CN111732661A

CN111732661A - 抗h5n1病毒入胞抗体ptd-7b及其应用

Info

Publication number: CN111732661A
Application number: CN202010529606.XA
Authority: CN
Inventors: 岳玉环; 张国利; 雍伟; 刘楚含; 高玉伟; 田园; 吴广谋; 王铁成; 李泽鸿; 刘雨玲; 卢士伟; 那漫; 孙赫; 邓欣
Original assignee: Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences
Current assignee: Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences
Priority date: 2020-06-11
Filing date: 2020-06-11
Publication date: 2020-10-02

Abstract

本发明公开了抗H5N1病毒入胞抗体PTD‑7B，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示；一种融合蛋白PTD‑7B，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示；融合蛋白PTD‑7B的制备方法：1）利用引物，以筛选的噬菌体抗体ScFv基因为模板，扩增M1‑ScFv的7B基因；2）扩增的7B基因连接入PET28a‑PTD‑GFP载体中，替换GFP基因片段，构建原核表达载体PET28a‑PTD‑7B；3）原核表达载体转化至大肠杆菌中表达、纯化；一种融合蛋白PTD‑7B在制备抗H5N1型人禽流感病毒药物的应用；结果显示胞内抗体具有中和H5N1病毒活性，效价为350TCID50。

Description

抗H5N1病毒入胞抗体PTD-7B及其应用

技术领域

本发明属生物工程及疾病防治领域，具体涉及全人源抗高致病性禽流感H5N1病毒入胞抗体PTD-7B的制备及其应用。

背景技术

禽流感病毒(AIV)为属于正黏病毒的RNA 病毒，其传播非常迅速。已知致病性非常多样化，从感染后无临床症状到几乎100％死亡率。所有禽流感病毒属于A 型并具有多种血清型：根据病毒表面存在的血凝素基因和神经氨酸酶基因，将血凝素(HA) 归类为16 个亚型，将神经氨酸酶(NA) 归类为9 个亚型，这潜在地允许A型流感病毒的144 种不同的组合。

在A型流感病毒的这些不同亚型中，已知H5 和H7 亚型对鸟致病，已知H1、H2和H3亚型导致人流感。一般已知禽流感病毒并不感染除禽和猪物种之外的任何动物。但是，在1997 年香港出现了感染禽流感病毒的患者并且已知H5N1 禽流感病毒导致患者的出现，这确认了人被禽流感病毒感染的可能性。人感染被认为由高致病性病毒引起，所述高致病性病毒通过当禽流感病毒和人流感病毒同时感染人时在它们之间的遗传组合而产生。此外，在韩国在2003 年12 月至2004 年3 月21 日之间出现的高致病性禽流感H5N1 的总共19例爆发，不仅影响了国内的家禽养殖产业，而且还因由对人感染的担忧引起的消费者信心缩减所致，影响了相关第二产业，并且导致了非常巨大的经济损失，包括1500 亿韩元的仅在用于根除高致病性禽流感的政府花费之中的直接花费，接着该爆发结束。近来，在泰国和越南也不断出现H5N1 感染的人病例并引起全世界的关注。

但是，禽流感病毒具有如此多种血清型并且血清型相互之间有弱交叉免疫性或无交叉免疫性。因此，很难通过其它血清型来防止感染。因为禽流感病毒非常容易发生突变，故没有防止禽流感的有效疫苗。目前，最有效的防止方法是用抗菌剂洗涤，并用灭活的流感病毒疫苗或重组的禽痘病毒疫苗进行的胃肠外疫苗接种。然而，此类方法仅在禽流感爆发并检查病毒亚型后才使用。因此，对减少或防止禽流感的传播有限。

在病毒不断产生耐药性的情况下，新型抗体药物可能成为应对H5N1病毒引发潜在流感大流行的有效手段。目前针对人禽流感的治疗以使用抗病毒药物为主，当前批准的抗病毒药物包括两种离子通道抑制剂和两种神经氨酸酶抑制剂，但由于耐药相关位点突变等原因，流感病毒不断产生耐药。如果连续数年对重症及危重症患者超适应症使用抗病毒药物,以及将抗病毒药物作为预防性药物普遍使用,势必不能排除耐药增加的可能性、高风险以及由此导致的公共卫生安全严重后果。在此情况下，制备新型抗流感病毒药物非常必要。抗体对于严重流感的治疗非常有效，但异源抗体免疫原性强，临床应用易引发人体变态反应。随着基因工程技术的发展，基因工程抗体的发展非常迅速，其中单链抗体以其特异性高、分子量小，结构简单，较亲本抗体免疫原性低，在临床应用中能够最大减轻异种蛋白引起的变态反应的独特优势，吸引了众多科研工作者的目光，其制备技术已趋于成熟，特别是噬菌体展示技术更提高了抗体及抗体基因的筛选效率。因此，单链抗体对病毒感染性疾病的治疗将发挥重要的作用。

H5N1病毒最主要的中和抗体来自于表面糖蛋白血凝素（HA），所以HA成为以往主要研究靶标。然而H5N1病毒具有高度变异性，根据分子进化树分析预测结果显示H5N1病毒HA基因已演变成至少10种不同抗原性特征的变异分支，不同分支之间的免疫交叉反应较弱。鉴于病毒变异的影响，基于保守抗原组分的抗体能够对不同亚型禽流感病毒产生抗病毒作用。流感病毒基质蛋白M1是禽流感病毒主要的结构蛋白，位于病毒囊膜内侧，通过与宿主细胞靶蛋白结合而参与和调控病毒的复制、转录、释放等过程。M1蛋白序列保守，因此针对M1的抗体可以通过与M1蛋白结合，抑制其活性，干扰各亚型禽流感病毒的复制、转录及释放，从而起到抗病毒的作用。

基于蛋白转导域的入胞抗体可以进入细胞，与胞内靶标抗原结合，发挥生物学活性。M1蛋白抗体能够对各种亚型禽流感病毒产生抗病毒活性，但其位于病毒囊膜内侧，抗体需要进入感染细胞才能发挥作用。蛋白转导域（Protein transduction domain, PTD）是能介导蛋白跨过细胞膜的小肽段，能够携带大分子有效通过生物膜进入细胞。PTD介导的蛋白转运不依赖于受体、通道、能量及胞吞作用，可以直接作用于所有类型细胞的脂质双分子层完成跨膜运动，而且其跨膜功能不具有物种特异性。自PTD被识别并鉴定以来，已经有数百种化合物和蛋白质被成功转导进入不同的细胞，并表现出了相应的生物活性。在已发现的PTD中，人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）TAT蛋白PTD是研究最多、功能确切的PTD，TAT蛋白PTD能将与之连接的多肽、蛋白质及DNA 以一种浓度依赖的方式高效快速地导入细胞内，而细胞的正常结构和功能不受影响。尽管蛋白转导的机制目前尚在研究中，但其可以直接将具有治疗作用的生物大分子送入细胞发挥生物学效应这一特性为疾病的生物治疗提供了新的思路，因而在医学研究领域受到广泛关注。1997 年，Vives等发现，TAT的PTD是位于47 ～57 位的11个氨基酸（YGRKKRRQRRR），是一个富含碱性氨基酸的多肽片段。

发明内容

本发明目的是提供全人源抗高致病性禽流感H5N1病毒入胞抗体PTD-7B的制备及其应用。

融合蛋白基因PTD- 7B，它是由突变的TAT转膜肽PTD基因和抗H5N1病毒M1蛋白的全人源单链抗体7B连接制得。

所述的融合蛋白基因PTD-7B，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示。

一种融合蛋白PTD-7B，它是由所述的融合蛋白基因PTD- 7B表达的蛋白；

所述的一种融合蛋白PTD-7B，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示。

融合蛋白PTD-7B的制备方法，它包括以下步骤：

1）利用引物：

5`-GTGAATTCATAATGAAATACCTATTGCCT-3`；其碱基序列如序列表SEQ ID NO.7所示。

5`-GCAAGCTTCTATGCGGCCCCATTCAG-3`；其碱基序列如序列表SEQ ID NO.8所示。

以筛选的噬菌体抗体ScFv基因为模板，扩增7B基因；

2）扩增的抗M1- 单链抗体7B基因连接入PET28a-PTD-GFP载体中，替代GFP基因，构建原核表达载体PET28a-PTD-7B；

3）原核表达载体中，转化至大肠杆菌中表达、纯化。

一种融合蛋白PTD-7B在制备抗H5N1型人禽流感病毒药物的应用。

本发明提供了融合蛋白基因PTD-7B，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示；一种融合蛋白PTD-7B，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示；融合蛋白PTD-7B的制备方法，它包括以下步骤：1）利用引物： 5`-GTGAATTCATAATGAAATACCTATTGCCT-3`； 5`-GCAAGCTTCTATGCGGCCCCATTCAG-3`以筛选的噬菌体抗体ScFv基因为模板，扩增7B基因；2）扩增的7B基因连接入PET28a-PTD-GFP载体中，替换GFP基因，构建原核表达载体PET28a-PTD-7B；3）原核表达载体转化至大肠杆菌中表达、纯化；一种融合蛋白PTD-7B在制备抗H5N1型人禽流感病毒药物的应用；结果显示胞内抗体具有中和H5N1病毒活性，PTD-7B中和H5N1病毒的效价为350TCID50；本发明选择人高致病性禽流感病毒H5N1保守序列M1蛋白为靶标抗原，利用噬菌体抗体库筛选出全人源抗M1蛋白的高亲和力单链抗体，将其基因与TAT蛋白PTD基因连接，表达融合蛋白PTD-7B，制备出抗人禽流感病毒的入胞抗体，为人高致病性禽流感的治疗提供新的途径；鉴于TAT PTD的生物转导特性，将该片段进行了疏水突变，将其中第二位氨基酸Gly突变为His后，并与抗M1 的ScFv融合表达，该肽段可将抗M1 蛋白的ScFv带入病毒感染细胞，靶向作用于胞内的M1蛋白，阻止其发挥生物功能，抑制流感病毒的装配和释放，从而起到抗病毒的作用。

附图说明

图1 M1蛋白表达质粒pET-SUMO-M1 PCR鉴定结果；M：DNA Marker；1:H5N1 cDNA为模板，以引物P1、P2扩增M1基因；2：以pET-SUMO-M1质粒为模板PCR扩增鉴定；

图2 PET-SUMO-M1蛋白表达工程菌在诱导后的表达结果；M：蛋白质Marker；1：阴性对照；2：诱导菌体超声沉淀；3：诱导菌体超声上清；4：诱导全菌；

图3 纯化后的M1蛋白；M:Marker;1:SUMO酶切并纯化的M1蛋白质样品；

图4 10株抗M1蛋白阳性噬菌体抗体株的PCR鉴定结果；

图5 纯化后的M1-scFv；M:Marker;1:10%-55%饱和度硫酸铵沉淀样品;2:流穿3:纯化后样品；

图6 重组表达质粒pET-28a-PTD-M1 ScFv的诱导表达结果；M：蛋白分子量 Marker；1:阴性对照；2:重组表达质粒pET-28a-PTD-7B诱导; 3: pET-28a-PTD-3F诱导

图7 纯化的scFv；M:Marker；1: PTD -scFv表达菌诱导超声上清；2: 纯化的PTD-7B;3:纯化的PTD -3F。

具体实施方式

实施例1 H5N1病毒M1蛋白重组表达质粒pET-SUMO-M1的构建、表达及M1蛋白的纯化

设计并合成M1的引物P1、P2：

P1：5’-atgagtcttctaaccgaggtc-3’；其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

P2: 5’-CCggaattcttaCttgaatcgctgcatctgcact-3’；其碱基序列如序列表SEQID NO.2所示。

以H5N1 cDNA为模板PCR扩增M1蛋白基因，并克隆入PET-SUMO载体中，构建质粒pET-SUMO-M1，然后转入T-shot感受态细胞，含卡那霉素抗性的琼脂平板进行初步筛选。挑选单菌落于LB液体培养基中培养；用质粒回收试剂盒提取质粒并且PCR鉴定，产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，获得750 bp左右的条带，大小与插入的目的基因相符，并进行序列的测定，证明目的片段正确插入载体中，成功构建了重组质粒pET-SUMO-M1（见图1）；

将重组质粒pET-SUMO-M1转化表达菌大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达后，SDS-PAGE结果显示：重组蛋白SUMO-M1在40KD左右处有一明显表达带，大小与理论值相符，超声后目的蛋白主要在超声上清中，证明目的蛋白以可溶形式表达（见图2）；

M1蛋白的纯化：诱导表达菌体超声裂解后，取其上清，以20-45% 饱和硫酸铵分步沉淀，沉淀以PB(pH 7.0)重悬后过离子交换层析（SP FF），以含0.5M Nacl的PB线性洗脱，收集目的蛋白洗脱峰，目的蛋白收集峰进行Cu²⁺金属螯合层析，缓冲系统为20mM Tris·cl+0.5MNacl(pH 8.0)，分别以50mM、150mM咪唑洗脱，目的蛋白在150 mM咪唑洗脱峰中。将150 mM咪唑洗脱液稀释至咪唑浓度为20 mM，按100:1加入SUMO蛋白酶，30℃酶切2h。酶切产物再次进行Cu²⁺金属螯合层析，平衡液为20mM Tris·cl (pH 8.0) +20mM咪唑，流川峰以SP FF阳离子层析浓缩，得到纯度在95%以上的M1蛋白，满足噬菌体抗体库筛选的需要（见图3）。

实施例2 噬菌体单链抗体库的筛选

将冻存的Tomlinson I库和J库中菌液全部接入到200 mL 2×TY培养基中（含100 µg/mL Amp和1%葡萄糖），37℃振荡培养到OD600值约为0.4，从培养液中取出50 mL菌液，加入2×10¹¹辅助噬菌体KM13，37℃静置水浴30 min，4℃，3000×g离心10 min，沉淀用50 mL 2×TY培养基（含100 µg/mL Amp，50 µg/mL Kan和0.1%葡萄糖）重悬，30℃振荡培养过夜。将过夜的产物4℃，3500×g离心30 min，收集上清40 mL加入10 mL冰冷的PEG/NaCl溶液（终浓度为20% PEG-6000，2.5mol/L NaCl），混匀后冰上放置1 h以上，4℃，3500×g离心30 min弃去PEG/NaCl溶液，沉淀用2 mL PBS重悬，11600×g，4℃，离心10 min，转移上清到无菌的离心管中，放在4℃保存（或加入终浓度为15%甘油，保存于-70℃）；用于抗体库筛选同时进行噬菌体滴度测定。

实施例3 抗M1-scFv的筛选

以纯化的M1蛋白为抗原包被于96孔酶标板上，4℃过夜。次日弃上清，用2%的Milk-PBS37℃封闭2h，加入制备的次级噬菌体抗体库，室温下剧烈晃动孵育60min，静置60min后弃去液体，用含0.1%Twenn-20的PBS洗涤10次，洗涤后将每孔中残留的液体轻轻拍干，每孔加入50µL洗脱液（5mg/mL的胰酶-PBS），室温下剧烈晃动10min，洗脱噬菌体，收集4℃保存；

用洗脱下的噬菌体侵染E.coli TG1，并涂布于TYE平板上（含100µg/mL氨苄青霉素和1%的葡萄糖）37℃过夜培养。利用辅助噬菌体KM13扩增噬菌体库，通过PEG/NaCl回收噬菌体；重复以上过程3次，共4轮筛选；

筛选后的噬菌体侵染E.Coli HB2151，诱导表达后，利用ELISA鉴定，置酶标仪测定OD值（波长为490nm），每个样品做双孔测定，取OD平均值；阳性克隆菌株确定标准为：OD值为阴性对照的3倍以上；

按照Tomlinson I+J试剂盒上的pIT-2载体的基因序列，合成两条特异性PCR引物扩增ScFv全基因片段；

LMB3: 5’—CAG GAA ACA GCT ATG AC—3’；其碱基序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

pHEN: 5’ —CTA TGC GGC CCC ATT CA—3’；其碱基序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

扩增出930bp左右的片段，证明获得多株完整的单链抗体(图4)。

实施例4 M1-ScFv的表达及纯化

将ELISA阳性菌株转接于5mL 2×TY培养基（含100 µg/mL氨苄青霉素和1%的葡萄糖），37℃培养过夜。次日，转接200µL过夜培养物于2×TY培养基（含100 µg/mL氨苄青霉素和0.1%的葡萄糖），37℃培养至OD600至0.9（约4 h），再加入终浓度为1 mmol/L IPTG，30℃振荡培养过夜诱导；次日将诱导菌液4200rpm离心20 min，取上清，以10%-55%饱和硫酸铵分步沉淀，沉淀用30 mmol/L PB（pH7.2）重悬，在PBS中透析过夜，透析样品进行rProtein-A FF亲和层析，洗脱样品用PBS透析过夜，12%SDS-PAGE分析显示目的蛋白大小约为31000 Da，纯化后的scFv纯度满足进行抗病毒试验的要求（图5）。

实施例5 PTD-M1 ScFv的构建、表达及纯化

设计合成2条ScFv引物：分别引入EcoRⅠ、HindⅢ 酶切位点，提取有生物学活性的M1-ScFv菌株质粒7B，以此为模板进行PCR。

P5：5`-GTGAATTCATAATGAAATACCTATTGCCT-3`；其碱基序列如序列表SEQ ID NO.7所示。

P6：5`-GCAAGCTTCTATGCGGCCCCATTCAG-3`；其碱基序列如序列表SEQ ID NO.8所示。

采用凝胶电泳回收上述PCR反应的扩增产物，分别用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切PCR扩增回收产物及载体pET28a-PTD-GFP，其中的PTD为His突变体，T4连接酶连接PCR产物及载体片段，转化感受态大肠杆菌DH5α，PCR鉴定阳性克隆，提取PCR鉴定正确的重组质粒测序，结果表明：PTD-7B片段以正确的阅读框架克隆到表达载体pET-28a中。

将构建的PET28a-PTD-7B氯化钙法转化到BL21(DE3)中，挑取单菌落，接种到LB液体培养基中振荡培养至菌液OD600≈0.5以上，加IPTG诱导表达。收集诱导菌体，进行12%SDS-PAGE检测，以未诱导工程菌作为阴性对照，结果显示，在约30KDa处出现一条明显表达带，与融合蛋白预期大小完全一致（图6）。

PTD-7B的纯化，诱导表达菌体超声裂解后，取其上清，过Cu²⁺金属螯合层析，缓冲系统为PBS(pH7.2)，分别以20mM、200mM咪唑洗脱，目的蛋白在200 mM咪唑洗脱峰中。200 mM咪唑洗脱液进行亲和层析（rProteinA FF）,洗脱样品以PBS透析，即获得纯化的PTD-7B（图7）。

实施例6 7B及PTD-7B的生物活性检测

将消化后的MDCK细胞铺96孔细胞培养板(3×10⁴个细胞/孔)，待细胞长成单层吸弃培养基，以DMEM洗细胞3次，每孔加入200TCID50 H5N1 攻毒(阴性对照孔加入PBS),37℃孵育3.5h，弃细胞外液，PBS洗细胞2次，分别加入纯化的7B以及PTD-7B（10.8μg/孔,对照加PBS），37℃作用1.5h ，吸弃细胞外液，每孔加入DMEM(含2%FBS)，37℃过夜培养。次日，以过夜培养物上清做血凝试验。

血凝试验：反应板内加入培养上清，50μL/孔，每个样品做复孔，再向每孔中加入0.85%鸡红细胞悬液50μL/孔，室温放置30min，将反应板直立观察结果。

结果显示胞内抗体PTD-7B中和H5N1病毒的活性较单纯7B高，PTD-7B中和H5N1病毒的效价为350TCID50，7B中和H5N1病毒的效价为150TCID50（见表1）。

表1 血凝试验结果表

*H5N1的TCID50为10^-4.5/0.1mL

实施例7 PTD突变对转导效率的影响

1）人工合成上游引物含有TAT的PTD多肽11个氨基酸基因序列及GFP部分基因，如下：

Ptat1:5’-CCATGGGCTATGGTCGTAAAAAACGTCAGCGTCGTCGTGAATTC-3’；其碱基序列如序列表SEQ ID NO.9所示。

Ptat2: 5’-GCGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTC-3’；其碱基序列如序列表SEQ IDNO.10所示。

在此基础上合成PTD第二位突变为组氨酸的引物：

Ptat3:5’-CCATGGGCTATCATCGTAAAAAA-3’；其碱基序列如序列表SEQ ID NO.11所示。

上游引物5’均引入NcoⅠ酶切位点，3’有EcoR I位点，下游引物5’引入SalⅠ位点，与其紧邻的为终止密码子。

2）以本室保存质粒pEGFP-N1为模板利用Ptat1和Ptat2进行扩增，获得PTD-GFP片段；利用Ptat3和Ptat2进行扩增，获得突变mPTD-GFP片段。

3）用NcoⅠ和SalⅠ双酶切PTD-GFP和mPTD-GFP片段及pET-28(a)，分别进行连接、转化，测序正确的质粒转化至E.coilBL21进行诱导并纯化。

4）PTD-GFP和mPTD-GFP蛋白的纯化

诱导表达菌超声破碎，上清液进行20-45%饱和硫酸铵分步沉淀，然后依次利用Phenyl-HP疏水层析、Sephadex G25脱盐、Q强阴离子交换层析柱，纯化蛋白峰并收集。

5）二者转导效应的比较

含10%血清1640培养Hela细胞在37℃，5% CO₂的培养箱内培养，消化后以5×10³个细胞的量接种96孔板，24h后添加PTD-GFP融合蛋白。

纯化的PTD-GFP和mPTD-GFP以无血清1640稀释蛋白溶液，设定三个初始浓度380μg/mL、190μg/mL、126.67μg/mL，分别倍比稀释每个浓度，共17个不同浓度，每个浓度同时做3个复孔，以无血清1640作为阴性对照。培养24h后， 37℃生理盐水洗去96孔板中残余的蛋白液，细胞板中加入200μL/孔细胞裂解液，作用20min后3000×g，离心30min，上清转移至96孔黑色微孔板。在激发光485nm发射光533nm的条件下，利用多功能酶标仪读取荧光强度，结果mPTD-GFP的转运效率比PTD-GFP高2³~2⁴。

序列表

<110> 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所

<120> 抗H5N1病毒入胞抗体PTD-7B及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

atgagtcttc taaccgaggt c 21

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

ccggaattct tacttgaatc gctgcatctg cact 34

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

caggaaacag ctatgac 17

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

ctatgcggcc ccattca 17

<210> 2

<211> 891

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

tatcatcgta aaaaacgtcg tcagcgtcgt cgtgaattca taatgaaata cctattgcct 60

acggcagccg ctggattgtt attactcgcg gcccagccgg ccatggccga ggtgcagctg 120

ttggagtctg ggggaggctt ggtacagcct ggggggtccc tgagactctc ctgtgcagcc 180

tctggattca cctttagcag ctatgccatg agctgggtcc gccaggctcc agggaagggg 240

ctggagtggg tctcagatat tagtaagtct ggttctaaga catcgtacgc agactccgtg 300

aagggccggt tcaccatctc cagagacaat tccaagaaca cgctgtatct gcaaatgaac 360

agcctgagag ccgaggacac ggccgtatat tactgtgcgg aaatgccttc tgtttttgac 420

tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcgagcggtg gaggcggttc aggcggaggt 480

ggcagcggcg gtggcgggtc gacggacatc cagatgaccc agtctccatc ctccctgtct 540

gcatctgtag gagacagagt caccatcact tgccgggcaa gtcagagcat tagcagctat 600

ttaaattggt atcagcagaa accagggaaa gcccctaagc tcctgatcta tgaggcatcc 660

aagttgcaaa gtggggtccc atcaaggttc agtggcagtg gatctgggac agatttcact 720

ctcaccatca gcagtctgca acctgaagat tttgcaactt actactgtca acagctgaat 780

catcggcctc agacgttcgg ccaagggacc aaggtggaaa tcaaacgggc ggccgcaggg 840

gccgcagaac aaaaactcat ctcagaagag gatctgaatg gggccgcata g 891

<210> 1

<211> 296

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

Tyr His Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Glu Phe Ile Met Lys

1 5 10 15

Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln

20 25 30

Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

35 40 45

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

50 55 60

Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

65 70 75 80

Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Ser Gly Gly Thr Phe Thr Asp Tyr

85 90 95

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

100 105 110

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

115 120 125

Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asn His Phe Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

130 135 140

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro

165 170 175

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg

180 185 190

Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

195 200 205

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ala Leu Gln Ser

210 215 220

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

225 230 235 240

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

245 250 255

Gln Gln Thr Lys Pro Gly Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

260 265 270

Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser

275 280 285

Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala

290 295

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

gtgaattcat aatgaaatac ctattgcct 29

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

gcaagcttct atgcggcccc attcag 26

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

ccatgggcta tggtcgtaaa aaacgtcagc gtcgtcgtga attc 44

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

gcgtcgactt acttgtacag ctcgtc 26

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

gcgtccatgg gctatcatcg taaaaaa 27

Claims

1. 抗H5N1病毒入胞抗体PTD- 7B基因，它是由突变的转膜肽PTD基因和抗H5N1病毒M1蛋白的单链抗体ScFv基因连接制得。

2. 权利要求1所述的抗H5N1病毒入胞抗体PTD-7B，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示。

3.一种抗H5N1病毒入胞抗体PTD-7B，它是由权利要求1所述的融合蛋白基因PTD-7B表达的蛋白。

4. 根据权利要求3所述的一种抗H5N1病毒入胞抗体PTD-7B，其特征在于：其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示。

5.抗H5N1病毒入胞抗体PTD-7B的制备方法，它包括以下步骤：

1）利用引物：

5` GTGAATTCATAATGAAATACCTATTGCCT 3`

5` GCAAGCTTCTATGCGGCCCCATTCAG 3`

以筛选的噬菌体抗体ScFv基因为模板，扩增抗M1蛋白的ScFv基因7B株；

2）扩增的7B基因连接入PET28a-PTD-GFP载体中，替换GFP基因片段，构建原核表达载体PET28a-PTD-7B；

3）原核表达载体中，转化至大肠杆菌中表达、纯化。

6.抗H5N1病毒入胞抗体PTD-7B在制备抗H5N1型人禽流感病毒药物的应用。