3 22 96.1 23 95.9
ScFv - A3 0 100 11 98.0 20 96.5 15 97.3
ScFv - A4 0 100 30 94.6 32 94.4 32 94.3
[0178] (上記表中「コロニー数」は残存コロニー数を表す。 )
上記実験より、通常の酵母 (サッカロミセス)はもちろん、既存の抗真菌剤では効き めが弱いカンジダ.アルビカンス株に対しても、本発明の ScFvは、有効な抗真菌作用 を発揮することが示された。即ち、本発明の中和抗体を用いて作製される抗イディォ タイプ抗体 (ScFv)は、カンジダ ·アルビカンス株までも殺傷し得る強力な抗真菌活性 を有することが実証された。
[0179] 従って、本発明の中和抗体は、顕著な抗真菌活性を有する抗体の作製のための免 疫原として非常に有用であることが示された。
[0180] 〔実施例 2〕nmAb-KTの特徴の解析
マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットを用いて、 nmAb- KTは IgGl( κ )サ ブタイプとして分類された。 SDS-PAGEによりそれぞれ分子量約 57 kDaおよび 25 kDa の重鎖および軽鎖のバンドのみが示され、抗体の精度が示唆された。 HM-1および H YIの酵母キラートキシン活性に及ぼす nmAB- KTの効果を図 1に示す。 nmAb- KTを 添加しても酵母の増殖に及ぼす影響は示されな力つた力 HM-1および HYIは強い キラートキシン活性を示した。 nmAb- KTは HM-1による酵母細胞の増殖阻止を防!ヽ だ力 細胞を HYIで処理した場合には、高い濃度 (15 μ g/ml)においても、 nmAb- KT は細胞破壊活性から感受性酵母細胞を防ぐことができな力つた。
[0181] これらの結果から、 nmAb- KTは HM-1のキラートキシン活性を特異的に中和し、 HYI のキラートキシン活性は、これら 2つのトキシンがアミノ酸配列において高い相同性を 共有するものの、 nmAb- KTによって妨げられないことが示された。
[0182] 〔実施例 3〕ウェスタンプロット解析による nmAb- KTの結合特異性
HM-1および HYIタンパク質を 15% SDS-PAGEにより電気泳動し、 PVDFメンブレンに 転写し、次いで nmAb- KTを一次抗体として使用した。アルカリホスファターゼ結合抗
マウスャギ IgGおよびウェスタンブルーを添カ卩して、メンブレン上のタンパク質を可視 ィ匕した。図 2では、 HM-1の予想分子量約 9500 Daに相当する明らかな単一バンドが 示されたが、 HYIはメンブレン上にバンドが示されなかった。
[0183] これらの結果から、 nmAb- KTは M-1のみに結合し、 HYIには結合しないことが示さ れた。ドットプロット法によっても同様の結果が得られた。
[0184] 〔実施例 4〕HM-1の定量
0.25〜5 ng (すなわち、 5〜100 ng/ml溶液 50 1)の範囲の少量の HM-1を測定でき るように、 HM-1を定量ィ匕するサンドイッチ ELISA法により典型的な検量線を作成した( 図 3)。一次抗体として mAB- ΚΤを用いるサンドイッチ ELISA条件下では、一次構造に おいて HM-1と高い (87%)相同性を示すにもかかわらず、 HYI (5 ng)は検出されなかつ た。この結果から、 nmAb- KTの結合は、 HM-1に対して厳密に特異的であることが示 された。
[0185] 〔実施例 5〕HM- 1および HYIの SPR解析
SPR解析により、精製 HM-1および HYIの結合特異性および動力学的パラメータを 決定した(図 4)。 Biacoreセンサーグラムから、固定化 nmAb- KTと HM-1または HYIと の相互作用の程度が示された。 SPR解析力 得られた動力学的データにより、 HM-1 力 ¾mAb- KTに対して強!、親和性を示すのに対して、 HYIは nmAb-KTに対する結合 を示さないことが明らかになった。 k および k ならびに Kの計算値を表 4に示す。 HM on off d
-1の K値は 5.48 X 10— 9 Μ— 1である。従って、この場合もやはり、 nmb-KTは HM-1に対 d
する強 、反応性を示すが、 HYIに対する反応性は示さな 、と結論づけることができる
[0186] SPR解析によって測定した HM-1および HYIに対する nmAb-KTの結合の動力学的 ノ ラメータを表 4に示す。
[0187] [表 4] 0Π off κά 検体
(X 105M-1s- (X κτ 1) (χ 10"9Μ) 謹- 1 3.3 1.81 5.48
HYI ND ND ND
[0188] HM-1および HYIの動力学的定数は、 BIAcoreバイオセンサーを用いて測定した: k 、結合速度定数; k 、解離速度定数; K、K = k /k として算出。 ND、シグナルは検 n off d d off on
出されなかった。
[0189] 〔実施例 6〕nmAb-KTのペプチド解析
酵母増殖阻害アツセィにより、 nmAb-KTのペプチド解析を行った。 12の合成 HM-1 ペプチドのうち、 P1が HM-1分子を網羅する最初のペプチド ^GDGYLIMCKN^配 列番号: 9)であり、 P12が最後のペプチド(78GFYIRSYRRVE88、配列番号: 20)である( 表 1)。酵母増殖に及ぼすペプチドの影響を図 5Aに示したが、この結果から、有意な 阻害を示す P6および隣接ペプチドを除 、て、 12のペプチドのほとんどすべてが HM- 1に及ぼす nmAb- KTの阻害効果を妨げな!/、ことが示された。ペプチドを nmAb-KTに 添加することにより、 HM-1のキラートキシン活性がある程度回復したことから(図 5B) 、ペプチド P6 (33NVHWMVTGGST43、配列番号: 14)、 P7 (44DGKQGCATIWEGS56、 配列番号: 15)、および P9 (44DGKQGCATIWEGSGCV59、配列番号: 17)力 ¾mAb- K Tと反応すると考えられる。一般に、モノクローナル抗体が同じタンパク質中の 3つの 異なるペプチドに結合することは異例である。したがって、 nmAb- KTの特異的結合ェ ピトープを同定するため、 P6、 P7、および P9の位置において重複配列を示す新たな デカペプチド(39TGGSTDGKQG48、配列番号: 2)を合成した。
[0190] HYIにおいて HM-Iの同じ位置に相当する HYIナノペプチド(39TGESNGQQG47、配 列番号: 4)もまた、対照として合成した(Komiyama, T., Ohta, T., Furuichi, Y., Ohta, Y., and Tsukada, Y. (199b; Structure and activity of HYI killer toxin from Hansenul a saturnus. Biol. Pharm. Bull. 18, 1057-1059.)。同じ条件下において、 HM- 1デカぺ プチド (39TGGSTDGKQG48、配列番号: 2)の添カ卩により nmAb- KTの中和活性が減少 し、このことから、ペプチドによって nmAb- KTの HM-1への結合が妨害されて、遊離の HM-1分子が酵母細胞を死滅させることが示唆される(図 5C)。一方、 HYIナノべプチ ド(39TGESNGQQG47、配列番号: 4)は nmAb-KTの HM-1中和活性に影響しなかった 。これらの結果から、 nmAb- KTカ^9 TGGSTDGKQG48 (配列番号: 2)の位置において HM-1に特異的に結合し、 HM-1のキラートキシン活性を中和することが強く示唆され
[0191] 〔実施例 7〕nmAb- KTのェピトープの同定
HM-1分子内の nmAb-KTのェピトープを調べるため、ドットブロット解析により、 HYI ナノペプチドを陰性対照として使用して、 12の HM-1ペプチドまたは HM-1デカぺプ チドに対する nmAb-KTの結合特異性を測定した(図 6)。図 6Aに示すように、試験し た 12のペプチドのうち、ペプチド P6および P7が nmAb- KTに対して強!、結合を示した のに対して、 P9は弱い結合を示した。ペプチド P6および P7を網羅する HM-1デカぺプ チドを用いたドットプロット解析は、すべてのうち最も強い結合を示したが、同じ領域 のアミノ酸配列に相当する HYIナノペプチドは nmAb-KTに対する結合を示さなかった (図 6B)。これらの結果から、この場合もやはり、 nmAb- KTのェピトープが HM-1デカ ペプチド39 TGGSTDGKQG48 (配列番号: 2)内に位置することが示唆された。
産業上の利用可能性
[0192] キラートキシンは、酵母および菌類の間での増殖競合を制御する興味深い抗菌性 タンパク質であることが判明している。キラー現象は 1963年に酵母において発見され 、それ以来、二本鎖 RNAウィルス様粒子の検出、キラー因子の作用機序、およびキラ 一因子遺伝子の発現における核遺伝子の関与ついて、酵母キラー因子に関する数 多くの分子生物学的および微生物学的研究がなされてきた。キラートキシン系による これらの研究は、抗真菌薬の開発およびタンパク質-タンパク質相互作用研究を含む 種々の目的に利用されている。
[0193] キラー活性を中和する抗体のェピトープを同定し特徴づけることは、キラートキシン の構造と機能との関連性を理解するため、ならびに農業および臨床分野においてキ ラータンパク質または抗体を利用するために必然的に重要である。
[0194] キラートキシンは、それ自体、抗真菌剤の候補物質であることが示された (Yamamot 0, T., Imai, M., Tachibana, K., and Mayumi, M. (1986) Application of monoclonal an tibodies to the isolation and characterization of a killer toxin secreted by Hansenula mrakii. FEBS Lett. 195, 253-257.)。し力し、キラートキシンのタンパク質性および免 疫原性の性質によって、病原性真菌の全身感染を治療するために直接適用すること は困難であった。また、キラートキシンの抗真菌活性が、病原体の増殖を効率的に処 理するのに十分強力であるのかどうか、または抗菌スペクトルが種々の病原株に対処
するのに十分広いかどうかは不明であった。
[0195] 本発明者らは、 HM-1のキラートキシン活性を中和し得る nmAb-KT、および、 HM-1 に結合するが HM-1のキラートキシン活性を中和しない他の種類のモノクローナル抗 体、 1F1および 4A2を作製した(Komiyama, T., Zhang, Q.Z., Miyamoto, M., Selvakum ar, D., and Furuichi, Y. (2004) Monoclonal antibodies and sandwich ELISA for quant itation of HM-1 killer toxin. Biol. Pharm. Bull. 27, 691-693.)。さらに、本発明者らの 以前の研究で、別のキラートキシン HYIが、構造およびグルカン合成酵素阻害活性 の点で HM-1に非常に類似して 、るにもかかわらず、 HM-1に対する nmAb-KTによつ て中和されないことを示した。
[0196] 本発明者らは、グルカン合成酵素阻害に関与する HM-の活性部位および nmAb-K Tが結合するェピトープ部位を特徴づけることに成功した。
本研究では、 nmAb- KTを IgGl( K )抗体であると特徴づけ、またナノグラム以下の微 量の HM-1を定量できるように、 nmAb-KTを用いて新たなサンドイッチ ELISA法を作 製した。次に、 HM-1のグルカン合成酵素阻害活性およびキラー活性を阻害する(中 和する) nmAb- KTによって認識される HM-1のェピトープを特徴づけた。合成べプチ ドスキャン解析から、 nmAb- KTのェピトープが HM- 1デカペプチド39 TGGSTDGKQG48 (配列番号: 2)内に位置することが認められ、これが HM-1キラー機能の活性部位の 一部である可能性があることが示された。これと一致して、 nmAb- KTによって中和さ れない HYIは、相当する領域に、 HM-1と約 50%の部分的相同性し力示さない、異なる アミノ酸配列39 TGESNGQQG47 (配列番号: 4)を含むことが判明した。 HYIは、 HM-1と の全体的な相同性は 87%と!、う高さであるにもかかわらず、 39TGESNGQQG47 (配列番 号: 4)領域でのみ HM-1と相同でないことは注目に値する。 SPR解析から、 nmAb-KT は HM- 1と Kd = 5.48 X 10— 9 M—1という高い親和性で結合する力 HYIとは結合しないこ とが証明された。一方、初めに HM-1に対して作製したモノクローナル抗体、 1F1およ び 4A2は、ドットブロット解析によって示されるように HM-1および HYIの両方に結合し( 図 6Aおよび B)、 HM-1および HYIは、 87%という高いアミノ酸配列相同性によって同じ 3D構造を有することが示唆された。 nmAb-KTカ 9 TGGSTDGKQG48 (配列番号: 2)で HM-1のみに結合しキラー活性を中和すると 、う事実から、同じ領域の39 TGESNGQQ
G47 (配列番号: 4)を認識する HYI抗体は、 nmAb- KTのように HYIのキラートキシン活 性およびグルカン合成酵素阻害活性を中和することが示唆された。このような抗体は 、HYIと類似の活性を有する抗イディォタイプ抗体を作製するための抗ィディオタイブ 免疫に用いることが可能である。
[0197] また本発明者らは、イディォタイプワクチン接種にぉ 、て nmAb- KTを使用して、組 換え DNA技術またはファージディスプレイ技術により、 HM-1キラートキシンの内部像 を模倣した抗イディォタイプ抗体を実際に作製した。本発明者らは、臨床的に重要な 種々の病原体に対する強力なキラートキシン真菌活性を示す ScFv抗イディォタイプ 抗体の取得に成功した。
[0198] 本実施例において、可溶性ペプチドを用いることにより、 nmAb- KTのェピトープを 決定することができた。 HM-1と HYIとの相同性を考慮して、 nmAb- KTの最終的ェピト ープが示唆された。 HM- 1デカペプチド中のアミノ酸39 TG4°および47 QG48は、 HYIと相 同である(表 1)。従って、 nmAb- KTの最終的ェピトープは41 GSTDGK46 (配列番号: 21 )の位置であると結論づけることが可能である。
[0199] ペプチド結合アツセィから、 nmAb- KT^HM-lデカペプチドと最も強く反応するが、 HYIナノペプチドとは反応しないことが明らかになった。これらの結果は、 HM-1デカ ペプチドが HM-1のキラートキシン活性を発現する活性部位の 1つであることを強く示 唆するものである。本実施例で評価した nmAb- KTのェピトープのアミノ酸配列は、 H M-1のァスパラギン酸- 44およびリジン- 46が HM-1のキラートキシン活性に重要な 2つ の必須なアミノ酸であることが示唆された。 HYI配列のこの位置にこれら 2つのアミノ酸 が存在しな 、ことは、 HYIが nmAb- KTに結合できな 、ことの根拠の説明になると考え られる。
[0200] 非常に有用な抗体を理解し設計するためには、ェピトープの同定といった基本レべ ルで抗体を特徴づけることが必要である。本研究で得られ記載した実験結果は、臨 床応用に関連した本抗体のさらなる研究をサポートするものである。
Claims
請求の範囲
[I] 以下の(a)および Zまたは (b)の活性を有するキラートキシン様タンパク質に対する 抗体であって、該活性を阻害する機能を有することを特徴とする抗体。
(a) グルカン合成酵素を有する真菌に対する抗菌活性
(b)真菌の βグルカン合成酵素を阻害する活性
[2] モノクローナル抗体である、請求項 1に記載の抗体。
[3] 前記キラートキシン様タンパク質が酵母 Williopsis saturnus属由来のタンパク質であ る、請求項 1または 2に記載の抗体。
[4] 前記キラートキシン様タンパク質カ¾\1-1である、請求項 3に記載の抗体。
[5] 配列番号: 1で示される HM-1タンパク質の 39位〜 48位内にェピトープを有すること を特徴とする、請求項 4に記載の抗体。
[6] 配列番号: 2に記載のペプチドと反応させることにより前記機能が低下する、請求項
3〜5の!ヽずれかに記載の抗体。
[7] 配列番号: 5〜8のいずれかに記載のペプチドと結合親和性を有する、請求項 3〜
5の!、ずれかに記載の抗体。
[8] 3.0xl07M— 1以上の親和定数 (Ka)を有する、請求項 7に記載の抗体。
[9] 配列番号: 5〜8のいずれかに記載のペプチドと結合し、該ペプチドが有する βグ ルカン合成酵素阻害活性を抑制し得る抗体である、請求項 7または 8に記載の抗体。
[10] 前記キラートキシン様タンパク質カ¾丫1である、請求項 3に記載の抗体。
[I I] 配列番号: 3で示される ΗΥΙタンパク質の 39位〜 47位内にェピトープを有することを 特徴とする、請求項 10に記載の抗体。
[12] 配列番号: 4に記載のペプチドと反応させることにより前記機能が低下する、請求項
10または 11に記載の抗体。
[13] 以下の (a)または (b)の抗体を有効成分として含む、抗イディォタイプ抗体作製用 抗原。
(a) nmAb-KTと称するモノクローナル抗体
(b)請求項 1〜12のいずれかに記載の抗体
[14] 前記抗ィディオタイブ抗体が、 βグルカン合成酵素阻害活性および Ζまたは抗真
菌活性を有することを特徴とする抗体である、請求項 13に記載の抗イディォタイプ抗 体作製用抗原。
[15] 以下の(a)または (b)の抗体を抗原として用いることを特徴とする、 |8グルカン合成 酵素阻害活性および Zまたは抗真菌活性を有する抗体の作製方法。
(a) nmAb-KTと称するモノクローナル抗体
(b)請求項 1〜12のいずれかに記載の抗体
[16] 以下の (a)または (b)の抗体を免疫原として抗体を作製する工程、を含む抗真菌剤 の製造方法。
(a) nmAb-KTと称するモノクローナル抗体
(b)請求項 1〜12のいずれかに記載の抗体
[17] HM-1タンパク質の部分断片ポリペプチドであって、配列番号: 1に記載の HM-1タ ンパク質において 39位〜 48位のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
[18] HYIタンパク質の部分断片ポリペプチドであって、配列番号: 3に記載の HYIタンパ ク質において 39位〜 47位のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
[19] 請求項 17または 18に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、中和抗体を 誘導し得る免疫原組成物。
[20] 前記中和抗体が βグルカン合成酵素阻害活性を阻害する機能を有することを特徴 とする、請求項 19に記載の免疫原組成物。
[21] 請求項 19または 20に記載の免疫原組成物を抗原として用いることを特徴とする、 Η
M-1タンパク質の中和抗体の作製方法。
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