JPH0768267B2 - フラビウイルス抗原 - Google Patents

フラビウイルス抗原

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JPH0768267B2
JPH0768267B2 JP61131208A JP13120886A JPH0768267B2 JP H0768267 B2 JPH0768267 B2 JP H0768267B2 JP 61131208 A JP61131208 A JP 61131208A JP 13120886 A JP13120886 A JP 13120886A JP H0768267 B2 JPH0768267 B2 JP H0768267B2
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、フラビウイルス抗原に関するものである。更
に詳しくはフラビウイルスのV3蛋白の少くとも１種のエ
ピトープを含有する抗原に関する。本発明の抗原は、高
純度の日本脳炎ワクチンとして優れて有効に用いること
ができ、しかも、安価かつ安全に大量生産することがで
きるものである。また、本発明の抗原は、高度の免疫特
異性を有するため、抗フラビウイルス抗体の優れた診断
剤として利用することができ、更にまた、抗ウイルス抗
体の作成にも利用することができる。
［従来の技術］ 日本脳炎は、日本脳炎ウイルスの感染によって引き起こ
される高い死亡率と重篤な後遺症を残す伝染病である。
近年日本国に於ては患者数が激減したが、東アジアか東
南アジア更には南アジアに至る諸国ではしばしば大流行
し、流行地域のみならず国交の激しい現代においては世
界的に大きな社会問題となっている。
日本脳炎ウイルスは、トガウイルス科フラビウイルス属
に属するウイルスである。フラビウイルス属には、ウイ
ルス分類学上、日本脳炎ウイルスを含む約50種のウイル
スが含まれており、日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、
ウエストナイルウイルス、デングウイルスなどが比較的
詳しく研究されている。フラビウイルスの遺伝子は分子
量が3.8×106〜4.2×106の一本鎖RNAからなり、かかる
遺伝子により発現されるフラビウイルス粒子の構造蛋白
質は次の３種類に大別されている：エンベロープの主要
部を占めている糖蛋白Ｅ（旧名V3、分子量約53,000）、
エンベロープの小さい蛋白Ｍ（旧名V1、分子量約8,70
0）、及びヌクレオキャプシッドの蛋白質Ｃ（旧名V2、
分子量約13,500）。このうち特に、糖蛋白Ｅ（以下、
「V3抗原」という）は、ウイルス感染の成立に重要な役
割を演じるため、予防医学並びに診断学の分野では、V3
抗原の感染防御抗原としての機能の利用及びV3抗原のエ
ピトープ（抗原決定基）の詳細な構造解析が期待されて
いる。現在、中和活性、赤血球凝集活性、被感染細胞融
合活性、赤血球溶血活性などを指標としてV3抗原の研究
が進められており、V3抗原には少なくとも９種のエピト
ープの領域のあることが報告されている。また、フラビ
ウイルスは種の間で相互に近縁ないしは類似の抗原を持
っていることが知られている。
［発明が解決しようとする問題点］ 日本脳炎のウイルスのV3抗原は、従来技術では、次の要
領で生産されている；マウス脳や体細胞培養をウイルス
培養宿主として用い、病原性のシード用ウイルスを培養
した後、かかる培養物からウイルス全粒子を精製分離
し、次いで、物理化学的処理によりウイルス全粒子を開
裂して得られるV1、V2、V3各抗原、及びウイルスRNA等
の混合物からV3抗原を単離精製している。従って、従来
技術の欠点は次の通りである：病原性ウイルスを直接取
り扱うため、バイオハザードの確率が高い：原材料、生
産工程、設備等が複雑多岐にわたるため、生産コストが
高い：ウイルス培養宿主由来及び培地由来の不純物の混
入の危険性が高いため、高度に精製されたV3抗原の取得
が極めて困難である。
［問題点を解決するための手段及び作用］ 本発明者らは、前記問題点を解決すべく鋭意研究を行っ
た結果、日本脳炎ウイルスの感染に重要な役割を果たす
V3抗原をコードするDNAをクローニングすることに成功
し、更に、クローニングによって得てれたDNAを解析す
ることにより日本脳炎ウイルスV3抗原をコードするDNA
の塩基配列を決定した。また、このクローニングによっ
て得られたDNAを遺伝子組換え技術で発現させたとこ
ろ、日本脳炎ウイルスの抗原性を有する蛋白質が安全に
安定かつ大量に得られることを見出した。本発明者らは
これらの知見に基づき本発明を完成した。
本発明によれば、次式（Ｉ）： Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp Phe Ile Gl
u Gly Ala Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu
Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr Ile Met Ala Asn Asp Ly
s Pro Thr Leu Asp Val Arg Met Ile Asn Ile Glu Ala
Ser Gln Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr His Al
a Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro
Thr Thr Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Se
r Ser Tyr Val Cys Lys Gln Gly Phe Thr Asp Arg Gly
Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Il
e Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Thr Ser Lys Ala
Ile Gly Arg Thr Ile Gln Pro Glu Asn Ile Lys Tyr Gl
u Val Gly Ile Phe Val His Gly Thr Thr Thr Ser Glu
Asn His Gly Asn Tyr Ser Ala Gln Val Gly Ala Ser Gl
n Ala Ala Lys Phe Thr Ile Thr Pro Asn Ala Pro Ser
Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asp Tyr Gly Glu Val Thr Le
u Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala
Phe Tyr Val Met Thr Val Gly Ser Lys Ser Phe Leu Va
l His Arg Glu Trp Phe His Asp Leu Ala Leu Pro Trp
Thr Ser Pro Ser Ser Thr Ala Cys Arg Asn Arg Glu Le
u Leu Met Glu Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys Gln
Ser Val Val Ala Leu Gly Ser Gln Glu Gly Gly Leu Hi
s Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Val Val Glu Tyr Ser
Ser Ser Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Ar
g Met Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr
Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys As
n Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu
Leu Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pr
o Ile Val Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro
Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ala Th
r Ser Ser Ala Asn Ser Lys Leu Leu Val Glu Met Glu
Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gl
y Asp Lys Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ala Gly
Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe Ser Thr Thr Leu Lys Gl
y Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp
Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gl
y Lys Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg
Thr Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Le
u Met Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Val Asn Ala
Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr Gl
y Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala
・・・・・（Ｉ） （式中Alaはアラニン,Argはアルギニン,Asnはアスパラ
ギン,Aspはアスパラギン酸,Cysはシステイン,Glnはグル
タミン,Gluはグルタミン酸,Glyはグリシン,Hisはヒスチ
ジン,Ileはイソロイシン,Lysはリジン,Leuはロイシン,M
etはメチオニン,Pheはフェニルアラニン,Proはプロリ
ン,Serはセリン,Thrはスレオニン,Trpはトリプトファ
ン,Tyrはチロシン,Valはバリンの各残基をそれぞれ表わ
す）、で表されるフラビウイルス抗原のアミノ酸配列の
少なくとも一部を含有する抗原であって、その一部が該
フラビウイルス抗原の少なくとも１種のエピトープを含
むことを特徴とする抗原が提供される。
前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列は日本脳炎ウイル
スV3抗原の全アミノ酸配列である。本発明の抗原は日本
脳炎ウイルス抗原の上記全アミノ酸配列の少くとも一部
を含有する抗原である。すなわち、本発明の抗原は前記
式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列の全部を含有してもよ
いし、日本脳炎ウイルスに特異的な少なくとも１種のエ
ピトープを含む前記アミノ酸配列の一部を含有してもよ
い。尚、エピトープとは、抗原抗体反応の特異性を決定
する抗原の構造であり、抗体の抗原結合部位と特異的に
結合する抗原決定基を意味する。
前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を有する抗原は次
のようにして製造することができる。
（Ｉ）日本脳炎ウイルスの遺伝子RNAを抽出する工程−
−この工程の技術は、従来の公知の常法、例えばフェノ
ール抽出法等により行なうことができる。
（II）ウイルスRNAに相補的な二重鎖cDNAを調製する工
程−−この工程の技術は、例えば、逆転写酵素を用いる
公知の常法により行なうことができる。
（III）cDNAをクローニングし、その塩基配列を決定す
る工程−−この工程で用いるクローニングベフターとし
ては、大腸菌、枯草菌等の原核細胞を宿主とするプラス
ミド、また、λファージ、T4系ファージ等のバクテリオ
ファージ由来のベクターなど、公知のものを使用でき
る。この工程では、クローニングベクターとその宿主細
胞とを組み合せて選択使用することが望ましい： （IV）クローニングされたcDNAがV3抗原の遺伝子（以下
「V3遺伝子という）を含んでいることを同定する工程−
−細胞由来の構造遺伝子は、その翻訳の開始と終止の領
域に特定のDNA塩基配列を持っており、かつ、その調節
遺伝子の構造にも類似性があるため、かかる構造遺伝子
の領域の検出と同定は比較的容易である。これに対し、
V3遺伝子には、翻訳の開始領域、終止領域及び調節遺伝
子が存在せず、特定の塩基配列を指標として採用できな
いため、V3遺伝子領域の検出と同定は極めて困難であ
る。本発明者らの長年を経て培われた深い洞察力と優れ
た技術に基づき、クローニングされたcDNAの迅速な塩基
配列の解析、及びかかるcDNAの発現とその発現産物の免
疫学的検出同定の三者を同時に組み合せて駆使すること
により、また、既に報告されている黄熱ウイルス及びウ
エストナイルウイルスのV3遺伝子の塩基配列並びにV3蛋
白のアミノ酸配列とを比較検討することにより、上記困
難が克服されている。
（Ｖ）クローニングされたV3遺伝子内の領域を発現させ
る工程−−この工程で用いる発現ベクターとしては、大
腸菌、枯草菌等の原核細胞を宿主とする発現ベクター、
酵母を含む真核細胞を宿主とする発現ベクター、発現用
シャトルベクター、ワクシニアウイルス、SV40等のウイ
ルス遺伝子由来の発現ベクターなど公知のものを使用で
きる。この工程では、発現ベクターとその宿主細胞とを
組み合せて選択使用することが望ましい。この工程では
特に留意すべき困難な点として、V3遺伝子と公知の発現
ベクターとを単純に連係したものを宿主細胞に移入する
ことにより得られた形質転換体では、免疫原性を有する
V3抗原の生産がほとんど期待できないことである。すな
わち、V3遺伝子と公知の発現ベクターとの連係には、大
概、次の工夫を要する:V3遺伝子は翻訳の開始と終止の
領域を有しないので、これらを補充する；所望の抗原性
並びに免疫原性を有する発現産物を得るため、V3遺伝子
の全域又はどの部分を発現ベクターに連係するかを決定
する；発現産物の抗原性並びに免疫原性を高める：発現
ベクター及び形質転換体の遺伝的安定性を高める。発現
産物の収量を高める；発現産物を細胞外へ分泌させ精製
工程を容易にする。これらの工夫は、夫に発現ベクター
の改造構築により達成できる。
（VI）発現産物の抽出と精製の工程−−この工程では、
従来技術を組み合せて利用できる；例えば、ろ過、塩
析、遠心分離、カラムクロマトグラフィー等を組み合せ
ることにより抽出精製することができる。
（VII）発現産物の抗原性と免疫原性を検定する工程−
−この工程では、従来技術を組み合せて利用できる。例
えば酵素結合抗体免疫アッセイ（ELISA）、中和試験（5
0％プラック減少法：「生物学的製剤基準」,76ページ、
厚生省薬務局監修、社団法人 細菌製剤協会 1985年10
月10日発行）等を組み合せて検定することができる。
前記工程（IV）においてクローニングしたV3遺伝子は次
式（II）で表される塩基配列を有する： TTT AAT TGT CTG GGA ATG GGC AAT CGT GAC TTC ATA GA
A GGA GCC AGT GGA GCC ACT TGG GTG GAC TTG GTG CTA
GAA GGA GAT AGC TGC TTG ACA ATC ATG GCA AAC GAC AA
A CCA ACA TTG GAC GTC CGC ATG ATT AAC ATC GAA GCT
AGC CAA CTT GCT GAG GTC AGA AGT TAC TGC TAT CAT GC
T TCA GTC ACT GAC ATC TCG ACG GTG GCT CGG TGC CCC
ACG ACT GGA GAA GCT CAC AAC GAG AAG CGA GCT GAT AG
T AGC TAT GTG TGC AAA CAA GGC TTC ACT GAT CGT GGG
TGG GGC AAC GGA TGT GGA CTT TTC GGG AAG GGA AGC AT
T GAC ACA TGT GCA AAA TTC TCC TGC ACC AGC AAA GCG
ATT GGA AGA ACA ATC CAG CCA GAA AAC ATC AAA TAC GA
A GTT GGC ATT TTT GTG CAT GGA ACC ACC ACT TCG GAA
AAC CAT GGG AAT TAT TCA GCG CAA GTT GGG GCG TCC CA
G GCG GCA AAG TTT ACA ATA ACA CCC AAT GCT CCT TCG
ATA ACC CTC GGG CTT GGT GAC TAC GGA GAA GTC ACG CT
G GAC TGT GAG CCA AGG AGT GGA CTG AAC ACT GAA GCG
TTT TAC GTC ATG ACC GTG GGG TCA AAG TCA TTT CTG GT
C CAT AGG GAA TGG TTT CAT GAC CTC GCT CTC CCC TGG
ACG TCC CCT TCG AGC ACA GCG TGC AGA AAC AGA GAA CT
C CTC ATG GAA TTT GAA GAG GCG CAC GCC ACA AAA CAG
TCC GTT GTT GCT CTT GGG TCA CAG GAA GGA GGC CTC CA
T CAG GCG TTG GCA GGA GCC ATC GCG GTG GAG TAC TCA
AGC TCA GTG AAG TTA ACA TCA GGC CAC CTG AAA TGT AG
G ATG AAA ATG GAC AAA CTG GCT CTG AAA GGC ACA ACC
TAT GGC ATG TGT ACA GAA AAA TTC TCG TTC GCG AAA AA
T CCG GCG GAC ACT GGC CAC GGA ACA GTT GTC ATT GAA
CTA TCC TAC TCT GGG AGT GAT GGC CCC TGC AAA ATT CC
G ATT CTC TCC GTT GCG AGC CTC AAT GAC ATG ACC CCC
GTT GGG CGG CTG GTG ACA GTG AAC CCT TTC GTC GCG AC
T TTC AGT GCC AAC TCA AAG CTG CTG GTC GAG ATG GAA
CCC CCC TTC GGA GAC TCC TAC ATC GTG GTT GGG AGG GG
A GAC AAG CAG ATC AAC CAC CAT TGG CAC AAA GCT GGA
AGC ACG CTA GGC AAG GCC TTT TCA ACA ACT TTG AAG GG
A GCT CAA AGA CTG GCA GCG TTG GGC GAC ACA GCC TGG
GAC TTT GGC TCC ATT GGA GGG GTC TTC AAC TCC ATA GG
A AAA GCC GTT CAC CAA GTG TTT GGT GGT GCC TTC AGA
ACA CTC TTT GGG GGA ATG TCT TGG ATC ACA CAA GGG CT
A ATG GGT GCC CTA CTA CTC TGG ATG GGC GTC AAC GCA
CGA GAC CGA TCA ATT GCT TTG GCC TTC TTA GCC ACA GG
A GGT GTG CTC GTG TTC TTA GCG ACC AAT GTG CAT GCT
・・・・・（II） （式中、Ａはデオキシアデニル酸残基、Ｇはデオキシグ
アニル酸残基、Ｃはデオキシシチジル酸残基及びＴはデ
オキシチミジル酸残基を表わし、表（II）の左端および
右端はそれぞれ５′−水酸基側および３′−水酸基を表
わす） 上記塩基配列は、前記式（Ｉ）のアミノ酸配列を変えな
い限り、遺伝暗号の縮重に基づき、その塩基配列の少な
くとも１つの塩基を別の塩基と置換することも可能であ
る。本発明の抗原は、前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸
配列の少くとも一部をコードしている前記式（II）の塩
基配列の部分を含むDNAを遺伝子組換え技術で発現ベク
ターに結合し、宿主内で発現させることにより、製造す
ることができる。例えば、上記DNAは、発現ベクターと
の関連技術に基づき、発現ベクター由来のペプチド、リ
ンカー由来のペプチド、日本脳炎ウイルスのV3蛋白以外
の異種の外来ペプチド等が該V3エピトープのＣ末端及び
／又はＮ末端に結合した融合ペプチドとして発現させる
ことができる。この場合は、これらのペプチドを化学的
または酵素的に切断するか、もしくは抗原性に影響がな
ければそのまま用いることができる。
本発明の抗原を遺伝子工学的に製造するために用いるDN
Aは、その一部または全部を市販のDNA合成装置等により
有機合成することができる。
また、本発明の抗原は、市販のペプチド合成装置等によ
り有機合成することもできる。更にまた、公知の蛋白質
工学の手法により本発明の抗原の各エピトープのデザイ
ン、合成及び修飾をも容易に行なうことができる。
本発明の抗原は、フラビウイルス、特に日本脳炎ワクチ
ンの有効成分として用いることができる。ワクチンの調
製は、本発明の抗原を、滅菌済の生理的食塩水、リン酸
緩衝液等の等張液に添加して行う。この場合、ペプト
ン、アミノ酸、糖類などを安定剤として用いることが望
ましい。また、液状ワクチンだけでなく、免疫原を高め
るため、アジュバントを添加した沈降ワクチンや、高度
に安定化し輸送を容易にするため、凍結乾燥ワクチンを
調製することも可能である。また、分子接合法や細胞内
での翻訳後の修飾を用いて、本発明の抗原に糖鎖を導入
し、品質を向上させることも可能である。尚、ワクチン
のドーズ当たりの抗原量は、通常0.001〜1000μｇであ
る。また、本発明の抗原は、抗原性が近縁ないしは類似
のフラビウイルス感染の免疫学的診断剤として用いるこ
とができる。例えば、酵素結合抗体免疫アッセイ、赤血
球凝集試験、赤血球凝集阻止試験、受身凝集試験、補体
結合試験、更に、蛍光色素、酵素、及び放射性同位元素
等で標識された抗原又は抗体を用いるその他の種々の試
験等において有用である。フラビウイルス抗体の検出及
び同定用の抗原として用いる場合には、上記の各種試験
法の公知の術式により、調製かつ使用する。本発明の抗
原を用いて抗体を作成する場合には、本発明の抗原を実
験用動物に接種し抗体を産生させた後、被接種動物の血
液又は体液を採取するか、又は公知の細胞融合技術を用
いる。これにより容易に作成されるポリクロナール抗体
及びモノクロナール抗体は、フラビウイルス抗原の検出
及び同定用の抗体として上記の各種試験法の公知の術式
に従って調製かつ使用できる。
更にまた、本発明の抗原又はこれを用いて作成される抗
体は、抗原抗体反応に基づくバイオセパレータ、バイオ
リアクター並びにバイオセンサーにも用いることができ
る。この場合には、本発明の抗原又は抗体を基板又は支
持体に公知の常法により固定化する。更に、使用目的に
従い、本発明の抗原とその抗体は、蛍光色素、酵素、放
射性同位元素等により公知の常法により標識して用いる
ことができる。
次に本発明を実施例により説明するが、本発明は以下の
実施例に限定されるものではない。
実施例１ 日本脳炎ウイルスRNAの抽出：蚊の一種であるAedes al
bopictus由来のC6/36細胞培養（Igarshi,A.J.Gen.Viro
l,40,531,1978）にて日本脳炎ウイルスJaOArS982株を28
℃で48時間培養後、培養上清にポリエチレングライコー
ル6000を6g/dlと塩化ナトリウム2.22g/dl加え15分撹拌
する。12000g、30分間遠心し、沈澱したウイルス粒子を
STEバッファー（0.1M NaCl,0.01M Tris・HCl、0.001M
EDTA,PH7.6）に浮遊し、15％蔗糖液の上に重層後、37,
000rpm.120分間遠心し、沈澱をSTE−0.1SDS（ドデシル
硫酸ソーダー）に溶解する。次いで、ウイルスRNAを抽
出する目的でSTE飽和フェノールを等量加え、よく混合
した後、水層を分離しこれに２容量のエタノールを加え
−20℃に一晩置き15000rpm、30分間遠心してRNAを沈澱
させる。凍結乾燥後、RNAをSTE−0.1％SDSに浮遊し15〜
30％（w/w）の0.01％SDSの入蔗糖密度勾配に重層し45,0
00rpm,180分間遠心する。沈降速度係数42S画分をプール
してエタノール沈澱後、沈澱物を乾燥して50mM Tris・
HCl,（pH7.9）に溶解することによる精製ウイルスRNAを
得た。
実施例２ ウイルスRNAに相補的二重鎖cDNAの調製:10μｇのウイル
スRNAに50μの2.5mM MgCl2,25mM NaCl,0.5mg/ml牛
血清アルブミン（BSA）,1mM ATP,30単位のRNaseインヒ
ビター及び１単位のポリ（Ａ）ポリメラーゼを加え37℃
で５分間インキュベートする。RNAはフェノール抽出
後、エタノールを沈澱さえ、遠心して得た沈澱を乾燥し
た。次に、50μの0.1M KCl,10mM MgCl2,10mMDTT,1m
MのdNTP,20ugのオリゴ（dT）12-18,50mM Tris・HCl（p
H7.9）と30単位の逆転写酵素を加えたものにRNAを溶か
し、42℃で60分間インキュベートし、更に、150ulの0.1
mM MgSO4,0.5mg/mlBSA,1mM dNTP,100μＭ NAD,0.5M
Tris・HCl（pH7.9）,25単位のRNaseH,1単位のDNAリガ
ーゼと20単位のDNAポリメラーゼＩを含む酵素液を加
え、最終200ulの反応液は15℃で２時間インキュベート
後、フェノール抽出し、エタノール沈澱させた後、100u
lの10mM MgCl2,50mM NaCl,0.1mg/ml BSA,1mM DTT,1
mM dNTPと50mM Tris・HCl（ph7.9）を含む水溶液に溶
解後、２単位のT4DNAポリメラーゼを加え37℃にて10分
間インキュベートしフェノール抽出後、エタノールで沈
澱させ、ウイルスRNAに相補的cDNAを得た。
実施例３ cDNAのクローニングと塩基配列の決定： 実施例２で得たCDNAの両末端にBamHIリンカーを挿入す
るために、cDNAを60mM Tris・HCl（pH7.6）,6,6mMをMg
Cl2,10mM DTT,1mM ATPを含む水溶液に溶解し、BamHI
リンカーとT4DNAリガーゼに加え４℃で16時間インキュ
ベート後、未反応のBamHIリンカーを除去するため10mM
Tris・HCl（pH8.0）,50mM NaCl,1mM EDTAからなるT
EN50バッファーで平衡化したCL−4Bゲルにてゲルろ過を
を行った。次いで、過剰に挿入されたリンカーを除去す
るためBamHIで消化し、CL−4Bで再ゲルろ過をを行って
両末端にBamHIリンカーの挿入されたcDNAを調製した。
このcDNAをクローニングベクターpUC13（Pharmacia社
製）のBamHI部位に挿入してクローニングするために、p
UC13をBamHIで開き、BamHIリンカーを挿入されたcDNAを
加えT4DNAリガーゼにより４℃で16時間ライゲーション
し、次いで、大腸菌DH1株（ATCC No.33849）を形質転
換してcDNAのクローニングを行った。次に、種々の長さ
のcDNAをサブクローニングする目的で前述の組換え体大
腸菌よりcDNAを調製しエキソヌクレアーゼBal31処理を
行うため、cDNAを50mM Tris・HCl（pH8.0）,12mM CaC
l2,12mM MgCl2,400mM NaClからなるBal31バッファー1
00ulに溶解し、２単位のエキソヌクレアーゼBal31を加
え、20℃でインキュベートした。インキュベーション
後、3,6,10,15分で20μづつの反応液をとり、フェノ
ール抽出後、エタノール沈澱を行った。次に、T4DNAポ
リメターゼ処理により両末端を平滑末端にするため、70
mM Tris・HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,5mM DTT,200μ
ＭのdNTPを含むバッファーにDNAを溶解しT4DNAポメリラ
ーゼを加え37℃で30分間インキュベートした後、クロー
ニングベクターpUC19（Pharmacia社製）のHincII部位に
挿入し、大腸菌JM83株を形質転換し、様々なサイズのcD
NAをもつクローンを得た。得られたクローンの塩基配列
をジデオキシチエーンターミネター法（Sanger,F.et a
l,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.74,5463,1977;Hattori,M.et
al.Anal.Biochem.152,232,1986）にて決定した。この結
果、ウイルスRNAの５′末端より約2000bp下流からはじ
まる約4000bpより成るcDNAであるクローンK68を取得し
た。これとは別に、ウイルスRNAの５′末端を含むCDNA
を得るためにウイルスRNAの５′末端方向にcDNAを合成
した。尚、この場合、cDNA合成のプライマーとして、次
の配列より成るオリゴヌクレオチド（dGTACGGDTTCCCACA
TTTGGTGCTCC,26mer）を使用した。
実施例４ クローンS22のクローニングとV3蛋白をコードする領
域：実施例３のオリゴヌクレオチド26merを用い、ウイ
ルスRNAよりcDNAを実施例２の方法にて調製し、クロー
ニングベクターpUC13にクローニングした。クローニン
グにより得られた各形質転換体からアルカリ法等により
プラスミドを分離し、前記実施例３にに記載と同様の方
法で解析した。この内のクローンS22は、長さ約2500bp
より成り、ウイルスRNAの５′末端を含み又、日本脳炎
ウイルスと同属の他のフラビウイルスである黄熱ウイル
ス、ウエストナイルウイルスの塩基配列やアミノ酸配列
（Rice,C.M.et al.Science.229,726.1985;Wengler,G.e
t al.Virology 147,264,1985）との類似性を比較検討
した結果（第１図ａ〜ｉ）、日本脳炎ウイルスのV3蛋白
をコードする遺伝子領域を含むことが塩基配列の決定よ
り判明した。その結果を第２図ａ〜ｆに示す。上記のク
ローニングによって得られたクローンS22の大腸菌（Esc
herichia coli）をJM83/pS22株（微工研条寄 第1047
号）と命名した。
実施例５ V3蛋白遺伝子の発現用プラスミドの構築：クローンS22
のプラスミドpS22はV3遺伝子５′末端から上流49bpに制
限酵素MluI部位を持ち又、３′末端から7bp上流にSphI
部位を持つ。そこで、MluI部位と更に上流のベクター中
のEcoRI部位の２か所を切断するため、大腸菌JM83pS22
から実施例４に記載と同様の方法により分離したpS22の
DNAを10mM Tris・HCl（pH7.5）,100m NaCl,7mM MgCl
2液に溶解し、制限酵素MluIとEcoRIを加え37℃で２時間
消化後、フェノール抽出とエタノール沈澱法によりDNA
を回収した。このDNAの両末端を付着末端とするため前
述のT4DNAポリメラーゼ反応液に溶解し、37℃で30分間
処理した。フェノール抽出、エタノール沈澱の後、XhoI
リンカーを実施例３に記載の如く両末端に結合し、大腸
菌JM83株を形質転換し、XhoIリンカーが挿入されたクロ
ーンS22Xを得た（第３図）。
次に、クローンS22XのプラスミドpS22Xを10mM Tris・H
Cl（pH7.5）、100mM NaCl,7mM MgCl2液に溶解し、制
限酵素SphIとBamHIを加え、37℃で２時間消化した後、
前述のごとくT4DNAポリメラーゼで末端を平滑にし、Uni
versal Terminator（Pharmacia社製）を結合し、再び
大腸菌JM83株を形質転換しクローンS22XSを得た（第３
図）。
一方、発現用ベクターとしては、本発明者等が構築した
YEp133PCTなるベクターを用いた。YEp13（ATCC NO.371
15）のLEU2遺伝子両端のXhoI及びSalI及びSalI部位をLE
U2遺伝子断片を逆に挿入することにより両部位を消失さ
せ、次にTcr遺伝子内にあるBamHI及びSai部位にpPH05
（Kenji A,et al,Nucl.Acid Res.11,1741,1982）由
来のPH05プロモーターを含む約650bpのBamHI及びSalI断
片を挿入し、更に、SaLI部位からエキソヌクレアーゼBa
l31によりPH05プロモーター断片を削り、プロモーター
のみとし、XhoIリンカーを挿入しクローニング部位とし
た。又、YRp7（ATCC NO.37060）のTRP1ターミネーター
及びARS（Autonomous Replication Sequence）を含む
HindIIIとEcoRI断片のHindIII部位へXhoIリンカー,EcoR
I部位にSalIリンカーを挿入し、この約800bpのDNA断片
を前述のクローニングベクターに挿入し発現用ベクター
YEp133PCTを構築した。この発現用ベクターにV3蛋白遺
伝子を挿入するため、pS22XSを制限酵素XhoI及びSalIで
消化し、アガロース電気泳動で1600bpのサイズのDNA断
片を回収した。このDNA断片を,YEp133PCTを制限酵素Xho
Iで開いたプラスミドに挿入し、再び大腸菌JM83株を形
質転換して、生じたクローンを単離し、Ｌ−培地（バク
トトリプトン１％，イーストエキストラクト0.5％，塩
化ナトリウム0.5％，アンピシリン25ug/ml,pH7.2〜7.
4）で培養後、プラスミドをアルカリ法にて抽出し、各
種制限酵素により消化し、アガロース電気泳動の結果よ
り、V3遺伝子を含むDNA断片のYEp133PCTに挿入されてい
る方向を確認し、プラスミドpJV3を得た（第４図）。こ
のクローンのプラスミドで酵母を形質転換し、培養した
酵母中にV3蛋白が産生されているのをELISA法で確認し
た。次に、V3蛋白産生量を増大させるため、クローンpJ
EV3の改良を種々試みた。その結果を５図に示す。特
に、pJEV3DNAを制限酵素XhoIで消化し、T4DNAポリメラ
ーゼで平滑末端とした後、制限酵素BamHIで消化し、ア
ガロース電気泳動により13,000bpのDNA断片を回収し
た。このDNAはpJEV3のPHO5プロモーター領域を欠いたも
のである。一方、PHO5構造遺伝子の翻訳開始コドンATG
を利用するため、pHO5を制限酵素BamHIとDralで消化
し、アガロース電気泳動により550bpのPH05プロモータ
ー領域のDNA断片を回収し、これに前述の13,000bpのDNA
断片を結合し、大腸菌JM83株を形質転換し、クローニン
グした。得られたプラスミドをpJM105と命名した。pJM1
05の調製を示すフローチャートを第４図に示す。
上記の如くクローニングしたpJM105を用いるとPH05由来
の２個のアミノ酸、V3遺伝子上流のV1遺伝子由来の16個
のアミノ酸、V3遺伝子自身の498個のアミノ酸、PH05プ
ロモーターとの継目由来の２個のアミノ酸及びユニバー
サルターミネーター由来の１個のアミノ酸の計519個の
アミノ酸からなるポリペプタイドが合成されることが期
待された。
実施例６ 発現用プラスミドpJM105による酵母の形質転換と組換え
酵母の単離：発現用プラスミドpJM105で酵母（Saccharo
myces cerevisiae）SHY4株（ATCC No.44772）をアル
カリカチオン法にて形質転換するため、酵母をYPD培地
（バクトペプトン２％，イーストエキストラクト１％，
デキストローズ２％）にて培養する。培養液を5mlとり2
500rpm5分間遠心し菌体を5mlのTE緩衝液（10mM Tris・
HCl pH8.0,0.1mM EDTA）に浮遊し、遠心し得られた菌
体を0.6mlのTE緩衝液に再浮遊した内の0.5mlに同量の0.
2M酢酸リチウム液を加え30℃で60分間インキュベートす
る。次いで、0.1mlをとり、これにプラスミドDNAを８μ
加え30℃で30分間再びインキュベートする。0.1mlの7
0％ポリエチレングライコール4000液を加え、更に、30
℃で60分間インキュベートした後、蒸留水2mlを加え、2
500rpmで５分間遠心し菌体を少量の蒸留水に再浮遊した
後に、ロイシンを含まない選択培地であるSD寒天培地
（0.67％バクトイーストナイトロジェンベースアミノ酸
フリーDifco社製、２％デキストローズ，各々20ug/mlの
ウラシル,L−トリプトファン,L−ヒスチジン,2％寒天）
に拡げ30℃で培養し、出現したコロニーを単離した。得
られた組換え体酵母をSHY4/pJM105と命名した。
実施例７ 組換え体酵母の培養とV3蛋白の抽出：組換え体酵母SHY4
/pJM105を第１リン酸カリ1.5g/Lを含む完全合成培地バ
ルクホルダー培地（Burkholder,P.R.et al.Am.J.Botan
y,30,206 1943）に接種し、30℃で24時間振とう培養
後,2500rpm,5分間遠心して集菌する。一度、菌体を蒸留
水で洗滌後、第一リン酸カリの代りに塩化カリ1.5g/Lを
含むバルクホルダー培地に植込み、更に、30℃で48時間
振とう培養した。菌体を遠心操作により集め、洗浄後、
0.01リン酸バッファー（pH9.0）に再浮遊しガラスビー
ズを加え強く振とうして菌体を破砕し10,000rpmで10分
間遠心して上清を酵母抽出液を得た。
実施例８ 組換え体酵母のV3蛋白産生量：酵母抽出液中のV3蛋白の
定量はELISA法にて行った。ELISAは一次抗体に日本脳炎
ウイルス（中山予研株）で過免疫して得たマウス血清よ
り1gGを精製したものを、二次抗体にパーオシターゼ（H
RPO）を標識した日本脳炎ウイルスV3蛋白モノクロナー
ル抗体（Kimura,K.J.et.al J.Virol.45,124,1983）を
用いたサンドイッチ法で行いオルソーフェニレンジアミ
ンにより発色させ吸光度を測定し、参照日本脳炎ワクチ
ン（Lot 181,国立予防衛生研究所）との平行線検量法
によりELISA抗原価として得た。この結果、組換え体酵
母SHY4/pJM105は第１表に示すごとく、大量のV3蛋白を
産生することを確認した。
実施例９ 組換え体酵母SHY4/pJM105により産生されたV3蛋白のウ
エスタンブロッテング法による同定と分子量の測定：酵
母よりV3蛋白を抽出した液は20％〜30％蔗糖密度紅梅遠
心（21000rpm,20時間）により精製した後、V3蛋白を含
む画分を１％２−メルカブトエタノール,125mM Tris・
HC（pH6.8）中で室温にて20分間処理した後、10％ポリ
アクリルアミドゲルで電気泳動した。次にゲルをはず
し、Bio−RAD社製TRANS−BLOTTMcellを使用し、ニトロ
セルロース膜にゲル上の蛋白をブロッテイングした。こ
のニトロセルロース膜を抗日本脳炎ウイルスV3モノクロ
ーナル抗体と反応後、HRPO標識抗マウスIgGヤギIgGを反
応させ、４−クロロ−インドナフトールを発色させるこ
とによってV3蛋白を同定することが出来た。第６図に示
すごとく、分子量約53KDの蛋白が抗V3モノクロナール抗
体と反応しておりこの蛋白が、プラスミドの塩基配列よ
り推定されるサイズのV3蛋白であると同定した。
実施例10 組換え体酵母の産生したV3蛋白の免疫原性:20％（w/w）
〜50％（w/w）蔗糖密度勾配にV3蛋白抽出液を重層し、2
1000rpmで20時間遠心して部分精製したV3蛋白（ELISA抗
原価で4,20,100）を水酸化アルミをアジュバンドとし
て、４週齢のddY系マウスの腹腔に免疫し、１週後に同
量追加免疫し、更に、１週間後に採血し日本脳炎ウイル
スに対するELISA抗体価と50％ブラック減少法による中
和抗体価を測定した。第２表に示すごとく、ELISA抗体
価は検出されたが、中和抗体はこの免疫法では検出され
なかった。
実施例11 組換え体酵母の産生したV3蛋白の免疫原性：実施例10と
同様に調製した抗原液をマウス腹腔内に1,8,15,22,29,3
6日目に６回免疫し、43日目に採血して、日本脳炎ウイ
ルスに対する中和抗体価を測定した。第３表に示すごと
く、中山株、北京株,JaOArS982株のいずれでも中和抗体
を検出した。
［発明の効果］ クローニングされたV3蛋白遺伝子を細胞培養により発現
させるため、生産工程下でのバイオハザードの確率が実
質的に低くなる。また、生産コストが低減される。更
に、培地を含む培養系の組成と構成がすべて既知である
ため、精製が容易になり、高純度の製品が得られる。そ
の上に、製品の分子構造が明確であるため、有効性並び
に安全性が優れて高い均質な生物学的製剤、及び極めて
特異性の高い高性能の診断剤等の提供が可能になる。な
お、この発明に関する優れた抗原性と免疫原性は実施例
10及び11の記載のとおりである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、日本脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス
及び黄熱ウイルスの順にV3蛋白領域の遺伝子DNAの塩基
配列、及びアミノ酸配列の比較を示す。 第２図は、日本脳炎ウイルスのV3蛋白領域の遺伝子DNA
の塩基配列、及びアミノ酸配列を示す。 第３図は、pS22とpS22XSのフローチャートである。 第４図は、発現ベクターとpJM105構築の系統を示すフロ
ーチャートである。 第５図は、pJEV3の種々の改造構築及び、pJM105の構築
を示す。 第６図は、本発明に関する日本脳炎ウイルスV3抗原の同
定を示す電気泳動図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (56)参考文献 特開 昭58−77823（ＪＰ，Ａ) Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．147，Ｎｏ. ２，（1985），Ｐ．264−274 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．110，Ｎｏ. １，（1981），Ｐ．26−34

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次式（Ｉ）： Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp Phe Ile Gl
    u Gly Ala Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu
    Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr Ile Met Ala Asn Asp Ly
    s Pro Thr Leu Asp Val Arg Met Ile Asn Ile Glu Ala
    Ser Gln Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr His Al
    a Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro
    Thr Thr Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Se
    r Ser Tyr Val Cys Lys Gln Gly Phe Thr Asp Arg Gly
    Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Pha Gly Lys Gly Ser Il
    e Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Thr Ser Lys Ala
    Ile Gly Arg Thr Ile Gln Pro Glu Asn Ile Lys Tyr Gl
    u Val Gly Ile Phe Val His Gly Thr Thr Thr Ser Glu
    Asn His Gly Asn Tyr Ser Ala Gln Val Gly Ala Ser Gl
    n Ala Ala Lys Phe Thr Ile Thr Pro Asn Ala Pro Ser
    Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asp Tyr Gly Glu Val Thr Le
    u Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala
    Phe Thr Val Met Thr Val Gly Ser Lys Ser Phe Leu Va
    l His Arg Glu Trp Phe His Asp Leu Ala Leu Pro Trp
    Thr Ser Pro Ser Ser Thr Ala Cys Arg Asn Arg Glu Le
    u Leu Met Glu Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys Gln
    Ser Val Val Ala Leu Gly Ser Gln Glu Gly Gly Leu Hi
    s Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Val Val Glu Tyr Ser
    Ser Ser Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Ar
    g Met Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr
    Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys As
    n Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu
    Leu Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pr
    o Ile Val Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro
    Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ala Th
    r Ser Ser Ala Asn Ser Lys Leu Leu Val Glu Met Glu
    Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gl
    y Asp Lys Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ala Gly
    Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe Ser Thr Thr Leu Lys Gl
    y Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp
    Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gl
    y Lys Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg
    Thr Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Le
    u Met Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Val Asn Ala
    Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr Gl
    y Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala
    ・・・・・（Ｉ） （式中Alaはアラニン,Argはアルギニン,Asnはアスパラ
    ギン,Aspはアスパラギン酸,Cysはシステイン,Glnはグル
    タミン,Gluはグルタミン酸,Glyはグリシン,Hisはヒスチ
    ジン,Ileはイソロイシン,Lysはリジン,Leuはロイシン,M
    etはメチオニン,Pheはフェニルアラニン,Proはプロリ
    ン,Serはセリン,Thrはスレオニン,Trpはトリプトファ
    ン,Tyrはチロシン,Valはバリンの各残基をそれぞれ表わ
    す）、で表わされる日本脳炎ウイルスV3抗原のアミノ酸
    配列の少なくとも一部を含有する抗原であって、その一
    部が日本脳炎ウイルスに特異的な少なくとも１種のエピ
    トープを含むことを特徴とする抗原。
  2. 【請求項２】日本脳炎ウイルスに特異的な少なくとも１
    種のエピトープが大腸菌JM83/pS22株（微工研条基第107
    4号）内のプラスミドpS22が保有の日本脳炎ウイルスV3
    抗原遺伝子cDNAの発現物である請求項１に記載の抗原。
  3. 【請求項３】次式（Ｉ）： Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp Phe Ile Gl
    u Gly Ala Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu
    Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr Ile Met Aln Asn Asp Ly
    s Pro Thr Leu Asp Val Arg Met Ile Asn Ile Glu Ala
    Ser Gln Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr His Al
    a Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro
    Thr Thr Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Se
    r Ser Tyr Val Cys Lys Gln Gly Phe Thr Asp Arg Gly
    Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Pha Gly Lys Gly Ser Il
    e Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Thr Ser Lys Ala
    Ile Gly Arg Thr Ile Gln Pro Glu Asn Ile Lys Tyr Gl
    u Val Gly Ile Phe Val His Gly Thr Thr Thr Ser Glu
    Asn His Gly Asn Tyr Ser Ala Gln Val Gly Ala Ser Gl
    n Ala Ala Lys Phe Thr Ile Thr Pro Asn Ala Pro Ser
    Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asp Tyr Gly Glu Val Thr Le
    u Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala
    Phe Thr Val Met Thr Val Gly Ser Lys Ser Phe Leu Va
    l His Arg Glu Trp Phe His Asp Leu Ala Leu Pro Trp
    Thr Ser Pro Ser Ser Thr Ala Cys Arg Asn Arg Glu Le
    u Leu Met Glu Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys Gln
    Ser Val Val Ala Leu Gly Ser Gln Glu Gly Gly Leu Hi
    s Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Val Val Glu Tyr Ser
    Ser Ser Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Ar
    g Met Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr
    Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys As
    n Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu
    Leu Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pr
    o Ile Val Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro
    Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ala Th
    r Ser Ser Ala Asn Ser Lys Leu Leu Val Glu Met Glu
    Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gl
    y Asp Lys Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ala Gly
    Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe Ser Thr Thr Leu Lys Gl
    y Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp
    Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gl
    y Lys Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg
    Thr Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Le
    u Met Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Val Asn Ala
    Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr Gl
    y Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala
    ・・・・・（Ｉ） （式中Alaはアラニン,Argはアルギニン,Asnはアスパラ
    ギンAspはアスパラギン酸,Cysはシステイン,Glnはグル
    タミン,Gluはグルタミン酸,Glyはグリシン,Hisはヒスチ
    ジン,Ileはイソロイシン,Lysはリジン,Leuはロイシン,M
    etはメチオニン,Pheはフェニルアラニン,Proはプロリ
    ン,Serはセリン,Thrはスレオニン,Trpはトリプトファ
    ン,Tyrはチロシン,Valはバリンの各残基をそれぞれ表わ
    す）で表わされる日本脳炎ウイルスV3抗原のアミノ酸配
    列の少なくとも一部を含有する抗原であって、その一部
    が日本脳炎ウイルスに特異的な少なくとも１種のエピト
    ープを含む抗原を有効成分として免疫を奏する量、含有
    するワクチン。
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