CN101497909B - 制备抗a型肉毒毒素免疫球蛋白抗体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗体的方法。该方法包括如下步骤：以A型肉毒毒素重组蛋白rAHc为免疫原，免疫动物，制备得到抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗体。本发明的制备抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗体的方法，去除了抗体中能引起副作用的Fc片段，得到马抗A型肉毒毒素免疫球蛋白F(ab′)₂抗体，将五免和六免得到的血清混合后，进一步纯化得到的半成品中，F(ab′)₂含量(纯度)可达80.2％，其中和抗体的滴度可达8000IU/ml，该抗体对A型肉毒毒素具有很好的特异性及灵敏性，其纯度和比活性高于传统类毒素免疫马匹制备的抗毒素，而且稳定性好、安全。

Description

制备抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗体的方法

技术领域

本发明涉及一种制备抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗体的方法。

背景技术

肉毒毒素(Botulinum Toxin，BoNT)是目前已知毒力最强的蛋白，1.0g肉毒毒素结晶物足以杀死100万人，由肉毒梭菌(Clostridium botulinum)在厌氧环境中产生的外毒素有7个血清型(A-G)，其中，A、B型肉毒毒素是致人中毒的常见型，E、F型偶尔引起食物中毒流行，C、D型则仅引起动物、禽类中毒，G型引起中毒的报道较少。临床观察表明，A型肉毒毒素相比其它型可引起更严重的中毒症状，并导致更高的死亡率。肉毒毒素中毒在人群中发病机率小，但其毒性大，致死率高，对公共卫生安全危害极大，必须引起人们的高度重视。由于产生肉毒毒素的肉毒梭菌在自然界广泛存在，并且其芽孢对外界环境具有较强的抵抗力，肉毒毒素中毒仍然是一个十分严重的公共卫生问题。近年，我国许多地区均发生数例肉毒中毒的疫情，甚至有群体肉毒毒素中毒事件发生。尤其是A型肉毒毒素还被数十个国家(如前苏联和伊拉克)用于制造生物武器，同时其也可被恐怖组织利用以制造生物恐怖。因此，进行肉毒毒素的防治研究无论是对国家生物安全，公共卫生安全，还是对人们群众的生命健康安全都具有重要的实际意义。

对于肉毒毒素中毒的预防，现有的疫苗为类毒素(PBT)疫苗，存在工艺复杂、副作用大、保护性不好、免疫周期长，未能获得FDA批准。我国目前也尚无有效的疫苗，因此肉毒毒素中毒治疗药物的研究就显得尤为重要。中毒治疗药物的研究主要集中在中和抗体和毒素拮抗剂，其中中和抗体是最有效的治疗药物。中和抗体可分为多克隆抗毒素和单克隆抗体。目前国际上基因工程中和单抗的研究均处于实验室阶段。因此，尽管多克隆抗毒素可能存在过敏、动物病毒污染等问题，但仍是目前肉毒毒素中毒治疗药物的最佳选择。目前，一些发达国家均有肉毒毒素抗毒素产品上市。我国兰州生物制品研究所研制的A、B、C、D、E、F 6个血清型的单价抗毒素也均已通过SFDA认证上市。然而世界各国肉毒毒素抗毒素的储备严重不足，为了应对在泰国爆发的肉毒毒素中毒事件，分别从四个国家(美国、英国、加拿大和日本)紧急调集抗毒素才避免了中毒人员的死亡就说明了这个问题。

国际上和国内肉毒毒素抗毒素(抗肉毒毒素免疫球蛋白抗体)均是采用类毒素免疫动物而制备的。类毒素的一些表位，尤其对抗体识别与中和作用至关重要的表位可能在毒素灭活过程中发生改变，无论是作为免疫原或是抗原，类毒素与毒素之间都存在显著差异。同时，类毒素本身还存在过多的非中和表位，导致免疫产生的抗体虽然滴度可以很高，但有效成分中和抗体的比例较低，即比活性相对较低，抗毒素的中和活性受到影响，而衡量抗毒素药效的最重要指标为中和抗体的活性(比活性)。因此，一个理想的免疫原应该是保持其自身结构的最小的非毒性部分，能产生完全的免疫保护，同时缺乏整个毒素的生物学特性。肉毒毒素保护性抗原为重链受体结合区(Hc)，它包含保护性抗原基本决定簇(PPADs)，在动物体内能够诱发中和抗体，对于毒素的攻击具有保护效果。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备A型肉毒毒素免疫原的方法。

本发明所提供的制备A型肉毒毒素免疫原的方法，包括如下步骤：

1)将序列表中序列1所示基因转入宿主菌中，得到含有所述基因的重组菌；

2)发酵步骤1)得到的重组菌，得到含有A型肉毒毒素免疫原的产物；

3)将步骤2)得到的产物进行阳离子交换层析，得到一次纯化产物；

4)将步骤3)得到的一次纯化产物进行阴离子交换层析，得到二次纯化产物；

5)将步骤4)得到的二次纯化产物进行疏水层析，得到A型肉毒毒素免疫原。

其中，所述阳离子交换层析使用SP阳离子交换柱，所用的洗脱缓冲液为含300mMNaCl、pH值为7.4的20mM磷酸钠溶液。

所述阴离子交换层析中使用Q阴离子交换层析柱；所述疏水层析使用辛基HIC疏水层析柱，所用的洗脱缓冲液为含50mM NaCl的20mM磷酸钠溶液。

所述基因是通过重组表达载体pTIG-Trx-AHc转入所述宿主菌中的；

所述重组表达载体pTIG-Trx-AHc是通过将序列表中序列1所示基因插入原核表达载体pTIG-Trx的EcoR I和Xho I位点得到的；

所述原核表达载体pTIG-Trx是通过将序列表中序列2所示的硫氧还蛋白基因插入载体pET-22b(+)的Nde I和EcoR I位点得到的。

本发明的另一个目的是提供一种制备抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗体的方法。

本发明所提供的制备抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗体的方法，包括如下步骤：用上述方法制备得到的A型肉毒毒素免疫原免疫动物，制备得到抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗体。

所述方法还包括如下步骤：在所述免疫后，取动物免疫血清，用胃蛋白酶消化，得到切除副作用片段的抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗体。

所述方法中，在所述取动物免疫血清后，所述用胃蛋白酶消化前，还包括灭活所述血清的步骤。

所述方法中，在所述用胃蛋白酶消化后，还包括用硫酸铵沉淀所述切除副作用片段的抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗体的步骤。

所述方法中，在所述硫酸铵沉淀后，包括用DEAE阴离子交换剂进行纯化的步骤。

所述动物具体可为马。

本发明的制备A型肉毒毒素免疫原的方法制备得到的A型肉毒毒素免疫原不含组氨酸标签，纯度高，可达95％，其免疫效果好，可以实际应用于人的免疫治疗；实验证明，由该A型肉毒毒素免疫原免疫马，可以制备得到高滴度免疫血清，免疫6次后，其抗体滴度可达1∶745000，其中和抗体的滴度可达16000IU/ml；另外本发明制备方法操作简单、成本低廉。

本发明的制备抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗体的方法，去除了抗体中能引起副作用的Fc片段，得到马抗A型肉毒毒素免疫球蛋白F(ab′)₂抗体。实验证明，将五免和六免得到的血清混合后，进一步纯化得到的半成品中，F(ab′)₂含量(纯度)可达80.2％，其中和抗体的滴度可达8000IU/ml，该抗体对A型肉毒毒素具有很好的特异性及灵敏性，其纯度和比活性高于传统类毒素免疫马匹制备的抗毒素，而且稳定性好、安全。

基于以上，本发明的制备A型肉毒毒素免疫原的方法及制备抗A型肉毒毒素抗体的方法在预防和治疗A型肉毒毒素中毒领域会有广阔的应用前景。

附图说明

图1为rAHc在大肠杆菌BL21(DE3)表达及纯化的SDS-PAGE检测和Westernblot鉴定结果。

图2为重组蛋白rAHc免疫马后不同阶段的IgG抗体滴度。

图3为非还原蛋白电泳鉴定A型肉毒抗毒素免疫球蛋白F(ab′)₂。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。具体如《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)和《中华人民共和国药典》(国家药典委员会编，2005年三部，化学工业出版社)中所述。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

所用引物由上海英俊生物技术有限公司合成。

实施例1、A型肉毒毒素免疫原的制备

下述中，AHc表示基因，rAHc表示AHc基因编码的蛋白。

一、重组原核表达载体pTIG-Trx-AHc的构建

硫氧还蛋白(Trx)是参与新生蛋白肽链折叠的辅助蛋白，当重组蛋白rAHc与之共表达时(一条mRNA、二个阅读框，结果表达先翻译Trx，后翻译目的蛋白rAHc，并不融合，成为独立蛋白)，它可促进下游正在折叠的目的蛋白通过异构反应获得正确的折叠，另外，也能够增强胞内蛋白质的二硫键的形成，使表达产物不易形成包涵体，能够以可溶性形式表达，因此用下述方法构建含有Trx基因和AHc基因的原核表达载体：

1、重组载体pTIG-Trx的构建

首先，通过普通PCR方法克隆(以载体pET-32a(+)为模板)硫氧还蛋白基因序列(来源于Novagen公司的pET-32a(+)载体中的Trx基因序列，位于该载体的自5’端第366-692位碱基处，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2，编码109个氨基酸残基)，然后将获得的Trx基因序列连接入质粒载体pET-22b(+)(Novagen公司)的Nde I和EcoR I酶切位点之间，得到含有Trx基因的重组载体，命名为pTIG-Trx，多克隆位点的结构如下：

5’-NdeI-Trx-GCGGGATCCGG

AATTCGA…-SacI-SalI-Hind

RBS EcoR I

III-Not I-Xho I-3’

2、原核表达载体pTIG-Trx-AHc的获得

AHc基因序列如序列表中序列1所示，基因上游带有EcoR I识别位点、Trx基因的终止密码子TAA和AHc基因的起始密码子ATG，基因下游带有终止密码子TAA和Xho I识别位点，使后续菌表达产物不含有组氨酸标签。

将序列表中序列1所示AHc基因用EcoR I和Xho I双酶切，再用EcoR I和Xho I双酶切载体pTIG-Trx，连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序，测序结果表明得到了基因序列及插入位置均正确的AHc基因的重组原核表达载体，命名为pTIG-Trx-AHc。

二、AHc在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化与鉴定

1、AHc在大肠杆菌中的表达及表达产物的SDS-PAGE检测

将步骤一构建的AHc的原核表达载体pTIG-Trx-AHc转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(TIANGEN公司)，筛选阳性重组子，以转化有pTIG-Trx空载体的重组菌为阴性对照，然后按1∶100的比例将阳性重组菌接种至含100mg/mL氨苄青霉素的500mL LB液体培养基中，在37℃、250rpm下进行大量培养，培养至对数生长期(OD₆₀₀约为0.4-0.6)时加入化学诱导剂IPTG(Promega公司)至终浓度为0.2mmol/L，在28-30℃下继续诱导培养4小时。

培养结束后，离心收集菌体，重悬于20mM磷酸钠缓冲液中(pH 7.4)，超声打碎细胞，离心收集上清进行12％SDS-PAGE检测，结果显示经诱导表达的重组蛋白以可溶性方式表达，分子量约为50KD，与预期的分子量一致(图1B，泳道5)，而未诱导的菌株和诱导的空载体对照未出现该目的蛋白带，说明所表达的蛋白就是目的蛋白rAHc；再经薄层扫描分析，表达产物约占细菌可溶性总蛋白的25％，达到一个较高水平。

2、表达产物的纯化

步骤1所表达的重组蛋白rAHc没有标签，其PI＝9.1，采用如下三步纯化法分离重组蛋白rAHc。第一步采用SP阳离子交换柱纯化重组蛋白rAHc，获得初步纯化的产物；第二步采用Q阴离子交换柱吸附SP产物中杂蛋白，收集过柱液获得更高纯度重组蛋白rAHc；第三步采用苯基HIC疏水层析精制纯化，经洗脱后收集重组蛋白rAHc产物。

以上层析柱均购自法玛西亚公司(Pharmacia Biotech，Sweden)，并参照说明书对可溶性表达产物进行纯化。

第一步SP阳离子交换柱(SP-Sephadex ion exchange media)纯化方法为：先将细菌上清与经平衡液(20mM磷酸钠缓冲液，pH 7.4)平衡后的SP层析柱结合，然后用含300mM NaCl的平衡液洗脱层析柱收集洗脱液，得到一次纯化蛋白。

第二步Q阴离子交换层析柱(QAE-Sephadex ion exchange media)纯化方法为：首先用平衡液透析第一步产物，将透析后产物过经平衡液平衡后的Q层析柱，柱吸附大量的杂蛋白，收集流出液，为二次纯化蛋白。

第三步HIC疏水层析纯化方法为：使用辛基HIC疏水层析柱(介质为辛基琼脂糖凝胶(octyl sepharose)(Pharmacia Biotech，Sweden))，将第二步产物调盐浓度为2.6M NaCl，过用含2.6M NaCl的20mM磷酸钠缓冲液平衡后的层析柱，用含50mM NaCl的20mM磷酸钠缓冲液洗脱层析柱，收集洗脱液，得到精制纯化目的蛋白。

对上述各步纯化产物进行12％SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图1-A所示(泳道M为低分子量蛋白Marker，分子量范围25-116KD，泳道1为经第二步纯化后产物，泳道2为第三步纯化后产物，泳道3为第一步纯化后产物)，结果表明经过三步纯化后获得了高纯度的目的蛋白。

收集产物经PBS透析后，12％SDS-PAGE电泳，结果如图1B(泳道M为低分子量蛋白Marker，分子量范围25-116KD，泳道4为第三步纯化后产物经PBS透析脱盐后的产物，泳道5为表达载体pTIG-Trx-AHc重组BL21(DE3)诱导表达的细菌上清)，采用薄层扫描定量检测蛋白质纯度达95％以上。HLPC分析最后的产物纯度也大于95％，表明获得了高纯度的蛋白，可作为免疫原用于免疫马或作为人用候选疫苗。用BCA蛋白分析试剂盒(Sigma)测定蛋白含量，产量可达10mg/L，最终产物保存于-70℃或-20℃备用。

3、表达产物的鉴定

以马源抗BONT/A多抗(购自中国药品生物制品检定所)为一抗，以HRP标记兔抗马IgG(购自北京中杉金桥生物有限公司)为二抗，对空载体对照、诱导表达的超声上清及纯化的重组蛋白进行Western blot分析，结果显示诱导表达或经纯化的重组蛋白与马源抗BoNT/A多抗均能特异性结合，条带大小位置与电泳位置一致，分子量约为50KD，而空载体对照无此条带，见图1-C(泳道6为空载体pTIG-Trx转入BL21(DE3)细菌产生的上清，泳道7为第三步纯化后产物经PBS透析脱盐后的产物，泳道8为表达载体pTIG-Trx-AHc转入BL21(DE3)后诱导表达的细菌上清)，表明诱导表达或经纯化的重组蛋白即为目的蛋白rAHc。

实施例2、重组rAHc免疫原免疫马及马免疫血清ELISA抗体和中和抗体水平检测

将实施例1中重组蛋白rAHc在大肠杆菌中的表达与纯化的方案进行放大规模，大量纯化获得足量的重组抗原用作免疫原。

溶于PBS的重组蛋白rAHc与等体积的不完全弗氏佐剂(IFA，Sigma)乳化后免疫马，每匹马5ml，共5匹(经检疫符合生物制品要求的马匹)，采用皮下和肌肉多点免疫。第一和第二次重组蛋白剂量为3mg，第三和四次重组蛋白剂量为5mg，第五和第六次重组蛋白剂量为8mg，共6次免疫马(先四次，后再加强二次)，间隔二周免疫一次。免疫前、二至六次免疫后2周分离马血清，用ELISA法测定血清抗体(用酶联免疫板包被rAHc抗原，浓度为2μg/mL，用分离的免疫马血清为一抗，以HRP标记兔抗马IgG(购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.)为二抗)。

按终末稀释ELISA法测定免疫马血清中的特异性抗体滴度。以空对照组马血清为阴性对照(即N)，重组蛋白rAHc免疫组的OD₄₉₂值(即P)达到0.5以上，并且P/N≥2.1为阳性。每组的平均抗体滴度以每组单个血清样品的抗体滴度的几何平均数(GMT±SD)表示。实验设3次重复。ELISA检测结果：免疫马匹产生了高滴度的特异性抗体，免疫次数与抗体滴度成相关性，随着免疫次数的增加，抗体滴度也得到相应提高，免疫2次得到的马血清平均抗体效价约为1∶51200，免疫3次得到的马血清平均抗体效价约为1∶145000，免疫4次得到的马血清平均抗体效价为1∶344000，免疫5次得到的马血清平均抗体效价约为1∶487000，免疫6次得到的马血清平均抗体效价为1∶745000。而空对照组血清与免疫前相比始终为阴性，低于200(图2)。上述检测结果表明重组蛋白rAHc免疫马后可使其体内产生较高滴度的特异性抗体。

抗体体内中和活性及中和抗体效价：

用经典的体内中和实验测定了免疫马血清抗体的体内中和活性及中和抗体效价，方法为：将免疫组混合血清抗体起始1∶10稀释于磷酸钠缓冲液(50mM Na₂HPO₄)中，然后以2倍梯度依次稀释，与10 LD₅₀A型肉毒毒素(BoNT/A，A62，国际标准株，购自兰州生物制品研究所)混合并室温放置(一个LD₅₀定义为腹腔注射A型肉毒毒素16-22g小鼠死亡一半的毒素剂量)，每个梯度组4只鼠(16-22g)，每只注射500μl上述混合物，观察一周，记录统计存活率及时间。血清中中和抗体滴度以相对于标准抗毒素(A型肉毒抗毒素标准品购自中国药品生物制品检定所)的，并且以每毫升国际单位(IU/ml)报告。一个IU定义为中和10,000个LD₅₀(i.p.)的A型肉毒毒素的中和抗体(10⁴LD50/ml＝1IU/ml)。

结果表明，随着免疫次数的增加，中和抗体滴度也得到相应提高，重组蛋白rAHc四次免疫后血清含有10⁶LD50/ml或100IU/ml滴度的中和抗体，五次免疫后血清含有1000IU/ml滴度的中和抗体，六次免疫后血清含有16000IU/ml滴度的中和抗体，五和六次免疫后马血清可用于制备抗毒素F(ab′)2。

实验例3、制备马抗A型肉毒毒素免疫球蛋白F(ab′)2抗体

1)采集实施例2中五次和六次免疫马抗A型肉毒毒素血浆，用SD(有机溶剂/去污剂)灭活，SD灭活流程为：加入Triton X-100和TNBP溶液至终浓度分别为1％和0.3％，4度6小时后，加入0.074％的硅藻土，搅拌10分钟后压滤，收集血浆。

2)经SD灭活的血浆，1份血浆加2份注射水稀释，加入胃蛋白酶，加甲苯至终浓度为0.2％，用盐酸调PH至3.2后30℃消化75分钟。IgG经胃蛋白酶切割Fc段后为F(ab′)₂。

3)胃酶消化后的血浆进行硫酸铵一次沉淀：加15％固体硫酸铵，搅拌至完全溶解，调pH5.4，加温至58℃，维持温度30分钟，降温至45℃后，加入硅藻土至0.8％，搅拌均匀，压滤。收集滤液(免疫球蛋白F(ab′)₂抗体)，弃沉淀。

4)硫酸铵二次沉淀：上述滤液调pH7.2，加20％固体硫酸铵，搅拌至完全溶解，静置45分钟，加入硅藻土至0.8％，搅拌均匀，压滤，收集沉淀。

5)明矾吸附、过滤：收集的沉淀加2倍血浆量的注射水(水温35℃以下)溶解，加10％明矾液(明矾终浓度为0.8％)，调pH 7.8±0.1，搅拌60分钟，压滤，弃沉淀。

6)超滤脱铵：使用millipore超滤仪超滤，滤膜为50KD，加注射水超滤至硫酸铵浓度至0.1％以下即可，获得了纯化的A型肉毒抗毒素免疫球蛋白F(ab’)2抗体。

7)DEAE精制纯化F(ab′)₂：DEAE为弱酸性阴离子交换剂(DEAE-Sephadex ionexchange media，Pharmacia Biotech，Sweden，购自法玛西亚公司)，经NaOH将Cl^-型转变为OH^-型后，可吸附酸性蛋白。而上述纯化的马抗肉毒毒素免疫球蛋白F(ab′)₂抗体液中除F(ab′)₂外其余均属酸性蛋白，当溶液的pH在6.5时，酸性蛋白被DEAE吸附，而有效成分F(ab′)₂留在溶液中。因此经过超滤脱铵后的滤液，可通过DEAE柱(购自法玛西亚公司)层析再次纯化。首先用NaOH预处理DEAE，加入滤液，除去了杂蛋白，收集原液，得到精制纯化的马抗肉毒毒素免疫球蛋白F(ab′)₂抗体。

实验例4、抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗体的中和活性、稳定性检定及安全性评价

1)原液半成品配制、除菌过滤：向实施例3中制备得到的F(ab′)₂抗体液中加入NaCl(终浓度为0.75～0.95％)，加间甲酚(终浓度≤0.25％)，搅拌均匀，调节pH至6.0～7.0。采用0.22um除菌滤膜对原液除菌，获得的原液为高纯度的马抗A型肉毒毒素免疫球蛋白F(ab′)₂抗体即A型肉毒抗毒素，置2-8℃冷库保存。

2)A型肉毒抗毒素原液半成品的检定：按《中华人民共和国药典》(国家药典委员会编，2005年三部，化学工业出版社)所述方法和要求对A型肉毒抗毒素原液半成品进行一系列检定，结果：蛋白含量21.4g/L、F(ab′)₂含量(纯度)80.2％、NaCl含量：9.1g/L；硫酸铵含量0.19g/L、pH值6.34、间甲酚含量2.5％、类A含量0.12ug/ml、白蛋白合格、无菌合格、热源和异常毒性合格。

3)A型肉毒抗毒素原液半成品中和活性的检定：按实施例2中体内中和实验方法和《中华人民共和国药典》(国家药典委员会编，2005年三部，化学工业出版社)所述方法测定了A型肉毒抗毒素原液半成品中和活性，与标准抗毒素(A型肉毒抗毒素标准品来自中国药品生物制品检定所)对比。实验设3次重复。结果表明A型肉毒抗毒素原液半成品中和抗体效价为8000IU/ml。

4)A型肉毒抗毒素中和活性和F(ab′)₂稳定性检定：

A型肉毒抗毒素免疫球蛋白F(ab′)₂于4℃、25℃和37℃观察稳定性，实验设3次重复。实验证实A型肉毒抗毒素放置6个月以上中和效价不减，有很好的稳定性；并且非还原蛋白电泳(按《中华人民共和国药典》(国家药典委员会编，2005年三部，化学工业出版社)所述方法)检定表明A型肉毒抗毒素免疫球蛋白F(ab′)₂蛋白纯度浓度不变、结构稳定(图3)(泳道M为低分子量蛋白Marker，分子量范围18-116KD，泳道1为A型肉毒抗毒素免疫球蛋白F(ab′)₂在4℃放置6个月的样品，泳道2为A型肉毒抗毒素免疫球蛋白F(ab′)₂在25℃(室温)放置6个月的样品，泳道3为A型肉毒抗毒素免疫球蛋白F(ab′)₂在37℃放置6个月的样品)。

5)A型肉毒抗毒素安全性评价

急性毒性试验：进行了A型肉毒抗毒素单次静脉注射给予小鼠的毒性试验。本试验观察A型肉毒抗毒素在较大容量和浓度下，单次静脉注射给予小鼠所产生的急性中毒反应和死亡情况。A型肉毒抗毒素单次静脉注射给予小鼠，给药容量为20ml/kg，给药剂量为428mg/kg，对照组静脉注射等容量的生理盐水。每组均10只小鼠，雌雄各半，药后连续观察14天，检测指标包括临床观察、食量、体重和病理检查。结果显示，给药后4小时，除供试品组有一只动物在给药即刻出现明显安静状态，一分钟内恢复正常，其余动物均未见明显毒性反应；连续14天的观察期间，各组动物无死亡，未见其他异常表现；大体解剖观察，未见异常。结论：在本试验条件下，A型肉毒抗毒素单次静脉注射给予小鼠的最大给药量为428mg/kg。

安全药理试验：进行了A型肉毒抗毒素单次静脉注射给予小鼠和狗的安全药理试验。本试验观察了A型肉毒抗毒素对小鼠中枢神经系统，对狗呼吸和心血管系统的影响。方法：A型肉毒抗毒素单次静脉注射给予小鼠，共三项试验，每项试验40只小鼠，分别设A型肉毒抗毒素4、20和60mg/kg三个剂量组和一个生理盐水对照组，每组5雄5雌。A型肉毒抗毒素单次静脉注射给予狗的试验，设2、10、30mg/kg三个剂量组和一个生理盐水对照组，每组3雄3雌。实验设3次重复。结果：给药后，小鼠一般行为表现、姿势、步态等未见异常，各剂量组给药小鼠的自主活动次数、攀网能力及戊巴比妥钠阈下催眠引起的翻正反射消失数、入睡时间和睡眠持续时间与生理盐水对照组比较均无显著差异；狗单次静脉注射A型肉毒抗毒素后，各给药剂量组动物的心电图各参数值、呼吸频率和呼吸幅度未见与给药相关的毒理学改变；各给药剂量组动物血压指标(收缩压、舒张压、平均动脉压)与生理盐水对照组比较未见明显差异。结论：在本试验条件下，单次静脉注射A型肉毒抗毒素在4、20、60mg/kg范围内对小鼠中枢神经系统无明显影响，与戊巴比妥钠也无协同催眠作用。单次静脉注射A型肉毒抗毒素在2、10、30mg/kg范围内对狗呼吸和心血管系统无明显影响。

溶血试验：进行了A型肉毒抗毒素溶血试验。本试验采用体外试管法观察了A型肉毒抗毒素对兔红细胞溶血及凝集的影响。浓度为21.4mg/ml A型肉毒抗毒素按不同容量(0.1～0.5ml)加入已有不同容量(2.0～2.4ml)生理盐水和2.5ml的2％红细胞混悬液的玻璃试管中，同时以生理盐水和注射用水分别作为阴性和阳性对照品。实验设3次重复。结果显示：该浓度的A型肉毒抗毒素无溶血作用，不引起红细胞凝聚。生理盐水阴性对照品无溶血无凝聚，注射用水阳性对照品全部溶血。结论：浓度为21.4mg/ml A型肉毒抗毒素体外对兔红细胞无溶血作用，不引起红细胞凝聚。

以上的试验结果为A型肉毒抗毒素临床应用提供科学可靠的参考依据，表明A型肉毒抗毒素是安全性的。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所

<120>制备抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗体的方法

<130>CGGNARC92128

<160>2

<210>1

<211>1315

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gccggaattc taatggaata catcaagaac atcatcaata cctccatcct gaacctgcgt    60

tacgaatcca atcacctgat cgacctgtct cgttacgctt ccaaaatcaa catcggttct    120

aaagttaact tcgatccaat cgacaagaat cagatccagc tgttcaatct ggaatcttcc    180

aaaatcgaag ttatcctgaa gaatgctatc gtatacaact ctatgtacga aaacttctcc    240

acctccttct ggattcgtat cccaaaatac ttcaactcca tctctctgaa caatgaatac    300

accatcatca actgcatgga aaacaattct ggttggaaag tatctctgaa ctacggtgaa    360

atcatctgga ctctgcagga cactcaggaa atcaaacagc gtgttgtatt caaatactct    420

cagatgatca acatctctga ctacatcaat cgttggatct tcgttaccat caccaacaat    480

cgtctgaata actccaaaat ctacatcaac ggccgtctga tcgaccagaa accaatctcc    540

aatctgggta acatccacgc ttctaataac atcatgttca aactggacgg ttgccgtgac    600

actcaccgtt acatctggat caaatacttc aatctgttcg acaaagaact gaacgaaaaa    660

gaaatcaaag atctgtacga caaccagtcc aattctggta tcctgaaaga cttctggggt    720

gactacctgc agtacgacaa accatactac atgctgaatc tgtacgatcc aaacaaatac    780

gttgacgtca acaatgtagg tatccgtggt tacatgtacc tgaaaggtcc acgtggttct    840

gttatgacta ccaacatcta cctgaactct tccctgtacc gtggtaccaa attcatcatc    900

aagaaatacg cgtctggtaa caaggacaat atcgttcgta acaatgatcg tgtatacatc    960

aatgttgtag ttaagaacaa agaataccgt ctggctacca atgcttctca ggctggtgta    1020

gaaaaaatct tgtctgctct ggaaatccca gacgttggta atctgtctca ggtagttgta    1080

atgaaatcca agaacgacca gggtatcact aacaaatgca aaatgaatct gcaggacaac    1140

aatggtaacg atatcggttt catcggtttc caccagttca acaatatcgc taaactggtt    1200

gcttccaact ggtacaatcg tcagatcgaa cgttcctctc gtactctggg ttgctcttgg    1260

gagttcatcc cagttgatga cggttggggt gaacgtccac tgtaactcga gctag         1315

<210>2

<211>327

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

agcgataaaa ttattcacct gactgacgac agttttgaca cggatgtact caaagcggac    60

ggggcgatcc tcgtcgattt ctgggcagag tggtgcggtc cgtgcaaaat gatcgccccg    120

attctggatg aaatcgctga cgaatatcag ggcaaactgg ccgttgcaaa actgaacatc    180

gatcaaaacc ctggcactgc gccgaaatat ggcatccgtg gtatcccgac tctgctgctg    240

ttcaaaaacg gtgaagtggc ggcaaccaaa gtgggtgcac tgtctaaagg tcagttgaaa    300

gagttcctcg acgctaatct ggcggga                                        327

Claims (7)

1.一种制备A型肉毒毒素免疫原的方法，包括如下步骤：

1)将序列表中序列1所示基因转入宿主菌中，得到含有所述基因的重组菌；

2)发酵步骤1)得到的重组菌，得到含有A型肉毒毒素免疫原的产物；

3)将步骤2)得到的产物进行阳离子交换层析，得到一次纯化产物；所述阳离子交换层析使用SP阳离子交换柱，所用的洗脱缓冲液为含300mM NaCl、pH值为7.4的20mM磷酸钠溶液；

4)将步骤3)得到的一次纯化产物进行阴离子交换层析，得到二次纯化产物；所述阴离子交换层析中使用Q阴离子交换层析柱；

5)将步骤4)得到的二次纯化产物进行疏水层析，得到A型肉毒毒素免疫原；所述疏水层析使用辛基HIC疏水层析柱，所用的洗脱缓冲液为含50mM NaCl的20mM磷酸钠溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述基因是通过重组表达载体pTIG-Trx-AHc转入所述宿主菌中的；

所述重组表达载体pTIG-Trx-AHc是通过将序列表中序列1所示基因插入原核表达载体pTIG-Trx的多克隆位点得到的；

所述原核表达载体pTIG-Trx是通过将序列表中序列2所示的硫氧还蛋白基因插入载体pET-22b(+)的多克隆位点得到的。

3.一种制备抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗体的方法，包括如下步骤：用权利要求1或2所述方法制备A型肉毒毒素免疫原，得到A型肉毒毒素免疫原；将所述A型肉毒毒素免疫原免疫动物，制备得到抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗体；所述动物为马。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：在所述免疫后，取动物免疫血清，用胃蛋白酶消化，得到切除副作用片段的抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述取动物免疫血清后，所述用胃蛋白酶消化前，还包括灭活所述血清的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述用胃蛋白酶消化后，还包括用硫酸铵沉淀所述切除副作用片段的抗A型肉毒毒素免疫球蛋白抗体的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述硫酸铵沉淀后，包括用DEAE阴离子交换剂进行纯化的步骤。

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