CN114634579A

CN114634579A - 一种抗新冠病毒基因工程疫苗

Info

Publication number: CN114634579A
Application number: CN202011487036.9A
Authority: CN
Inventors: 黄忠; 臧金凯
Original assignee: Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Current assignee: Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Priority date: 2020-12-16
Filing date: 2020-12-16
Publication date: 2022-06-17

Abstract

本发明提供了一种抗新冠病毒基因工程疫苗，具体地，本发明提供了融合蛋白和新型冠状病毒的疫苗多肽，本发明还提供含有所述融合蛋白或疫苗多肽的疫苗组合物及其应用。实验表明，本发明的融合蛋白或疫苗多肽可产生阻断RBD与ACE2结合的较高滴度的中和抗体，因而本发明在新型冠状病毒肺炎的预防或治疗有潜在的应用前景。

Description

一种抗新冠病毒基因工程疫苗

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种抗新冠病毒基因工程疫苗。

背景技术

冠状病毒有多个家族能够感染不同的宿主，在人体中能够引起从感冒到危机生命的感染。与其他冠状病毒一样，SARS-CoV-2与其他两种高致病性β型冠状病毒SARS-CoV-1、MERS一样，拥有约30kb的单链正义RNA基因组。该病毒基因组编码4种结构蛋白，包括刺突(S)、包膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)蛋白，16种非结构蛋白和少量辅助蛋白。其中S蛋白由胞外域、跨膜结构域和胞内结构域组成。胞外域可以进一步划分为两个功能不同的亚单位，S1和S2，分别负责受体结合和膜融合。与与之密切相关的SARS-CoV病毒一样，SARS-CoV-2也以人血管紧张素转换酶2(ACE2)为关键受体，促进其进入宿主细胞。S蛋白通过位于S1亚基内的受体结合域(RBD)与人类ACE2蛋白结合。

目前由于亚单位疫苗的免疫原大小有限，可能对于激发机体免疫不利。

因此，本领域迫切需要开发一种有更好的免疫原性和保护性的抗新型冠状病毒基因工程疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种有更好的免疫原性和保护性的抗新型冠状病毒基因工程疫苗。

本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：

(a)任选的信号肽序列；

(b)衍生自新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)的第一抗原元件，所述第一抗原元件的长度为190-300个氨基酸，较佳地，190-260个氨基酸，更佳地，200-220个氨基酸；

(c)衍生自新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)的第二抗原元件，所述第二抗原元件的长度为180-300个氨基酸，较佳地，190-260个氨基酸，更佳地，190-255个氨基酸。

在另一优选例中，所述融合蛋白具有式I所述结构：

Z0-Z1-Z2 (I)，

其中，

Z0为任选的信号肽序列；

Z1为衍生自新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)的第一抗原元件，所述第一抗原元件的长度为190-300个氨基酸，较佳地，190-260个氨基酸，更佳地，200-220个氨基酸；

Z2为衍生自新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)的第二抗原元件，所述第二抗原元件的长度为180-300个氨基酸，较佳地，190-260个氨基酸，更佳地，190-255个氨基酸；

“-”表示连接上述各元件的肽键或肽接头。

在另一优选例中，所述信号肽包括α-信号肽。

在另一优选例中，所述融合蛋白还包括一连接肽，位于组分(b)和(c)之间。

在另一优选例中，所述融合蛋白还包括一连接肽，位于Z1和Z2之间。

在另一优选例中，所述连接肽由甘氨酸和丝氨酸组成，较佳地，所述连接肽为具有(Gly)_n-Ser所示的序列，其中n为2-8，优选地n为3-6。

在另一优选例中，所述新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述第一抗原元件包含新型冠状病毒S蛋白的第320－534位氨基酸。

在另一优选例中，所述第一抗原元件包含新型冠状病毒S蛋白的第332－527位氨基酸。

在另一优选例中，所述第二抗原元件包含新型冠状病毒S蛋白的第332－527位氨基酸。

在另一优选例中，所述的融合蛋白与新型冠状病毒的S蛋白竞争性结合人ACE2蛋白。

在另一优选例中，所述的“竞争性结合”指所述的融合蛋白与新型冠状病毒的S蛋白结合于相同或基本相同的人ACE2蛋白的结合域(或氨基酸区段)。

在另一优选例中，所述的融合蛋白与新型冠状病毒的S蛋白结合于人ACE2蛋白上的相同的结合区段。

在另一优选例中，所述的竞争性结合包括阻断性或非阻断性的竞争性结合。

在另一优选例中，所述的融合蛋白为人工合成的或重组的融合蛋白。

在另一优选例中，所述融合蛋白为酵母细胞表达的重组蛋白。

在另一优选例中，所述酵母包括毕赤酵母。

在另一优选例中，所述融合蛋白选自下组：

(a)具有SEQ ID No:2或3所示的氨基酸序列的多肽；

(b)对(a)中多肽的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸添加、一个或多个氨基酸的取代或1-3个氨基酸缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与衍生前的SEQ ID No:2或3所示多肽具有相同或基本相同的功能。

在另一优选例中，所述的“基本相同的功能”指所述的衍生多肽具有基本相同的激发免疫反应的免疫原性，与新型冠状病毒的S蛋白竞争性结合人ACE2蛋白的活性。

本发明第二方面提供了一种疫苗多肽，所述疫苗多肽包括本发明第一方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述的疫苗多肽可激发灵长动物和啮齿动物产生阻断RBD与ACE2结合的中和抗体。

在另一优选例中，所述的疫苗多肽可激发灵长动物产生细胞免疫和体液免疫。

在另一优选例中，所述的灵长动物包括人、非人灵长类动物。

本发明第三方面提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的融合蛋白或本发明第二方面所述的疫苗多肽。

本发明第四方面提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第三方面所述的多核苷酸。

本发明第五方面提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第四方面所述的表达载体，或者在基因组中整合有本发明第三方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括酵母、果蝇S2细胞、大肠杆菌、CHO细胞、DC细胞。

本发明第六方面提供了一种药物组合物，所述的组合物含有本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的疫苗多肽或本发明第三方面所述的多核苷酸或者本发明第四方面所述的表达载体或者本发明第五方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或辅料。

在另一优选例中，所述的药物组合物为疫苗组合物。

在另一优选例中，所述疫苗组合物为单价或多价。

在另一优选例中，所述的药物组合物还含有佐剂，首选各种铝佐剂。

在另一优选例中，所述药物组合物中融合蛋白或免疫多肽、和佐剂(如铝)的摩尔数或重量比在1:100之间，优选为1:40到1:60之间。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括单方药物、复方药物、或协同药物。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为液态、固体、或凝胶态。

在另一优选例中，所述的药物组合物用选自下组的方式施用：皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射、微针注射、口服、或口鼻腔喷入和雾化吸入。

本发明第七方面提供了一种疫苗组合物，所述的组合物含有本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的疫苗多肽或本发明第三方面所述的多核苷酸或者本发明第四方面所述的表达载体或者本发明第五方面所述的宿主细胞，以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。

在另一优选例中，所述的佐剂包括氧化铝、皂苷、quil A、胞壁酰二肽、矿物油或植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、细胞因子(包括IL-1、IL-2、IFN-r、GM-CSF、IL-6、IL-12、和CpG)。

本发明第八方面提供了如本发明第一方面所述的融合蛋白或本发明第二方面所述的疫苗多肽或本发明第六方面所述的药物组合物或本发明第七方面所述的疫苗组合物的用途，(a)用于制备针对新型冠状病毒的抗体；和/或(b)用于制备预防冠状病毒SARS-CoV-2感染或其相关疾病的药物。

在另一优选例中，所述的冠状病毒SARS-CoV-2相关疾病选自下组：呼吸道感染、肺炎及其并发症、或其组合。

在另一优选例中，所述的冠状病毒SARS-CoV-2相关疾病为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。

本发明第九方面提供了一种制备本发明第一方面所述的融合蛋白的方法，包括步骤：

(i)在适宜条件下培养本发明第五方面所述的宿主细胞，从而表达本发明第一方面所述的融合蛋白；

(ii)纯化所述融合蛋白。

在另一优选例中，所述方法步骤(i)中将转化的酵母单菌落分别接种到BMGY培养基中，培养后离心去除上清，用BMMY培养基重悬菌体，28－30℃(优选为29.5℃)，诱导培养36－48小时(优选为48小时)。

本发明第十方面提供了一种产生针对冠状病毒SARS-CoV-2的免疫反应的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的疫苗多肽、或本发明第六方面所述的药物组合物或本发明第七方面所述的疫苗组合物。

在另一优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物包括非人灵长动物(如猴)。

在另一优选例中，所述方法在所述对象中诱导产生针对冠状病毒SARS-CoV-2的中和抗体。

在另一优选例中，所述中和抗体阻断冠状病毒SARS-CoV-2与人ACE2蛋白的结合。

本发明第十一方面提供了一种治疗方法，其特征在于，给需要的对象施用本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的疫苗多肽、本发明第三方面所述的多核苷酸或者本发明第四方面所述的表达载体或者本发明第五方面所述的宿主细胞或本发明第六方面所述的药物组合物或本发明第七方面所述的疫苗组合物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了pPinkα-HC-nCov-RBD-dimer质粒图谱。

其中，AOX1，醇氧化酶启动子；α，α-淀粉酶分泌信号肽；序列根据毕赤酵母基因进行密码子优化。

图2显示了小量筛选毕赤酵母高表达株。

(A)

#1：pPinkα-HC-RBD-dimer(320-534+332-527)；

#2：pPinkα-HC-RBD-dimer(332-550+332-527)；

#3：pPinkα-HC-RBD-dimer(320-550+319-534)；

#4：pPinkα-HC-RBD-dimer(332-527+332-527)。

四个质粒电转培养表达，取上清去糖基化处理后WB分析。

(B)pPinkα-HC-RBD-dimer(320-534+332-527)不同克隆的培养基部分取50ul样品上清ELISA检测。

(C)纯化的pPinkα-HC-RBD-dimer(320-534+332-527)3号菌株RBD-dimer蛋白考马斯亮蓝染色分析。

图3显示了RBD-dimer与ACE2受体蛋白的亲和力以及RBD-dimer抑制假病毒进入。

(A)与ACE2受体的结合亲和力。稳态时的结合亲和力表示为平衡解离常数(KD)。

(B)RBD-dimer抑制假病毒进入过表达hACE2-mcherry的HEK293T细胞。

图4显示了RBD-monomer、RBD-dimer免疫后抗体滴度、抗体功能及SARS-CoV-2假病毒中和检测。

(A)小鼠在免疫后能够产生针对293F表达的nCov-RBD的特异性抗体，随着免疫次数的增加抗体滴度也相应增加，并且RBD-dimer免疫后能够更快的产生抗体，2w、4w抗体滴度明显高于免疫RBD-monomer的血清滴度。

(B)ELISA试验证明免疫RBD-dimer后6周血清也能够与新冠三聚体刺突蛋白具有结合活性。

(C)免疫RBD-dimer和RBD-monomer后得到的14周血清，可以有效的阻止RBD与ACE2受体的结合。

(D)将假病毒与两倍系列稀释的6周血清温育1小时，然后加到293T/ACE2-mcherry细胞上。感染后约48小时测定细胞内荧光素酶活力，并使用GraphPad Prism软件计算每组免疫后血清的半数抑制浓度(IC₅₀)。数据表示为平均值±平均数标准误差。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，意外地获得一种融合蛋白，该融合蛋白包括衍生自新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)的第一抗原元件，所述第一抗原元件的长度为190-300个氨基酸，较佳地，190-260个氨基酸，更佳地，200-220个氨基酸；衍生自新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)的第二抗原元件，所述第二抗原元件的长度为180-300个氨基酸，较佳地，190-260个氨基酸，更佳地，190-255个氨基酸；以及任选的信号肽序列，并且该融合蛋白在酵母中高效表达，其具有功能性构象，能够与受体ACE2结合，用其免疫动物还可产生高效价血清中和抗体，具有极大的疫苗开发潜力。在此基础上，本发明人完成了本发明。

冠状病毒SARS-CoV-2

冠状病毒(Coronavirus，CoV)属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)，是一种有包膜的正链RNA病毒，其亚科包含α、β、δ及γ四属。

目前已知的感染人的冠状病毒中，HCoV-229E和HCoV-NL63属于α属冠状病毒，HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV-2均为β属冠状病毒。

2019年年底爆发的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)与SARS-CoV有约80％相似性、与MERS-CoV有40％的相似性，也属于β属冠状病毒。

该类病毒的基因组是一条单股正链RNA，是基因组最大的RNA病毒之一，编码包括复制酶、刺突蛋白、囊膜蛋白、包膜蛋白和核壳蛋白等。在病毒复制的初始阶段，基因组被翻译成两条长达几千个氨基酸的肽链即前体多聚蛋白(Polyprotein)，随后前体蛋白被蛋白酶切割生成非结构蛋白(如RNA聚合酶和解旋酶)和结构蛋白(如刺突蛋白)及辅助蛋白。

S蛋白是冠状病毒SARS-CoV-2的一种主要的结构蛋白，其中，RBD负责与人ACE2受体结合。

冠状病毒SARS-CoV-2的RBD区域位于S蛋白的第319-534位。

在本发明中，一种代表性的第一抗原元件的氨基酸序列如SEQ ID No:1中第332－527位或第320－534位所示，另一种代表性的第二抗原元件的氨基酸序列如SEQ ID No:1中第332－527位所示。

>Spike蛋白(S蛋白)

MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQ(SEQ ID NO.1)

应理解，在本发明中，S蛋白、RBD区域均包括野生型和突变型。

本发明主要目标是研发出一种能诱导机体产生靶向冠状病毒SARS-CoV-2的RBD区域中和抗体的疫苗，用于预防新型冠状病毒的感染。

融合蛋白

本发明提供的一种融合蛋白，所述的融合蛋白包括衍生自新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)的第一抗原元件，所述第一抗原元件的长度为190-300个氨基酸，较佳地，190-260个氨基酸，更佳地，200-220个氨基酸；衍生自新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)的第二抗原元件，所述第二抗原元件的长度为180-300个氨基酸，较佳地，190-260个氨基酸，更佳地，190-255个氨基酸；以及任选的信号肽序列。

如本发明所用“衍生”包括：

(A)从一个较长的多肽上截取一段较短的多肽片段；

(B)多肽I与多肽II的某一片段相比，同源性≥80％(优选地≥90％，更优选地≥95％，最优选地≥98％)则可定义为多肽I衍生自多肽I I。

在一优选实施方式中，所述新型冠状病毒S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

在一优选实施方式中，所述融合蛋白包括依次串联的衍生自新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)的第一抗原元件(SEQ ID NO.:1中的第320－534位氨基酸)，衍生自新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)的第二抗原元件(SEQ ID NO.:1中的第332－527位氨基酸)；以及任选的信号肽元件(比如α-信号肽)。

在一优选实施方式中，所述融合蛋白包括依次串联的衍生自新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)的第一抗原元件(SEQ ID NO.:1中的第332－527位氨基酸)，衍生自新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)的第二抗原元件(SEQ ID NO.:1中的第332－527位氨基酸)；以及任选的信号肽元件(比如α-信号肽)。

在一优选实施方式中，所述融合蛋白氨基酸序列包括：

VQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVGGGGSITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCG)(SEQ ID NO.:2，SEQ ID NO.1中的第320-534位和第332-527位组成的融合蛋白)

在一优选实施方式中，所述融合蛋白氨基酸序列包括：

ITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGGGGGSITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCG(SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.1中的第332-527位和第332-527位组成的融合蛋白)。

如本文所用，术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的、SEQ ID NO：2或3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。

本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)抗原肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与SEQ ID NO.:2或3的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

本发明还包括疫苗多肽，疫苗多肽还包括其他形式，例如药学上可接受的盐、偶联物、或融合蛋白。

在本发明中，疫苗多肽包括对SEQ ID No:2或3的序列进行一个或多个(如1-5个，优选地1-3个)氨基酸添加、一个或多个(如1-5个，优选地1-3个)氨基酸的取代和/或1-3个氨基酸缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与衍生前的原始多肽具有基本相同的功能。

优选地，疫苗多肽包括对SEQ ID No:2或3的序列经过1-3个氨基酸添加(优选添加在N端或C端)、和/或1-2个氨基酸的取代(优选保守性氨基酸替换)并仍具有与衍生前的原始多肽具有基本相同的功能。

优选地，所述的保守性氨基酸替换根据表A进行氨基酸替换。

表A

本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与SEQ ID NO:2或3所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明多肽(融合蛋白)还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。

当疫苗多肽的序列较长或以融合蛋白形式提供疫苗多肽时，也可以用重组法来大批量地获得相关肽序列。这通常是将编码所述抗原多肽或其融合蛋白的编码序列克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到相关的抗原肽或融合蛋白。

编码序列

本发明还涉及编码根据本发明的融合蛋白的多核苷酸。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQ ID NO:2或3所示的多肽的序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2或3所示的多肽，但相应编码区序列有差别的核酸序列。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码本发明酶的功能。

如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3'端与模板互补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。

本发明的多肽的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述酶的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列来表达或生产本发明融合蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码本发明多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化融合蛋白。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明酶的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如毕赤酵母、酿酒酵母细胞；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

制备方法

本发明的融合蛋白(多肽)可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。

一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25％六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4％对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲苯酚(5-10％)的氟化氢(HF),在0℃下处理1小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护基团。以50-80％乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，溶液冻干后进一步用分子筛Sephadex G10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC)，羟基苯骈三氮唑(HOBt)或1,1,3,3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)进行直接偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。

在一实施方式中，本发明的融合蛋白，按其序列，采用固相合成的方法制备，行高效液相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉，-20℃贮存。

另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸来表达或生产本发明的融合蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的融合蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

由于本发明多肽较短，因此可以考虑将多个多肽串联在一起，重组表达后获得多聚体形式的表达产物，然后通过酶切等方法形成所需的小肽。

制备疫苗组合物

本发明还提供了一种制备疫苗组合物的方法，具体地，包括步骤：

将本发明制备的融合蛋白与药学上可接受的疫苗佐剂混合，从而形成疫苗组合物。

在另一优选例中，所述的佐剂为铝佐剂、GLA佐剂，较佳的GLA佐剂。

组合物和施用方法

本发明还提供了一种组合物，所述组合物含有：(i)用本发明方法制备的重组融合蛋白或疫苗多肽，以及(ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。本发明的组合物可以是单价的，也可以是多价的。

本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不限于)：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。

(i)药物组合物

本发明的药物组合物包括有效量的用本发明方法制备的抗原肽或疫苗多肽，所述抗原肽或疫苗多肽可以是单价的，也可以是多价的。

本文所用的术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.2微克/千克至2微克/千克。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如抗原肽或其它治疗剂)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。

组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。

(ii)疫苗组合物

本发明的疫苗组合物可以是预防性的(即预防感染)，也可以是治疗性的。所述的疫苗组合物包含免疫性抗原(包括本发明蛋白或自组装的病毒样颗粒)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。

增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方，例如，(a)MF59(参见WO90/14837)，(b)SAF，和(c)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，(3)皂素佐剂；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如霍乱毒素CT，百日咳毒素PT或大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体，参见例如WO93/13302和WO92/19265；以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。

包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。

更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。

通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。

(iii)给药途径和剂量

所述组合物可以直接给予对象。对象可以是人或非人哺乳动物，较佳地为人。当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的病毒样颗粒直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。

给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于)：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、阴道内、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。

应以“有效量”给予病毒样颗粒疫苗，即病毒样颗粒的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗新型冠状病毒感染。

在各疫苗剂份中所选用的病毒样颗粒的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂的疫苗足以含有约1μg-1000μg，较佳地为1μg-100μg，更佳地10μg-50μg蛋白质或VLP。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明首次发现，含有衍生自新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)的第一抗原元件和第二抗原元件的融合蛋白可在酵母中高效表达，并且该融合蛋白具有功能性构象，能够与受体ACE2结合，免疫动物还可产生高效价血清中和抗体，具有极大的疫苗开发潜力。

(2)本发明的试验结果表明，本发明的亚单位疫苗具有更好的免疫原性和保护性，是一种优秀的抗新型冠状病毒基因工程疫苗候选者。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验指南(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)；或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

通用方法

1.材料和方法

1.1细胞

Vero细胞、293T细胞、293T/ACE2-mcherry(使用慢病毒系统在293T细胞表面过表达hACE2/mcherry受体蛋白)用含10％牛血清的DMEM培养基进行培养。PichiaPink^TM酵母菌株购于美国Invitrogen公司，并按照厂家说明书进行培养。

1.2抗体、蛋白

抗His tag的抗体为Proteintech的HRP标记的单克隆抗体。抗新冠病毒RBD蛋白鼠多抗为本课题组制备，用大肠杆菌表达的新型冠状病毒RBD蛋白免疫Balb/c小鼠三次后，采集血液分离血清而获得鼠多抗。ACE2受体蛋白、293F表达的nCoV-RBD蛋白由本课题组制备。

1.3质粒构建

根据新型冠状病毒2019年SARS-CoV-2strain Wuhan-Hu-1(GenBank ID:MN908947.3)S1蛋白编码序列，进行酵母密码子优化及基因合成，并进一步克隆到载体上，获得质粒p-nCov-S1。

利用以下引物：

optRBD-dimer-1-1-F(α-HC):

aggggtatctctcgagaagagatccatcactaacttgtgtcct(SEQ ID NO.4)

optRBD-dimer-1-1-R(α-HC):ggaacctccgcctccaccagtaccagtcaaaccgtt(SEQ IDNO.5)

optRBD-dimer-1-2-F(α-HC):ggtactggtggaggcggaggttccattacaaacttgtgtccattt(SEQ ID NO.6)

optRBD-dimer-1-2-R(α-HC):accaccagaaccagaaccgaattcaccacaaacagtagctggagc(SEQ ID NO.7)

optRBD-dimer-2-1-F(α-HC):

gaaggggtatctctcgagaagagatccgttcaaccaactgagtctatc(SEQ ID NO.8)

optRBD-dimer-2-1-R(α-HC):tctggaacctccgcctccaccagtaccagtcaaaccgttg(SEQID NO.9)

optRBD-dimer-2-2-F(α-HC):ggtactggtggaggcggaggttccagagttcaaccaacagaatca(SEQ ID NO.10)

optRBD-dimer-2-2-R(α-HC):accaccagaaccagaaccgaattcaaccaagttagtagacttcttagg(SEQ ID NO.11)

optRBD-dimer-3-1-F(α-HC):

gaagaaggggtatctctcgagaagagatccatcactaacttgtgtcct(SEQ ID NO.12)

optRBD-dimer-3-1-R(α-HC):aatggaacctccgcctccaccacaaacagtagctggagcatg(SEQ ID NO.13)

optRBD-dimer-3-2-F(α-HC):tgtggtggaggcggaggttccattacaaacttgtgtccatttgga(SEQ ID NO.14)

optRBD-dimer-3-2-R(α-HC):ccaccagaaccagaaccgaattcaccacaaacagtagctggagc(SEQ ID NO.15)

optRBD-dimer-4-1-F(α-HC):

gaagaaggggtatctctcgagaagagatccgttcaaccaactgagtctatc(SEQ ID NO.16)

optRBD-dimer-4-1-R(α-HC):tgtaatggaacctccgcctccaaccaaattagtagatttcttagg(SEQ ID NO.17)

optRBD-dimer-4-2-F(α-HC):tggttggaggcggaggttccattacaaacttgtgtccatttggag(SEQ ID NO.18)

optRBD-dimer-4-2-R(α-HC):accaccagaaccagaaccgaattcaccacaaacagtagctggagc(SEQ ID NO.19)

从基因优化的质粒p-nCov-S1上PCR扩增八条不同长度RBD基因，所获得PCR产物用多片段同源重组克隆到XhoI和EcoRI双酶切的带有His-tag的pPinkα-HC(Invitrogen)载体上，得到四个质粒

pPinkα-HC-RBD-dimer(320-534+332-527)；

pPinkα-HC-RBD-dimer(332-550+332-527)；

pPinkα-HC-RBD-dimer(320-550+319-534)；

pPinkα-HC-RBD-dimer(332-527+332-527)。

1.4毕赤酵母转化和菌株表达量检测

为了转化毕赤酵母，质粒用EcoNI线性化，然后电转入PichiaPink^TM Strain 1(Invitrogen)。毕赤酵母的转化和随后的转化子的筛选根据厂家说明书进行操作。根据说明书进行了小量培养表达筛选实验。简单来说，转化的酵母单菌落分别接种到5ml BMGY培养基中，30℃ 250rpm培养24h，然后离心去除上清，用1ml BMMY(含有1％甲醇)培养基重悬菌体，30℃ 250rpm诱导培养48h。诱导结束后，离心收集培养基上清，取上清适量进行Elisa检测。

1.5RBD-dimer蛋白的制备

为了制备RBD-dimer抗原，对选定的菌株进行培养和诱导。离心收集培养基上清，首先使用0.45uM的滤膜过滤，然后使用3KDa的超滤管进行超滤浓缩，浓缩后的样品用Binding buffer从超滤管中洗下来，使用镍柱进行纯化。最后对纯化的蛋白进行去糖基化处理，然后考马斯亮蓝染色和Western-blot检测。

1.6生物膜干涉测量(BLI)测定

为了测定蛋白与受体的结合亲和力，根据制造商的说明，在Octet RED96机器(PallFortéBio，美国)上进行BLI测定。简言之，将ACE2-Fc受体蛋白，透析到0.01M PBS中，然后用动力学溶液(补充有0.1％牛血清白蛋白和0.02％吐温20的0.01M PBS)稀释到50ng/μL，然后固定在有Protein A(ProA)生物传感器(PallFortéBio)上直至饱和。将结合上抗原的生物传感器置于含有一系列稀释的抗原样品的孔中作用500s以允许抗原抗体结合，然后浸入动力学溶液中作用500s来解离。使用Octet数据分析软件(Pal lFortéBio)计算平衡解离常数(KD)。

1.7竞争抑制试验

SARS-CoV-2假病毒竞争抑制试验，过表达ACE2/mecherry HEK293T细胞接种到96孔细胞培养白板中，10000个/孔，培养20小时。加入60ng/ul的BSA、RBD-dimer 37℃孵育1h，之后加入50ul假病毒，37℃培养，12小时后弃去上清，换为2％FBS DMEM培养基，继续培养48小时。然后利用Luciferase Assay System(Promega)试剂盒检测胞内荧光素酶信号，方法依据制造商的说明书。

1.8小鼠免疫及疫苗特异性抗体检测

将纯化的nCov-RBD、nCov-RBD-dimer蛋白与

(Invivogen，美国)佐剂相混合，做成试验性疫苗，每个剂量含有10ug抗原(nCov-RBD、nCov-RBD-dimer)和500ug的氢氧化铝佐剂。将PBS与佐剂混合作为阴性对照。Balb/c小鼠(每组六只，6-8周龄)购买自维通利华公司，在第0周、2周和4周腹腔注射试验性疫苗或PBS阴性对照，然后在第2周、4周、6周和14周采血，用于抗体检测。

免疫后特异性抗体的测定方法如下：用293F表达的的nCov-RBD、S-Trimer蛋白包被ELISA板(25ng/孔)，之后的每步操作后都需要用PBST洗板三次以除去非特异性结合，用5％milk封闭后，每孔加50ul的倍比稀释的血清，然后加HRP偶联的羊抗鼠IgG(sigma)作为二抗，TMB(Life technology)显色液显色，1N磷酸溶液终止，测定0D450。高于本底吸光值的3倍的最大稀释倍数为血清的终点滴度。PBS组血清滴度定位1。

1.9ACE2受体结合抑制试验

用293F表达的的nCov-RBD包被ELISA板(25ng/孔)，之后的每步操作后都需要用PBST洗板三次以除去非特异性结合，用5％milk封闭后，每孔加入提前混合的25ul倍比稀释的血清和20ng生物素化的ACE2受体蛋白，37℃2h后，PBST洗板，然后加HRP偶联的Streptavidin(Proteintech)作为二抗，TMB(Life technology)显色液显色，1N磷酸溶液终止，测定0D450。

1.10假病毒的制备和中和试验

基于鼠白血病病毒(MLV)的SARS-CoV-2假病毒制备简述如下：将S蛋白编码质粒、MLV Gag-Pol包装质粒和和编码荧光素酶报告基因的MLV转移质粒与Lipofectamine 2000(Life Technologies)混合后，共转染到HEK 293T细胞中。将细胞与转染培养基在37℃孵育18小时。然后去掉转染培养基，加入含有10％FBS的DMEM，37℃再孵育30小时。然后收集上清液，并用0.45μm膜过滤。

假病毒中和试验如下：培养293T/ACE-2-mcherry细胞，接种到96孔板中。50μl 2倍梯度稀释的抗体样品与50μl假病毒，37℃温育1小时后，加入到细胞上，37℃孵育12小时。去掉培养基后，加入新鲜培养基，37℃再孵育48小时。然后利用Luciferase Assay System(Promega)试剂盒检测胞内荧光素酶信号，方法依据制造商的说明书。根据如下公式计算中和百分比：100×(给定样品的荧光-单纯细胞对照样品的荧光)/(单纯假病毒对照样品的荧光-单纯细胞对照样品的荧光)。使用GraphPad Prism软件，通过非线性回归方法计算每种单抗的半数抑制浓度(IC₅₀)。IC₅₀定义为与单纯假病毒对照样品的感染相比，抑制50％病毒感染所需的抗体稀释倍数。

1.11统计

所有的统计分析均使用GraghPad Prism版本5来进行。Kaplan–Meier生存曲线使用log-rank检验进行比较，其他实验数据均是使用two-tailed student’s t-test方法来分析。统计的显著性差异定义如下：ns，P≥0.05；*0.01≤P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

实施例1 SARS-CoV-2RBD-dimer在毕赤酵母中的表达及鉴定

为了在毕赤酵母中重组表达RBD二聚体蛋白，我们构建了四个质粒pPinkα-HC-RBD-dimer(320-534+332-527)；pPinkα-HC-RBD-dimer(332-550+332-527)；pPinkα-HC-RBD-dimer(320-550+319-534)；pPinkα-HC-RBD-dimer(332-527+332-527)。质粒结构如图1所示，其N-端融合α-淀粉酶分泌信号肽用于上清表达，C-端融合His tag便于蛋白纯化。

我们将四个质粒分别转化酵母细胞，得到的重组酵母克隆用Elisa方法来检测RBD的表达量，从而获得针对每个质粒的高表达克隆。为了确定这些高表达克隆株所表达蛋白的分子量，我们将包含重组蛋白的酵母上清液进行去糖基化处理，然后通过WB进行检测(图2A)。结果显示，pPinkα-HC-RBD-dimer(332-550+332-527)和pPinkα-HC-RBD-dimer(320-550+319-534)转化酵母克隆并不能表达RBD-dimer蛋白，即其去糖基化后产物的分子量与同样处理的RBD单体的分子量相当；相反，pPinkα-HC-RBD-dimer(332-527+332-527)和pPinkα-HC-RBD-dimer(320-534+332-527)有非常强的抗His tag单抗检测信号(图2A)，其去糖基化后产物的分子量为同样处理的RBD-monomer的分子量的两倍，符合预期，证明该表达产物为RBD-dimer蛋白。综合考虑后，我们选取pPinkα-HC-DimerRBD(320-534+332-527)开展后续研究。

根据ELISA结果(图2B)，我们挑选pPinkα-HC-RBD-dimer(320-534+332-527)的3号菌株作为高表达株进行大量表达纯化，所获得纯化产物用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色进行分析鉴定(图2C)。与之前WB结果(图2A)相比较证明成功表达纯化了新冠RBD-dimer蛋白。

以上结果表明，RBD-dimer在酵母中正确、高效表达，具有极大的疫苗开发潜力。

实施例2生物膜干涉测量(BLI)测定及竞争抑制试验

为了定量测定的纯化的RBD-dimer蛋白与受体ACE2-Fc的结合亲和力，进行生物膜干涉实验(BLI)测定。在该实验中，将的ACE2-Fc固定到protein A传感器上，然后使其与不同浓度的单抗相互作用。RBD-dimer蛋白的平衡解离常数(KD)为0.172nM(图3A)。同样的试验结论在假病毒抑制进入试验中也得到了印证(图3B)，这些结果表明RBD抗原对受体ACE2蛋白具有很高的亲和力。

实施例3 RBD-dimer免疫小鼠产生高效价中和抗体

为了研究RBD-dimer的免疫原性，3组(每组6只)Balb/c小鼠在第2周、第4周和第6周分别免疫RBD-monomer、RBD-dimer或PBS，PBS为阴性对照组。血清样品在第2周、第4周和第6周收集，用293F表达的nCov-RBD作为包被抗原，进行ELISA试验来检测特异性抗体反应。如图4A所示，PBS组小鼠血清的抗原抗体反应为背景水平，而RBD-monomer、RBD-dimer组小鼠的免疫血清均有明显的抗体反应，且在同一时间点RBD-dimer产生更强的抗体表达。ELISA结果表明，RBD-dimer免疫小鼠可以更快的产生特异性抗体。

如图4B所示，免疫RBD-dimer后六周血清在1000倍和10000倍稀释后与新冠三聚体刺突蛋白也有很好的结合。

如图4C所示，受体结合抑制试验对免疫后14周血清的功能进行检测，试验结果表明免疫后14周血清可以有效的抑制RBD-dimer与受体ACE2的结合，从而表明抗血清在阻止病毒吸附的过程中可能起到一定作用。

我们通过假病毒中和试验来评估6周免疫血清在体外抑制nCOv假病毒进入的能力。如图4D所示，PBS组抗血清的中和效价与两组实验组抗血清中和效价有显著性差异；RBD-monomer组抗血清的几何均值中和效价为2418，而RBD-dimer组明显高于RBD-monomer组，为17860。以上结果表明，RBD-dimer疫苗的具有更好的免疫原性，能够强烈诱发具有保护潜力的中和抗体。

结论

nCov-RBD-dimer蛋白在毕赤酵母中高效表达，酵母表达RBD-dimer蛋白具有功能性构象，能够与受体ACE2结合，RBD-dimer蛋白免疫动物产生高效价血清中和抗体。

综上，酵母表达RBD-dimer蛋白是一种优秀的抗新型冠状病毒基因工程疫苗候选者。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海巴斯德研究所

<120> 一种抗新冠病毒基因工程疫苗

<130> P2020-2574

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1208

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

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Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含：

(a)任选的信号肽序列；

2.一种疫苗多肽，其特征在于，所述疫苗多肽包括权利要求1所述的融合蛋白。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白或权利要求2所述的疫苗多肽。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求4所述的表达载体，或者在基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。

6.一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物含有权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的疫苗多肽或权利要求3所述的多核苷酸或者权利要求4所述的表达载体或者权利要求5所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或辅料。

7.一种疫苗组合物，其特征在于，所述的组合物含有权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的疫苗多肽或权利要求3所述的多核苷酸或者权利要求4所述的表达载体或者权利要求5所述的宿主细胞，以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。

8.如权利要求1所述的融合蛋白或权利要求2所述的疫苗多肽或权利要求6所述的药物组合物或权利要求7所述的疫苗组合物的用途，其特征在于，(a)用于制备针对新型冠状病毒的抗体；和/或(b)用于制备预防冠状病毒SARS-CoV-2感染或其相关疾病的药物。

9.一种制备权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)在适宜条件下培养权利要求5所述的宿主细胞，从而表达权利要求1所述的融合蛋白；

(ii)纯化所述融合蛋白。

10.一种产生针对冠状病毒SARS-CoV-2的免疫反应的方法，其特征在于，包括步骤：给需要的对象施用权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的疫苗多肽、或权利要求6所述的药物组合物或权利要求7所述的疫苗组合物。