JPS63297A - 遺伝子発現産物の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［＃７上の利用分野］ 本発明は、遺伝子発現産物中に混入する菌体由来のアル
ケンを除去するための精製法に関ブるものである。更に
詳しくは、組換えＤＮＡ技術等により得られる形質転換
体を用いて有用物質を生産し、かかる有用物質を単離精
製するとき、必然的に夾雑物ないしは不純物として混入
する形質転換体由来のアルケンを、アルゲン検出の公知
の常法によっては検出できない程度に高度に除去するた
めの精製法に関する。本発明の精製法は、微生物及び細
胞培養を用いて生産される有用物質のうら、特に、人体
に直接使用される医薬品並びに医薬部外品の有効成分の
ＷＡ造に有用である。例えば、ワクヂン抗原、医薬用酵
素、ｍ磨剤用Ｐ？Ｉ素、化訃品用蛋白質等の製造におい
て、本発明の精製法は極めてイｉ効に用いることができ
る。

［従来の技術］ 生体に抗原が接種されたり、吸入される等により、抗原
刺激が加えられると、生体はその抗原に対し特異的に反
応する抗体を産生ずる。かかる生体に再１文、同一抗原
が移入されると、生体内では抗原抗体反応が生じ、異物
としての抗原は破壊される−一これが、いわゆる感染症
の防ｆ１１ＩＩ！ｌ　＋Ｍとして知られている免疫現象
である。ところが、かかる免疫現象とは全く正反対の局
所炎症、忌激なショック症状等の異常反応ないしは過敏
反応が上記の抗原移入により生じることがある。−一こ
れは、アレルギー反応またはアナフィラキシ−と呼ばれ
ている。現在、アレルギー反応は、症状、発現別序等の
相異により■〜ＩＶ型の四つのをに大別されている。こ
れらのうら、特に、丁型アレルギーは、即時型アレルギ
ーまたはアナフィラキシ−といわれ、主要なアレルギー
反応として知られている。また、ヒトの■型アレルギー
は、通常、免疫グロブリンＥ（［ＱＥ）抗体により惹起
されることも知られている。例えば、抗原としてのアレ
ルゲンによる刺激を受けるとヒトの体内では該アレルゲ
ンに対するＩａＥ抗体が産生され保有される。かかる感
作された状態下のヒトに再度、同一のアレルゲンが導入
されると、上記ＩｑＥｆｆｉ体と該アレルゲンとの間で
生ずる抗原抗体反応が引き金となって、アレルギー反応
が惹起される。アレルゲンの起源またはアレルゲンにな
り得る物質としては、例えば、花粉、昆虫、動物の皮屑
、カビ、微生物由来物質、食拗、薬物、化学物質等が知
られている。かかるアレルゲンに対する生体のｌａＥ抗
体の保有状況は、一般に、受身皮円アナフィラキシ−（
ＰＣＡ）反応により測定されている。

［発明が解決しようとする問題点３ 人体に直接用いるワクチン等の注射薬における夾雑物ま
たは不純物としてのアレルゲンの混入は、安全性を保証
すべき医薬品への信頼を大きく損なう。しかしながら、
ワクチン等の生物学的製剤の製造では、その製品が兼備
すべき有効性、安全性並びに均質性に関する未解決の要
素並びに制約があまりにも多数存在するため、アレルゲ
ンの除去のみを指標かつ目的とした高度精製技術は、未
だ完成されていない。

近年、ポリエチレングリコール、プルラン、デキストラ
ン、ポリアミン、脂肪酸、尿素、グルタルアルデヒド、
ホルマリン等を用いて種々のアレルゲンを修飾すること
により、かかるアレルゲンが有するＩＱＥ抗体産生誘導
能を低減させようとする試みがなされてはいるが、未だ
Ｂ　Ｖｌ　ｒＪｆ究の段階にある。

更に、ここ１０数年来、遺伝子工学の急速な進歩により
、微生物や体細胞の形質転換体が作成され、その培養物
から有用物質を生産する技術が盛んに浦（石されている
ため、かかる形質転換体由来のアルケンがあらゆる製品
中に混入する確率が益々高くなりつつある。しかしなが
ら、かかる遺伝子工学の分野においても、遺伝子発現産
物中にａ人するアルケンの除去を目的とした高度精製技
術はΦ似視されていない傾向にある。モノクロ±−ル抗
体を用いるアフィニテイクロマトグラフイー、大型電気
泳動に買等が開発されてはいるが、これらは、形質転換
体由来のアレルゲン除去の観点から【よ十分にはＲ能し
ていない。

従って、生物学的製剤の製造技術を含む遺伝子工学の分
野では、有用物質を生産する形′１１転換体由来のアレ
ルゲンの除去を目的とした５度精製技術の確立は急務の
課題である。

［問題を解決するための手段及び作用１本発明考らは、
前記課題を解決するため、鋭ｎ研究を重ねた結果、珪酸
による吸脱着処理、活性炭による処理、密度勾配遠心法
及び平衡密度勾配遠心法を順次組合せた精製法により、
組換え遺伝子技術により作成された形質転換体の培養物
中の遺伝子発現産物を極めて高純度にＦＩ製できること
を見出した。即ち、該形質転換体由来のアルケンがＰＣ
Ａ反応では検出できない程度にまで除去された遺伝子発
現産物の製造に成功した。同時に、上記精製法により、
かかる遺伝子発現産物を安定かつ大単にａ度ｗＩ製でき
ることを見出した。木光明者らは、これらの知見に基づ
き本発明を完成した。

本発明によれば、（１）珪酸による吸１１ｆ２着処理、
（２）活性炭による不純物の吸着除去処理、（３）少な
くとも２回の密度勾配遠心法による分画、及び（４）少
なくとも２回の平衡密度勾配遠心法による分画を含むこ
とを特徴とする遺伝子発現産物の精製法が提供される。

同時に、本発明は、上記形質転換体由来のアルケンのみ
ならず、自然界に存する微生物並びに体細胞由来のアル
ケンをも除去する精製法を提供するものである。

本発明の精製法が適用される遺伝子発現産物とは、遺伝
子発現の一次産物並びに二次産物を意味する、例えば、
−次産物としては、蛋白質性のウィルス抗原、酵素、ホ
ルモン、インターフェロン並びにその他の生部活性物質
、二次産物としては、非蛋白質性の抗生物質、ホルモン
並びにその他の生し！ｉＩ活性物質を上げることができ
る。

上記遺伝子発現産物が細胞外へ分泌される場合には、細
胞ＩＦＳ養の外液を抽出液とし、細胞外へ分泌されない
場合には細胞を集めて破砕し、破砕された細胞の残渣を
除去することにより抽出液をＦ！４製する。′ａ胞の破
砕には、公知の常法、例えば、酵素による消化処理、浸
透圧による破壊処理、超音波、種々のホモジナイザー等
を用いることができるが、加圧式ホモジナイザーの使用
が望ましい。

このようにして得られた遺伝子発現産物の抽出液を以下
の工程に供する。

（丁）珪酸による吸脱！！処理−−上記抽出液に珪酸を
添加し、攪拌することにより遺伝子発現産物を珪酸に吸
着させ上清液を除去する。次に、（９られた珪酸を洗浄
模、適当な溶出液を添加攪拌して、珪酸画分を該珪酸か
ら溶出させる。珪酸と溶出液とを遠心弁Ｍ等により分離
してｍ出液を１９る。珪酸は、市販のもの、例えば、精
製カラムクロマトグラフィー用の粉末等が使用できる。

該抽出液に対し、約０．１〜１０Ｗ／Ｖ％になるよう珪
酸を添加する。また、攪拌は通常１０〜３０℃で１０〜
１００分聞行う。また、本工程は通常のカラムクロマト
グラフィーの手法によっても行うことができる。遺伝子
発現産物の珪酸への吸脱着は、ＰＨ、イオン強度等の差
を利用して行うことができる。　　　（（ｌ〉活性炭に
よる不純物の＠着除去処理−−前記工程（Ｉ）で得られ
る溶出液を濃縮器を用いて濃縮すると共に、基ｇｉ！溶
液を交換してもよい。得られた溶液に活性炭を該溶液に
対し、０．１〜１０Ｗ／Ｖ％になるよう添加した侵、通
常、１０〜３０℃で５〜３０分間攪拌する。所望の遺伝
子発現産物は活性炭に吸着されずに不純物が吸着される
ので、攪拌後、遠心等により活性炭を分離除去し、上清
液を採取する。活性炭としては、市販のもの、例えば、
粉末状の製品等を使用できる。本工程は、通常の公知の
カラムクロマトグラフィーの手法によっても行うことが
できる。

１ｑられた上清液はＩＩ！！溶液等を用いて酸処理を（
１う。例えば、塩酸溶液を上記上清液に滴下し、ＰＨを
下げることにより不純物を沈殿させ、これを遠心等によ
り分離除去する。一方、その上清液を採取し、アルカリ
溶液を滴下してかかる上清液のＰＨを７．０〜９．０に
修正する。このようにして得た上滑液は、必要に応じて
、常用されている別種の吸ｒＩＩ着剤、例えばアルミナ
、セライト等による追加の吸ｆｉｎ処理に供してもよい
。上清液は通常の公知の方法で濃縮する。

（ＩＩ［＞密度勾配遠心による分画−一前記工程（Ｉ）
で１ｑられた濃縮液を通常の公知の密度勾配遠心法によ
る分画に供する。この工程での密度勾配は、密度が′＆
続的に傾斜した直線状であっても、また、密度が異なる
２以上の担体溶媒の重層からなる不連続な階段状のもの
であっても使用できる。

密度勾配カラムを調製する物質として。蔗糖、トイトリ
ウムオキサイド、ディオドン、フィコール、臭化カリウ
ム、ポリごニールピロリドン、セシウムクロライド等、
公知公用の物質を用いることができるが、経済性及び使
用の容易性の観点から蔗糖の使用が望ましい。この工程
での遠心による分画は、２回以上、同一に調製された密
度勾配カラムを用いて行うか、または、調製の異なる密
度勾配カラムを適宜、用いて行う。調製を変えて密度勾
配遠心を行う場合は、前に用いた調製カラムの濃度勾配
の濃度範囲よりもせま狭い濃度範囲を右する濃度勾配の
調製カラムを用いて遠心分離を行う。尚、調製カラムの
濃度勾配の濃度範囲は、遺伝子発現産物の種類や夾雑物
などの種類によって異なるが、初回の密度勾配遠心分酊
において通常上限濃度が約４０〜５０Ｗ／Ｗ％下限濃度
が約１０〜２０Ｗ／Ｗ％の範囲で行うことができる。ま
た、遠心条件としては通常的２０，０００〜４０゜００
０ｒｏｍで約２〜３０時間の遠心条件で行うことｈ（で
きる。

この工程において遠心分離を行うことにより青られる両
分の中から所望の遺伝子発現産物を含む両分を染め、通
常の公知の方法によって濃縮、透析、濾過などを行った
侵、次の遠心分離に供づる。このようにして最終的に丙
られた両分を下記の平衡密度勾配遠心に供する。

（ＩＶ　）平ｔｌｉ密度勾配遠心による分画−一前記工
程（Ｉｌｌ）で１ηられる画分を通常の公知の平１ｌＩ
ｉ密度勾配法による分画に供する。この工程での遠心分
離は、甲−密度のｌｉ１体溶媒の一層、または、密度が
異なる２以上の担体Ｆ８媒の重層からなるカラムを用い
ることができる。カラムを［１する物質としては、上記
工程（Ｉ［ｌ）に記載のものと同じものを用いることが
できるが、この工程での分画には、経済性及び産業廃棄
物として無害の観点から、臭化カリウムの使用が望まし
い。この工程における遠心分離による分画は２回以上同
一に調製されたカラムを用いＣ行うか、または、調製の
異なるカラムを適宜、用いて行うことができる。カラム
のａｔ製を変えて遠心分離を行う場合は、前に用いたカ
ラムの密度よりも低い密度を有するｖ４製カラムを用い
て遠心分離を行う。尚、調製カラムの密度は、遺伝子発
現産物の種類や夾雑物などの種類によって異なるが、初
回の平衡密度勾配遠心分離において通常１０〜５０％で
行うことができる。

また、遠心条件としては通常的３０，０００〜６ｏ、ｏ
ｏｏｒｐｍで約３０〜８０時間の遠心条件で行うことが
できる。この工程において遠心分離を行うことにより得
られる画分の中から所望の発現産物を含む両分を集め、
通常の公知の方法によって濃縮、透析、濾過などを行っ
た後、次の遠心分離に供する。このようにして、最終的
に高純度に精製された遺伝子発現産物を１りることがで
きる。

本発明の精製法では、多種多様に存在する公知の精製技
術の中から、精製の各工程に適した技術が上述の如く選
択使用され、かつ、選択された諸技術の組合せによって
、アルケンを除去するという所ｆｆ１の目的を達成でき
るものである。尚、本発明の精製法の各工程においては
、目的とする遺伝子発現産物の種類等によって湿度、圧
：／］、ＰＨ５濃度、イオン濃度等の物理化学的因子の
選定：ＩＢ胞破砕剤、ｍ胞豹化剤、沈殿剤、可溶化剤、
吸脱賃剤、支持体、分散剤専の精製用試薬の選定；及び
遠心、濾過、電気泳動、ホモジナイズ等の精製用別器装
置などを適宜選択することができる。

次に、本発明を実施例により説明するが、本発明は以下
の実施に限定されるものではない。

尚、実施例１〜６に記載の各精製工程下での１−Ｉ　Ｂ
　ｓ抗絵の検出と測定は、参者例２に記載と同一の方法
で行った。

参考ＶＡＩ Ｂ型肝炎ワクチンＤＮＡウィルスを右するプラスミドｐ
Ｍ１Ｂ１１が移入されている大腸［４！Ｉ×１７７６／
ＤＭ１Ｂ１１　（ｙｉ工研条奇第１０８１号）からＣＭ
ｌＢｌｌをフェノールで抽出する。

かかるｐＭｌＢｌｌより制限Ｉｌｌ素Ｘｈｏ１．３ａｍ
１１１を用いてＢ型肝炎ウィルス表面表抗原（以下、ｒ
ＨＢｓ抗原」とつい）を含む領域を切り出し、これをＩ
ｌｌ母の抑制性酸性フォスフアーゼ遺伝子ＰＨ０５（Ｋ
ｅｎｊｉ　　Ａ、、ｅｔ　　ａｔ、。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　　　Ａｃ１ｄ　　　［）ｅｓｅａｒｃ
ｈ。

１旦、１７４１．１９８２）領域の下流にＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連係した螢、Ｉ）ＢＲ３２５のＢａｍ１
−１［サイトにりＯ−ニングし、ＨＢＳ遭伝子を発現す
るプラスミドを得る。かかるプラスミドを用いてＭＦｆ
ＩＳａＣＣｈａｒＯｍ　　ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
　　５ＨＹ４（ＡＴＣＣＮｏ。

４４７７２１を形質転換し、形質転換体酵母を１りた。

実施例１ 参考例１で（りられた形質転換体酵母を第１リン酸カリ
１．５Ｑ／ｌを含む完全合成培地バルクホルダー培地（
３ｕｒｋｈｏ　１ｄｅｒ、Ｐ、Ｒ。

ｅｔａ　１．Ａｍ、Ｊ、Ｂｏｔａｎｙ、３０．２０６．
１９４３．各々２０　ＬＪ　ｇ／ｍ　ｌ　（７）つ７シ
ル。

Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ヒスチジンを含む）を用いて
、３０℃で２４時間培養して得られた酵母菌体の培養液
を遠心（１２，０００ｇ、１０分）し、集菌する。含水
の生菌体５００を取り、５０ＱｍｌのＭ／１０リン酸ｔ
ＪＪ函液（ｐＨ９，０）に該菌体を浮遊した後、上記と
同様に遠心し、菌体を洗浄する。該菌体の洗浄を２回行
う。

実施例２ 実施例１で得た洗Ｅ菌体を５００ｍ１のＭ／１００リン
酸緩衝液（ｐＨ９，Ｏ）に再浮遊した後、これを高圧ホ
モジナイザー（米国ゴーリン社製：８，０００〜１０，
０ＯＯＰＳ　ｉ　）処理し、菌体を破Ｉ！する。次いで
、遠心（１２，０ＯＯＱ。

２０分）し、上清液を集め、ＨＢｓ抗原の粗抽出液とす
る。

実施例３ 実施例２で得た粗抽出液に、塩化ナトリウムをＲ終濃度
０．２モルになるよう添加混合する。

次いで、珪酸を２Ｗ／Ｖ％になるよう添加した優、室温
で３０分間ｌ！！痒し、珪酸にＨＢｓ抗原を吸着させる
。かかる珪酸を、遠心（５，０ＯＯＱ、１０分）により
集めた侵、これに２５０ｍ１の炭酸緩衝液（ｐＨ１０）
を加えて室温で４０分間攪拌し、ＨＢｓ抗原を珪酸から
Ｔｉ離させる。遠心（５゜０００ｑ、１０分）により珪
酸を分離し、上清液を採取する。

実施例４ 実施例３で得た上清液に活性炭を１Ｗ／Ｖ％になるよう
添加した後、！１２で１０分ＩＦ８ｆｆｉ拌する。

次いで、活性炭除去のため、遠心＜１０，０００Ｑ、１
０分）した後、上清液を採取する。該上清液に０．０２
Ｎ塩酸を滴下し、ｐＨを６．０に調整債、１０℃、３０
分間攪拌し酸沈澱物を形成させる。酸沈澱物を除去する
ため、遠心（１０，０００Ｑ、１０分）処理し、上清液
を採取する。次いで、該上清液に０．０２Ｎ水酸化ナト
リウムを滴下シ、ｐＨ８，０１，：：１１！！！後、限
外濾過器（米国ミリボッ社製）にて濃縮し、２５ｍ１の
ＨＢｓ抗原ｆ縮液を得る。

実施例５ 実施例４で得た濃縮液を２０〜３０Ｗ／Ｗ％蔗糖密度勾
配遠心（日立王様製：ＲＰＺ−３５Ｔゾーナル０−ター
、３０．００Ｏｒｐｍ、１８時間）し、ＨＢｓ抗原画分
を採取した後、該両分をＭ／２００リン酸緩衝液（ｐＨ
９，０＞に対し２４時間透析し蔗糖を除去する。上記操
作を再度行う。

実施例６ 実施例５で得たＨＢｓ画分１０ｍ１を、４０Ｗ　／　Ｗ
％臭化ナトリウム含有のＭ／２００リン酸緩衝液４０ｍ
１に添加混合後、平衡密度勾配遠心（日立王様製：　Ｒ
Ｐ−５０Ｔ−２０−ター、４５゜０００ｒｐｍ、４８時
間）し、ＨＢ　ｓ抗原画分を採取する。該両分をＭ／２
００リン酸緩衝液（ｐＨ９，０）に対し、２４時間透析
し、臭化カリウムを除去する。上記傑作を再度行い、高
度精製のｌ−Ｉ　Ｂ　ｓ抗原を得た。

実施例７ ＳＤＳ−ＰＡＧＥキット（第１化学製品）を用いて、実
施例６で冑たＨａｓ抗原の純度試験を行う。精製ＨＲｓ
抗原液を２０％グリセロール、０．１Ｍ−１−リス（Ｐ
Ｈ６，８）、２％ＳＤＳ、０．００４％ブロムフェノー
ルブルー、１０％２ＭＥを含有する緩！＃７液で２倍Ｗ
ｉ段希釈したものをゲルにアプライし、泳動する。次い
で、泳！ｌ銀染色を行い、不純物とＨａｓ抗原のバンド
の染色限界の希釈倍数の比から純度を産出する。その結
果、本発明によるＨＢＳ抗原の純度は９９．５％以上で
あった。

実施例８ 実施例６で得たＨＢＳ抗原をマウスに接種し、抗酵母免
疫マウス血清を作成する。一方、実施例２と同様にして
得た酵母菌体抽出液をマウスに接種し、抗酵母免疫マウ
ス自消を作成する。次いで、抗酵母免疫マウス血清を対
照として抗ＨＢＳ免疫マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、５週令♀
）血清中のＭｆｆｌに対するＩＱＥ抗体の含ωを受身皮
円アナフィラキシ−（ＰＣＡ）反応で測定する。該ＰＣ
Ａ反応は、上記各免疫血清を等倍希釈した後、ＳＷ♀ラ
ットの背部皮肉に０．１ｍｌ接種し、その２４時間後に
１ｍＧ蛋白窒素ｗｇ母抽出液及び０．５Ｗ／Ｖ％エバン
スブルーを尾静脈から静注し、その３０分優に上記接種
部位に青色斑点が出現する（ＦＩＡ性）か否か（陰性）
を判定して行う。その結果、第１表に示す通り、実施例
６で得たＨＢＳ抗原はＭ母菌体山米のアルケンが除去さ
れていた。

第７表 免疫原　　免疫ドーズ　ＰＣＡ価　ＩＱＥ抗体（ＵＣ＋
蛋白質） 抗Ｍ母　　４．０　　　　　＞４０　　　　　右免疫　
　　１．０　　　　　４０　　　　　有マウス　　０．
２５　　　　１０　　　　　有血清０．０６２５８有 ０．０１６　　　　＜５　　　　　照 抗ＨＢｓ　　８．０　　　　　　＜５　　　　　無免疫
　　　４．　Ｏ＜５　　　　　無 マウス　　２．０　　　　−　＜５　　　　　無血清　
　　１．０　　　　　　＜５　　　　　無０．５　　　
　　　＜５　　　　　無 実施例９ 遺伝子組換え技術により形質転換された日本脳炎ウィル
スＶ３抗原産生のＰ？Ｉ母菌の培養液について、実施例
１〜７と実質的に同様の操作を行い、酵母菌体由来のア
ルケンが除去されたＶ３抗原を得た。

実施例１０ 遺伝子組換え技術により形質転換されたムタナーゼ産生
の大腸菌の培養液について実施例１〜７と実質的に同様
の操作を行い、大腸菌由来のアルケンが除去されたムタ
ナーゼを得た。

実施例１１ 遺伝子組換え技術により形質転換されたムタナーゼ産生
の枯草菌の培養液について実施ｇ！４１〜７と実質的に
同様の操作を行い、枯草菌由来のアルケンが除去された
ムタナーゼを得た。

得た。

参考例２ 実施例６で得たＨＢＳ抗原の抗原価をラジオイムノアッ
セイで行う、該ＨＢｓ抗原を２倍段階希釈し、ＨＢＳＫ
体吸着のビーズ（アボット社製。

Ａｕ５ｌｉａ［キット）と−昼夜反応ざぜる。次いで］
２５Ｉ標識抗体（アボット社製、Ａｕ５ｌｉａ［キット
）を加えて４５℃で１時間保温し、シンチレーションカ
ウンターでＣｐｍを測定する。

抗原価は、抗原対照のｃｐｍとの平行線検定法により）
出する。その結果、本発明の１１Ｂ　Ｓ抗原価は、１０
．４４ｕｇ／ｍ１であり、ＦＪ　ｈ　タ抗ｆＡ　性のあ
ることが７１１明した。

参考ＶＡ３ 実施例６で得たＨＢｓ抗原を用いて公定の「生物学的製
剤基準（厚生省告示第１５９号）」に定められた沈降Ｂ
型肝炎ワクチン製剤基準に準拠してワクチンの調製及び
にマウス力価試験を行う。生１ｇ！的食塩水を用いて上
記精製抗ｌ１７ｉ４０μＱ／ｍ＋及び水酸化アルミ０．
４ｆｆｌ／ｍｌを調製侵、かかる両液を’Ｓ　ｍ　ｕｎ
合し、アルミ尤陪Ｂ望旧炎ワクヂンを作成する。該ワク
チンについて、上記製剤もｔ準に定められた各種試験を
行い、その適格性を確認した後、マウス力価試験を行う
。該ワクチンを生Ｉ！！５週令のＢへＬ　Ｂ　／　ｃマ
ウス１０匹のｔＹ部にそれぞれ７ｍｌずつ皮下接種する
。接種から５週＠Ｊ後に採血し、血中抗体価を受身赤血
球凝集反応により測定する。、参照量として用いた国立
予防研究所交付の力価試験用「参照沈降Ｂ型肝炎ワクチ
ン」との相対力価を求める。その結果、参照量１．０に
対する本発明の相対力価は１．７６であり、優れた免疫
原性のあることが判明した。

［発明の効果］ 本発明の絹製方法によれば、ｆ］換えＤＮＡ技術で用い
る宿主由来のアルケンが除去された高純度の遺伝子発現
産物が得られる。従って、生物学的製剤を合む医薬品、
及び歯磨剤等を含む医薬品各部品として使用される遺伝
子発現産物の、安全性と信頼性が極めて高まるため、本
発明は高品質の上記製品の提供を可能にする。

手続補正書く自発） 昭和６２年９月１７日 ・慢− １事件の表示 昭和６１年特許願第１４３４１３号 ２　発明の名称 イデンシハツゲンサンブツ　セイセイホウ遺伝子発現産
物の精製法 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 スイタシャマダオ力 住所　大阪府吹田市山田丘３番１号 オオサカダイガクナイ 大阪大学内 ハンダイビセイブツビョウケンキュウカイ香用県観音寺
市へ幡町２丁目９番４１号５　手続補正の日付　「自発
」 ６　補正の対象 「明細書の発明の詳細な説明の欄」 ７　補正の内容 明細書の発明の詳細な説明の欄の記載を下記の通り訂正
する： ページ　行　　　　　　補正前　　　　　　　　補正後
１　下１　　　アルタン　　　　　　アレルゲン２　上
５　　　アルタン　　　　　　アレルゲンＩＩ　　　ノ
ｊ　　　アルタン　　　　　　　アレルゲン３　上４　
　−一これ　　　　　　これ５　上７　　　アルタン　
　　　　　　アレルゲン６　上７　　　アルタン　　　
　　　　アレルゲンＩＩ　　下１　　　アルタン　　　
　　　　アレルゲン７　上８　　　「抗生物質、ホルモ ン並びにその」を削 除する ８　上９　　　他の　　　　　　　　　高分子の９　上
７〜　　ＰＨを　　　　　　　ＤＩを約４．トロ、５に
上８ 下１０　　　　ＰＨを７．ト９．０に　　ｐＨを約７０
〜９．０に１０　上２　　　物質として、　　　　　物
質として、下４　　約４ト５０　Ｗ／−％　　　約４ト
ロ０す／−％ＩＩ　　下４〜　約１（ｈ−２０ｋ４／ｌ
Ｊ％約５〜２０　Ｗ／ｋ１％下３ ページ　行　　　　　　補正前　　　　　　　　補正後
１２　下３　　　アルタン　　　　　　　アレルゲン１
３　上８　　　実施に　　　　　　　　実施例に１３　
下８　　　Ｂ型肝炎ワクチン　　　Ｂ型肝炎つィルスｎ
　　　ｎ　　　　ＤＮＡウィルス　　　　ＤＮＡ１３　
下３　　　表面表抗原　　　　　　表面抗原遺伝子１３
　下２　　　　ｒＨＢｓ抗原」とうい　　ｒＨＢｓ抗原
」という１４　上Ｉ　　　　ＰＨ０５胆並プロモーター
１６　下４　　２トコ０冒／賀％　　　　２０−３０　
Ｗ／ｗ％１８　上３　　　産出する。　　　　　　算出
する。

ＩＪ　　下６　　　等倍希釈　　　　　　　２倍階段希
釈１９　上２　　　アルタン　　　　　　　アレルゲン
ＩＩ　　上６　　　　（ｕＧ蛋白質）　　　　（８ｇ蛋
白質）２０　下１　　−昼夜反応　　　　　　室温で一
昼夜反応２１　上１　　１２５１　　　　　　／”Ｉ上
６　　　　　　　＋０．４４　　ｕｏ／膳ｌ　　　　　
　　　　　　　　　１０．４４　１ｔ　ｇ　７ｍ１２２
　上９　　　アルタン　　　　　　　アレルゲン（以下
余白） 明細書第１９ページ、上第２行「実施例９」から、第２
０ページ、上第６行「得た。」までを全文削除し、次の
文章を加入する： ［実施例９ 日本脳炎ウィルスＶ３蛋白遺伝子を有するラスミドｐＳ
２２が移入されている大腸菌Ｊ　Ｍ８３／ｐＳ２２（微
工研条寄第１０４７号）から、ｐｓ２２をフェノールで
抽出する。次いで、ｐｓ２２の剛ｕＩサイトをχｈｏＩ
に置換した後、Ｓｐｈ　Ｉサイトにユニバーサルターミ
ネータ−（ＰｈａｒｍａＣｉａ製）を挿入し、プラスミ
ドｐＳ２２ＸＳを作製する。該ｐＳ２２ＸＳから、制限
酵素Ｘｈ。

工及び５ａｌＩを用いて日本脳炎ウィルスＶ３蛋白遺伝
子を含む領域を切り出し、以下これを用いて参考例１の
記載に従って、酵母のＰＨ０５プロモーターの下流に連
係の後、ＹＥｐ１３のＸｈｏ　Ｉサイトにクローニング
し、日本脳炎ウィルス■３蛋白遺伝子を発現するプラス
ミドを作製する。次いで、これをＳ、５ｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ　５ＨＹ４株に移入することにより、形質転換体酵
母を得る。この形質転換体酵母の培養液について、実施
例１〜７と実質的に同様の操作を行い、酵母菌体由来の
アレルゲンが除去された純度が９９．５％以上のｖ３抗
原を得た。

実施例１０ ムタナーゼ産生菌Ｐｓｅｕｄｏｓ＋ｏｎａｓ属ＳＫ−旧
株（微工研条寄第９号）空ＤＮＡを抽出しくＥＸｐｅｒ
ｉｌｌｅｎ−ｔ　ｗｉｔｈ　Ｇｅｎｅ　Ｆｕｓｉｏｎ、
ＤＤ、１３７−１３９．Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎｏ　Ｈ−
ａｒｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８４発行）
、制限酵素ＥｃｏＲＩにより部分分解を行いＤＮＡ断片
を得る。これを市販の発現ベクター、プラスミドｐＹＥ
ＪＯＯ１（Ｔｈ　）ｆｏ−Ｉｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ　Ｃａｔａｌｏｇ、ｐ、６７、Ｐｈａｒａ＋ａｃｉ
ａ　Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、１９８５発行
）に連係した後、大腸菌に１２株ＨＢＩＯＩ（ＡＴＣＣ
Ｎｏ、３５６７３）に移入し、Ｃ＋ａ（クロラムフェニ
コール）感受性のコロニーを選別する０次いで、該コロ
ニーからムタナーゼ産生のクローンを選択して、形質転
換体大腸菌株に１２ＨＢ１０／ρＹＥＪＨＯＩを得る。

この形質転換されたムタナーゼ産生の大腸菌株の培養液
について、実施例１〜７と実質的に同様の操作を行い、
大腸菌体由来のアレルゲンが除去された純度が９９．５
％以上のｖ３抗原を得た。

実施例１１ 実施例１０で得られたムタナーゼ産生の形質転換体大腸
菌株から、ｐＹＥＪＨＯｌをフェノールで抽出する。こ
れに制限酵素ＥｃｏＲ■を作用させてムタナーゼ遺伝子
ＤＮＡを切り出す、一方、市販の発現ベクター、プラス
ミドｐＰＬ６０８（ＡＴＣＣＮｏ、３７１０８）を制限
酵素Ｈｉｎｄｌｌで切断した後、これにムタナーゼ遺伝
子ＤＮＡ断片を、リンカ−及び■４リガーゼを用いて連
係する０次いで、これを枯草菌８Ｒ１５１（ＡＴＣＣＮ
ｏ、　３３６７７）に移入した後、ムタナーゼを産生す
るクローンを選択し、形質転換体枯草菌株ＢＲ１５１／
ｐＰＬＨＯ１を得る。この形質転換されたムタナーゼ産
生の枯草菌株の培養液について、実施例１〜７と実質的
に同様の操作を行い、枯草菌体由来のアレルゲンが除去
された純度が９９．５％以上のｖ３抗原を得た。」 （以下余白）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、組換えＤＮＡ技術により製造される遺伝子発現産物
   の精製法にして、下記の工程： （１）珪酸による吸脱着処理。 （２）活性炭による不純物の吸着除去、 （３）少なくとも２回の密度勾配遠心分離による分画、
   及び （４）少なくとも２回の平衡密度勾配遠心分離による分
   画 を含むことを特徴とする遺伝子発現産物の精製法。