KR20180038557A - 타겟 폴리펩티드를 제시하기 위한 폴리펩티드 캐리어 및 이의 용도 - Google Patents

타겟 폴리펩티드를 제시하기 위한 폴리펩티드 캐리어 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 타겟 폴리펩티드를 제시하기 위한 폴리펩티드 캐리어 및 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 폴리펩티드 캐리어를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 삽입에 사용되는 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 폴리펩티드 캐리어 및 타겟 폴리펩티드를 포함하는 재조합 단백질의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 폴리펩티드 캐리어를 포함하는 재조합 단백질 및 HBV로부터의 에피토프를 포함하는, HBV 감염 또는 HBV 감염에 관련된 질병(예를 들어, B형 간염)을 예방, 완화 또는 치료하기 위한 약학 조성물 또는 백신에 관한 것이다.

Description

타겟 폴리펩티드를 제시하기 위한 폴리펩티드 캐리어 및 이의 용도
본 발명은 유전공학 백신, 분자 바이러스학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특히 B형 간염 바이러스(HBV) 감염의 치료 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 폴리펩티드 캐리어(펩타이드 캐리어)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 삽입에 사용되는 핵산분자에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 핵산분자가 삽입된 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 가지고 재조합 단백질로서 발현된 후, 폴리펩티드 캐리어는 타겟 폴리펩티드(예를 들어, 타겟 항원 또는 타겟 항원의 에피토프)를 제시할 수 있고/있거나 재조합 단백질은 바이러스-유사 입자를 형성하여 타겟 폴리펩티드를 제시할 수 있다. 이에 더하여, 본 발명은 또한 폴리펩티드 캐리어 및 타겟 폴리펩티드를 포함하는 재조합 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 핵산분자 및 재조합 단백질의 용도에 관한 것이다. 이에 더하여, 본 발명은 HBV 감염 또는 HBV 감염에 관련된 질환(예를 들어, B형 간염)의 예방, 경감 또는 치료에 유용하고, 본 발명의 폴리펩티드 캐리어 및 HBV의 에피토프를 포함하는 백신 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
백신은 전염병의 퇴치에 효과적인 수단이다. 해당되는 사람에 따라, 백신은 예방 백신과 치료 백신으로 나눌 수 있다. 예방 백신은 주로 약독백신(attenuated vaccine), 불활화백신(inactivated vaccine) 및 유전공학 백신(genetically engineering vaccine)을 포함하여 바이러스 감염을 예방하는 데 주로 사용되며, 주로 유기체에 중화항체를 유도하여 바이러스 감염으로부터 유기체를 보호한다. 치료 백신은 주로 종양과 같은 지속적인 바이러스 감염 및 질환을 치료하는 데 사용된다. 이 질환에서 환자는 일반적으로 타겟 항원에 면역 내성이 있으므로, 연구자들은 유기체에서 타겟 항원에 대한 효과적인 면역 반응의 생성을 유도하기 위해 몇 가지 형태의 백신을 시도해왔다. 치료용 백신은 주로 핵산 백신, 바이러스 벡터 백신, 유전공학 백신 등을 포함한다. 그 중에서, 유전공학 백신은 상당한 이점을 가지고 있다.
시판되는 유전공학 백신에는 B형 간염 바이러스(HBV) 백신, 인간 유두종 바이러스(HPV) 백신, 및 E형 간염 바이러스(HEV) 백신을 포함하고, 이들은 모두 바이러스-유사 입자(VLPs)의 형태이다. 바이러스-유사 입자는 바이러스 핵산을 포함하지 않는 특정 바이러스의 하나 이상의 구조 단백질에 의해 형성된 중공 입자를 말하며, 자가 복제될 수 없지만, 형태와 구조 면에서 실제 비리온(virion)과 동일하거나 유사하다. 바이러스-유사 입자는 다음의 이점을 갖는다: 강한 면역원성, 높은 안정성, 쉽게 불활성화 되지 않고, 외인성 펩타이드 단편을 제공할 수 있으며, 유기체 내에서 외인성 펩타이드 단편이 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있으므로, 백신 분야에서 중요한 응용 가치를 가지고 있다.
현재, 전 세계적으로 약 20억 명이 HBV에 감염되어 있고, 약 3억 5천만명이 만성 HBV 감염을 가지고 있으며, 감염된 사람들이 결국 HBV 감염과 관련된 간 질환으로 사망할 위험이 15~25%에 달할 수 있다. 매년 전 세계적으로 B형 간염으로 인한 말기 간 질환으로 1백만 보다 많은 사람들이 사망했다. 중국은 HBV 감염에 심한 어려움을 겪고 있으며, 현재 약 9300만 명의 B형 간염 환자가 있다. 최근에는, 사례보고 시스템의 지속적인 개선으로 인해 B형 간염 관련 질환의 발생 정도와 사망률이 감소하는 대신 증가한다.
현재, 만성 HBV 감염을 치료하기 위한 약제는 주로 인터페론 및 뉴클레오시드/뉴클레오티드 유사체(NAs)의 두 가지 부류로 나뉠 수 있다. 만성 HBV 감염의 최종 치료 목표는 심각한 간염(간부전), 간경화 및 간암과 같은 말기 간 질환의 발생을 예방하는 것으로, 최적의 임상 종료점은 환자가 B형 간염 표면 항원의 혈청학적 음성 변환 또는 혈청학적 전환, 즉 완전히 깨끗한 HBV를 달성할 수 있게 하는 것이다. 그러나, 목표를 달성할 수 있는 기존 약물의 수가 제한되어 있다. 따라서, 만성 HBV 감염 환자에게 바이러스를 보다 효과적으로 정화할 수 있는, 특히, HBsAG를 효과적으로 정화하거나 HBsAg 레벨을 크게 감소시킬 수 있는 새롭고 독창적인 치료 약물과 방법의 개발이 시급하고 필요하며, 이것은 치료 백신을 개발하는 잠재적인 전략이다.
본 발명의 기술적 솔루션은 종래 기술에 비해 다음과 같은 유익한 효과를 갖는다:
(1) 본 발명은 광범위한 적용성을 가지며, 다양한 타겟 폴리펩티드(예를 들어, 항원성 에피토프/항원 펩티드 단편)을 효율적으로 제시하는데 사용되고, 숙주 내에서 타겟 폴리펩티드에 대한 특이적 면역 반응의 생성을 유도할 수 있는 신규한 폴리펩티드 캐리어를 제공한다. 이러한 타겟 폴리펩티드(예를 들어, 항원성 에피토프/항원 펩티드 단편)는 HIV로부터의 항원성 에피토프/항원 펩티드 단편(예를 들어, HIV GP120 단백질로부터의 항원성 에피토프/항원 펩티드 단편; 예를 들어, GP120 단백질의 361-375 위치의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드), 인간 PD-L1으로부터의 항원성 에피토프/항원 펩티드 단편(예를 들어, 인간 PD-L1 단백질의 147-160 위치의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드), 및 인간 HBV 로부터의 항원성 에피토프/항원 펩티드 단편(예를 들어, 인간 HBV로부터의 HBsAg 단백질의 항원성 에피토프/항원 펩티드 단편; 예를 들어, HBsAg 단백질의 113-135 위치의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
(2) 본 발명의 폴리펩티드 캐리어는 인간 B형 간염 바이러스(예를 들어, 인간 HBV로부터의 HBsAg의 에피토프)로부터의 항원 에피토프를 제시하는데 특히 적합하고, 대상에서 HBsAg를 세정하기 위한 매우 강력하고 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있으며, 기존의 B형 간염 백신(예를 들어, 동일한 에피토프를 포함하고 인간 HBV의 HBcAg를 폴리펩티드 캐리어로 사용하여 제조된 백신)의 효과보다 현저하게 우수한 효과를 지니고 있다.
본 발명의 양태는 다음의 도면 및 실시예를 참조하여 상세히 설명된다. 그러나, 당업자는 다음의 도면 및 실시예가 본 발명의 보호범위를 제한하기 보다는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로만 사용된다는 것을 이해할 것이다. 다음의 도면 및 바람직한 실시예에 대한 상세한 설명에 따르면, 본 발명의 다양한 목적 및 유리한 측면은 당업자에게 분명하다.
도 1은 본 발명의 RBHBcAg 캐리어, TBHBcAg 캐리어 및 HBHBcAg 캐리어에 타겟 폴리펩티드(타겟 폴리펩티드 단편)을 삽입하여 재조합 단백질이 제조되는 클로닝 용액의 도식을 나타낸다.
도 2는 실시예 2에서 제조된 18개의 재조합 단백질의 SDS-PAGE 결과와, 재조합 단백질에 의해 형성된 바이러스-유사 입자의 투과 전자 현미경(TEM) 결과를 나타낸다.
도 3은 실시예 2에서 제조된 18개의 재조합 단백질에 의해 형성된 바이러스-유사 입자로 BALB/C 마우스를 면역화시킨 후, 시간이 경과함에 따라 마우스 혈청 재의 재조합 단백질에서 타겟 폴리펩티드에 대한 항체 역가의 변화를 나타낸다. 세로축: 항체 역가(log10); 가로축: 시간(week). 도 3A: 사용된 타겟 폴리펩티드는 서열번호 20이고, 항-GP120 항체의 역가가 측정되었다; 도 3B: 사용된 타겟 폴리펩티드는 서열번호 21이고, 항-PD-L1 항체의 역가가 측정되었다; 도 3C: 사용된 타겟 폴리펩티드는 서열번호 22이고, 항-HBsAg 항체의 역가가 측정되었다.
도 4는 동일한 에피토프 펩티드(서열번호 1)를 제시하는 상이한 바이러스-유사 입자로HBV 트랜스제닉 수컷(도 4A) 및 암컷(도 4B) 마우스를 처리한 후, 시간 경과에 따른 마우스 혈청에서의 HBsAg 수준의 변화를 나타낸다. 세로축: HBsAg 수준(IU/ml); 가로축: 시간(week). 화살표는 마우스에 바이러스-유사 입자를 투여한 시점을 나타낸다.
도 5는 동일한 에피토프 펩티드(서열번호 22)를 제시하는 상이한 바이러스-유사 입자로 HBV 트랜스제닉 수컷 마우스를 처리한 후, 시간 경과에 따른 마우스 혈청에서의 HBV DNA 수준의 변화를 나타낸다. 세로축: HBV DNA 수준(Log10 IU/ml); 가로축: 시간(week). 화살표는 마우스에 바이러스-유사 입자를 투여한 시점을 나타낸다.
도 6은 동일한 에피토프 펩티드(서열번호 22)를 제시하는 상이한 바이러스-유사 입자로 HBV 트랜스제닉 수컷(도 6A) 및 암컷(도 6B) 마우스를 처리한 후, 시간 경과에 따른 마우스 혈청에서의 항-HBsAg 항체의 역가를 나타낸다. 세로축: 항-HBsAg 항체; 가로축: 시간(week).
도 7은 실시예 5에서 제조한 6개의 재조합 단백질에 의해 형성된 바이러스-유사 입자의 TEM 결과를 나타낸다.
도 8은 8개의 재조합 단백질에 의해 형성된 바이러스-유사 입자로 BALB/C 마우스를 면역화시킨 3주 후에, 마우스 혈청에서의 상응하는 타겟 폴리펩티드(서열번호 60, 22, 61, 및 62)에 대한 항체 역가를 나타내며; HBV 유전자형 A로부터의 HBsAg 단백질의 에피토프 펩티드 (서열번호 60)를 사용하여 RBHBcAg149-SEQ60 및 TBHBcAg153-SEQ60으로 면역화된 마우스의 혈청에서의 항체 역가를 측정함; HBV 유전자형 B로부터의 HBsAg 단백질의 에피토프 펩타이드 (서열번호 22)를 사용하여 RBHBcAg149-SEQ22 및 TBHBcAg153-SEQ22로 면역화된 마우스의 혈청에서의 항체 역가를 측정함; HBV 유전자형 C로부터의 HBsAg 단백질의 에피토프 펩티드 (서열번호 61)를 사용하여 RBHBcAg149-SEQ61 및 TBHBcAg153-SEQ61로 면역화된 마우스의 혈청에서의 항체 역가를 측정함; 그리고 HBV 유전자형 D로부터의 HBsAg 단백질의 에피토프 펩티드 (서열번호 62)를 사용하여 RBHBcAg149-SEQ62 및 TBHBcAg153-SEQ62로 면역화된 마우스의 혈청에서의 항체가를 측정하였다. 결과는 8개의 재조합 단백질에 의해 형성된 모든 바이러스-유사 입자가 우수한 면역원성을 가지며, 마우스에서 타겟 항원에 특이적으로 결합하는 고-역가 항체의 생성을 유도할 수 잇음을 보여준다.
도 9는 4개의 재조합 단백질(서열번호 36, 69, 70, 및 71)에 의해 형성된 바이러스-유사 입자로 HBV 트랜스제닉 수컷(도 9A) 및 암컷(도 9B) 마우스의 처리 후, 시간 경과에 따른 마우스 혈청에서의 HBsAg 수준의 변화를 나타내며, 세로축: HBsAg 수준(IU/ml); 가로축: 시간(week)이다.
본 출원의 발명자들은, 3가지 박쥐 유래 B형 간염 바이러스 코어 항원(즉, 라운드리프 박쥐(roundleaf bat) HBV (RBHBV) 코어 항원(RBHBcAg); 천막박쥐(tent-making bat) HBV(TBHBV) 코어 항원 (TBHBcAg); 및 관박쥐(horseshoe bat) HBV 코어 항원(HBHBcAg))에 기초하여, 타겟 폴리펩티드를 제시하기 위한 새로운 폴리펩티드 캐리어(펩타이드 캐리어)의 종류를 개발했다. 따라서, 본 발명은 폴리펩티드 캐리어를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산분자를 제공한다. 이러한 핵산분자는 그 안에 삽입된 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있고, 폴리펩티드 캐리어와 타겟 폴리펩티드(예를 들어, 타겟 항원 또는 항원의 타겟 에피토프)를 포함하는 재조합 단백질로서 발현될 수 있다. 또한 제조된 재조합 단백질은 VLP를 효율적으로 형성할 수 있고, VLP 표면에 삽입된 타겟 폴리펩티드를 제시할 수 있으므로, 타겟 폴리펩티드가 유기체의 면역계에 의해 효과적으로 인식됨으로써 유기체에서 타겟 폴리펩티드에 대한 특이적인 면역 반응의 생성을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드 캐리어는 백신의 캐리어로서, 타겟 폴리펩티드, 예를 들어 펩타이드 단편(예를 들어, 에피토프)을 제시할 수 있다; 그리고 본 발명의 폴리펩티드 캐리어 및 타겟 폴리펩티드를 포함하는 재조합 단백질은 백신으로 사용되어 유기체에서 타겟 폴리 펩타이드에 대한 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있다.
또한, 본 출원의 발명자들은 놀랍게도 RBHBcAg 단백질, TBHBcAg 단백질 및 HBHBcAg 단백질의 C 말단이 라이신이 풍부한 영역이고, VLP의 어셈블리에 필요하지 않음을 발견했다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드 캐리어는 RBHBcAg 단백질, TBHBcAg 단백질 및 HBHBcAg 단백질의 C 말단을 포함하지 않을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 RBHBcAg 캐리어는 RBHBcAg 단백질의 145-189 위치가 부분적으로 또는 완전히 결실된 아미노산을 가질 수 있다(예를 들어, RBHBcAg 단백질의 150-189 위치가 결실된 아미노산을 가질 수 있다); 본 발명의 TBHBcAg 캐리어는 부분적으로 또는 완전히 결실된 TBHBcAg 단백질의 149-188 위치의 아미노산을 가질 수 있다(예를 들어, TBHBcAg 단백질의 154-188 위치가 결실된 아미노산을 가질 수 있다); 본 발명의 HBHBcAg 캐리어는 HBHBcAg 단백질의 145-189 위치가 부분적으로 또는 완전히 결실된 아미노산을 가질 수 있다(예를 들어, HBHBcAg 단백질의 150-189 위치가 결실된 아미노산을 가질 수 있다).
또한, 본 출원의 발명자들은 놀랍게도, 본 발명의 폴리펩티드 캐리어가 인간 B형 간염 바이러스(예를 들어, 인간 HBV로부터의 HBsAg의 에피토프)로부터 항원 에피토프를 제시하는 데 특히 적합하고, 기존의 B형 간염 백신(예를 들어, 동일한 에피토프를 포함하고, 인간 HBV의 HbcAg를 폴리펩티드 캐리어로 사용하여 제작된 백신)보다 훨씬 효과가 우수한, 대상체에서의 HBsAg를 정화하기 위한 매우 강력하고 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 발견했다. 따라서, 본 발명은 인간 B형 간염 바이러스로부터 항원 에피토프를 제시하는 데 특히 적합한 폴리펩티드 캐리어를 제공한다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 캐리어 또는 이의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산분자를 제공하며, 상기 변이체는 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)의 상동성을 가지거나, 또는 엄격한 조건 또는 엄격 조건(stringent condition)이나 높은 엄격 조건 하에서 상기 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있고, 상기 폴리펩티드 캐리터는 하기로부터 선택된다:
(1) 라운드리프 박쥐 HBV 코어 항원 단백질과 상이한 RBHBcAg 캐리어(RBHBcAg; 예를 들어, 이의 아미노산 서열은 서열번호 1에 제시됨): (a) RBHBcAg 단백질의 N 말단에서 78-83 위치의 아미노산 잔기의 하나 이상의 아미노산 잔기(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 아미노산 잔기; 예를 들어 78-83 위치의 아미노산 잔기, 78-82 위치의 아미노산 잔기, 78-81 위치의 아미노산 잔기 또는 78-80 위치의 아미노산 잔기)가 결실되거나 링커(예를 들어, 가요성 링커(flexible linker); 예를 들어 서열번호 43에 기재된 링커)로 치환됨; 및 (b) 선택적으로 1-40 아미노산 잔기(예를 들어, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 또는 35-40 아미노산 잔기)가 RBHBcAg 단백질의 C 말단에서 결실됨;
(2) 천막박쥐 HBV 코어 항원 단백질과 상이한 TBHBcAg 캐리어(TBHBcAg; 예를 들어, 이의 아미노산 서열은 서열번호 2에 기재됨): (a) TBHBcAg 단백질의 N 말단에서 80-84 위치 아미노산 잔기의 하나 이상의 아미노산 잔기(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기; 예를 들어, 80-84 위치의 아미노산 잔기, 80-83 위치의 아미노산 잔기, 또는 80-82 위치의 아미노산 잔기)가 결실되거나 링커(예를 들어, 가요성 링커(flexible linker); 예를 들어 서열번호 43에 기재된 링커)로 치환됨; 및 (b) 선택적으로, 1-35 아미노산 잔기(예를 들어, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 또는 30-35 아미노산 잔기)가 TBHBcAg 단백질의 C 말단에서 결실됨; 또는
(3) 관박쥐 HBV 코어 항원 단백질과 상이한 HBHBcAg; 예를 들어, 이의 아미노산 서열은 서열번호 3에 기재됨): (a) HBHBcAg 단백질의 N 말단에서 78-83 위치 아미노산 잔기의 하나 이상의 아미노산 잔기(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 아미노산 잔기; 예를 들어 78-83 위치의 아미노산 잔기, 78-82 위치의 아미노산 잔기, 78-81 위치의 아미노산 잔기 또는 78-80 위치의 아미노산 잔기)가 결실되거나 링커(예를 들어, 가요성 링커(flexible linker); 예를 들어 서열번호 43에 기재된 링커)로 치환됨; 및 (b) 선택적으로, 1-40 아미노산 잔기(1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 또는 35-40 아미노산 잔기)가 HBHBcAg 단백질의 C 말단에서 결실됨.
바람직한 양태에서, 변이체는 폴리펩티드 캐리어를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%의 상동성, 예를 들어 어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99 %의 상동성을 가진다.
바람직한 양태에서, 변이체는 엄격 조건(stringent condition) 하에 폴리펩티드 캐리어를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있다. 바람직한 양태에서, 변이체는 높은 엄격 조건 하에서 폴리펩티드 캐리어를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있다.
바람직한 양태에서, RBHBcAg 단백질은 야생형 RBHBcAg이다. 바람직한 양태에서, RBHBcAg 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1에 기재된다.
바람직한 양태에서, RBHBcAg 캐리어는 RBHBcAg 단백질의 N 말단의 78-83 위치의 아미노산 잔기의 하나 이상의 인접 아미노산 잔기(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 인접 아미노산 잔기)가 결실되거나 링커로 치환된다는 점에서 RBHBcAg 단백질과 다르다. 예를 들어, RBHBcAg 단백질의 N 말단에서 78-83 위치의 아미노산 잔기, 78-82 위치의 아미노산 잔기, 78-81 위치의 아미노산 잔기, 78-80 위치의 아미노산 잔기, 80-83 위치의 아미노산 잔기, 80-82 위치의 아미노산 잔기, 80-81 위치의 아미노산 잔기, 81-83 위치의 아미노산 잔기, 81-82 위치의 아미노산 잔기, 82-83 위치의 아미노산 잔기, 78 위치의 아미노산 잔기, 79 위치의 아미노산 잔기, 80 위치의 아미노산 잔기, 81 위치의 아미노산 잔기, 82 위치의 아미노산 잔기 또는 83 위치의 아미노산 잔기가 결실되거나 링커로 치환될 수 있다. 바람직한 양태에서, 링커는, 예를 들어 가요성 링커이다. 이러한 가요성 링커는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, GGGGGSGGGGTGSEFGGGGSGGGGS (서열번호 43)이다.
바람직한 양태에서, RBHBcAg 캐리어는 RBHBcAg 단백질과 다음과 같은 점에서 다르다: (1) 앞서 정의한 바와 같이, RBHBcAg 단백질의 N 말단의 78-83 위치의 아미노산 잔기의 하나 이상의 인접 아미노산 잔기(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 인접 아미노산 잔기)가 결실되거나 링커로 치환되고; (2) RBHBcAg 단백질의 C 말단의 1-40 개의 아미노산 잔기가 결실됨. 바람직한 양태에서, RBHBcAg 단백질의 C 말단에서 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35 또는 35-40 개의 아미노산 잔기가 결실된다; 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40 아미노산 잔기가 결실된다.
바람직한 양태에서, TBHBcAg 단백질은 야생형 TBHBcAg이다. 바람직한 양태에서, TBHBcAg 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2에 기재된다.
바람직한 양태에서, TBHBcAg 캐리어는 TBHBcAg 단백질의 N 말단의 80-84 위치의 아미노산 잔기의 하나 이상의 인접 아미노산 잔기(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 인접 아미노산 잔기)가 결실되거나 링커로 치환된다는 점에서 TBHBcAg 단백질과 다르다. 예를 들어, TBHBcAg 단백질의 N 말단에서 80-84 위치의 아미노산 잔기, 80-83 위치의 아미노산 잔기, 81-84 위치의 아미노산 잔기, 81-83 위치의 아미노산 잔기, 81-82 위치의 아미노산 잔기, 82-84 위치의 아미노산 잔기, 82-83 위치의 아미노산 잔기, 83-84 위치의 아미노산 잔기, 80 위치의 아미노산 잔기, 81 위치의 아미노산 잔기, 82 위치의 아미노산 잔기 83 위치의 아미노산 잔기 또는 84 위치의 아미노산 잔기가 결실되거나 링커로 치환될 수 있다. 바람직한 양태에서, 링커는, 예를 들어 가요성 링커이다. 이러한 가요성 링커는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, GGGGGSGGGGTGSEFGGGGSGGGGS (서열번호 43)이다.
바람직한 양태에서, TBHBcAg 캐리어는 TBHBcAg 단백질과 다음과 같은 점에서 다르다: (1) 앞서 정의한 바와 같이, TBHBcAg 단백질의 N 말단의 80-84 위치의 아미노산 잔기의 하나 이상의 인접 아미노산 잔기(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 인접 아미노산 잔기)가 결실되거나 링커로 치환되고; (2) TBHBcAg 단백질의 C 말단의 1-35 개의 아미노산 잔기가 결실됨. 바람직한 양태에서, TBHBcAg 단백질의 C 말단에서 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 또는 30-35 아미노산 잔기가 결실된다; 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35 개의 아미노산 잔기가 결실된다.
바람직한 양태에서, HBHBcAg 단백질은 야생형 HBHBcAg이다. 바람직한 양태에서, HBHBcAg의 아미노산 서열은 서열번호 3에 기재된다.
바람직한 양태에서, HBHBcAg 캐리어는 HBHBcAg 단백질의 N 말단의 78-83 위치의 아미노산 잔기의 하나 이상의 인접 아미노산 잔기(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 인접 아미노산 잔기)가 결실되거나 링커로 치환된다는 점에서 HBHBcAg 단백질과 다르다. 예를 들어, HBHBcAg 단백질의 N 말단에서 78-83 위치의 아미노산 잔기, 78-82 위치의 아미노산 잔기, 78-81 위치의 아미노산 잔기, 78-80 위치의 아미노산 잔기, 78-79 위치의 아미노산 잔기, 79-83 위치의 아미노산 잔기, 79-82 위치의 아미노산 잔기, 79-81 위치의 아미노산 잔기, 79-80 위치의 아미노산 잔기, 80-83 위치의 아미노산 잔기, 80-82 위치의 아미노산 잔기, 80-81 위치의 아미노산 잔기, 81-83 위치의 아미노산 잔기, 81-82 위치의 아미노산 잔기, 82-83 위치의 아미노산 잔기, 78 위치의 아미노산 잔기, 79 위치의 아미노산 잔기, 80 위치의 아미노산 잔기, 81 위치의 아미노산 잔기, 82 위치의 아미노산 잔기 또는 83 위치의 아미노산 잔기가 결실되거나 링커로 치환될 수 있다. 바람직한 양태에서, 링커는, 예를 들어 가요성 링커이다. 이러한 가요성 링커는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, GGGGGSGGGGTGSEFGGGGSGGGGS (서열번호 43)이다.
바람직한 양태에서, HBHBcAg 캐리어는 HBHBcAg 단백질과 다음과 같은 점에서 다르다: (1) 앞서 정의한 바와 같이, HBHBcAg 단백질의 N 말단의 78-83 위치의 아미노산 잔기의 하나 이상의 인접 아미노산 잔기(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 인접 아미노산 잔기)가 결실되거나 링커로 치환되고; (2) HBHBcAg 단백질의 C 말단의 1-40 개의 아미노산 잔기가 결실됨. 바람직한 양태에서, HBHBcAg 단백질의 C 말단에서 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35 또는 35-40 개의 아미노산 잔기가 결실된다; 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40 아미노산 잔기가 결실된다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 제한효소 절단 부위의 도입이 특히 유리하다. 따라서, 바람직한 양태에서, 본 발명의 핵산분자에서, 제한효소 절단 부위는 결실된 하나 이상의 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드 위치에 도입된다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 핵산분자에서, 제한효소 절단 부위는 링커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 그의 한쪽 또는 양쪽 말단에 도입된다. 바람직한 양태에서, 하나 이상의 제한효소 절단 부위는 본 발명의 핵산분자 및/또는 그의 한쪽 또는 양쪽 말단에 도입된다. EcoR I, BamH I, Hind II, Hind III, Hpa I, Hpa II, Mbo I, 및 Mbo II 등의 제한효소에 의해 인식되는 효소절단 부위를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌 다양한 제한효소 절단 부위가 당업자에게 공지되어 있다.
바람직한 양태에서, 폴리펩티드 캐리어는 서열번호 4 내지 9로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
바람직한 양태에서, 핵산분자는 서열번호 12 내지 17로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직한 양태에서, 핵산분자는 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 삽입에 사용된다. 예를 들어, 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 결실된 하나 이상의 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드의 위치에 삽입되거나, 링커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 한쪽 또는 양쪽 말단에 삽입된다. 바람직한 양태에서, 인-프레임(in-frame) 방식으로, 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드 캐리어를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 삽입된다. 바람직한 양태에서, 제한효소 절단 부위에 의해, 타겟 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 폴리펩타이드 캐리어를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 삽입된다.
바람직한 양태에서, 핵산분자는 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 상기 타겟 폴리펩티드는 폴리펩티드 캐리어에 대해 이종(heterologous)이고, 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 결실된 하나 이상의 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드 위치에 삽입되거나, 또는 링커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 말단 중 하나 또는 둘 모두에 삽입된다. 인-프레임(in-frame) 방식으로, 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드 캐리어를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 삽입된다. 바람직한 양태에서, 제한효소 절단 부위에 의해, 타겟 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 폴리펩타이드 캐리어를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 삽입된다.
바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 항원성 에피토프를 포함하는 항원 또는 에피토프 펩티드이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 에피토프 펩티드이며, 예를 들어, HIV, PDL1 또는 HBV(특히 인간 HBV)로부터의 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩티드이다.
바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는, 인간 HBV의 HBsAg 또는 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프 펩타이드이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드 캐리어는 RBHBcAg 캐리어이고, 에피토프 펩티드는 HIV, PDL1 또는 HBV(특히 인간 HBV)(예를 들어, 인간 HBV로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)로부터의 항원성 에피토프이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드 캐리어는 TBHBcAg 캐리어이고, 에피토프 펩티드는 HIV, PDL1 또는 HBV(특히 인간 HBV)(예를 들어, 인간 HBV로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)로부터의 항원성 에피토프이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드 캐리어는 HBHBcAg 캐리어이고, 에피토프 펩티드는 HIV, PDL1 또는 HBV(특히 인간 HBV)(예를 들어, 인간 HBV로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)로부터의 항원성 에피토프이거나, 이를 포함한다.
바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 인간 HBV의 HBsAg 단백질 또는 상기 HBsAg 단백질의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프 펩티드이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, HBV는 HBV 유전자형 A, B, C 및 D 중에서 선택된다. 바람직한 양태에서, HBsAg 단백질의 에피토프는 HBsAg 단백질의 113-135 위치의 아미노산이다.
바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 HIV GP120 단백질 또는 상기 HIV GP120 단백질의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프 펩티드이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 에피토프 펩티드는 GP120 단백질의 361-375 위치의 아미노산이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 인간 PD-L1 단백질 또는 인간 PD-L1 단백질의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프 펩티드이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 에피토프 펩티드는 인간 PD-L1 단백질의 147-160 위치의 아미노산이거나, 이를 포함한다.
바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 서열번호 20 내지 22 및 60 내지 62로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 양태에서, 핵산분자는 서열번호 23 내지 40 및 69 내지 74로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 그 서열로 이루어진다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 앞서 정의한 바와 같은 본 발명의 핵산분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
타겟 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 본 발명의 핵산분자)를 삽입하기 위한 벡터는 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함하나, 이에 한정되지는 않으며, 당업계에 잘 알려져 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 벡터는 진핵세포 발현벡터 또는 원핵세포 발현벡터일 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드(cosmid) 또는 파지(phage) 등이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 핵산분자 또는 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다. 이러한 숙주세포는 대장균 세포와 같은 원핵세포, 효모세포, 곤충세포, 식물세포 및 동물세포(예를 들어, 포유동물세포, 예를 들어, 마우스세포, 인간세포 등)와 같은 진핵세포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 숙주세포는 293T 세포와 같은 세포주일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 타겟 폴리펩티드를 제시하는 방법에 관한 것으로,
(1) 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 수득하기 위해 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 본 발명의 핵산 분자(특히, 폴리펩티드 캐리어를 코딩하는 뉴클레오티드 서열)에 삽입하는 단계; 및
(2) 단계 (1)의 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 발현시켜 재조합 단백질을 생산하는 단계; 를 포함한다.
바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 폴리펩티드 캐리어에 대해 이종이다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 결실된 하나 이상의 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클리오티드의 위치에 삽입되거나, 링커를 코딩하는 뉴클리오티드 서열 또는 그의 한쪽 또는 양쪽 말단에 삽입된다. 바람직한 양태에서, 인-프레임 방식으로, 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드 캐리어를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 삽입된다. 바람직한 양태에서, 제한효소 절단 부위에 의해, 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드 캐리어를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 삽입된다.
바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩타이드이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 에피토프 펩티드, 예를 들어, HIV, PDL1 또는 HBV(특히 인간 HBV)로부터의 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩티드이다.
바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는, 인간 HBV의 HBsAg 또는 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프 펩티드이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드 캐리어는 RBHBcAg 캐리어이고, 에피토프 펩티드는 HIV, PDL1 또는 HBV(특히 인간 HBV), 예를 들어, 인간 HBV로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)로부터의 항원성 에피토프이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드 캐리어는 TBHBcAg 캐리어이고, 에피토프 펩티드는 HIV, PDL1 또는 HBV(특히 인간 HBV), 예를 들어, 인간 HBV로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)로부터의 항원성 에피토프이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드 캐리어는 HBHBcAg 캐리어이고, 에피토프 펩티드는 HIV, PDL1 또는 HBV(특히 인간 HBV), 예를 들어, 인간 HBV로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)로부터의 항원성 에피토프이거나, 이를 포함한다.
바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 인간 HBV의 HBsAg 단백질 또는 상기 HBsAg 단백질의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프 펩티드이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, HBV는 HBV 유전자형 A, B, C 및 D 중에서 선택된다. 바람직한 양태에서, HBsAg 단백질의 에피토프는 HBsAg 단백질의 113-135 위치의 아미노산이다.
바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 HIV GP120 단백질 또는 상기 HIV GP120 단백질의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프 펩티드이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 에피토프 펩티드는 GP120 단백질의 361-375 위치의 아미노산이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 인간 PD-L1 단백질 또는 인간 PD-L1 단백질의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프 펩티드이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 에피토프 펩티드는 인간 PD-L1 단백질의 147-160 위치의 아미노산이거나, 이를 포함한다.
바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 서열번호 20 내지 22 및 60 내지 62로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 양태에서, 핵산분자는 서열번호 23 내지 40 및 69 내지 74로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 그 서열로 이루어진다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드 캐리어 및 타겟 폴리펩티드를 포함하는 재조합 단백질에 관한 것으로, 상기 타겟 폴리펩티드 캐리어는 앞서 정의된 바와 동일한 의미를 가지며, 타겟 폴리펩티드는 폴리펩티드 캐리어에 삽입된다.
바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 결실된 하나 이상의 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클리오티드의 위치에 삽입되거나, 링커 또는 그의 한쪽 또는 양쪽 말단에 삽입된다.
바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩타이드이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 에피토프 펩티드, 예를 들어, HIV, PDL1 또는 HBV(특히 인간 HBV)로부터의 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩티드이다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는, 인간 HBV의 HBsAg 또는 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프 펩티드이거나, 이를 포함한다.
바람직한 양태에서, 폴리펩티드 캐리어는 RBHBcAg 캐리어이고, 에피토프 펩티드는 HIV, PDL1 또는 HBV(특히 인간 HBV), 예를 들어, 인간 HBV로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)로부터의 항원성 에피토프이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드 캐리어는 TBHBcAg 캐리어이고, 에피토프 펩티드는 HIV, PDL1 또는 HBV(특히 인간 HBV), 예를 들어, 인간 HBV로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)로부터의 항원성 에피토프이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드 캐리어는 HBHBcAg 캐리어이고, 에피토프 펩티드는 HIV, PDL1 또는 HBV(특히 인간 HBV), 예를 들어, 인간 HBV로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)로부터의 항원성 에피토프이거나, 이를 포함한다.
바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 인간 HBV의 HBsAg 단백질 또는 상기 HBsAg 단백질의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프 펩티드이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, HBV는 HBV 유전자형 A, B, C 및 D 중에서 선택된다. 바람직한 양태에서, HBsAg 단백질의 에피토프는 HBsAg 단백질의 113-135 위치의 아미노산이다.
바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 HIV GP120 단백질 또는 상기 HIV GP120 단백질의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프 펩티드이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 에피토프 펩티드는 GP120 단백질의 361-375 위치의 아미노산이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 인간 PD-L1 단백질 또는 인간 PD-L1 단백질의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프 펩티드이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 에피토프 펩티드는 인간 PD-L1 단백질의 147-160 위치의 아미노산이거나, 이를 포함한다.
바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 서열번호 20 내지 22 및 60 내지 62로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드 캐리어는 서열번호 4 내지 9로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 양태에서, 재조합 단백질은 서열번호 23 내지 40 및 69 내지 74로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 그 서열로 이루어진다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 재조합 단백질로 이루어지거나, 재조합 단백질을 포함하는 바이러스-유사 입자에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 재조합 단백질 또는 바이러스-유사 입자, 및 선택적으로, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 비히클(vehicle) 또는 부형제(excipient)(예를 들어, 보조제(adjuvant))를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 재조합 단백질 또는 바이러스-유사 입자는 약학 조성물에 유효량으로 존재한다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 HBV 감염 또는 HBV 감염에 관련된 질병(예: B형 간염)의 예방 또는 치료에 유효한 양으로 재조합 단백질 또는 바이러스-유사 입자를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HBV 감염 또는 또는 HBV 감염에 관련된 질병(예: B형 간염)을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것으로, 이를 필요로 하는 대상에게, HBV(특히 인간 HBV)로부터의 항원성 에피토프를 포함하는 타겟 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 제조합 단백질 또는 바이러스-유사 입자 또는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 HBV(특히 인간 HBV)로부터의 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩티드이다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는, 인간 HBV의 HBsAg 또는 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프 펩티드이거나, 이를 포함한다.
바람직한 양태에서, 폴리펩티드 캐리어는 RBHBcAg 캐리어이고, 에피토프 HBV(특히 인간 HBV), 예를 들어, 인간 HBV로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)로부터의 항원성 에피토프이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드 캐리어는 TBHBcAg 캐리어이고, 에피토프 펩티드는 HBV(특히 인간 HBV), 예를 들어, 인간 HBV로부터의 HBsAg의 선형 에피토프)로부터의 항원성 에피토프이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드 캐리어는 HBHBcAg 캐리어이고, 에피토프 펩티드는 HBV(특히 인간 HBV), 예를 들어, 인간 HBV로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)로부터의 항원성 에피토프이거나, 이를 포함한다.
바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 인간 HBV의 HBsAg 단백질 또는 상기 HBsAg 단백질의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프 펩티드이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, HBV는 HBV 유전자형 A, B, C 및 D 중에서 선택된다. 바람직한 양태에서, HBsAg 단백질의 에피토프는 HBsAg 단백질의 113-135 위치의 아미노산이다.
바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 서열번호 22 및 60 내지 62로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 양태에서, 재조합 단백질은 서열번호 35 내지 40 및 69 내지 74로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 그 서열로 이루어진다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 재조합 단백질 또는 바이러스-유사 입자 또는 약학 조성물은 HBV 감염 또는 HBV 감염에 관련된 질병(예를 들어, B형 간염)의 예방 또는 치료에 효과적인 양으로 투여된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HBV 감염 또는 HBV 감염에 관련된 질병(예를 들어, B형 간염)을 예방하거나 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의 재조합 단백질 또는 바이러스-유사 입자의 용도에 관한 것으로, 타겟 폴리펩티드는 HBV(특히, 인간 HBV)로부터의 항원성 에피토프를 포함한다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 HBV(특히, 인간 HBV)로부터의 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩티드이다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 인간 HBV의 HBsAg 또는 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프 펩티드이거나, 이를 포함한다.
바람직한 양태에서, 폴리펩티드 캐리어는 RBHBcAg 캐리어이고, 에피토프 펩티드는 HBV(특히 인간 HBV), 예를 들어, 인간 HBV로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)로부터의 항원성 에피토프이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드 캐리어는 TBHBcAg 캐리어이고, 에피토프 펩티드는 HBV(특히 인간 HBV), 예를 들어, 인간 HBV로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)로부터의 항원성 에피토프이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드 캐리어는 HBHBcAg 캐리어이고, 에피토프 펩티드는 HBV(특히 인간 HBV) 예를 들어, 인간 HBV로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)로부터의 항원성 에피토프이거나, 이를 포함한다.
바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 인간 HBV의 HBsAg 단백질 또는 상기 HBsAg 단백질의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프 펩티드이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, HBV는 HBV 유전자형 A, B, C 및 D 중에서 선택된다. 바람직한 양태에서, HBsAg 단백질의 에피토프는 HBsAg 단백질의 113-135 위치의 아미노산이다.
바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 서열번호 22 및 60 내지 62로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 양태에서, 재조합 단백질은 서열번호 35 내지 40 및 69 내지 74로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 그 서열로 이루어진다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HBV 감염 또는 HBV 감염에 관련된 질병(예를 들어, B형 간염)을 예방하거나 치료하기 위한, 본 발명의 재조합 단백질 또는 바이러스-유사 입자 또는 약학 조성물에 관한 것으로, 타겟 폴리펩티드는 HBV(특히, 인간 HBV)로부터의 항원성 에피토프를 포함한다. 바라직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 HBV(특히, 인간 HBV)로부터의 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩티드이다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 인간 HBV의 HBsAg 또는 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프 펩티드이거나, 이를 포함한다.
바람직한 양태에서, 폴리펩티드 캐리어는 RBHBcAg 캐리어이고, 에피토프 펩티드는 HBV(특히 인간 HBV), 예를 들어, 인간 HBV로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)로부터의 항원성 에피토프이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드 캐리어는 TBHBcAg 캐리어이고, 에피토프 펩티드는 HBV(특히 인간 HBV), 예를 들어, 인간 HBV로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)로부터의 항원성 에피토프이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드 캐리어는 HBHBcAg 캐리어이고, 에피토프 펩티드는 HBV(특히 인간 HBV) 예를 들어, 인간 HBV로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)로부터의 항원성 에피토프이거나, 이를 포함한다.
바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 인간 HBV의 HBsAg 단백질 또는 상기 HBsAg 단백질의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프 펩티드이거나, 이를 포함한다. 바람직한 양태에서, HBV는 HBV 유전자형 A, B, C 및 D 중에서 선택된다. 바람직한 양태에서, HBsAg 단백질의 에피토프는 HBsAg 단백질의 113-135 위치의 아미노산이다.
바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 서열번호 22 및 60 내지 62로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 양태에서, 재조합 단백질은 서열번호 35 내지 40 및 69 내지 74로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 그 서열로 이루어진다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HIV 감염 또는 HIV 감염에 관련된 질병(예를 들어, AIDS)을 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것으로, 이를 필요로 하는 대상에게 본 발명의 재조합 단백질 또는 바이러스-유사 입자 또는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 타겟 폴리펩티드는 HIV의 항원성 에피토프를 포함한다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 HIV로부터의 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩티드이다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 HIV GP120 단백질 또는 GP120 단백질의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프이거나, 이를 포함한다.
바람직한 양태에서, 에피토프 펩티드는 GP120 단백질의 361-375 위치 아미노산을 포함하거나, 그 아미노산으로 이루어진다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 서열번호 20으로 제시되는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 양태에서, 재조합 단백질은 서열번호 23 내지 28로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 그 서열로 이루어진다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 재조합 단백질 또는 바이러스-유사 입자 또는 약학 조성물은 HIV 감염 또는 HIV 감염에 관련된 질병(예를 들어, AIDS)의 예방 또는 치료에 효과적인 양으로 투여된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HIV 감염 또는 HIV 감염에 관련된 질병(예를 들어, AIDS)을 예방하거나 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의 재조합 단백질 또는 바이러스-유사 입자의 용도에 관한 것으로, 타겟 폴리펩티드는 HIV로부터의 항원성 에피토프를 포함한다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 HIV로부터의 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩티드이다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 HIV GP120 단백질 또는 GP120 단백질의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프로부터 선택되거나, 이를 포함한다.
바람직한 양태에서, 에피토프 펩티드는 GP120 단백질의 361-375 위치 아미노산을 포함하거나, 그 아미노산으로 이루어진다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 서열번호 20으로 제시되는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 양태에서, 재조합 단백질은 서열번호 23 내지 28로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 그 서열로 이루어진다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HIV 감염 또는 HIV 감염에 관련된 질병(예를 들어, AIDS)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 재조합 단백질 또는 바이러스-유사 입자 또는 약학 조성물에 관한 것으로, 타겟 폴리펩티드는 HIV로부터의 항원성 에피토프를 포함한다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 HIV로부터의 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩티드이다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 HIV GP120 단백질 또는 GP120 단백질의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프이거나, 이를 포함한다.
바람직한 양태에서, 에피토프 펩티드는 GP120 단백질의 361-375 위치 아미노산을 포함하거나, 그 아미노산으로 이루어진다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 서열번호 20으로 제시되는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 양태에서, 재조합 단백질은 서열번호 23 내지 28로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 그 서열로 이루어진다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암(예를 들어, 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer))을 예방하거나 치료하기 위한 방법에 관한 것으로, 이를 필요로 하는 대상에게 본 발명의 재조합 단백질 또는 바이러스-유사 입자 또는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 타겟 폴리펩티드는 PD-L1의 항원성 에피토프를 포함한다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 인간 PD-L1 단백질의 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩티드이다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 인간 PD-L1 단백질 또는 인간 PD-L1 단백질의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프 펩티드이거나, 이를 포함한다.
바람직한 양태에서, 에피토프 펩티드는 PD-L1 단백질의 147-160 위치 아미노산을 포함하거나, 그 아미노산으로 이루어진다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 서열번호 21로 제시되는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 양태에서, 재조합 단백질은 서열번호 29 내지 34로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 그 서열로 이루어진다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 재조합 단백질 또는 바이러스-유사 입자 또는 약학 조성물은 암(예를 들어, 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer))의 예방 또는 치료에 효과적인 양으로 투여된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 암(예를 들어, 비소세포 폐암)을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의 재조합 단백질 또는 바이러스-유사 입자의 용도에 관한 것으로, 타겟 폴리펩티드는 인간 PD-L1 단백질로부터의 항원성 에피토프를 포함한다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 인간 PD-L1 단백질의 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩티드이다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 인간 PD-L1 단백질 또는 인간 PD-L1 단백질로부터의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프 펩티드이거나, 이를 포함한다.
바람직한 양태에서, 에피토프 펩티드는 PD-L1 단백질의 147-160 위치 아미노산을 포함하거나, 그 아미노산으로 이루어진다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 서열번호 21로 제시되는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 양태에서, 재조합 단백질은 서열번호 29 내지 34로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 그 서열로 이루어진다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암(예를 들어, 비소세포 폐암)을 예방하거나 치료하기 위한 본 발명의 재조합 단백질 또는 바이러스-유사 입자 또는 약학 조성물에 관한 것으로, 타겟 폴리펩티드는 인간 PD-L1 단백질로부터의 항원성 에피토프를 포함한다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 인간 PD-L1 단백질의 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩티드이다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 인간 PD-L1 단백질 또는 인간 PD-L1 단백질로부터의 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프)를 포함하는 에피토프 펩티드이거나, 이를 포함한다.
바람직한 양태에서, 에피토프 펩티드는 PD-L1 단백질의 147-160 위치 아미노산을 포함하거나, 그 아미노산으로 이루어진다. 바람직한 양태에서, 타겟 폴리펩티드는 서열번호 21로 제시되는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 양태에서, 재조합 단백질은 서열번호 29 내지 34로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 그 서열로 이루어진다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 재조삽 단백질 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
타겟 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 본 발명의 핵산분자)를 삽입하기 위한 벡터는 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함하나, 이에 한정되지는 않으며, 당업계에 잘 알려져 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 벡터는 진핵세포 발현벡터 또는 원핵세포 발현벡터일 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드(cosmid) 또는 파지(phage) 등이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다. 이러한 숙주세포는 대장균 세포와 같은 원핵세포, 효모세포, 곤충세포, 식물세포 및 동물세포(예를 들어, 포유동물세포, 예를 들어, 마우스세포, 인간세포 등)와 같은 진핵세포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 숙주세포는 293T 세포와 같은 세포주일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 재조합 단백질의 제조방법에 관한 것으로, 재조합 단백질의 발현에 적합한 조건하에 본 발명의 숙주세포를 배양하는 단계 및 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 관련 용어에 대한 정의 및 설명
본 발명에서, 달리 명시하지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 과학적 및 기술적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 또한, 본 명세서에서 사용된 세포배양, 분자 유전학, 핵산 화학 및 면역학의 실험식 운영 단계는 해당 분야에서 널리 사용되는 통상적인 단계이다. 또한, 본 발명을 더 잘 이해하기 위해, 관련 용여의 정의 및 설명이 다음과 같이 제공된다.
본 명세서에서 사용된 용어, "라운드리프 박쥐 HBV 코어 항원 단백질(RBHBcAg)" 및 "RBHBcAg 단백질"은 라운드리프 박쥐 HBV(RBHBV)로부터의 코어 항원 단백질을 의미하며, 이는 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, NCBI GENBANK 수탁번호: KC790373.1 참조).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, RBHBcAg 단백질의 아미노산 서열이 언급될 때, 이는 서열번호 1로 제시되는 서열을 참조하여 기술된다. 예를 들어, "RBHBcAg 단백질의 N 말단에서 78-83 위치의 아미노산 잔기"라는 표현은, 서열번호 1에 기재된 폴리펩티드의 78-83 위치의 아미노산 잔기를 의미한다. 그러나, 당업자는 돌연변이 또는 변이체(치환, 결실 및/또는 부가를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 예를 들어, RBHBcAg 단백질의 다른 유전자형 또는 아형(subtype))가 자연적으로 발생하거나 또는 그의 생물학적 성질에 영향을 주지 않으면서 RBHBcAg 단백질의 아미노산 서열에 인위적으로 도입될 수 있다는 것을 이해한다. 따라서, 본 발명에서, 용어 "RBHBcAg 단백질"은 서열번호 1에 기재된 서열 및 그의 천연 또는 인공 변이체를 포함하는 모든 이와 같은 서열을 포함하고자 한다. 또한, RBHBcAg 단백질의 서열 단편이 기술될 때, 서열번호 1의 서열 단편뿐만 아니라 그의 천연 또는 인공 변이체에 상응하는 서열 단편도 포함한다. 예를 들어, "RBHBcAg 단백질의 N 말단에서 78-83 위치의 아미노산 잔기"라는 표현은, 서열번호 1의 78-83 위치로부터의 아미노산 잔기 및 이의 변이체(천연 또는 인공 변이체)의 상응하는 단편을 포함한다. 본 발명에 따르면, "상응하는 서열 단편" 또는 "상응하는 단편"이라는 표현은 서열이 최적화된 정렬을 받을 때, 즉, 서열이 동일성의 가장 높은 퍼센트를 얻기 위해 정렬될 때, 서열의 동일한 위치에 위치하는 단편을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "야생형 RBHBcAg"는 라운드리프 박쥐 HBV에서 자연적으로 생기는 코어 항원 단백질을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "RBHBcAg 캐리어"는 RBHBcAg 단백질 유래의 폴리펩티드 캐리어를 의미한다. 상술한 바와 같이, RBHBcAg 캐리어는 RBHBcAg 단백질과 다음과 같은 점에서 다르다: (a) RBHBcAg 단백질의 N 말단의 78-83 위치의 아미노산 잔기의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실되거나 링커로 치환되고; (2) 선택적으로, RBHBcAg 단백질의 C 말단의 1-40 개의 아미노산 잔기가 결실됨.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "천막 박쥐 HBV 코어 항원(TBHBcAg)" 및 "TBHBcAg 단백질"은 천막 박쥐 HBV(TBHBV)로부터의 코어 항원 단백질을 의미하며, 이는 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, NCBI GENBANK 수탁번호: KC790378.1 참조).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, TBHBcAg 단백질의 아미노산 서열이 언급될 때, 이는 서열번호 2에 기재된 서열을 참조하여 기술된다. 예를 들어, "TBHBcAg 단백질의 N 말단에서 80-84 위치의 아미노산 잔기"라는 표현은, 서열번호 2에 기재된 폴리펩티드의 80-84 위치의 아미노산 잔기를 의미한다. 그러나, 당업자는 돌연변이 또는 변이체(치환, 결실 및/또는 부가를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 예를 들어, TBHBcAg 단백질의 다른 유전자형 또는 아형(subtype))가 자연적으로 발생하거나 또는 그의 생물학적 성질에 영향을 주지 않으면서 TBHBcAg 단백질의 아미노산 서열에 인위적으로 도입될 수 있다는 것을 이해한다. 따라서, 본 발명에서, 용어 "TBHBcAg 단백질"은 서열번호 2에 기재된 서열 및 그의 천연 또는 인공 변이체를 포함하는 모든 이와 같은 서열을 포함하고자 한다. 또한, TBHBcAg 단백질의 서열 단편이 기술될 때, 서열번호 2의 서열 단편뿐만 아니라 그의 천연 또는 인공 변이체에 상응하는 서열 단편도 포함한다. 예를 들어, "TBHBcAg 단백질의 N 말단에서 80-84 위치의 아미노산 잔기"라는 표현은, 서열번호 2의 80-84 위치로부터의 아미노산 잔기 및 이의 변이체(천연 또는 인공 변이체)의 상응하는 단편을 포함한다. 본 발명에 따르면, "상응하는 서열 단편" 또는 "상응하는 단편"이라는 표현은 서열이 최적화된 정렬을 받을 때, 즉, 서열이 동일성의 가장 높은 퍼센트를 얻기 위해 정렬될 때, 서열의 동일한 위치에 위치하는 단편을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "야생형 TBHBcAg"는 천막 박쥐 HBV에서 자연적으로 생기는 코어 항원 단백질을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "TBHBcAg 캐리어"는 TBHBcAg 단백질 유래의 폴리펩티드 캐리어를 의미한다. 상술한 바와 같이, TBHBcAg 캐리어는 TBHBcAg 단백질과 다음과 같은 점에서 다르다: (a) TBHBcAg 단백질의 N 말단의 80-84 위치의 아미노산 잔기의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실되거나 링커로 치환되고; (2) 선택적으로, TBHBcAg 단백질의 C 말단의 1-35 개의 아미노산 잔기가 결실됨.
본 명세서에서 사용된 용어 "관박쥐 HBV코어 항원(HBHBcAg)" 및 "HBHBcAg 단백질"은 관박쥐 HBV 유래의 코어 항원 단백질을 의미하며, 이는 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, NCBI GENBANK 수탁번호: KC790377.1 참조).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, HBHBcAg 단백질의 아미노산 서열이 언급될 때, 이는 서열번호 3에 개시된 서열을 참조하여 기술된다. 예를 들어, "HBHBcAg 단백질의 N 말단에서 78-83 위치의 아미노산 잔기"라는 표현은, 서열번호 3에 기재된 폴리펩티드의 78-83 위치의 아미노산 잔기를 의미한다. 그러나, 당업자는 돌연변이 또는 변이체(치환, 결실 및/또는 부가를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 예를 들어, HBHBcAg 단백질의 다른 유전자형 또는 아형(subtype))가 자연적으로 발생하거나 또는 그의 생물학적 성질에 영향을 주지 않으면서 HBHBcAg 단백질의 아미노산 서열에 인위적으로 도입될 수 있다는 것을 이해한다. 따라서, 본 발명에서, 용어 "HBHBcAg 단백질"은 서열번호 3으로 기재된 서열 및 그의 천연 또는 인공 변이체를 포함하는 모든 이와 같은 서열을 포함하고자 한다. 또한, HBHBcAg 단백질의 서열 단편이 기술될 때, 서열번호 3의 서열 단편뿐만 아니라 그의 천연 또는 인공 변이체에 상응하는 서열 단편도 포함한다. 예를 들어, "HBHBcAg 단백질의 N 말단에서 78-83 위치의 아미노산 잔기"라는 표현은, 서열번호 3의 78-83 위치로부터의 아미노산 잔기 및 이의 변이체(천연 또는 인공 변이체)의 상응하는 단편을 포함한다. 본 발명에 따르면, "상응하는 서열 단편" 또는 "상응하는 단편"이라는 표현은 서열이 최적화된 정렬을 받을 때, 즉, 서열이 동일성의 가장 높은 퍼센트를 얻기 위해 정렬될 때, 서열의 동일한 위치에 위치하는 단편을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "야생형 HBHBcAg"는 관박쥐 HBV에서 자연적으로 생기는 코어 항원 단백질을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "HBHBcAg 캐리어"는 HBHBcAg 단백질 유래의 폴리펩티드 캐리어를 의미한다. 상술한 바와 같이, HBHBcAg 캐리어는 HBHBcAg 단백질과 다음과 같은 점에서 다르다: (a) TBHBcAg 단백질의 N 말단의 78-83 위치의 아미노산 잔기의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실되거나 링커로 치환되고; (2) 선택적으로, HBHBcAg 단백질의 C 말단의 1-40 개의 아미노산 잔기가 결실됨.
본 명세서에서 사용된 용어 "인간 HBV HBcAg" 및 "Hu-HBcAg"는 인간 B형 간염 바이러스의 코어 항원 단백질을 의미하며, 이는 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, NCBI GENBANK 수탁번호: AAO63517.1 참조). 본 명세서에서, 인간 HBV HBcAg의 아미노산 서열이 언급될 때, 이는 HCBI GENBACK 수탁번호 AAO63517.1에 기재된 서열로 기술된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "인간 HBV HBsAg" 및 "Hu-HBsAg"는 인간 B형 간염 바이러스의 표면 항원 단백질을 의미하며, 이는 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, NCBI GENBANK 수탁번호: AAF24729.1참조).
본 명세서 사용된 바와 같이, 인간 HBV HBsAg의 아미노산 서열이 언급될 때, 이는 서열번호 44(즉, NCBI GENBANK 수탁번호: AAF24729.1)에 기재된 서열을 참조로 기술된다. 예를 들어, "HBsAg 단백질의 113-135 위치의 아미노산 잔기"라는 표현은, 서열번호 44에 기재된 폴리펩티드의 113-135 위치로부터의 아미노산 잔기를 의미한다. 그러나, 당업자는 돌연변이 또는 변이체(치환, 결실 및/또는 부가를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 예를 들어, HBcAg 단백질의 다른 유전자형 또는 아형(subtype))가 자연적으로 발생하거나 또는 그의 생물학적 성질에 영향을 주지 않으면서 HBcAg 단백질의 아미노산 서열에 인위적으로 도입될 수 있다는 것을 이해한다. 따라서, 본 발명에서, 용어 "HBcAg 단백질"은 서열번호 44에 기재된 서열 및 그의 천연 또는 인공 변이체를 포함하는 모든 이와 같은 서열을 포함하고자 한다. 또한, HBcAg 단백질의 서열 단편이 기술될 때, 서열번호 44의 서열 단편뿐만 아니라 그의 천연 또는 인공 변이체에 상응하는 서열 단편도 포함한다. 예를 들어, "HBsAg 단백질의 113-135 위치의 아미노산 잔기"라는 표현은, 서열번호 44의 113-135 위치로부터의 아미노산 잔기 및 이의 변이체(천연 또는 인공 변이체)의 상응하는 단편을 포함한다. 본 발명에 따르면, "상응하는 서열 단편" 또는 "상응하는 단편"이라는 표현은 서열이 최적화된 정렬을 받을 때, 즉, 서열이 동일성의 가장 높은 퍼센트를 얻기 위해 정렬될 때, 서열의 동일한 위치에 위치하는 단편을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "X 단백질의 C 말단에서 결실된 Y 아미노산 잔기"라는 표현은, X 단백질의 C 말단에서 마지막 Y 아미노산 잔기가 완전히 결실되었음을 의미한다. 예를 들어, "RBHBcAg 단백질의 C 말단에서 결실된 1-40 아미노산 잔기"라는 표현은, RBHBcAg 단백질의 C 말단의 마지막 1-40 아미노산 잔기가 완전히 결실되었음을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "상동성(identity)"은, 2개의 폴리펩티드 사이 또는 2개의 핵산 사이의 일치 정도를 의미한다. 비교를 위한 2개의 서열이 특정 사이트(site)에서 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛을 갖는 경우(예를 들어, 2개의 DNA 분자 각각은 특정 사이트에 아데닌을 갖거나, 2개의 폴리펩티드 각각은 특정 사이트에 라이신을 갖는다), 두 분자는 그 사이트에서 동일하다. 두 서열간의 퍼센트 상동성은 비교를 위한 총 사이트 수×100에 대해 두 서열에 의해 공유되는 동일 사이트 수의 함수이다. 예를 들어, 두 서열의 10개 사이트 중 6개가 일치한다면, 이 두 서열의 상동성은 60%이다. 예를 들어, DNA 서열 CTGACT 과 CAGGTT는 50%의 상동성을 공유한다(6개의 사이트 중 3개가 일치). 일반적으로, 2개의 서열 비교는 최대의 상동성을 생성하는 방식으로 수행된다. 이러한 정렬은 Needleman 등의 방법에 기초한 정렬 프로그램 (DNAstar, Inc.)과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써 수행 될 수있다. (J. Mol. Biol. 48 : 443-453, 1970). 2개의 아미노산 서열 사이의 상동성 퍼센트는 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4 : 11-17 (1988))의 알고리즘을 사용하고, PAM 120 중량 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 캡 페널티 4를 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열 사이의 상동성 퍼센트는 GCG 소프트웨어의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 사용 가능)에 통합된 Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48 : 444-453 (1970))의 알고리즘을 사용하고, Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 갭 중량 16, 14, 12 10, 8, 6, 또는 4 및 길이 중량 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하여 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "보존적치환(conservative substitution)"은 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드의 생물학적 활성에 불리하게 영향을 주거나 이를 변화시키지 않는 아미노산 치환을 의미한다. 예를 들어, 보존적치환은 당해 기술분야에서 공지된 부위 특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis) 및 PCR 매개 돌연변이(PCR-mediated mutagenesis)와 같은 표준 기술에 의해 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기, 예를 들어, 상응하는 아미노산 잔기와 물리적 또는 기능적으로 유사한 잔기(유사한 크기, 형태, 전하, 공유 결합 또는 수소 결합을 형성하는 등의 능력을 포함하는 화학적 특성)로 치환되는 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 같는 아미노산 잔기의 패밀리가 당업계에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 알칼리성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산 및 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 상응하는 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 아미노산 보존적치환을 확인하는 방법은 당업계예 공지되어 있다(예를 들어, 본 명세서에 참조로 통합되는 Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); and Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997) 참조).
본 명세서에서 사용된 용어 "혼성화"는 특정 조건(예를 들어, 적절한 온도, 이온 세기 등) 하에서 상보적인 염기가 쌍을 이루는 원리에 기초하여 상보적인 서열을 갖는 2개의 단일 가닥 핵산 분자를 어닐링함으로써 이중 가닥 핵산을 형성하는 공정을 말한다. 핵산 혼성화는 DNA-DNA 사이뿐만 아니라, DNA-RNA 또는 RNA-RNA 사이에서도 염기쌍을 위한 상보적인 서열을 갖는 한, 발생할 수 있다. 핵산 혼성화에 대한 보다 상세한 설명에 관하여, 예를 들어, Henegariu O et al., (1999) "Custom fluorescent-nucleotide synthesis as an alternative method for nucleic acid labeling", Nature Biotechnology 18:345-348; Ezaki T et al., 1989. Fluorometric Deoxyribonucleic Acid-Deoxyribonucleic Acid Hybridization in Microdilution Wells as an Alternative to Membrane Filter Hybridization in which Radioisotopes Are Used to Determine Genetic Relatedness among Bacterial Strains. Int. J. of Systemic Bacteriology 29 (3): 224-229; and Herrington C et al., 1998. PCR 3: PCR in situ hybridization: a practical approach, Volume 3. Oxford: Oxford University Press.를 참조한다.
핵산 혼성화의 특이성을 보장하기 위해, 일반적으로 엄격 조건(stringent condition) 또는 높은 엄격 조건이 사용된다. 엄격 조건 및 높은 엄격 조건은 분자생물학 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 엄격 조건은 약 45℃에서 6 × 염화나트륨/시트르산 나트륨 (SSC)에서 혼성화한 다음, 0.2 × SSC / 0.1 % SDS에서 약 50-65 ℃에서 1 회 이상 세정하는 것을 의미할 수 있다. 높은 엄격 조건은 약 45℃에서 6 × SSC로 혼성화한 다음, 약 68℃에서 0.1×SSC / 0.2 % SDS로 1 회 이상 세정하는 것을 의미할 수 있다. 당업자에게 공지된 다른 엄격 조건 또는 높은 엄격 조건에 관하여, 예를 들어, Ausubel, F.M. et al. (ed.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. 및 John Wiley & Sons, Inc., New York, 페이지 6.3.1-6.3.6 및 2.10.3를 참조한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "링커"는 2개의 분자(예를 들어, 단백질)를 연결하기 위한 짧은 펩티드를 의미한다. 이러한 링커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, (Gly)4, (Gly)4-Ser, 및 ((Gly)4-Ser)3과 같은 가요성 링커를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 동일한 의미를 가지며, 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에서, 아미노산은 일반적으로 1 문자 코드 및 3 문자 코드로 표현된다. 예를 들어, 알라닌은 A 또는 Ala로 표현될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "제한효소 절단 부위"는 제한효소에 의해 인식되는 효소 절단 부위를 의미한다. 이러한 제한효소 절단 부위는, 당업자에게 잘 알려져 있으며, EcoR I, BamH I, Hind II, Hind III, Hpa I, Hpa II, Mbo I, 및 Mbo II 등의 제한효소에 의해 인식되는 효소 절단 부위를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항원성 에피토프", "항원 에피토프" 및 "에피토프"는 면역 글로불린 또는 항체에 의해 특이적으로 결합되는 항원 상의 부분을 의미한다. "에피토프"는 당업계에서 "항원 결정기"라고도 불린다. 에피토프 또는 항원 결정기는 일반적으로 아미노산, 탄수화물 또는 사카라이드 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹으로 이루어지며, 일반적으로 특정 3D 구조적 특성 및 특정 전하 특성을 갖는다. 예를 들어, 에피토프는 일반적으로 그의 독특한 형태로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 개의 인접 또는 비인접 아미노산을 포함하며, "선형" 또는 "구조적(conformational)"일 수 있다. 예를 들어, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)를 참조. 선형 에피토프에서, 단백질과 상호작용 분자(예를 들어, 항체) 사이의 모든 상호작용 부위는 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 존재한다. 구조적 에피토프에서, 상호작용 부위는 아미노산 잔기에 의해 서로 이격되어있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "HBsAg 에피토프"는 면역 글루볼린 또는 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 잇는 HBsAg 상의 부분을 의미한다. 인간 HBV의 HBsAg의 구조와 기능은 잘 연구되어 왔다. 또한, 많은 논문이 인간 HBV의 HBsAg에 대한 에피토프를 보고했다. 예를 들어, WO 97/39029 A2; WO 85/04103 A1; Xiaoxing Qiu 등, The Journal of Immunology, 1996, Vol. 156 권, 3350-3356 페이지; WO 2013/185558 A1 등을 참조.
본 명세서에서 사용된 용어 "에피토프 펩티드"는 에피토프를 형성하거나 에피토프로서 작용할 수 있는 항원 상의 펩티드 단편을 의미한다. 몇몇 조건 하에서, 에피토프 펩티드 단독은 에피토프에 대한 항체에 의해 특이적으로 인식/결합될 수 있다. 몇몇 다른 조건 하에서, 에피토프 펩티드는 항체에 의해 특이적으로 인식되도록 하기 위해, 폴리펩티드 캐리어에 융합되어야 한다. 에피토프 펩티드에 포함된 에프토프는 선형 또는 구조적 에피토프일 수 있다. 에피토프 펩티드가 선형 에피토프를 포함하는 경우, 항원에서 에피토프를 형성하는 인접 아미노산 분절(즉, 펩티드 단편)을 포함할 수 있거나 인접 아미노산 분절이다. 에피토프 펩티드가 구조적 에피토프를 포함하는 경우, 구조적 에피토프에 포함된 모든 아미노산 잔기를 포함하는 인접 아미노산 분절(즉, 펩티드 단편)을 포함할 수 있거나, 인접 아미노산 분절이다. 본 발명의 일부 양태에서, 에피토프 펩티드는, 바람직하게는 500 아미노산 잔기 이하의 길이, 예를 들어, 400 아미노산 잔기 이하의 길이, 300 아미노산 잔기 이하의 길이, 200 아미노산 잔기 이하의 길이, 100 아미노산 잔기 이하의 길이, 90 아미노산 잔기 이하의 길이, 80 아미노산 잔기 이하의 길이, 70 아미노기 잔기 이하의 길이, 60 아미노산 잔기 이하의 길이, 50 아미노산 잔기 이하의 길이, 40 아미노산 잔기 이하의 길이, 30 아미노산 잔기 이하의 길이 또는 25 아미노산 잔기 이하의 길이를 갖는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "폴리펩티드 캐리어"는 에피토프 펩티드 캐리어로서 작용할 수 있는, 즉, 특정 위치(예를 들어, 단백질 내, 또는 단백질의 C 말단 또는 N 말단)에 삽입된 에피토프를 가질 수 있는 캐리어 단백질을 지칭하며, 따라서, 항체 또는 면역계에 의해 인식될 수 있다. 이러한 캐리어 단백질은, 예를 들어, HPV L1 단백질 (에피토프 펩티드가 단백질의 위치 130 내지 131 또는 426 내지 427의 아미노산 사이에 삽입 될 수 있음); Slupetzky, K. et al., Chimeric papillomavirus-like particles expressing a foreign epitope on capsid surface loops[J]. J Gen Virol,2001, 82: 2799-2804; Varsani, A. et al., Chimeric human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 particles presenting the common neutralizing epitope for the L2 minor capsid protein of HPV-6 and HPV-16[J]. J Virol,2003, 77: 8386-8393) 참조, CRM197 단백질(에피토프 펩티드는 단백질의 N 말단 또는 C 말단 또는 그의 단편에 결합될 수 있음), 등을 포함하여 이전 논문에 보고된 바 있다. 상술한 바와 같이, 본 발명은 인간 B형 간염 바이러스(예를 들어, 인간 HBV로부터의 HBsAg의 에피토프)로부터의 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩티드를 제시하는 데 특히 적합한 타겟 폴리펩티드를 제공하기 위한 폴리펩티드 캐리어의 새로운 부류를 제공한다. 본 발명의 양태에서, 링커(예를 들어, 가요성 또는 강성 링커)는 에피토프 펩티드와 폴리펩티드 캐리어 사이에서 그들의 접힘(folding)을 촉진하기 위해 각각 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "재조합 단백질"은 기술된 단백질이 자연 발생 단백질이 아니라는 것을 의미하며, 단백질을 생산하거나 수득하는 수단을 제한하려는 것은 아니다. 본 발명의 재조합 단백질은 공지된 방법, 예를 들어, 유전 공학 방법 및 인공 합성 방법에 의해 생산될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "바이러스-유사 입자"는 바이러스 핵산을 포함하지 않고, 자기복제될 수 없으나, 형태 및 구조 측면에서 실제 비리온(virion)과 동일하거나 유사한 특정 바이러스의 하나 이상의 구조 단백질에 의해 형성된 중공 입자를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한 캐리어 및/또는 부형제"는 당업계에 공지된 약학적으로 및/또는 생리학적으로 대상 및 활성 성분에 거부반응을 일으키지 않는 캐리어 및/또는 부형제를 의미하며(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995 참조), pH 조절제, 계면활성제, 보조제 및 이온 강도 강화제(ionic strength enhancer)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, pH 조절제는 인산 완충액; 계면 활성제는 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제(예를 들어, Tween-80); 및 이온 강도 강화제는 NaCl을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "보조제(adjuvant)"는 항원에 대한 면역 반응을 강화시키거나, 보조제가 유기체에 전달되거나 또는 항원과 함께 전달될 때 유기체에서 면역 반응의 유형을 변화시킬 수 있는 비특이적인 면역 강화제(immunopotentiator)를 지칭한다. 알루미늄 보조제(예를 들어, 수산화 알루미늄), 프로인트 보조제(Freund's adjuvants)(예를 들어, 프로인트 완전 보조제 및 프로인트 불완전 보조제), 코리네박테리움파붐(coryne bacterium parvum), 리포폴리사카라이드, 사이토카인 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌 다양한 보조제가 있다. 프로인트 보조제는 현재 동물 실험에서 가장 일반적으로 사용되는 보조제이다. 수산화 알루미늄 보조제는 임상시험에서 보다 일반적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "E. coli 발현 시스템"은 GI698, ER2566, BL21 (DE3), B834 (DE3), 및 BLR (DE3)과 같이 구입 가능한 대장균 균주를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌, 대장균(균주) 및 벡터로 이루어진 발현 시스템을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "벡터"는 그 안에 삽입된 폴리뉴클레오티드를 가질 수 있는 핵산 비히클을 의미한다. 벡터가 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 허용하는 경우, 이 벡터를 발현벡터라 한다. 벡터는 숙주 세포 내로의 형질전환, 형질도입 또는 형질감염에 의해 숙주세포에서 발현되는 운반된 유전 물질 요소를 가질 수 있다. 벡터는 플라스미드, 파지, 코스미드, 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1유래 인공 염색체(PAC)와 같은 인공 염색체; λ 파지 또는 M13 파지와 같은 파지 및 동물 바이러스를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 공지되어 있다. 벡터로 사용될 수 있는 동물 바이러스는 레트로 바이러스(렌티바이러스(lentivirus) 포함), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스(단순포진바이러스(herpes simplex virus) 등), 수두 바이러스, 바큘로 바이러스, 유두종 바이러스 및 파포바바이러스(SV40 등)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택 구성 및 리포터 유전자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌 발현 조절을 위한 다수의 구성을 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 개시점을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "숙주세포"는 벡터가 도입될 수 있는 세포를 의미하며, 대장균 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 원핵세포, 표모 세포 또는 아스페르길루스(Aspergillus)와 같은 곰팡이 세포를, S2 도스필라(Dosphila) 세포 또는 Sf9와 같은 곤충 세포, 그리고 섬유아세포, CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, 헬라세포, BHK 세포, HEK 293 세포 또는 인간 세포와 같은 동물 세포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "대상"은 포유동물, 예를 들어, 인간과 같은 영장류 포유동물을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유효량"은 원하는 효과를 달성하거나 또는 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양을 의미한다. 예를 들어, 질병을 예방하기 위한 유효량(예를 들어, HBV 감염 또는 HBV 감염에 관련된 질병)은 질병(예를 들어, HBV 감염 또는 HBV 감염에 관련된 질병)의 진행을 예방, 억제 또는 지연시키기에 충분한 양을 의미한다; 치료학적 유효량은 질병을 가진 환자에서 질병 및 그의 합병증을 치료하거나 적어도 부분적으로 억제하기에 충분한 양을 의미한다. 유효량의 결정은 완전히 당업자의 능력 내에 있다. 예를 들어, 치료 용도의 유효량은 치료하고자하는 질병의 중증도, 환자의 면역 시스템의 일반적 상태, 예를 들어 연령, 체중 및 성별, 약물의 투여 경로, 동시에 사용되는 추가의 치료 등을 포함한다.
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서열번호 1-44의 서열정보
서열번호 명칭 서열정보
1 RBHBcAg MDIDPYKEFGASSQLISFLPEDFFPNLAELVETTTALYEEELVGKEHCSPHHTALRSLLNCWGETVRLITWVRNSVEGPLIQDAIVQQVQASVGLRMRQLMWFHLSCLTFGQPTVIEFLVSFGTWIRTPQAYRPPNAPILSTLPEHTIVRRRGGSRATRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSPASSNC
2 TBHBcAg MENLERLDIYKEFGVSDVLVSFLPDDFFPTLQQLLESVNALYEDELTGPNHCSPHHTALRHLIMCGVELRDFIDWMHEQGLSPDADALLAGYLRSKYLKHITKAIWYHLSCLTFGKQTVHEYLVSFGTWIRTPAAYRPVNAPILTTLPETSVIRRRPASRRSTPSPRRRRSQSPRRRRSPSPRPASNC
3 HBHBcAg MDIDPYKEFGASSQLVSFLPADFFPALNDLVETSVALYEEDLVGKEHCSPHHAALRALLNCWEETVRLITWVRATVEGQPVQDAIIGYVQTTVGLRMRQQIWFHLSCLTFGQQTVIEFLVSFGTWMRTPAAYRPPNAPILSTLPEHTVIRRRGNPRAPRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSPAPSNC
4 RBHBcAg189 MDIDPYKEFGASSQLISFLPEDFFPNLAELVETTTALYEEELVGKEHCSPHHTALRSLLNCWGETVRLITWVRNSVEGGGGGSGGGGTGSEFGGGGSGGGGSQDAIVQQVQASVGLRMRQLMWFHLSCLTFGQPTVIEFLVSFGTWIRTPQAYRPPNAPILSTLPEHTIVRRRGGSRATRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSPASSNC
5 RBHBcAg149 MDIDPYKEFGASSQLISFLPEDFFPNLAELVETTTALYEEELVGKEHCSPHHTALRSLLNCWGETVRLITWVRNSVEGGGGGSGGGGTGSEFGGGGSGGGGSQDAIVQQVQASVGLRMRQLMWFHLSCLTFGQPTVIEFLVSFGTWIRTPQAYRPPNAPILSTLPEHTIV
6 TBHBcAg188 MENLERLDIYKEFGVSDVLVSFLPDDFFPTLQQLLESVNALYEDELTGPNHCSPHHTALRHLIMCGVELRDFIDWMHEQGGGGGSGGGGTGSEFGGGGSGGGGSDADALLAGYLRSKYLKHITKAIWYHLSCLTFGKQTVHEYLVSFGTWIRTPAAYRPVNAPILTTLPETSVIRRRPASRRSTPSPRRRRSQSPRRRRSPSPRPASNC
7 TBHBcAg153 MENLERLDIYKEFGVSDVLVSFLPDDFFPTLQQLLESVNALYEDELTGPNHCSPHHTALRHLIMCGVELRDFIDWMHEQGGGGGSGGGGTGSEFGGGGSGGGGSDADALLAGYLRSKYLKHITKAIWYHLSCLTFGKQTVHEYLVSFGTWIRTPAAYRPVNAPILTTLPETSVI
8 HBHBcAg189 MDIDPYKEFGASSQLVSFLPADFFPALNDLVETSVALYEEDLVGKEHCSPHHAALRALLNCWEETVRLITWVRATVEGGGGGSGGGGTGSEFGGGGSGGGGSQDAIIGYVQTTVGLRMRQQIWFHLSCLTFGQQTVIEFLVSFGTWMRTPAAYRPPNAPILSTLPEHTVIRRRGNPRAPRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSPAPSNC
9 HBHBcAg149 MDIDPYKEFGASSQLVSFLPADFFPALNDLVETSVALYEEDLVGKEHCSPHHAALRALLNCWEETVRLITWVRATVEGGGGGSGGGGTGSEFGGGGSGGGGSQDAIIGYVQTTVGLRMRQQIWFHLSCLTFGQQTVIEFLVSFGTWMRTPAAYRPPNAPILSTLPEHTVI
10 HBcAg183 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC
11 HBcAg149 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQNAPILSTLPETTVV
12 RBHBcAg189 ATGGACATTGATCCTTATAAAGAATTTGGAGCTTCATCTCAACTGATCTCTTTCTTGCCTGAGGACTTTTTCCCAAACCTTGCAGAATTGGTCGAGACCACCACAGCTCTCTATGAAGAAGAATTAGTAGGTAAGGAGCATTGCTCCCCTCACCATACTGCTTTACGATCCTTGCTAAATTGCTGGGGAGAGACTGTTAGATTAATAACTTGGGTCAGGAACTCTGTGGAGGGAGGTGGAGGTGGTTCTGGAGGTGGTGGTACTGGATCCGAATTCGGTGGTGGAGGTTCAGGAGGAGGTGGTTCCCAAGATGCCATTGTCCAGCAAGTTCAGGCCTCGGTGGGCCTGCGCATGAGACAGTTAATGTGGTTCCATCTCTCATGCCTAACATTTGGACAGCCCACTGTCATAGAATTTCTGGTCTCTTTTGGAACATGGATCAGAACCCCGCAAGCTTACAGACCCCCTAATGCACCCATTCTCTCGACTCTTCCGGAGCATACAATCGTTAGGAGAAGAGGAGGTTCACGCGCTACTAGGTCCCCCCGAAGGCGCACTCCCTCTCCTCGCCGACGCAGATCTCAATCGCCGCGTCGCCGCAGATCTCAGTCTCCAGCTTCCTCCAACTGCTAA
13 RBHBcAg149 ATGGACATTGATCCTTATAAAGAATTTGGAGCTTCATCTCAACTGATCTCTTTCTTGCCTGAGGACTTTTTCCCAAACCTTGCAGAATTGGTCGAGACCACCACAGCTCTCTATGAAGAAGAATTAGTAGGTAAGGAGCATTGCTCCCCTCACCATACTGCTTTACGATCCTTGCTAAATTGCTGGGGAGAGACTGTTAGATTAATAACTTGGGTCAGGAACTCTGTGGAGGGAGGTGGAGGTGGTTCTGGAGGTGGTGGTACTGGATCCGAATTCGGTGGTGGAGGTTCAGGAGGAGGTGGTTCCCAAGATGCCATTGTCCAGCAAGTTCAGGCCTCGGTGGGCCTGCGCATGAGACAGTTAATGTGGTTCCATCTCTCATGCCTAACATTTGGACAGCCCACTGTCATAGAATTTCTGGTCTCTTTTGGAACATGGATCAGAACCCCGCAAGCTTACAGACCCCCTAATGCACCCATTCTCTCGACTCTTCCGGAGCATACAATCGTT
14 TBHBcAg188 ATGGAAAACCTTGAAAGACTTGACATCTATAAAGAATTTGGAGTCTCTGATGTCTTGGTGTCTTTCTTACCTGATGATTTCTTTCCAACTTTACAGCAACTTTTGGAATCAGTGAATGCCCTATATGAGGATGAACTCACTGGGCCTAATCACTGTTCTCCCCATCATACTGCCTTAAGGCACTTGATTATGTGTGGGGTAGAATTAAGAGATTTTATTGATTGGATGCATGAACAGGGGGGTGGAGGTGGTTCTGGAGGTGGTGGTACTGGATCCGAATTCGGTGGTGGAGGTTCAGGAGGAGGTGGTTCCGATGCAGACGCTCTTTTGGCTGGTTACCTTCGATCCAAATATCTTAAACATATTACCAAGGCTATTTGGTATCATTTAAGCTGTTTGACCTTTGGTAAGCAAACAGTGCATGAATACCTGGTATCCTTTGGCACCTGGATCAGAACCCCAGCTGCATATAGACCAGTGAATGCACCCATTCTCACCACTCTTCCGGAAACTTCAGTTATCAGAAGAAGGCCTGCCTCCAGAAGATCTACTCCCTCTCCTCGCAGACGCCGATCTCAATCACCGCGCCGCCGCCGCTCTCCATCTCCAAGACCAGCAAGCAATTGCTGA
15 TBHBcAg153 ATGGAAAACCTTGAAAGACTTGACATCTATAAAGAATTTGGAGTCTCTGATGTCTTGGTGTCTTTCTTACCTGATGATTTCTTTCCAACTTTACAGCAACTTTTGGAATCAGTGAATGCCCTATATGAGGATGAACTCACTGGGCCTAATCACTGTTCTCCCCATCATACTGCCTTAAGGCACTTGATTATGTGTGGGGTAGAATTAAGAGATTTTATTGATTGGATGCATGAACAGGGGGGTGGAGGTGGTTCTGGAGGTGGTGGTACTGGATCCGAATTCGGTGGTGGAGGTTCAGGAGGAGGTGGTTCCGATGCAGACGCTCTTTTGGCTGGTTACCTTCGATCCAAATATCTTAAACATATTACCAAGGCTATTTGGTATCATTTAAGCTGTTTGACCTTTGGTAAGCAAACAGTGCATGAATACCTGGTATCCTTTGGCACCTGGATCAGAACCCCAGCTGCATATAGACCAGTGAATGCACCCATTCTCACCACTCTTCCGGAAACTTCAGTTATC
16 HBHBcAg189 ATGGACATTGATCCTTATAAAGAGTTCGGTGCTTCATCTCAACTTGTCTCCTTTTTGCCTGCTGACTTCTTTCCCGCCTTGAACGACCTGGTGGAAACTTCGGTGGCCTTATATGAGGAAGACCTTGTAGGTAAGGAGCATTGCTCCCCTCATCATGCAGCCTTAAGGGCCCTACTTAATTGCTGGGAGGAAACAGTCAGACTGATTACCTGGGTCCGTGCCACAGTAGAGGGAGGTGGAGGTGGTTCTGGAGGTGGTGGTACTGGATCCGAATTCGGTGGTGGAGGTTCAGGAGGAGGTGGTTCCCAGGATGCCATCATCGGTTATGTCCAGACTACGGTGGGCCTACGCATGAGACAACAGATCTGGTTCCATCTCTCATGCCTTACTTTTGGGCAGCAGACTGTGATAGAGTTCCTGGTCTCATTTGGGACATGGATGAGAACTCCAGCCGCCTATAGACCCCCCAATGCACCCATTTTATCAACTCTTCCAGAGCACACAGTCATTAGGAGAAGAGGAAATCCGCGTGCTCCTAGGTCCCCCAGAAGGCGCACTCCCTCTCCTCGCCGACGCAGATCTCAATCTCCGCGTCGCCGGAGATCTCAATCTCCAGCTCCCTCCAACTGCTAA
17 HBHBcAg149 ATGGACATTGATCCTTATAAAGAGTTCGGTGCTTCATCTCAACTTGTCTCCTTTTTGCCTGCTGACTTCTTTCCCGCCTTGAACGACCTGGTGGAAACTTCGGTGGCCTTATATGAGGAAGACCTTGTAGGTAAGGAGCATTGCTCCCCTCATCATGCAGCCTTAAGGGCCCTACTTAATTGCTGGGAGGAAACAGTCAGACTGATTACCTGGGTCCGTGCCACAGTAGAGGGAGGTGGAGGTGGTTCTGGAGGTGGTGGTACTGGATCCGAATTCGGTGGTGGAGGTTCAGGAGGAGGTGGTTCCCAGGATGCCATCATCGGTTATGTCCAGACTACGGTGGGCCTACGCATGAGACAACAGATCTGGTTCCATCTCTCATGCCTTACTTTTGGGCAGCAGACTGTGATAGAGTTCCTGGTCTCATTTGGGACATGGATGAGAACTCCAGCCGCCTATAGACCCCCCAATGCACCCATTTTATCAACTCTTCCAGAGCACACAGTCATT
18 HBcAg183 ATGGACATTGATCCATATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCCGACTTCTTTCCTTCTATCCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACGGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTAGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGATGGTGGAGGTGGTTCTGGAGGTGGTGGTACTGGATCCGAATTCGGTGGTGGAGGTTCAGGAGGAGGTGGTTCCAGGGAACTAGTAGTCAGCTATGTCAACGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGGAGAGAAACTGTTCTTGAATATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCATATAGACCACAAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTCGTCGCCGAGGCCGTAGCCCGCGACGACGTACCCCGAGCCCGCGTCGACGTCGCAGCCAGAGCCCGCGCCGTCGTCGCAGCCAGAGCCGTGAAAGCCAGTGCTAA
19 HBcAg149 ATGGACATTGATCCATATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCCGACTTCTTTCCTTCTATCCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACGGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTAGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGATGGTGGAGGTGGTTCTGGAGGTGGTGGTACTGGATCCGAATTCGGTGGTGGAGGTTCAGGAGGAGGTGGTTCCAGGGAACTAGTAGTCAGCTATGTCAACGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGGAGAGAAACTGTTCTTGAATATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCATATAGACCACAAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTT
20 HIV-GP120-aa361-375 FKQSSGGDPEIVTHS
21 hPDL1-aa147-160 TSEHELTCQAEGYP
22 HBsAg-aa113-135 SSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFP
23 RBHBcAg189-SEQ20 MDIDPYKEFGASSQLISFLPEDFFPNLAELVETTTALYEEELVGKEHCSPHHTALRSLLNCWGETVRLITWVRNSVEGGGGGSGGGGTGSFKQSSGGDPEIVTHSEFGGGGSGGGGSQDAIVQQVQASVGLRMRQLMWFHLSCLTFGQPTVIEFLVSFGTWIRTPQAYRPPNAPILSTLPEHTIVRRRGGSRATRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSPASSNC
24 RBHBcAg149-SEQ20 MDIDPYKEFGASSQLISFLPEDFFPNLAELVETTTALYEEELVGKEHCSPHHTALRSLLNCWGETVRLITWVRNSVEGGGGGSGGGGTGSFKQSSGGDPEIVTHSEFGGGGSGGGGSQDAIVQQVQASVGLRMRQLMWFHLSCLTFGQPTVIEFLVSFGTWIRTPQAYRPPNAPILSTLPEHTIV
25 TBHBcAg188-SEQ20 MENLERLDIYKEFGVSDVLVSFLPDDFFPTLQQLLESVNALYEDELTGPNHCSPHHTALRHLIMCGVELRDFIDWMHEQGGGGGSGGGGTGSFKQSSGGDPEIVTHSEFGGGGSGGGGSDADALLAGYLRSKYLKHITKAIWYHLSCLTFGKQTVHEYLVSFGTWIRTPAAYRPVNAPILTTLPETSVIRRRPASRRSTPSPRRRRSQSPRRRRSPSPRPASNC
26 TBHBcAg153-SEQ20 MENLERLDIYKEFGVSDVLVSFLPDDFFPTLQQLLESVNALYEDELTGPNHCSPHHTALRHLIMCGVELRDFIDWMHEQGGGGGSGGGGTGSFKQSSGGDPEIVTHSEFGGGGSGGGGSDADALLAGYLRSKYLKHITKAIWYHLSCLTFGKQTVHEYLVSFGTWIRTPAAYRPVNAPILTTLPETSVI
27 HBHBcAg189-SEQ20 MDIDPYKEFGASSQLVSFLPADFFPALNDLVETSVALYEEDLVGKEHCSPHHAALRALLNCWEETVRLITWVRATVEGGGGGSGGGGTGSFKQSSGGDPEIVTHSEFGGGGSGGGGSQDAIIGYVQTTVGLRMRQQIWFHLSCLTFGQQTVIEFLVSFGTWMRTPAAYRPPNAPILSTLPEHTVIRRRGNPRAPRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSPAPSNC
28 HBHBcAg149-SEQ20 MDIDPYKEFGASSQLVSFLPADFFPALNDLVETSVALYEEDLVGKEHCSPHHAALRALLNCWEETVRLITWVRATVEGGGGGSGGGGTGSFKQSSGGDPEIVTHSEFGGGGSGGGGSQDAIIGYVQTTVGLRMRQQIWFHLSCLTFGQQTVIEFLVSFGTWMRTPAAYRPPNAPILSTLPEHTVI
29 RBHBcAg189-SEQ21 MDIDPYKEFGASSQLISFLPEDFFPNLAELVETTTALYEEELVGKEHCSPHHTALRSLLNCWGETVRLITWVRNSVEGGGGGSGGGGTGSTSEHELTCQAEGYPEFGGGGSGGGGSQDAIVQQVQASVGLRMRQLMWFHLSCLTFGQPTVIEFLVSFGTWIRTPQAYRPPNAPILSTLPEHTIVRRRGGSRATRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSPASSNC
30 RBHBcAg149-SEQ21 MDIDPYKEFGASSQLISFLPEDFFPNLAELVETTTALYEEELVGKEHCSPHHTALRSLLNCWGETVRLITWVRNSVEGGGGGSGGGGTGSTSEHELTCQAEGYPEFGGGGSGGGGSQDAIVQQVQASVGLRMRQLMWFHLSCLTFGQPTVIEFLVSFGTWIRTPQAYRPPNAPILSTLPEHTIV
31 TBHBcAg188-SEQ21 MENLERLDIYKEFGVSDVLVSFLPDDFFPTLQQLLESVNALYEDELTGPNHCSPHHTALRHLIMCGVELRDFIDWMHEQGGGGGSGGGGTGSTSEHELTCQAEGYPEFGGGGSGGGGSDADALLAGYLRSKYLKHITKAIWYHLSCLTFGKQTVHEYLVSFGTWIRTPAAYRPVNAPILTTLPETSVIRRRPASRRSTPSPRRRRSQSPRRRRSPSPRPASNC
32 TBHBcAg153-SEQ21 MENLERLDIYKEFGVSDVLVSFLPDDFFPTLQQLLESVNALYEDELTGPNHCSPHHTALRHLIMCGVELRDFIDWMHEQGGGGGSGGGGTGSTSEHELTCQAEGYPEFGGGGSGGGGSDADALLAGYLRSKYLKHITKAIWYHLSCLTFGKQTVHEYLVSFGTWIRTPAAYRPVNAPILTTLPETSVI
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34 HBHBcAg149-SEQ21 MDIDPYKEFGASSQLVSFLPADFFPALNDLVETSVALYEEDLVGKEHCSPHHAALRALLNCWEETVRLITWVRATVEGGGGGSGGGGTGSTSEHELTCQAEGYPEFGGGGSGGGGSQDAIIGYVQTTVGLRMRQQIWFHLSCLTFGQQTVIEFLVSFGTWMRTPAAYRPPNAPILSTLPEHTVI
35 RBHBcAg189-SEQ22 MDIDPYKEFGASSQLISFLPEDFFPNLAELVETTTALYEEELVGKEHCSPHHTALRSLLNCWGETVRLITWVRNSVEGGGGGSGGGGTGSSSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFPEFGGGGSGGGGSQDAIVQQVQASVGLRMRQLMWFHLSCLTFGQPTVIEFLVSFGTWIRTPQAYRPPNAPILSTLPEHTIVRRRGGSRATRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSPASSNC
36 RBHBcAg149-SEQ22 MDIDPYKEFGASSQLISFLPEDFFPNLAELVETTTALYEEELVGKEHCSPHHTALRSLLNCWGETVRLITWVRNSVEGGGGGSGGGGTGSSSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFPEFGGGGSGGGGSQDAIVQQVQASVGLRMRQLMWFHLSCLTFGQPTVIEFLVSFGTWIRTPQAYRPPNAPILSTLPEHTIV
37 TBHBcAg188-SEQ22 MENLERLDIYKEFGVSDVLVSFLPDDFFPTLQQLLESVNALYEDELTGPNHCSPHHTALRHLIMCGVELRDFIDWMHEQGGGGGSGGGGTGSSSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFPEFGGGGSGGGGSDADALLAGYLRSKYLKHITKAIWYHLSCLTFGKQTVHEYLVSFGTWIRTPAAYRPVNAPILTTLPETSVIRRRPASRRSTPSPRRRRSQSPRRRRSPSPRPASNC
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39 HBHBcAg189-SEQ22 MDIDPYKEFGASSQLVSFLPADFFPALNDLVETSVALYEEDLVGKEHCSPHHAALRALLNCWEETVRLITWVRATVEGGGGGSGGGGTGSSSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFPEFGGGGSGGGGSQDAIIGYVQTTVGLRMRQQIWFHLSCLTFGQQTVIEFLVSFGTWMRTPAAYRPPNAPILSTLPEHTVIRRRGNPRAPRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSPAPSNC
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41 HBcAg183-SEQ22 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSSSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFPEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC
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43 Linker GGGGGSGGGGTGSEFGGGGSGGGGS
44 HBsAg MENIASGLLGPLLVLQAGFFLLTKILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTPVCLGQNSQSQISSHSPTCCPPICPGYRWMCLRRFIIFLCILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWFWGPSLYNILSPFMPLLPIFFCLWVYI
본 발명은 하기 실시예(본 발명의 보호범위를 제한하기 보다는 본 발명을 설명하기 위한 것)를 참조하여 예시된다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 분자생물학적 실험방법 및 면역학적 검정은 실질적으로 Sambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, and F. M. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995에 기술된 방법에 따른다; 제한 효소는 제품 제조 업체가 권장하는 조건에서 사용된다. 당업자는 본 발명을 예시하기 위해 실시예를 사용하였으나, 본 발명의 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아님을 이해하여야 한다.
실시예 1: 폴리펩티드 캐리어를 코딩하는 플라스미드의 제조
본 실시예에서는, 폴리펩티드 캐리어를 코딩하는 플라스미드를 제작하였다.
1.1 폴리펩티드 캐리어를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 제조
세 박쥐 유래 HBV 코어 항원(즉, RBHBcAg 단백질, TBHBcAg 단백질, 및 HBHBcAg 단백질)에 기초하여, 다음의 폴리펩티드 캐리어가 설계되었다:
RBHBcAg 단백질의 78-81 위치로부터의 아미노산 잔기가 서열번호 43에 기재된 링커로 치환된 점에서 RBHBcAg 단백질(서열번호 1)과 상이한 RBHBcAg189 캐리어; RBHBcAg189 캐리어의 아미노산 서열은 서열번호 4로 제시되고, RBHBcAg189 캐리어의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 12에 기재됨;
RBHBcAg 단백질의 80-83 위치의 아미노산 잔기가 서열번호 43에 기재된 링커로 치환된다는 점에서 TBHBcAg 단밸질(서열번호 2)과 상이한 TBHBcAg188 캐리어; TBHBcAg188 캐리어의 아미노산 서열은 서열번호 6에 제시되고, TBHBcAg188 캐리어의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 14에 기재됨;
RBHBcAg 단백질의 78-81 위치의 아미노산 잔기가 서열번호 43에 기재된 링커로 치환된다는 점에서 HBHBcAg 단밸질(서열번호 3)과 상이한 HBHBcAg189 캐리어; HBHBcAg189 캐리어의 아미노산 서열은 서열번호 8에 제시되고, TBHBcAg188 캐리어의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 16에 기재됨.
또한, 인간 HBV의 HBcAg 단백질에 기초하여, HBcAg183 캐리어도 대조군으로 설계되었다. HBcAg183 캐리어는 인간 HBV의 HBcAg 단백질의 79-81 위치의 아미노산 잔기가 서열번호 43에 기재된 링커로 치환된다는 점에서 인간 HBV의 HBcAg 단백질과 상이하며; HBcAg183 캐리어의 아미노산 서열은 서열번호 10에 제시되고, HBcAg 캐리어의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 18에 기재된다.
상기 4종의 캐리어 뉴클레오티드 서열에 관해서는, 그들의 전체 유전자 합성이 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd에 의해 수행되었다.
1.2 폴리펩티드 캐리어를 코딩하는 플라스미드의 제조
합성된 뉴클레오티드 서열을 주형으로 사용하고, 표 2의 프라이머를 사용하여 상기 4종의 캐리어의 전장 유전자 및 절단체(truncate)(즉, C 말단에서 절단된 유전자 단편)를 각각 PCR로 증폭시켰다. 8개의 PCR 산물, 즉 RBHBcAg189 캐리어 를 코딩하는 유전자(서열번호 12; 이로부터 코딩된 아미노산 서열은 서열번호 4임), RBHBcAg149 캐리어를 코딩하는 유전자(서열번호 13; 이로부터 코딩된 아미노산 서열은 서열번호 5임), TBHBcAg153 캐리어를 코딩하는 유전자(서열번호 14, 이로부터 코딩된 아미노산 서열은 서열번호 6 임), TBHBcAg153 캐리어를 코딩하는 유전자(서열번호 15; 이로부터 코딩된 아미노산 서열은 서열번호 7임), HBHBcAg189 캐리어를 코딩하는 유전자(서열번호 16; 이?鑿壙? 코딩된 아미노산 서열은 서열번호 8), HBHBcAg149 캐리어를 코딩하는 유전자(서열번호 17; 이로부터 코딩된 아미노산 서열은 서열번호 9임), HBcAg183 캐리어를 코딩하는 유전자(서열번호 18; 이로부터 코딩된 아미노산 서열은 서열번호 10 임), 및 HBcAg149 캐리어를 코딩하는 유전자 (서열번호 19; 이로부터 코딩된 아미노산 서열은 서열번호 11임)을 수득하였다.
pTO-T7 벡터(Luo Wenxin, Zhang Jun, Yang Haijie, et al., Construction and Application of an Escherichia coli High Effective Expression Vector with an Enhancer [J], Chinese Journal of Biotechnology, 2000, 16(5): 578-581)를 Ndel 및 HindIII에 의해 이중 효소 절단하여 선형 벡터를 얻었다. 깁슨 어셈블리 클로닝법(Gibson assembly cloning method) (New England Biolabs (UK) Ltd)에 의해 얻어진 8개의 PCR 산물을 선형 벡터에 연결하고, 5H5a 적격 박테리아(competent bacteria)로 형질전환 시켰다. 형질전환된 박테리아를 플레이트에 깔아 배양한 후, 모노클로날 콜로니를 선택하여 플라스미드를 추출하고 시퀀싱하였다. 폴리펩티드 캐리어를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한 8개의 플라스미드가 얻어진 것은 시퀀싱에 의해 확인되었다.
PCR에 관여하는 프라이머는 표 2에 나타낸다.
프라이머 서열
서열번호 프라이머 명칭 서열
45 RBHBcAg149/189F ACTTTAAGAAGGAGATATACATATGATGGACATTGATCCTTATAAAG
46 RBHBcAg149R GTGGTGCTCGAGGCGGCCGCAAGCTTTTAAACGATTGTATGCTCCGGAAGAGTCGA
47 RBHBcAg189R GTGGTGCTCGAGGCGGCCGCAAGCTTTTAGCAGTTGGAGGAAGCTGGAGACTGAGATCTGCGGCGAC
48 TBHBcAg153/188F ACTTTAAGAAGGAGATATACATATGATGGAAAACCTTGAAAGACTTG
49 TBHBcAg153R GTGGTGCTCGAGGCGGCCGCAAGCTTTTAGATAACTGAAGTTTCCGGAAGAGTG
50 TBHBcAg188R GTGGTGCTCGAGGCGGCCGCAAGCTTTTAGCAATTGCTTGCTGGTCTTG
51 HBHBcAg149/189F ACTTTAAGAAGGAGATATACATATGATGGACATTGATCCTTATAAAG
52 HBHBcAg149R GTGGTGCTCGAGGCGGCCGCAAGCTTTTAAATGACTGTGTGCTCTGGAAGAGTTGA
53 HBHBcAg189R GTGGTGCTCGAGGCGGCCGCAAGCTTTTAGCAGTTGGAGGGAGCTGGAGATTGAGATCTCCGGCGAC
실시예 2. 재조합 단백질의 제조
본 실시예에서는, 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 실시예 1에서 제조된 플라스미드에 삽입하였고, 타겟 폴리펩티드와 폴리펩티드 캐리어를 포함하는 재조합 단백질을 수득하였다. 본 발명의 RBHBcAg 캐리어, TBHBcAg 캐리어 및 HBHBcAg 캐리어에 타겟 폴리펩티드(타겟 항원 펩티드 단편)를 삽입하여 재조합 단백질을 제조하는 클로닝 용액의 도식을 도 1에 나타내었다.
2.1 타겟 폴리펩티드와 폴리펩티드 캐리어를 포함하는 재조합 단백질의 발현 플라스미드의 제조
실시예에서, 3개의 타겟 폴리펩티드를 사용하여 펩티드 단편을 제공하기 위한 본 발명의 폴리펩티드 캐리어의 범용성을 확인하였다. 상기 3개의 타겟 폴리펩티드는 다음과 같다: 폴리펩티드 HIV-GP120-aa361-375(즉, HIV GP120 단백질의 361-375 위치의 아미노산, 이 아미노산 서열은 서열번호 20에 기재됨); 폴리펩티드 hPDL1-aa147-160(즉, 인간 PD-L1 단백질의 147-160 위치의 아미노산, 이 아미노산 서열은 서열번호 21에 기재됨); 및 폴리펩티드 HBsAg-aa113-135(즉, 인간 HBV 유래의 B형 간염 표면 항원(HBsAg)의 113-135 위치의 아미노산, 이 아미노산 서열은 서열번호 22에 기재됨).
상기 3개의 타겟 폴리펩티드(표 3에 나타난 바와 같음)를 코딩하는 센스 및 안티센스 서열을 직접 합성하고, 어닐링하여 부착 말단(cohesive end)을 가지며, 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 단편을 수득하였다.
3개의 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 센스 및 안티센스 서열
서열번호 프라이머 명칭 서열
54 hPDL1-aa147-160F GATCCACCTCTGAACATGAACTGACATGTCAGGCTGAGGGCTACCCCG
55 hPDL1-aa147-160R AATTCGGGGTAGCCCTCAGCCTGACATGTCAGTTCATGTTCAGAGGTG
56 HIV-GP120-aa361-375F GATCCTTCAAACAGTCTTCTGGTGGTGACCCGGAAATCGTTACCCACTCTG
57 HIV-GP120-aa361-375R AATTCAGAGTGGGTAACGATTTCCGGGTCACCACCAGAAGACTGTTTGAAG
58 HBsAg-aa113-135F GATCCTCATCAACAACCAGCACCGGACCATGCAAAACCTGCACAACTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCG
59 HBsAg-aa113-135R AATTCGGGAAACATAGAGGTTCCTTGAGCAGGAGTTGTGCAGGTTTTGCATGGTCCGGTGCTGGTTGTTGATGAG
실시예 1에서 얻어진 6개의 플라스미드(RBHBcAg189, RBHBcAg149, TBHBcAg188, TBHBcAg153, HBHBcAg189 및 HBHBcAg149)를 BamHI 및 EcoRI에 의해 이중 효소 절단하여 6 개의 선형 벡터를 얻었다. 그 다음, 상기에서 제조된 부착 말단을 가지며, 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 3개의 유전자 단편을 선형 벡터에 연결하여 재조합 단백질을 코딩하는 발현 플라스미드(총 18개: RBHBcAg189-SEQ20, RBHBcAg149-SEQ20, TBHBcAg188-SEQ20, TBHBcAg153-SEQ20, HBHBcAg189-SEQ20, HBHBcAg149-SEQ20, RBHBcAg189-SEQ21, RBHBcAg149-SEQ21, TBHBcAg188-SEQ21, TBHBcAg153-SEQ21, HBHBcAg189-SEQ21, HBHBcAg149-SEQ21, RBHBcAg189-SEQ22, RBHBcAg149-SEQ22, TBHBcAg188-SEQ22, TBHBcAg153-SEQ22, HBHBcAg189-SEQ22, and HBHBcAg149-SEQ22)를 얻었다.
2.2 재조합 단백질의 발현, 정제 및 조립
이전 단계에서 제작된 18개의 발현 플라스미드를 사용하여 발현 플라스미드에 의해 코딩된 재조합 단백질을 동일한 방법으로 발현 및 정제하였다. RBHBcAg149-SEQX (SEQX는 SEQ20, SEQ21 또는 SEQ22를 나타냄)를 재조합 단백질의 발현 및 정제를 기술하기 위한 예로서 사용하였다.
(2.2.1) 재조합 단백질 발현을 위한 박테리아 균주의 제조 2.1에서 얻은 발현 플라스미드 RBHBcAg149-SEQX를 대장균 균주 ER2566으로 형질 전환시켜 발현 균주를 얻었다.
(2.2.2) 재조합 단백질 RBHBcAg149-SEQX의 발현: 박테리아 균주를 500mL의 삼각 플라스크에 접종하고, OD가 약 1.0이 될 때까지 진탕 테이블상에서 37℃에서 배양하고; 나중에 이소 프로필-베타-D-티오갈락토시드(IPTG)를 최종농도 0.5 mM로 첨가하고 25 ℃에서 6 시간 더 발현시켰다.
(2.3.3) 재조합 단백질 RBHBcAg149-SEQX의 정제:
(2.3.3.1) 박테리아의 초음파 파쇄: 2.2.2의 박테리아를 원심 분리로 수확하고, 초음파 파쇄를 실시했다. 초음파 처리 완충액: 20 mM 인산완충액(PH6.0) + 300 mM NaCl.
(2.2.3.2) 재조합 단백질의 1차 정제: 초음파 파쇄 후 얻어진 혼합물을 65℃의 수조에서 30 분 동안 배양한 후, 상청액을 원심분리에 의해 수집 하였다; 상청액에 1:1의 부피비로 포화 암모늄 설페이트를 첨가하고, 침전물을 원심분리에 의해 수집하였다; 적합한 부피의 완충액 (20 mM 인산염 완충액 (pH = 7.4) + 150 mM NaCl)을 첨가하여 침전물을 재부유시켜 1 차 정제된 재조합 단백질 RBHBcAg149-SEQX를 얻었다.
도 2는 구출된 18개의 재조합 단백질의 SDS-PAGE 결과 및 재조합 단백질에 의해 형성된 바이러스-유사 입자의 TEM 결과를 나타낸다. 이 결과는 수득된 18개의 모든 재조합 단백질이 순도 85 % 이상을 가지고, 직경이 약 30nm인 바이러스-유사 입자로 조립될 수 있음을 보여준다. 이들 결과는 본 발명에서 제조된 폴리펩티드 캐리어가 광범위한 범용성을 가지며 다양한 타겟 폴리펩티드를 제시하는데 사용될 수 있고, VLP를 형성할 수 있음을 보여준다.
실시예 3. 바이러스-유사 입자의 면역원성 평가
실시예에서, 본 발명자들은 본 발명의 재조합 단백질에 의해 형성된 바이러스-유사 입자의 면역원성을 확인하였다. 이러한 모든 바이러스-유사 입자는 유기체 내의 타겟 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 생성을 유도할 수 있다.
3.1 마우스의 면역화
실시예 2에서 제조된 18개의 바이러스-유사 입자로 BALB/C 마우스를 각각 면역화시켰다. 면역화 과정은 다음과 같았다: 사용된 면역보강제(immunoadjuvant)는 수산화 알루미늄 보조제였다; 면역 용량은 3㎍/dose; 면역화는 뒷다리의 외측 허벅지의 근육내 주사에 의해 수행되었다; 면역 절차는 1차 면역 + 2주 후 부스터 면역(즉, 총 2회) 이었다.
3.2 혈청에서 타겟 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 역가 검출
3.2.1 반응 플레이트의 제조
코팅 반응 플레이트용 항원은 상기 3가지 타겟 폴리펩티드에 상응하는 타겟 항원이었다, 즉, HIV-1 gp120 단백질(Sino Biological Inc. 에서 구입, 카탈로그 번호 11233-V08H), 인간 PD-L1 단백질(Sino Biological Inc.) 및 CHO 세포에서 재조합적으로 발현되는 인간 B 형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg, Beijing Wantai Biological Pharmacy로부터 구입).
3개의 재조합 단백질은 최종 농도 2㎍ / mL의 pH9.6 50mM CB 완충액(NaHCO3/Na2CO3 완충액, 최종 농도 50mM, pH = 9.6)으로 각각 희석하여 코팅용액을 수득하였다. 96-웰 ELISA 플레이트의 각 웰에 100μL 코팅 용액을 첨가하고, 웰을 2-8℃에서 16-24 시간 동안 코팅한 다음, 37℃에서 2시간 동안 추가로 코팅하였다. 그 후, PBST 세정용액(20 mM PB7.4, 150 mM NaCl, 0.1 % Tween20)을 사용하여 웰을 1 회 세척 하였다; 그리고 200 μL의 블로킹 용액(20% 소 혈청과 1% 카세인(pH = 7.4)을 함유한 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 완충용액)을 각 웰에 첨가하고, 웰을 37℃에서 2시간 동안 블로킹시켰다. 블로킹 용액을 버린다. 그 후, ELISA 플레이트를 건조시키고, 알루미늄 호일 백에 포장하고, 이를 추가로 사용하기 위해 2-8℃에서 보관하였다.
3.2.2 혈청에서의 항-HBsAg 항체 역가의 ELISA 검출
혈청 샘플 채취: 0, 2, 4주에 마우스의 안와 궤도에서 혈액을 채취하고 혈청을 분리하여 검출할 때까지 -20 ℃에서 동결 보존 하였다.
샘플 희석: 1:100, 1:500, 1:2500, 1:12500, 1:62500, 1:312500 및 1:1562500의 희석 구배에서 20 % 신생 소 혈청을 함유하는 PBS 용액으로 마우스 혈청을 희석시켰다.
ELISA 검출: 코팅된 ELISA 플레이트의 각 웰에 100㎕의 희석된 혈청 샘플을 첨가하고, 3 ℃에서 30분 동안 배양하였다. 이어서, ELISA 플레이트를 PBST 세정용액(20mM PB7.4, 150mM NaCl, 0.1 % Tween20)으로 5 회 세정하였다. 세정 후, ELISA 플레이트의 각 웰에 50 ㎕의 TMB 발색제(Beijing Wantai Biological Pharmacy 제공)를 첨가하고, 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 항온배양 후, ELISA 플레이트의 각 웰에 50μL 정지 용액 (Beijing Wantai Biological Pharmacy 에서 제공)을 첨가하고 각 웰의 OD450/630 값을 ELISA 장치로 판독하였다.
항체 역가의 계산: 판독 값이 0.2-2.0 이내인 검체를 샘플을 분석하였다; 회귀 곡선을 희석 배수 및 판독값으로 플롯하고, 판독값이 배경값의 2 배인 샘플의 희석 배수를 계산하였다; 샘플의 희석 배수를 혈청 중의 특정 항체의 역가로 사용하였다.
도 3은 BALB/C 마우스에 18개의 재조합 단백질에 의해 형성된 바이러스-유사 입자를 면역화한 후, 시간 경과에 따른 마우스 혈청 내 타겟 항원에 대한 항체의 역가 변화를 각각 나타낸다. 도 3A: 사용된 타겟 폴리펩티드는 서열번호 20이고, 항-GP 항체의 역가가 측정되었다; 도 3B: 사용된 타겟 폴리펩티드는 서열번호 21이고, 항-PD-L1 항체의 역가가 측정되었다; 도 3C 사용된 타겟 폴리펩티드는 서엷너호 22이고, 항-HBsAg 항체의 역가가 측정되었다. 결과는, 18개의 재조합 단백질에 의해 형성된 모든 바이러스0유사 입자가 우수한 면역원성을 가지며, 마우스에서 타겟 항원에 특이적으로 결합하는 고 역가 항체의 생성을 유도할 수 잇음을 보여준다.
실시예 4. HBsAg 에피토프(서열번호 22)를 나타내는 바이러스-유사 입자의 항-HBV 치료 효과에 대한 평가
실시예에서, 본 발명자들은 상이한 폴리펩티드 캐리어를 기본으로 하여 제조된 동일한 에피토프 펩티드(서열번호 22)를 나타내는 바이러스-유사 입자의 항-HBV 치료 효과를 평가하였다.
4.1 마우스의 면역화
실시예 1-2에서 기술된 방법에 따라, HBsAg 에피토프(즉, HBcAg183-SEQ22, 이의 아미노산 서열은 서열번호 41로 제시되고; HBcAg149-SEQ22, 이의 아미노산 서열은 서열번호 42에 기재됨)를 제시하고, 인간 HBV HBcAg를 기초로 제작된 2개의 재조합 단백질을 제조하고, 2개의 재조합 단백질에 의해 형성된 바이러스-유사 입자를 제조하였다. 이후, 실시예 2에서 제조된 HBsAg 에피토프(서열번호 22)를 제공하는 5개의 바이러스-유사 입자 및 실시예에서 제조된 2개의 바이러스-유사 입자의 HBV 형질전환 마우스 모델에서 항-HBV 치료 효과를 평가하였다. 면역화 방법은 다음과 같다: 사용된 면역보강제는 수산화 알루미늄 보조제였다; 면역 용량은 12㎍/dose; 면역화는 뒷다리의 외측 허벅지의 근육내 주사에 의해 수행되었다; 면역 절차는 0, 2, 3, 4, 5 및 6주(즉, 총 6회)에서의 면역화였다.
4.2 혈청 내 항체 역가 및 바이러스학적 지표의 검출
실시예 3.2에 기재된 방법에 따라, 혈청 중의 항-HBsAg 항체 역가를 측정하고, 마우스 혈청의 바이러스학적 지표(즉, HBV DNA 및 HBsAg의 수준)를 결정하였다.
4.3 재조합 단백질의 치료 효과 분석
검출 결과는 도 4-6에 나타내었다. 도 4는 동일한 에피토프 펩티드(서열번호 22)를 제시하는 상이한 바이러스-유사 입자로 HBV 트랜스제닉 수컷(도 4A) 및 암컷(도 4B) 마우스를 처리한 후 시간 경과에 따른 마우스 혈청에서의 HBsAg 수준 변화를 나타낸다. 도 5는 동일한 에피토프 펩티드(서열번호 22)를 제시하는 상이한 바이러스-유사 입자로 HBV 트랜스제닉 수컷 마우스를 처리한 후 시간 경과에 따른 마우스 혈청에서의 HBV DNA 수준 변화를 나타낸다. 도 6은 동일한 에피토프 펩티드(서열번호 22)를 제시하는 상이한 바이러스-유사 입자로 HBV 트랜스제닉 수컷(도 6A) 및 암컷(도 6B) 마우스를 처리한 후 시간 경과에 따른 마우스 혈청에서의 항-HBsAg 항체의 역가 변화를 나타낸다.
결과는 VLP로 면역요법을 받는 그룹에서, 면역화 후 마우스 혈청에서 항-HBsAg 항체가 검출되었고, 마우스 혈청에서 HBV DNA 및 HBsAg의 수준이 다른 범위로 감소함을 보여준다. 그에 비해, 대조군 마우스 (VLP로 면역화되지 않음)의 혈청에서는 항-HBsAg 항체가 생성되지 않았으며, 혈청 내 HBV DNA 및 HBsAg 수준의 감소가 관찰되지 않았다.
이러한 결과는 박쥐 B형 간염 바이러스 코어 단백질을 기반으로 제조된 모든 6개의 폴리펩티드 캐리어가 인간 HBV로부터 HBsAg의 에피토프 펩티드 (예를 들어. HBsAg-aa113-135)를 효과적으로 제시하고, VLP를 형성할 수 있으며, 생물체에서 고 역가 항- HBsAg 항체를 유도함으로써, 마우스에서 HBV DNA 및 HBsAg(즉, HBV DNA 및 HBsAg가 현저하게 감소함) 수준을 억제한다. 이에 더하여, 도 4-6의 실험 데이터는 본 발명의 폴리펩티드 캐리어(예를 들어, RBHBcAg149 및 TBHBcAg153)에 기초한 바이러스-유사 입자가 인간 HBV의 HBcAg에 기초하여 제작된 바이러스-유사 입자보다 특히 현저하게 항-HBV 치료 효과를 가진다는 것 또한 보여준다.
따라서, 실시예에서의 결과는 다음을 보여준다: (1) 본 발명의 폴리펩티드 캐리어가 VLP를 형성할 수 있고, 다양한 타겟 폴리펩티드를 제시하는 데 적합하며, 유기체에서 타겟 폴리펩티드에 대한 고 역가 항체의 생성을 유도할 수 있다; (2) 본 발명의 폴리펩티드 캐리어는 인간 HBV의 에피토프(예를 들어, 인간 HBV의 HBsAg의 에피토프)를 제시하는 데 특히 적합하고, HBsAg에 대한 고 역가 항체의 생성을 유도할 수 있으며, 인간 HBV의 HBcAg에 기초하여 제조된 폴리펩티드 캐리어의 효과보다 우수하게 생체 내에서 HBV DNA 및 HBsAg의 수준을 억제하거나 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 인간 HBV 에피토프를 제시하는 재조합 단백질은 HBV 감염을 치료할 잠재력이 있으며, 효과적이고 특이적이며 치료적인 항-HBV 면역을 유도하는데 특히 적합하다.
실시예 5. 상이한 HBV 유전자형으로부터의 HBsAg의 에피토프를 제시하는 바이러스-유사 입자의 제조 및 평가
실시예 2-4에서 사용된 HBsAg 에피토프(서열번호 22)는 HBV 유전자형 B로부터 유래된 것이다. 다양한 HBV 유전자형에 대한 본 발명의 폴리펩티드 캐리어의 넓은 범용성을 확인하기 위해, 본 발명자들은 또한 RBHBcAg149 및 TBHBcAg153을 예시적으로 사용하였다. HBV 유전자형(유전자형 A, C 및 D)으로부터의 HBsAg의 에피토프를 나타내는 재조합 단백질을 제조하고, 제조된 재조합 단백질이 바이러스-유사 입자로 조립되는 능력, 생성된 바이러스-유사 입자의 면역원성, HBV 감염에 대한 그의 치료 효과를 평가하였다.
5.1 타겟 폴리펩티드 및 폴리펩티드 캐리어를 포함하는 재조합 단백질을 코딩하는 발현 플라스미드의 제조
실시예에서, 실시예 2-4에서 사용된HBsAg 에피토프(HBV 유전자형 B, 서열번호 22로부터) 이외에, 타겟 폴리펩티드는 HBV 유전자형 A, C 및 D로부터의 HBsAg 에피토프(113-135 위치의 아미노산)를 추가로 포함하여 다음과 같이 설계되었다: HBsAg-aa113-135-A, HBsAg-aa113-135-C 및 HBsAg-aa113-135-D, 그리고 그의 서열(서열번호 60 내지 62)을 표 4에 나타내었다.
HBV 유전자형 A, C 및 D의 HBsAg 단백질의 113-135 위치의 아미노산 서열
서열번호 명칭 서열정보
60 HBsAg-aa113-135-A STTTSTGPCKTCTTPAQGNSMFP
61 HBsAg-aa113-135-C TSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFP
62 HBsAg-aa113-135-D SSTTSTGPCRTCTTPAQGTSMYP
상기 3개의 타겟 폴리펩티드를 코딩하는(표 5에 나타낸 바와 같이) 센스 및 안티센스 서열을 직접 합성하고 어닐링하여, 부착 말단을 가지고 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 단편을 얻었다.
3개의 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 센스 및 안티센스 서열
서열번호 프라이머 명칭 서열정보
63 HBsAg-aa113-135-AF gatccTCTACCACCACCTCTACCGGTCCGTGCAAAACCTGCACCACCCCGGCTCAGGGTAACTCTATGTTCCCGg
64 HBsAg-aa113-135-AR aattcCGGGAACATAGAGTTACCCTGAGCCGGGGTGGTGCAGGTTTTGCACGGACCGGTAGAGGTGGTGGTAGAg
65 HBsAg-aa113-135-CF gatccACCTCTACCACCTCTACCGGTCCGTGCAAAACCTGCACCATCCCGGCTCAGGGTACCTCTATGTTCCCGg
66 HBsAg-aa113-135-CR aattcCGGGAACATAGAGGTACCCTGAGCCGGGATGGTGCAGGTTTTGCACGGACCGGTAGAGGTGGTAGAGGTg
67 HBsAg-aa113-135-DF gatccTCTTCTACCACCTCTACCGGTCCGTGCCGTACCTGCACCACCCCGGCTCAGGGTACCTCTATGTACCCGg
68 HBsAg-aa113-135-DR aattcCGGGTACATAGAGGTACCCTGAGCCGGGGTGGTGCAGGTACGGCACGGACCGGTAGAGGTGGTAGAAGAg
실시예 2에서 기술한 바와 같이, 상기에서 제조한 폴리펩티드를 코딩하는 3개의 단편을 각각 선형 벡터 RBHBcAg149 및 TBHBcAg153에 연결하여 재조합 단백질을 코딩하는 발현 플라스미드(총 6개: RBHBcAg149- SEQ60, RBHBcAg149-SEQ61, RBHBcAg149-SEQ62, TBHBcAg153-SEQ60, TBHBcAg153-SEQ61 및 TBHBcAg153-SEQ62)를 수득하였다. 발현 플라스미드에 의해 코딩된 재조합 단백질의 아미노산 서열을 표 6에 나타내었다.
6개의 재조합 단백질의 아미노산 서열
서열번호 재조합 단백질 서열정보
69 RBHBcAg149-SEQ60 MDIDPYKEFGASSQLISFLPEDFFPNLAELVETTTALYEEELVGKEHCSPHHTALRSLLNCWGETVRLITWVRNSVEGGGGGSGGGGTGSSTTTSTGPCKTCTTPAQGNSMFPEFGGGGSGGGGSQDAIVQQVQASVGLRMRQLMWFHLSCLTFGQPTVIEFLVSFGTWIRTPQAYRPPNAPILSTLPEHTIV
70 RBHBcAg149-SEQ61 MDIDPYKEFGASSQLISFLPEDFFPNLAELVETTTALYEEELVGKEHCSPHHTALRSLLNCWGETVRLITWVRNSVEGGGGGSGGGGTGSTSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFPEFGGGGSGGGGSQDAIVQQVQASVGLRMRQLMWFHLSCLTFGQPTVIEFLVSFGTWIRTPQAYRPPNAPILSTLPEHTIV
71 RBHBcAg149-SEQ62 MDIDPYKEFGASSQLISFLPEDFFPNLAELVETTTALYEEELVGKEHCSPHHTALRSLLNCWGETVRLITWVRNSVEGGGGGSGGGGTGSSSTTSTGPCRTCTTPAQGTSMYPEFGGGGSGGGGSQDAIVQQVQASVGLRMRQLMWFHLSCLTFGQPTVIEFLVSFGTWIRTPQAYRPPNAPILSTLPEHTIV
72 TBHBcAg153-SEQ60 MENLERLDIYKEFGVSDVLVSFLPDDFFPTLQQLLESVNALYEDELTGPNHCSPHHTALRHLIMCGVELRDFIDWMHEQGGGGGSGGGGTGSSTTTSTGPCKTCTTPAQGNSMFPEFGGGGSGGGGSDADALLAGYLRSKYLKHITKAIWYHLSCLTFGKQTVHEYLVSFGTWIRTPAAYRPVNAPILTTLPETSVI
73 TBHBcAg153-SEQ61 MENLERLDIYKEFGVSDVLVSFLPDDFFPTLQQLLESVNALYEDELTGPNHCSPHHTALRHLIMCGVELRDFIDWMHEQGGGGGSGGGGTGSTSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFPEFGGGGSGGGGSDADALLAGYLRSKYLKHITKAIWYHLSCLTFGKQTVHEYLVSFGTWIRTPAAYRPVNAPILTTLPETSVI
74 TBHBcAg153-SEQ62 MENLERLDIYKEFGVSDVLVSFLPDDFFPTLQQLLESVNALYEDELTGPNHCSPHHTALRHLIMCGVELRDFIDWMHEQGGGGGSGGGGTGSSSTTSTGPCRTCTTPAQGTSMYPEFGGGGSGGGGSDADALLAGYLRSKYLKHITKAIWYHLSCLTFGKQTVHEYLVSFGTWIRTPAAYRPVNAPILTTLPETSVI
5.2 재조합 단백질의 발현, 정제 및 조립
실시예 2에 기술된 바와 같이, 전 단계에서 제작된 6개의 발현 플라스미드를 사용하여 발현 플라스미드에 의해 코딩된 재조합 단백질을 발현 및 정제 하였다. 이후, 재조합 단백질에 의해 형성된 VLP는 투과 전자 현미경 (TEM)에 의해 관찰되었다.
도 7은 6개의 제조된 재조합 단백질에 의해 형성된 바이러스-유사 입자의 TEM 결과를 나타낸다. 결과는 얻어진 6개의 모든 재조합 단백질이 직경 약 30nm의 바이러스-유사 입자로 조립될 수 있음을 보여준다. 이러한 결과는 본 발명에서 제조된 폴리펩티드 캐리어가 다양한 범용성을 가지며, 다양한 HBV 유전자형으로부터 에피토프 펩티드(예를 들어, HBsAg 단백질의 aa113-135)를 제시하는데 사용될 수 있고, VLP를 잘 형성할 수 있음을 보여준다.
5.3 바이러스-유사 입자의 면역원성 평가
실시예 3에 기술된 방법을 사용하여, 상기에서 제조된 6 개의 재조합 단백질 및 실시예 2의 재조합 단백질 RBHBcAg149-SEQ22 및 TBHBcAg153-SEQ22로 형성된 바이러스-유사 입자의 면역원성을 평가 하였다. 실험 결과는 도 8에 나타낸다.
도 8은 8개의 재조합 단백질에 의해 형성된 바이러스-유사 입자로 면역화된 BALB/C 마우스의 3 주 후, 마우스의 혈청에서 상응하는 타겟 폴리 펩타이드(서열 번호 60, 22, 61 및 62)에 대한 항체의 역가를 나타내며; HBV 유전자형 A로부터의 HBsAg 단백질의 에피토프 펩티드(서열 번호 60)를 사용하여 RBHBcAg149-SEQ60 및 TBHBcAg153-SEQ60으로 면역화된 마우스의 혈청에서의 항체 역가를 측정함; HBV 유전자형 B로부터의 HBsAg 단백질의 에피토프 펩티드(서열 번호 22)를 사용하여 RBHBcAg149-SEQ22 및 TBHBcAg153-SEQ22로 면역화된 마우스의 혈청에서의 항체 역가를 측정함; HBV 유전자형 C로부터의 HBsAg 단백질의 에피토프 펩티드(서열 번호 61)를 사용하여 RBHBcAg149-SEQ61 및 TBHBcAg153-SEQ61으로 면역화된 마우스의 혈청에서의 항체 역가를 측정함; 그리고 HBV 유전자형 D로부터의 HBsAg 단백질의 에피토프 펩티드(서열 번호 62)를 사용하여 RBHBcAg149-SEQ62 및 TBHBcAg153-SEQ62로 면역화된 마우스의 혈청에서의 항체 역가를 측정함. 결과는 8개의 재조합 단백질에 의해 형성된 바이러스-유사 입자가 우수한 면역원성을 가지며 마우스의 타겟 에피토프에 특이 적으로 결합하는 고 역가 항체의 생성을 유도할 수 있음을 보여준다.
5.4 바이러스-유사 입자의 항HBV 치료 효과에 대한 평가
실시예 4에 기재된 방법을 사용하여, 4가지 재조합 단백질 (서열번호 36, 69, 70 및 71)에 의해 형성된 바이러스-유사 입자의 항-HBV 치료 효과에 대해 평가 하였다. 실험결과는 도 9에 나타낸다.
도 9는 상기에서 제조된 4가지 재조합 단백질(RBHBcAg149-SEQ22, RBHBcAg149-SEQ60, RBHBcAg149-SEQ61, 및 RBHBcAg149-SEQ62; 이들의 서열번호는 각각 36, 69, 70, 및 71이다)에 의해 형성된 바이러스-유사 입자로 HBV 트랜스제닉 수컷(도 9A) 및 암컷(도 9B) 마우스를 처리한 후, 시간에 따른 마우스 혈청에서의 HBsAg 수준의 변화를 나타내며, 세로축: HBsAg 수준(IU/ml); 가로축: 시간(week). 결과는 VLP로 면역요법을 받은 마우스에서 혈청의 HBsAg 수준이 면역화 후 유의하게 감소했다는 것을 보여준다.
이러한 실험 결과는, 본 발명의 폴리펩티드 캐리어(예를 들어, RBHBcAg149 및 TBHBcAg153)가 상이한 유전자형(예를 들어, 유전자형 A, B, C 및 D)의 인간 HBV로부터의 HBsAg의 에피토프 펩티드(예를 들어, HBsAg-aa113-135)를 효과적으로 제시하는데 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 본 발명의 폴리펩티드 캐리어 및 HBsAg의 에피토프 펩티드에 기초하여 제조된 재조합 단백질은 VLP를 형성할 수 있고, 유기체에서 고 역가 항-HBsAg 항체의 생성을 유도함으로써 마우스에서의 HBsAg 수준(즉, HBsAg 수준이 현저하게 감소함)을 억제할 수 있다. 이는 본 발명의 폴리펩티드 캐리어 및 HBsAg의 에피토프 펩티드를 포함하는 재조합 단백질이 다양한 HBV 유전자형에 의한 감염을 예방하고 치료하는데 사용될 수 있고, 따라서 새로운 항-HBV 백신 및 약제의 개발에 사용될 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 실시예가 상세히 설명되었지만, 당업자는 모든 개시된 교시에 따라, 세부사항이 수정되거나 변경될 수 있으며, 이러한 변경은 모두 본 발명의 보호범위에 해당한다는 것을 이애할 것이다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위 및 그에 상당하는 것에 의해 한정된다.
<110> Xiamen University <120> Polypeptide carrier for presenting target polypeptide and uses thereof <130> APC-2018-0145 <150> CN 201510523187.8 <151> 2015-08-25 <160> 74 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 189 <212> PRT <213> roundleaf bat HBV <400> 1 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Glu Asp Phe Phe Pro Asn Leu Ala Glu Leu Val Glu 20 25 30 Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Ser Leu Leu Asn Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Pro Leu 65 70 75 80 Ile Gln Asp Ala Ile Val Gln Gln Val Gln Ala Ser Val Gly Leu Arg 85 90 95 Met Arg Gln Leu Met Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln 100 105 110 Pro Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Gln Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu His Thr Ile Val Arg Arg Arg Gly Gly Ser Arg Ala Thr Arg Ser 145 150 155 160 Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro 165 170 175 Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Ser Asn Cys 180 185 <210> 2 <211> 188 <212> PRT <213> tent-making bat HBV <400> 2 Met Glu Asn Leu Glu Arg Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Phe Gly Val Ser 1 5 10 15 Asp Val Leu Val Ser Phe Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro Thr Leu Gln 20 25 30 Gln Leu Leu Glu Ser Val Asn Ala Leu Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gly 35 40 45 Pro Asn His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg His Leu Ile Met 50 55 60 Cys Gly Val Glu Leu Arg Asp Phe Ile Asp Trp Met His Glu Gln Gly 65 70 75 80 Leu Ser Pro Asp Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gly Tyr Leu Arg Ser Lys 85 90 95 Tyr Leu Lys His Ile Thr Lys Ala Ile Trp Tyr His Leu Ser Cys Leu 100 105 110 Thr Phe Gly Lys Gln Thr Val His Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Thr 115 120 125 Trp Ile Arg Thr Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Val Asn Ala Pro Ile Leu 130 135 140 Thr Thr Leu Pro Glu Thr Ser Val Ile Arg Arg Arg Pro Ala Ser Arg 145 150 155 160 Arg Ser Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg 165 170 175 Arg Arg Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Ser Asn Cys 180 185 <210> 3 <211> 189 <212> PRT <213> horseshoe bat HBV <400> 3 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Val 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ala Asp Phe Phe Pro Ala Leu Asn Asp Leu Val Glu 20 25 30 Thr Ser Val Ala Leu Tyr Glu Glu Asp Leu Val Gly Lys Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Ala Ala Leu Arg Ala Leu Leu Asn Cys Trp Glu Glu 50 55 60 Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Ala Thr Val Glu Gly Gln Pro 65 70 75 80 Val Gln Asp Ala Ile Ile Gly Tyr Val Gln Thr Thr Val Gly Leu Arg 85 90 95 Met Arg Gln Gln Ile Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln 100 105 110 Gln Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Met Arg Thr 115 120 125 Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Asn Pro Arg Ala Pro Arg Ser 145 150 155 160 Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro 165 170 175 Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ala Pro Ser Asn Cys 180 185 <210> 4 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RBHBcAg189 carrier <400> 4 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Glu Asp Phe Phe Pro Asn Leu Ala Glu Leu Val Glu 20 25 30 Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Ser Leu Leu Asn Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Glu Phe Gly Gly Gly Gly 85 90 95 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala Ile Val Gln Gln Val Gln Ala 100 105 110 Ser Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Leu Met Trp Phe His Leu Ser Cys 115 120 125 Leu Thr Phe Gly Gln Pro Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly 130 135 140 Thr Trp Ile Arg Thr Pro Gln Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile 145 150 155 160 Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Ile Val Arg Arg Arg Gly Gly Ser 165 170 175 Arg Ala Thr Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg 180 185 190 Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Ser 195 200 205 Asn Cys 210 <210> 5 <211> 170 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RBHBcAg149 carrier <400> 5 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Glu Asp Phe Phe Pro Asn Leu Ala Glu Leu Val Glu 20 25 30 Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Ser Leu Leu Asn Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Glu Phe Gly Gly Gly Gly 85 90 95 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala Ile Val Gln Gln Val Gln Ala 100 105 110 Ser Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Leu Met Trp Phe His Leu Ser Cys 115 120 125 Leu Thr Phe Gly Gln Pro Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly 130 135 140 Thr Trp Ile Arg Thr Pro Gln Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile 145 150 155 160 Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Ile Val 165 170 <210> 6 <211> 209 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> TBHBcAg188 carrier <400> 6 Met Glu Asn Leu Glu Arg Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Phe Gly Val Ser 1 5 10 15 Asp Val Leu Val Ser Phe Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro Thr Leu Gln 20 25 30 Gln Leu Leu Glu Ser Val Asn Ala Leu Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gly 35 40 45 Pro Asn His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg His Leu Ile Met 50 55 60 Cys Gly Val Glu Leu Arg Asp Phe Ile Asp Trp Met His Glu Gln Gly 65 70 75 80 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Glu Phe Gly Gly 85 90 95 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gly 100 105 110 Tyr Leu Arg Ser Lys Tyr Leu Lys His Ile Thr Lys Ala Ile Trp Tyr 115 120 125 His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Lys Gln Thr Val His Glu Tyr Leu 130 135 140 Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Val 145 150 155 160 Asn Ala Pro Ile Leu Thr Thr Leu Pro Glu Thr Ser Val Ile Arg Arg 165 170 175 Arg Pro Ala Ser Arg Arg Ser Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 180 185 190 Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Ser Asn 195 200 205 Cys <210> 7 <211> 174 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> TBHBcAg153 carrier <400> 7 Met Glu Asn Leu Glu Arg Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Phe Gly Val Ser 1 5 10 15 Asp Val Leu Val Ser Phe Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro Thr Leu Gln 20 25 30 Gln Leu Leu Glu Ser Val Asn Ala Leu Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gly 35 40 45 Pro Asn His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg His Leu Ile Met 50 55 60 Cys Gly Val Glu Leu Arg Asp Phe Ile Asp Trp Met His Glu Gln Gly 65 70 75 80 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Glu Phe Gly Gly 85 90 95 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gly 100 105 110 Tyr Leu Arg Ser Lys Tyr Leu Lys His Ile Thr Lys Ala Ile Trp Tyr 115 120 125 His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Lys Gln Thr Val His Glu Tyr Leu 130 135 140 Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Val 145 150 155 160 Asn Ala Pro Ile Leu Thr Thr Leu Pro Glu Thr Ser Val Ile 165 170 <210> 8 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HBHBcAg189 carrier <400> 8 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Val 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ala Asp Phe Phe Pro Ala Leu Asn Asp Leu Val Glu 20 25 30 Thr Ser Val Ala Leu Tyr Glu Glu Asp Leu Val Gly Lys Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Ala Ala Leu Arg Ala Leu Leu Asn Cys Trp Glu Glu 50 55 60 Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Ala Thr Val Glu Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Glu Phe Gly Gly Gly Gly 85 90 95 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala Ile Ile Gly Tyr Val Gln Thr 100 105 110 Thr Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Gln Ile Trp Phe His Leu Ser Cys 115 120 125 Leu Thr Phe Gly Gln Gln Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly 130 135 140 Thr Trp Met Arg Thr Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile 145 150 155 160 Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Asn Pro 165 170 175 Arg Ala Pro Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg 180 185 190 Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ala Pro Ser 195 200 205 Asn Cys 210 <210> 9 <211> 170 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HBHBcAg149 carrier <400> 9 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Val 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ala Asp Phe Phe Pro Ala Leu Asn Asp Leu Val Glu 20 25 30 Thr Ser Val Ala Leu Tyr Glu Glu Asp Leu Val Gly Lys Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Ala Ala Leu Arg Ala Leu Leu Asn Cys Trp Glu Glu 50 55 60 Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Ala Thr Val Glu Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Glu Phe Gly Gly Gly Gly 85 90 95 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ala Ile Ile Gly Tyr Val Gln Thr 100 105 110 Thr Val Gly Leu Arg Met Arg Gln Gln Ile Trp Phe His Leu Ser Cys 115 120 125 Leu Thr Phe Gly Gln Gln Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly 130 135 140 Thr Trp Met Arg Thr Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile 145 150 155 160 Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr Val Ile 165 170 <210> 10 <211> 204 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HBcAg183 carrier <400> 10 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Glu Phe Gly Gly Gly Gly 85 90 95 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val 100 105 110 Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys 115 120 125 Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly 130 135 140 Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Gln Asn Ala Pro Ile 145 150 155 160 Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser 165 170 175 Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro 180 185 190 Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 195 200 <210> 11 <211> 170 <212> PRT 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Thr Leu Pro Glu His Thr Ile 180 185 190 Val <210> 72 <211> 197 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recombinant protein TBHBcAg153-SEQ60 <400> 72 Met Glu Asn Leu Glu Arg Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Phe Gly Val Ser 1 5 10 15 Asp Val Leu Val Ser Phe Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro Thr Leu Gln 20 25 30 Gln Leu Leu Glu Ser Val Asn Ala Leu Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gly 35 40 45 Pro Asn His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg His Leu Ile Met 50 55 60 Cys Gly Val Glu Leu Arg Asp Phe Ile Asp Trp Met His Glu Gln Gly 65 70 75 80 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ser Thr Thr Thr 85 90 95 Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser 100 105 110 Met Phe Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 115 120 125 Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gly Tyr Leu Arg Ser Lys Tyr Leu Lys His 130 135 140 Ile Thr Lys Ala Ile Trp Tyr His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Lys 145 150 155 160 Gln Thr Val His Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr 165 170 175 Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Val Asn Ala Pro Ile Leu Thr Thr Leu Pro 180 185 190 Glu Thr Ser Val Ile 195 <210> 73 <211> 197 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recombinant protein TBHBcAg153-SEQ61 <400> 73 Met Glu Asn Leu Glu Arg Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Phe Gly Val Ser 1 5 10 15 Asp Val Leu Val Ser Phe Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro Thr Leu Gln 20 25 30 Gln Leu Leu Glu Ser Val Asn Ala Leu Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gly 35 40 45 Pro Asn His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg His Leu Ile Met 50 55 60 Cys Gly Val Glu Leu Arg Asp Phe Ile Asp Trp Met His Glu Gln Gly 65 70 75 80 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Thr Ser Thr Thr 85 90 95 Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Met Phe Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 115 120 125 Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gly Tyr Leu Arg Ser Lys Tyr Leu Lys His 130 135 140 Ile Thr Lys Ala Ile Trp Tyr His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Lys 145 150 155 160 Gln Thr Val His Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr 165 170 175 Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Val Asn Ala Pro Ile Leu Thr Thr Leu Pro 180 185 190 Glu Thr Ser Val Ile 195 <210> 74 <211> 197 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recombinant protein TBHBcAg153-SEQ62 <400> 74 Met Glu Asn Leu Glu Arg Leu Asp Ile Tyr Lys Glu Phe Gly Val Ser 1 5 10 15 Asp Val Leu Val Ser Phe Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro Thr Leu Gln 20 25 30 Gln Leu Leu Glu Ser Val Asn Ala Leu Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gly 35 40 45 Pro Asn His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg His Leu Ile Met 50 55 60 Cys Gly Val Glu Leu Arg Asp Phe Ile Asp Trp Met His Glu Gln Gly 65 70 75 80 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ser Ser Thr Thr 85 90 95 Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Met Tyr Pro Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 115 120 125 Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gly Tyr Leu Arg Ser Lys Tyr Leu Lys His 130 135 140 Ile Thr Lys Ala Ile Trp Tyr His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Lys 145 150 155 160 Gln Thr Val His Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr 165 170 175 Pro Ala Ala Tyr Arg Pro Val Asn Ala Pro Ile Leu Thr Thr Leu Pro 180 185 190 Glu Thr Ser Val Ile 195

Claims (16)

  1. 폴리펩티드 캐리어 또는 그의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산분자로서,
    상기 변이체는 상기 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%의 상동성을 가지거나(예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%), 엄격 조건(stringent condition) 또는 고 엄격 조건 하에서 상기 뉴클레오티드 서열에 하이브리드할 수 있고, 상기 폴리펩티드 캐리어는 하기로부터 선택되는, 핵산분자:
    (1) 라운드리프 박쥐 HBV(RBHBcAg; 예를 들어, 그의 아미노산 서열은 서열번호 1에 기재됨)로부터의 코어 항원 단백질과 다음의 점에서 상이한 RBHBcAg 캐리어: (a) RBHBcAg 단백질의 N 말단에서 78-83 위치 아미노산의 하나 이상의 아미노산 잔기(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 아미노산 잔기; 예를 들어 78-83 위치의 아미노산 잔기, 78-82 위치의 아미노산 잔기, 78-81 위치의 아미노산 잔기, 또는 78-80 위치의 아미노산 잔기)가 결실되거나 링커(예를 들어, 가요성 링커; 예를 들어, 서열번호 43에 기재된 링커)로 치환됨; 그리고 (b) 선택적으로, RBHBcAg 단백질의 C말단의 1-40 아미노산 잔기(예를 들어, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35 또는 35-40 아미노산 잔기)가 결실됨;
    (2) 천막박쥐 HBV(TBHBcAg; 예를 들어, 그의 아미노산 서열은 서열번호 2에 기재됨)로부터의 코어 항원 단백질과 다음의 점에서 상이한 TBHBcAg 캐리어: (a) TBHBcAg 단백질의 N 말단에서 80-84 위치 아미노산의 하나 이상의 아미노산 잔기(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 잔기; 예를 들어 80-84 위치의 아미노산 잔기, 80-83 위치의 아미노산 잔기, 또는 80-82 위치의 아미노산 잔기)가 결실되거나 링커(예를 들어, 가요성 링커; 예를 들어, 서열번호 43에 기재된 링커)로 치환됨; 그리고 (b) 선택적으로, TBHBcAg 단백질의 C말단의 1-35 아미노산 잔기(예를 들어, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 또는 30-35 아미노산 잔기)가 결실됨; 또는
    (3) 관박쥐 HBV(HBHBcAg; 예를 들어, 그의 아미노산 서열은 서열번호 3에 기재됨)로부터의 코어 항원 단백질과 다음의 점에서 상이한 HBHBcAg 캐리어: (a) HBHBcAg 단백질의 N- 말단의 78-83 위치 아미노산의 하나 이상의 아미노산 잔기(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 아미노산 잔기; 예를 들어 78-83 위치의 아미노산 잔기, 78-82 위치의 아미노산 잔기, 78-81 위치의 아미노산 잔기, 또는 78-80 위치의 아미노산 잔기)가 결실되거나 링커(예를 들어, 가요성 링커; 예를 들어, 서열번호 43에 기재된 링커)로 치환됨; 그리고 (b) 선택적으로, HBHBcAg 단백질의 C말단의 1-40 아미노산 잔기(예를 들어, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35 또는 35-40 아미노산 잔기)가 결실됨;
    바람직하게는, 결실된 하나 이상의 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드의 위치에 제한효소 절단 부위가 도입됨;
    바람직하게는, 제한효소 절단 부위가 상기 링커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 그의 한쪽 또는 양쪽 말단에 도입됨;
    바람직하게는, 상기 폴리펩티드 캐리어는 서열번호 4 내지 9로부터 선택되는 아미노산 서열을 가짐;
    바람직하게는, 상기 핵산 분자는 서열번호 12 내지 17로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함함;
    바람직하게는, 상기 핵산 분자는 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하는데 사용되며, 예를 들어, 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 결실된 하나 이상의 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드의 위치에 삽입되거나 링커를 코딩하는 뉴클레오티드의 서열 또는 그의 한쪽 또는 양쪽 말단에 삽입됨(예를 들어, 제한효소 절단 부위에 의해);
    바람직하게는, 상기 핵산 분자는 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 상기 타겟 폴리펩티드는 폴리펩티드 캐리어에 대해 이종이며, 상기 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 결실된 하나 이상의 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드 위치에 삽입되거나 또는 링커를 코딩하는 뉴클레오티드 또는 그의 한쪽 또는 양쪽 말단에 삽입됨(예를 들어, 제한효소 절단 부위에 의해); 바람직하게는, 상기 타겟 폴리펩티드는 에피토프 펩티드, 예를 들어, HIV, PDL1 또는 HBV (특히 인간 HBV)로부터의 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩티드; 바람직하게는, 상기 에피토프 펩티드는 인간 HBV(예를 들어, HBV 유전자형 A, B, C 또는 D)로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, HBsAg 단백질의 113-135 위치로부터의 아미노산과 같은 선형 에피토프), HIV GP120 단백질의 에피토프(예를 들어, GP120 단백질의 361-375 위치로부터의 아미노산과 같은 선형 에피토프), 또는 인간 PD-L1의 에피토프(예를 들어, 인간 PD-L1의 147-160 위치로부터의 아미노산과 같은 선형 에피토프)를 포함함; 바람직하게는, 타겟 폴리펩티드는 서열번호 20 내지 22 및 60 내지 62로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지며; 바람직하게는, 핵산 분자는 서열번호 23 내지 40 및 69 내지 74로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성되거나, 이를 포함함.
  2. 제1항의 핵산 분자를 포함하는 벡터(예를 들어, 클로닝벡터 또는 발현벡터).
  3. 제1항의 핵산 분자 또는 제2항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  4. 타겟 폴리펩티드를 제시하는 방법으로서,
    (1) 제1항에 따른 핵산 분자 내에 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하여 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 수득하는 단계; 바람직하게는, 상기 타겟 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 결실되거나 링커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 말단 중 하나 또는 양쪽 모두에 삽입되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드의 위치에 삽입되는(예를 들어, 효소절단 부위에 의해), 단계; 및
    (2) 상기 단계 (1)의 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 발현시켜 재조합 단백질을 생산하는 단계;
    바람직하게는, 상기 타겟 폴리펩티드는 에피토프 펩티드, 예를 들어, HIV, PDL1 또는 HBV (특히 인간 HBV)로부터의 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩티드; 바람직하게는, 상기 에피토프 펩티드는 인간 HBV(예를 들어, HBV 유전자형 A, B, C 또는 D)로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, HBsAg 단백질의 113-135 위치로부터의 아미노산과 같은 선형 에피토프), HIV GP120 단백질의 에피토프(예를 들어, GP120 단백질의 361-375 위치로부터의 아미노산과 같은 선형 에피토프), 또는 인간 PD-L1의 에피토프(예를 들어, 인간 PD-L1의 147-160 위치로부터의 아미노산과 같은 선형 에피토프)를 포함함; 바람직하게는, 상기 타겟 폴리펩티드는 서열번호 20 내지 22 및 60 내지 62로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지며; 바람직하게는, 상기 핵산 분자는 서열번호 23 내지 40 및 69 내지 74로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성되거나, 이를 포함하는, 단계.
  5. 폴리펩티드 캐리어 및 타겟 폴리펩티드를 포함하는 재조합 단백질로서,
    상기 폴리펩티드 캐리어는 제1항에서 정의된 바와 같고, 상기 타겟 폴리펩티드는 결실되거나 링커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 말단 중 하나 또는 양쪽 모두에 삽입되는 하나 이상의 아미노산 잔기의 위치에 삽입되고; 바람직하게는, 상기 폴리펩티드 캐리어는 서열번호 4 내지 9로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지며;
    바람직하게는, 상기 타겟 폴리펩티드는 에피토프 펩티드, 예를 들어, HIV, PDL1 또는 HBV (특히 인간 HBV)로부터의 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩티드; 바람직하게는, 상기 에피토프 펩티드는 인간 HBV(예를 들어, HBV 유전자형 A, B, C 또는 D)로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, HBsAg 단백질의 113-135 위치로부터의 아미노산과 같은 선형 에피토프), HIV GP120 단백질의 에피토프(예를 들어, GP120 단백질의 361-375 위치로부터의 아미노산과 같은 선형 에피토프), 또는 인간 PD-L1의 에피토프(예를 들어, 인간 PD-L1의 147-160 위치로부터의 아미노산과 같은 선형 에피토프)를 포함함; 바람직하게는, 상기 타겟 폴리펩티드는 서열번호 20 내지 22 및 60 내지 62로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지며; 바람직하게는, 상기 재조합 단백질은 서열번호 23 내지 40 및 69 내지 74로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성되거나, 이를 포함하는, 재조합 단백질.
  6. 제5항의 재조합 단백질로 이루어지거나, 이를 포함하는 바이러스-유사 입자.
  7. 제5항에 따른 재조합 단백질 또는 제6항에 따른 바이러스-유사 입자, 및 선택적으로, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제(예를 들어, 보조제)를 포함하는, 약학 조성물(예를 들어, 백신).
  8. 제5항의 재조합 단백질 또는 제6항의 바이러스-유사 입자 또는 제7항의 약학 조성물을, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, HBV 감염 또는 HBV 감염에 관련된 질병(예를 들어, B형 간염)을 예방하거나 치료하는 방법으로서,
    상기 타겟 폴리펩티드는 HBV(특히 인간 HBV)로부터의 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩티드이고; 바람직하게는, 상기 에피토프 펩티드는 인간 HBV(예를 들어, HBV 유전자형 A, B, C 또는 D)로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, HBsAg 단백질의 113-135 위치로부터의 아미노산과 같은 선형 에피토프)를 포함하며; 바람직하게는, 상기 타겟 폴리펩티드는 서열번호 22 및 60 내지 62로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지고; 바람직하게는, 상기 재조합 단백질은 서열번호 35 내지 40 및 69 내지 74로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는, 방법.
  9. HBV 감염 또는 HBV 감염에 관련된 질병(예를 들어, B형 간염)을 예방하거나 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 제5항의 재조합 단백질 또는 제6항의 바이러스-유사 입자 또는 제7항의 약학 조성물의 용도로서,
    상기 타겟 폴리펩티드는 HBV(특히 인간 HBV)로부터의 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩티드이고; 바람직하게는, 상기 에피토프 펩티드는 인간 HBV(예를 들어, HBV 유전자형 A, B, C 또는 D)로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, HBsAg 단백질의 113-135 위치로부터의 아미노산과 같은 선형 에피토프)를 포함하며; 바람직하게는, 상기 타겟 폴리펩티드는 서열번호 22 및 60 내지 62로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지고; 바람직하게는, 상기 재조합 단백질은 서열번호 35 내지 40 및 69 내지 74로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는, 용도.
  10. HBV 감염 또는 HBV 감염에 관련된 질병(예를 들어, B형 간염)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 제5항의 재조합 단백질 또는 제6항의 바이러스-유사 입자 또는 제7항의 약학 조성물로서, 상기 타겟 폴리펩티드는 HBV(특히 인간 HBV)로부터의 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩티드이고; 바람직하게는, 상기 에피토프 펩티드는 인간 HBV(예를 들어, HBV 유전자형 A, B, C 또는 D)로부터의 HBsAg의 에피토프(예를 들어, HBsAg 단백질의 113-135 위치로부터의 아미노산과 같은 선형 에피토프)를 포함하며; 바람직하게는, 상기 타겟 폴리펩티드는 서열번호 22 및 60 내지 62로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지고; 바람직하게는, 상기 재조합 단백질은 서열번호 35 내지 40 및 69 내지 74로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는, 용도.
  11. 제5항에 따른 재조합 단백질을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
  12. 제11항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터(예를 들어, 클로닝벡터 또는 발현벡터).
  13. 제11항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제12항에 따른 벡터를 포함하는, 숙주세포.
  14. 제5항에 따른 재조합 단백질을 제조하기 위한 방법으로서, 제13항에 따른 숙주세포를 재조합 단백질의 발현에 적합한 조건으로 배양하는 단계; 및 상기 재조합 단백질을 회수하는 단계; 를 포함하는, 방법.
  15. HIV 감염 또는 HIV 감염에 관련된 질병(예를 들어, AIDS)을 예방하거나 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 제5항의 재조합 단백질 또는 제6항의 바이러스-유사 입자의 용도로서,
    상기 타겟폴리펩티드는 HIV로부터의 항원성 에피토프를 포함하고; 바람직하게는, 상기 타겟 폴리펩티드는 HIV로부터의 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩티드이고; 바람직하게는, 상기 에피토프 펩티드는, HIV GP120 단백질의 에피토프(예를 들어, GP120 단백질의 361-375 위치로부터의 아미노산과 같은 선형 에피토프)를 포함하고; 상기 타겟 폴리펩티드는 서열번호 20에 개시된 아미노산 서열을 가지며; 바람직하게는, 상기 재조합 단백질은 서열번호 23 내지 28로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는, 용도.
  16. 암(예를 들어, 비소세포 폐암)을 예방하거나 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 제5항의 재조합 단백질 또는 제6항의 바이러스-유사 입자의 용도로서,
    상기 타겟 폴리펩티드는 인간 PD-L1 단백질로부터의 항원성 에피토프를 포함하고; 바람직하게는, 상기 타겟 폴리펩티드는 인간 PD-L1으로부터의 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프 펩티드이고; 바람직하게는, 상기 에피토프 펩티드는, 인간 PD-L1 단백질의 147-160 위치의 아미노산을 포함하고; 상기 타겟 폴리펩티드는 서열번호 21에 개시된 아미노산 서열을 가지며; 바람직하게는, 상기 재조합 단백질은 서열번호 29 내지 34로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는, 용도.

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2543453A (en) 2014-06-26 2017-04-19 Univ Rockefeller Acinetobacter lysins
JP6955020B2 (ja) * 2017-02-17 2021-10-27 シャアメン ユニバーシティ 標的ポリペプチドを提示するためのポリペプチド担体及びその使用
AU2020280539A1 (en) * 2019-05-23 2022-01-27 Xiamen University Novel anti-hepatitis B virus antibody and uses thereof
CN111138550B (zh) * 2020-01-06 2022-12-13 国药中生生物技术研究院有限公司 一种重组呼吸道合胞病毒嵌合疫苗及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102127554A (zh) * 2010-12-22 2011-07-20 南京农业大学 一种日本脑炎颗粒疫苗及其制备方法和应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ219516A (en) * 1987-02-10 1991-02-26 Wellcome Found Fusion proteins of hbcag (hepatitis b virus core antigen)
US20060094017A1 (en) 2003-02-14 2006-05-04 Conley Anthony J Immunogens for hiv vaccine
US7144712B2 (en) 2003-07-30 2006-12-05 Vaccine Research Institute Of San Diego Human hepatitis B virus core proteins as vaccine platforms and methods of use thereof
CN100537762C (zh) * 2004-06-24 2009-09-09 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一种嵌合型病毒样颗粒疫苗载体蛋白及其制备方法与应用
CN104211784B (zh) 2013-06-04 2018-05-22 厦门大学 用于制备戊型肝炎病毒样颗粒的蛋白质和方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102127554A (zh) * 2010-12-22 2011-07-20 南京农业大学 一种日本脑炎颗粒疫苗及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
David C. Whitacre, Expert rev. Vaccines 8(11) 1565-1573 (2009.11.) *
F.Schodel 등, J Biotechnol. 44(1-3):91-96 (1996.01.26.) *
J.F. Drexler 등, PNAS vol.110, no.40, p.16151-16156 (2013.10.01.)* *

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