CN116802307A - 非洲猪瘟(asf)病毒疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明描述了含有非洲猪瘟(ASF)病毒的免疫原性多肽的免疫原性组合物，包括含有ASF病毒抗原以外的抗原的免疫原性组合物，所述ASF病毒抗原以外的抗原包括可用于针对引起腹泻疾病的病原体的免疫接种的抗原。还描述了用所公开的免疫原性组合物引发免疫应答的方法和治疗ASF感染的方法。

Description

非洲猪瘟(ASF)病毒疫苗

发明背景

发明领域

本发明大体上涉及引发针对非洲猪瘟(ASF)病毒的免疫应答的组合物。特别地，本发明涉及包含ASF病毒的免疫原性多肽的免疫原性组合物(例如疫苗)。此外，免疫原性组合物可以含有ASF病毒抗原以外的抗原。还描述了用本文公开的免疫原性组合物引发免疫应答的方法和治疗ASF感染的方法。

背景信息

非洲猪瘟(ASF)是猪的一种病毒性疾病，导致家猪的高死亡率，而在天然猪科动物(suid)储存宿主中无症状。在缺乏有效疫苗的情况下，它会造成不可避免的重大经济损失，而可用的疾病控制方法是隔离受影响的地区和宰杀受感染的动物。ASF是由ASF病毒(ASFV)引起的，这是一种具有复杂分子结构的双链DNA病毒。它是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)的唯一成员，也是唯一由节肢动物钝缘蜱属(Ornithodoros)的软蜱传播的DNA病毒。软蜱(非洲钝缘蜱(Ornithodoros moubata))参与了该病毒在非洲的森林传播周期，并且游走鸟壁虱(O.erraticus)参与了该病毒在欧洲的森林传播周期。患有与家猪相似的急性疾病的野猪似乎与欧洲的传播周期有关。

由这种病毒引起的疾病于20世纪20年代在肯尼亚首次被发现。然后，它局限在非洲，直到上世纪中叶传播到欧洲，并且后来传播到南美洲和加勒比海地区。20世纪90年代，通过严厉的控制和根除计划，这种疾病在欧洲(撒丁岛除外)被根除。然而，2007年，这种疾病再次从非洲蔓延到高加索地区，特别是格鲁吉亚，并于2014年蔓延到欧盟东部领土。这种疾病的最新报告包括越来越多的欧盟国家、波兰和三个波罗的海共和国，以及最近的摩尔多瓦。由于缺乏具有保护效力的疫苗，ASF对所有欧洲国家都构成了严重威胁。ASF的流行病学复杂性已在东非和南非得到清楚的证明，在那里，基于编码主要衣壳蛋白p72的B646L基因的C末端区域的序列变异的ASFV遗传表征显示存在22种基因型。最近描述了一种新的基因型，基因型XXIII，它与基因型IX和X具有共同的祖先，基因型IX和X包括在东非国家和刚果共和国传播的分离株。这篇综述文章总结了关于ASFV的知识现状。

ASFV是一种大的包膜病毒，具有二十面体形态并且平均直径为200nm。病毒基因组由一个线性、共价封闭末端、双链DNA的单分子组成。不同分离株的基因组长度在170Kbp和190Kbp之间变化，并且编码151个和167个之间的开放阅读框。ASFV的复制周期主要是在细胞质，但细胞核也是病毒早期DNA合成的场所。靠近病毒基因组开始复制的位点的薄层网络(lamina network)的分解和几种核蛋白的重新分布表明存在复杂的机制来调节病毒感染期间的核机制。

病毒基因的转录受到强烈的调节。通过其独特的积累动力学已经确定了四类mRNA，包括立即早期、早期、中期和晚期转录物。立即早期和早期基因在DNA复制开始前表达，而中期和晚期基因在DNA复制开始后表达。中期基因的存在表明了调节ASFV基因表达的级联模型。DNA复制所需的酶在病毒从部分裸露的核心颗粒进入细胞质后立即表达，并使用包装在病毒颗粒中的酶和其他因子。病毒形态发生在病毒工厂中发生，DNA复制的主要晚期也发生在那里。

ASFV颗粒具有由几个同心结构域组成的二十面体形态：中心基因组形成的内核包含类核，类核被称为核壳的厚蛋白质层包裹；围绕核心的内部脂质包膜；并且最后是衣壳，它是细胞内病毒体的最外层。细胞外病毒体拥有额外的外部包膜，当病毒穿过质膜出芽时获得该包膜。然而，这种包膜的重要性尚不清楚，因为它不是传染性所必需的。

目前对ASF疫苗的研究主要分为两个“阵营”。USDA和DHS目前采取的方法集中在改良活疫苗，认为病毒在细胞内的复制是产生保护性响应所绝对需要的。然而，属于这一类别的最先进的原型疫苗最近被称为“至少8年后才能许可使用”，并带有许多安全问题。最近的研究表明，一种高效的基因缺失ASF突变疫苗在猪中微弱复制，但在接种的动物中提供了免受致命攻击的保护。

虽然前景看好，但使用美国疫苗的减毒活株存在问题，并且疫苗病毒的培养目前需要使用原代巨噬细胞。有口头报道说，中国试图复制该疫苗，导致了负面结果，但这仍有待证实。

英国Pirbright实验室开发的第二种疫苗也显示出前景，再次保护免受ASF感染的致命后果，但不能限制病毒复制。简而言之，这种两剂疫苗通过将表达8种独特ASF蛋白的8种个体重组腺病毒组合成单一疫苗而开发。当施用时，结果似乎与使用较少蛋白的早期研究中观察到的结果相似。

与使用活体方法不同，亚单位疫苗是灭活产物；由于与描绘保护性蛋白靶和产生针对多种毒株的广泛保护性疫苗相关的困难，这些疫苗在很大程度上被忽视了。

因此，仍然需要用于治疗呈现与ASF病毒感染相关的临床症状的受试者的改进疗法和用于防止预防感染扩散的方法。

发明概述

本发明提供了包含非洲猪瘟(ASF)病毒抗原的免疫原性组合物，特别是作为亚单位疫苗的一部分。

在实施方案中，公开了产生ASF病毒衍生的免疫原性多肽和/或肽的方法，这些多肽和/或肽可以与佐剂混合或共表达。免疫原性组合物可以包含本文所述的一种或更多种多肽和/或佐剂。例如，免疫原性组合物可以包含可用于针对引起其他疾病的病原体的免疫的其他抗原，诸如衍生自非ASF病毒病原体的抗原。

在实施方案中，公开了产生多肽的方法，包括在诱导多肽表达的条件下培养用本文所述的核酸转化的宿主细胞的步骤。在相关方面，ASF病毒蛋白可以通过重组技术表达，并用于开发包含重组抗原亚单位的免疫原性组合物，其中使用杆状病毒/昆虫细胞方法产生这样的表达的多肽。

在一个方面，公开了产生核酸的方法，其中通过化学合成(至少部分地)制备编码ASF病毒衍生的蛋白质或多肽的核酸。在相关方面，该方法包括使用基于引物的扩增方法(例如，PCR)扩增核酸。

在另一方面，公开了产生蛋白质复合物的方法，包括向受试者施用ASF病毒衍生的多肽或其片段。在相关方面，该方法包括将ASF病毒衍生的多肽与药学上可接受的载体或稀释剂混合。在另一个相关方面，组合物可以包含SEQ ID NO:6(p30/p54融合蛋白)、SEQ IDNO:8(p72蛋白)、SEQ ID NO:10(p30蛋白)、SEQ ID NO:12(p54蛋白)、SEQ ID NO:17(血凝素蛋白)中所列的多肽。在又一个相关方面，多肽组合物包含SEQ ID NO:6和17。

在实施方案中，公开了一种在受试者中引发免疫应答的方法，包括施用本公开内容的组合物。在相关方面，该方法还包括施用佐剂。在另一个相关方面，该方法包括通过表面、肠胃外或粘膜途径向受试者施用免疫原性组合物。

在一个方面，施用可以是多次施用，其中第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物是相同的。在另一方面，第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物是不同的。

在一个方面，施用进行两次或更多次。

在实施方案中，公开了一种用于治疗ASF病毒感染的方法，包括向有相应需要的受试者施用治疗有效量的如本文所述的免疫原性组合物。

在一个方面，向受试者施用多种治疗有效剂量的免疫原性组合物。

在相关方面，该方法包括粘膜施用治疗有效量的包含一种或更多种ASF病毒抗原的第一免疫原性组合物和表面或肠胃外施用治疗有效量的包含一种或更多种ASF病毒抗原的第二免疫原性组合物。

在一个方面，向受试者施用多种治疗有效剂量的免疫原性组合物。在另一方面，免疫原性组合物包含单独的非ASF病毒抗原。

在一个方面，组合物包含ASF病毒p30/p54融合蛋白。

在相关方面，组合物包含ASF病毒血凝素蛋白。在另一相关方面，组合物包括施用包含ASF病毒p30/p54融合蛋白和ASF病毒血凝素蛋白的组合物。

在一方面，受试者是猪。在相关方面，蛋白质基本上同时或顺序地施用。

鉴于本公开内容，本领域技术人员将容易想到所公开的本发明主题的这些和其他实施方案。

发明详述

在描述本发明组合物、方法和方法论之前，应理解本发明不限于所描述的特定组合物、方法和实验条件，因为这样的组合物、方法和条件可以变化。还应理解本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并非旨在限制，因为本发明的范围将仅在所附的权利要求书中限定。

除非上下文另外清楚地指明，否则如本说明书和所附的权利要求书中使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种(a)核酸”包括一种或更多种核酸、和/或本文讨论的类型的多种组成，其对本领域技术人员而言在阅读本公开内容等后将是明显的。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。与本文所描述的那些方法和材料相似或等价的任何方法和材料可被用于本发明的实践或测试，因为应该理解，修改和变化被包括在本公开内容的精神和范围内。

如本文所用，“约”、“大约”、“实质上(substantially)”和“显著”将被本领域普通技术人员理解，并将根据其中使用它们的上下文而在一定程度上变化。如果存在对于本领域普通技术人员考虑其中术语被使用的上下文不清楚的术语的使用，则“约”和“大约”将意指特定术语的正或负<10％，且“基本上”和“显著地”将意指特定术语的正或负>10％。在实施方案中，组合物可以“含有”特定组分或组分的组、“包含”特定组分或组分的组或“基本上由”特定组分或组分的组“组成”，其中本领域技术人员将理解后者意味着权利要求的范围限于指定的材料或步骤“以及那些不会实质性影响所要求保护的发明的基本和新颖特性的材料或步骤”。

如本文所用，术语“ASF”是指非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)的成员。猪瘟病毒。术语ASF包括该病毒所有基因群(genogroup)中的毒株。目前，根据p72/B646L基因的测序，ASF毒株被分为24个基因群(Gx-Gxn)。术语ASF还包括在申请时未鉴定的分离株。

术语“多肽”和“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度的产物。因此，肽、寡肽、二聚体、多聚体等包括在该定义内。全长蛋白和其片段都包括在该定义中。该术语还包括多肽的后表达修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。此外，为了本公开内容的目的，“多肽”是指这样的蛋白，其包含对天然序列的修饰，诸如缺失、添加和取代(本质上通常是保守的)，只要该蛋白维持期望的活性即可。这些修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或者可以是偶然的，诸如通过产生蛋白的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错误。

“基本上纯化的”通常是指分离物质(化合物、多核苷酸、蛋白质、多肽、多肽组合物)，使得该物质占其所驻留的样品的大部分百分比。典型地，在样品中，基本上纯化的组分占样品的约50％、约80％-85％或约90％-95％。用于纯化感兴趣的多核苷酸和多肽的技术是本领域熟知的，并且包括例如离子交换层析、亲和层析和根据密度的沉降。

当涉及多肽时，“分离的”是指所示的分子与自然界中发现该分子的完整生物体或细胞分离和离散，或者在几乎不存在其他相同类型的生物大分子的情况下存在。关于多核苷酸的术语“分离的”是完全或部分地缺乏自然界中通常与其关联的序列的核酸分子；或在自然界中存在但具有与之关联的异源序列的序列；或者是与染色体分离的分子。

如本文所用，术语“标记”和“可检测标记”是指能够检测的分子，包括但不限于放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、发色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(例如生物素或半抗原)等。术语“荧光剂”是指能够在可检测范围内显示荧光的物质或其一部分。可使用的标记的具体实例包括荧光素、罗丹明、丹磺酰、伞形酮、德克萨斯红、鲁米诺、乙酰胺酯、NADPH和α-β-半乳糖苷酶。

“同源性”是指两个多核苷酸或两个多肽部分之间的同一性百分比。当两个核酸或两个多肽序列在分子的限定长度上表现出至少约50％的序列同一性、至少约75％的序列同一性、至少约80％-85％的序列同一性、至少约90％的序列同一性和至少约95％-98％的序列同一性时，这些序列彼此是“基本上同源的”。如本文所用，基本上同源的也指与指定序列显示完全同一性的序列。

一般来说，“同一性”是指两个多核苷酸或多肽序列分别的核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸的精确对应。同一性百分比可以通过直接比较两个分子之间的序列信息来确定，通过对齐序列，计算两个对齐的序列之间匹配的精确数量，除以较短序列的长度，并将结果乘以100。容易获得的计算机程序可以用来帮助分析，例如ALIGN，Dayhoff,M.O.于Atlas ofProtein Sequence and Structure M.O.Dayhoff,ed.,5Suppl.3:353-358,Nationalbiomedical Research Foundation,Washington,D.C.中，其采用Smith和WatermanAdvances in Appl.Math.2:482-489,1981的局部同源性算法用于肽分析。用于确定核苷酸序列同一性的程序可在Wisconsin Sequence Analysis程序包,Version 8中获得(可从Genetics Computer Group,Madison,Wis.获得)，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，它们也依赖于Smith和Waterman算法。这些程序很容易与制造商推荐并在上面提到的WisconsinSequence Analysis程序包中描述的默认参数一起使用。例如，特定核苷酸序列与参考序列的同一性百分比可以使用Smith和Waterman的同源性算法以默认评分表和六个核苷酸位置的空位罚分来确定。

在本公开内容的上下文中建立百分比同一性的另一种方法是使用由Universityof Edinburgh版权所有、由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发并由IntelliGenetics,Inc.(Mountain View,CA)发行的MPSRCH程序包。从这套包中，可以采用Smith-Waterman算法，其中默认参数用于评分表(例如，空位开放罚分为12，空位延伸罚分为1，并且空位为6)。从生成的数据来看，“匹配”值反映了“序列同一性”。用于计算序列之间的同一性或相似性百分比的其他合适程序在本领域中通常是已知的，例如，另一个比对程序是BLAST，以默认参数使用。例如，可以使用以下默认参数来使用BLASTN和BLASTP：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；分类依据＝高评分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白质+Spupdate+PIR。这些程序的细节很容易获得。

可选地，同源性可以通过在同源区域之间形成稳定双链体的条件下使多核苷酸杂交，随后用单链特异性核酸酶消化，并确定消化的片段的大小来确定。基本上同源的DNA序列可以在Southern杂交实验中在例如为该特定系统定义的严格条件下鉴定。定义合适的杂交条件在本领域技术范围内。

本文中用于描述核酸分子的“重组体”是指基因组、cDNA、病毒、半合成或合成来源的多核苷酸，该多核苷酸由于其来源或操作而不与其在自然界中相关联的全部或部分多核苷酸相关联。关于蛋白质或多肽使用的术语“重组体”是指通过表达重组多核苷酸产生的多肽。通常，感兴趣的基因被克隆，并且然后在转化的生物体中表达，如下文进一步描述的。宿主生物体在表达条件下表达外源基因以产生蛋白质。

术语“转化”是指将外源多核苷酸插入宿主细胞，而不论用于插入的方法如何。例如，包括直接摄取、转导或f-交配。外源多核苷酸可以保持为非整合载体，例如质粒，或者可选地可以整合到宿主基因组中。

“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”和表示培养为单细胞实体的微生物或高等真核细胞系的其他此类术语是指可以或已经用作重组载体或其他转移的DNA的受体的细胞，并且包括已经转染的原始细胞的原始后代。

“编码序列”或“编码”选定多肽的序列是这样的核酸分子，当置于适当的调节序列(或“控制元件”)的控制下时，其在体内被转录(在DNA的情况下)并翻译(在mRNA的情况下)为多肽。编码序列的边界可以由在5’(氨基)端处的起始密码子和在3’(羧基)端处的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA、来自病毒或原核DNA的基因组DNA序列，和甚至合成DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3’。

典型的“控制元件”包括但不限于转录启动子、转录增强子元件、转录终止信号、多腺苷酸化序列(位于翻译终止密码子的3’)、用于优化翻译起始的序列(位于编码序列的5’)和翻译终止序列。

术语“核酸”包括DNA和RNA，以及它们的类似物，诸如含有修饰主链的那些(例如硫代磷酸酯等)，以及肽核酸(PNA)等。本公开内容提供了包含与上述序列互补的序列的核酸(例如，用于反义或探测目的)。

“可操作地连接”指其中如此描述的组分被配置以执行它们的通常功能的元件布置。因此，与编码序列可操作连接的给定启动子能够在存在适当的酶时实现编码序列的表达。启动子不必与编码序列连续，只要其起到指导编码序列表达的功能即可。因此，例如，启动子序列和编码序列之间可存在中间的未翻译但已转录的序列，并且启动子序列仍然可被认为与编码序列“可操作地连接”。

“被编码”是指编码多肽序列的核酸序列，其中所述多肽序列或其一部分包含来自由该核酸序列编码的多肽的至少3至5个氨基酸、至少8至10个氨基酸和至少15至20个氨基酸的氨基酸序列。

“表达盒”或“表达构建体”是指能够指导感兴趣的序列或基因表达的装配体。表达盒通常包括如上所述的控制元件，诸如与感兴趣的序列或基因可操作地连接(以便指导其转录)的启动子，并且通常还包括多腺苷酸化序列。在实施方案中，本文描述的表达盒可以被包含在质粒构建体中。除了表达盒的组分之外，质粒构建体还可以包括一种或更多种选择标记、允许质粒构建体作为单链DNA存在的信号(例如，M13复制起点)、至少一个多克隆位点和“哺乳动物”复制起点(例如，SV40或腺病毒复制起点)。

“纯化的多核苷酸”是指感兴趣的多核苷酸或其片段，其基本上是游离的，例如含有少于约50％、少于约70％和少于约至少90％的与多核苷酸天然结合的蛋白质。用于纯化感兴趣的多核苷酸的技术是本领域熟知的，并且包括例如用离液剂破坏含有多核苷酸的细胞和通过离子交换层析、亲和层析和根据密度沉降来分离多核苷酸和蛋白质。

术语“转染”用于指细胞对外源DNA的摄取。当外源DNA被引入细胞膜内部时，细胞被“转染”。许多转染技术在本领域中通常是已知的。这样的技术可用于将一个或更多个外源DNA部分引入合适的宿主细胞。该术语是指遗传物质的稳定和瞬时摄取，并且包括肽或抗体连接的DNA的摄取。

“载体”能够将核酸序列转移到靶细胞(例如，病毒载体、非病毒载体、颗粒载体和脂质体)。典型地，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”是指能够指导感兴趣的核酸的表达并且可以将核酸序列转移到靶细胞的任何核酸构建体。因此，该术语包括克隆载体和表达载体，以及病毒载体。

“片段”是指仅由完整全长序列和结构的一部分组成的分子。多肽的片段可以包括天然多肽的C-末端缺失、N-末端缺失和/或内部缺失。多肽的片段通常将包括全长分子的至少约5-10个连续氨基酸残基、全长分子的至少约15-25个连续氨基酸残基和全长分子的至少约20-50个或更多个连续氨基酸残基，或5个氨基酸和全长序列中氨基酸数量之间的任何整数，前提是所讨论的片段保留引发所需生物响应的能力。核酸的片段可以包括核酸的5’-缺失、3’-缺失和/或内部缺失。核酸片段通常将包括全长分子的至少约5-1000个连续核苷酸碱基，并且可以包括全长分子的至少5个、10个、15个、20个、25个、30个、40个、50个、60个、75个、100个、150个、250个或至少500个连续核苷酸，或者5个核苷酸和全长序列中核苷酸数量之间的任何整数。这样的片段可用于杂交、扩增、产生免疫原性片段或核酸免疫接种。

“免疫原性片段”是指免疫原的片段，其包括一个或更多个表位，并且因此可以调节免疫应答或可以作为共施用的抗原的佐剂。这样的片段可以使用本领域熟知的任何数量的表位映射技术来鉴定。例如，线性表位可以通过例如以下来确定：在固体支持物上并行合成大量肽，这些肽对应于蛋白质分子的一部分，并在肽仍然附着于支持物时使肽与抗体反应。这样的技术是本领域已知的，并且在例如美国专利第4,708,871号中描述，该美国专利通过引用以其整体并入本文。类似地，构象表位很容易通过确定氨基酸的空间构象来鉴定，诸如，例如通过x射线晶体学和二维核磁共振。

为了本公开内容的目的，免疫原性片段将通常为至少约2个氨基酸长度、约5个氨基酸长度和至少约10至约15个氨基酸长度。片段的长度没有临界上限，它可以包含几乎全长的蛋白质序列，或者甚至是包含两个或更多个表位的融合蛋白。

如本文所用，术语“表位”通常是指抗原上被T细胞受体和/或抗体识别的位点。在实施方案中，它是衍生自蛋白质抗原或作为蛋白质抗原一部分的短肽。然而，该术语也旨在包括具有糖肽和糖类表位的肽。一个抗原分子可以携带若干个不同的表位。术语“表位”还包括氨基酸或糖类的修饰序列，其刺激识别整个生物体的应答。如果选择的表位是引起感染性疾病的感染原的表位，则是有利的。

表位可以从肽或多肽的氨基酸和相应DNA序列的知识产生，也可以从特定氨基酸的性质(例如，大小、电荷等)和密码子字典产生，而无需过度的实验。确定蛋白质是否会刺激应答的一些指导原则包括：肽长度---肽长约8或9个氨基酸适合I类MHC复合物，和长约13-25个氨基酸适合II类MHC复合物。这个长度是肽与MHC复合物结合的最小长度。在一个方面，肽可以比这些长度长，因为细胞可能切割肽。该肽可以包含适当的锚基序，这将使其能够以足够高的特异性结合各种I类或II类分子以产生免疫应答。这可以通过将感兴趣的蛋白质的序列与已发表的与MHC分子相关的肽的结构进行比较来完成，而无需过度的实验。因此，本领域技术人员可以通过将蛋白质序列与蛋白质数据库中列出的序列进行比较来确定感兴趣的表位。

如本文所用，术语“T细胞表位”通常指能够诱导T细胞应答的肽结构的那些特征，而“B细胞表位”通常指能够诱导B细胞应答的肽结构的那些特征。

对抗原或组合物的“免疫应答”是受试者中对存在于感兴趣组合物中的抗原发展体液和/或细胞免疫应答。出于本公开内容的目的，“体液免疫应答”是指由抗体分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”是由T淋巴细胞和/或其他白血细胞介导的免疫应答。细胞免疫的一个重要方面涉及溶细胞T细胞(“CTL”)的抗原特异性应答。CTL对与由主要组织相容性复合体(MHC)关于编码的蛋白质呈递并在细胞表面上表达的肽抗原具有特异性。CTL有助于诱导和促进细胞内微生物的破坏，或被这些微生物感染的细胞的溶解。细胞免疫的另一个方面涉及辅助性T细胞的抗原特异性应答。辅助性T细胞的作用是帮助刺激针对在其表面上展示与MHC分子相关的肽抗原的细胞的非特异性效应细胞的功能，并将其活性集中。“细胞免疫应答”也指由活化的T细胞和/或其他白血细胞产生的细胞因子、趋化因子和其他此类分子(包括来源于CD4+和CD8+T细胞的那些)的产生。

引起细胞免疫应答的组合物或疫苗可用于通过在细胞表面呈递与MHC分子相关的抗原来致敏脊椎动物受试者。在以下细胞或靠近以下细胞指导细胞介导的免疫应答，所述细胞在其表面呈递抗原。此外，可以产生抗原特异性T淋巴细胞，以允许将来对免疫接种的宿主的保护。

特定抗原刺激细胞介导的免疫应答的能力可以通过许多测定来确定，例如通过淋巴细胞增殖(淋巴细胞活化)测定、CTL细胞毒性细胞测定或通过测定致敏受试者中对抗原特异的T淋巴细胞。这样的测定是本领域熟知的。最近的测量细胞介导的免疫应答的方法包括测量细胞内细胞因子或T细胞群体的细胞因子分泌，或通过测量表位特异性T细胞。

因此，本文所用的免疫应答可以是刺激抗体产生的应答(例如，中和抗体，其通过与毒素和病原体结合而阻断细菌毒素和病原体诸如病毒进入细胞并复制，通常保护细胞免受感染和破坏)。感兴趣的抗原也可引发CTL的产生。因此，免疫应答可包括以下作用中的一种或更多种：B细胞的抗体产生；和/或特异性地针对存在于感兴趣的组合物或疫苗中的一种或更多种抗原的抑制T细胞和/或记忆/效应T细胞的激活。这些应答可用于中和感染性和/或介导抗体-补体或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)以向免疫接种的宿主提供保护。这样的应答可以使用本领域熟知的标准免疫测定和中和测定来确定。哺乳动物的先天免疫系统还通过激活Toll样受体和免疫细胞上的类似受体分子来识别和响应于致病生物体的分子特征。在激活先天免疫系统后，各种非适应性免疫应答细胞被激活以例如产生各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子。由先天免疫应答激活的细胞包括单核细胞和浆细胞样谱系(MDC、PDC)的未成熟和成熟的树突状细胞以及γ、δ、α和βT细胞和B细胞等。因此，本公开内容还预期这样的免疫应答，其中免疫应答包括先天和适应性应答两者。

“免疫原性组合物”是包含抗原分子的组合物，其中向受试者施用该组合物导致受试者针对感兴趣的抗原分子发展体液和/或细胞免疫应答。

术语“免疫原性”蛋白质或多肽是指引起如上所述的免疫应答的氨基酸序列。本文所用的“免疫原性”蛋白质或多肽包括所讨论蛋白质的全长序列，包括前体和成熟形式、其类似物或其免疫原性片段。

“基因转移”或“基因递送”是指将感兴趣的DNA或RNA可靠地插入宿主细胞的方法或系统。这样的方法可以导致非整合的转移DNA的瞬时表达、转移复制子(例如附加体)的染色体外复制和表达，或者将转移的遗传物质整合到宿主细胞的基因组DNA中。基因递送表达载体包括但不限于来源于细菌质粒载体、病毒载体、非病毒载体、α病毒、痘病毒和痘苗病毒的载体。当用于免疫接种时，这样的基因递送表达载体可以称为疫苗或疫苗载体。

术语“衍生自”在本文中用于标识分子的原始来源，但并不意味着限制制备分子的方法，所述方法可以是例如化学合成或重组手段。

通常，病毒多肽“衍生自”病毒的特定多肽(病毒多肽)，如果它(i)由该病毒的多核苷酸(病毒多核苷酸)的开放阅读框编码，或(ii)如上所述显示与该病毒的多肽的序列同一性。

“衍生自”指定序列的多核苷酸是指包含对应于指定核苷酸序列的区域，即与之相同或互补的大约至少约6个核苷酸、至少约8个核苷酸、至少约10-12个核苷酸和至少约15-20个核苷酸的连续序列的多核苷酸序列。衍生的多核苷酸不一定从感兴趣的核苷酸序列物理衍生，而是可以以任何方式产生，包括但不限于化学合成、复制、逆转录或转录，其是基于多核苷酸衍生自的区域中碱基序列提供的信息。因此，它可以代表原始多核苷酸的有义或反义取向。

如以上定义的，ASF多核苷酸、寡核苷酸、核酸、蛋白质、多肽或肽是衍生自ASF病毒的分子，包括但不限于ASF病毒的各种分离株中的任何一种。该分子不需要从所讨论的特定分离株物理衍生，而是可以合成或重组产生。

基因组DNA由168个开放阅读框(ORF)组成。这些蛋白质中的一些来源于更大的前体，这些前体是前体蛋白质进一步翻译后修饰的结果。特别地，由ASF病毒ORF编码的p30、p54、p72和血凝素多肽及其变体、其免疫原性片段和编码这些多肽、变体或免疫原性片段的核酸可用于所公开的主题的实践中。

许多ASF病毒分离株感兴趣的核酸和蛋白质序列也是已知的。代表性的p30、p54、p72和血凝素核酸序列呈现在SEQ ID NO:1(p30/p54融合)、SEQ ID NO:7(p72)、SEQ ID NO:9(p30)、SEQ ID NO:11(p54)、SEQ ID NO:13(血凝素)和SEQ ID NO:14(血凝素)。代表性的p30、p54、p72和血凝素氨基酸序列呈现在SEQ ID NO:6(p30/p54融合)、SEQ ID NO:8(p72)、SEQ ID NO:10(p30)、SEQ ID NO:12(p54)和SEQ ID NO:17(血凝素)。来自ASF病毒分离株的其他代表性序列，包括ASF病毒的序列及其编码的多肽被列在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中。参见，例如但不限于GenBank条目：CBw46759.1；ACJ61575.1；MH735140.1；MH601419.1；MH727102.1；KF834194.1；LC322015.1；MH735142；MH681419.1；KM609342.1；FR682468.1；KJ380910.1；FR682468.1；MH722357；MH68419.1；MH713612.1；LC322016.1；KF834193.1；所有这些序列(如在本申请提交日之前输入的)通过引用并入本文。

如本文所用，关于AFS病毒多肽的术语“p30”、“p54”、“p72”或“血凝素”是指包含与ASF病毒的“p30”、“p54”、“p72”或“血凝素”多肽同源或相同的序列的多肽，并且包括与其显示至少约80％-100％序列同一性，包括这些范围内的任何同一性百分比，例如与其显示81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。衣壳多肽可以由ASF病毒的相同株或ASF病毒的不同株编码。

如本文所用，术语“p30/p54融合蛋白”是指包含与来源于ASF病毒的p30 ASF病毒编码的p30和p54蛋白同源或相同的序列的蛋白，并且包括与其显示至少约80％-100％序列同一性，包括这些范围内的任何同一性百分比，诸如与其显示81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。

“抗原”是指含有一个或更多个表位(线性、构象或二者)的分子，其将刺激宿主的免疫系统产生体液和/或细胞抗原特异性应答。该术语可与术语“免疫原”互换使用。通常，B细胞表位将包括至少约5个氨基酸，但也可能小至3-4个氨基酸。T细胞表位，诸如CTL表位，将包括至少约7-9个氨基酸，并且辅助T细胞表位将包括至少约12-20个氨基酸。通常，表位将包括约7个和15个之间的氨基酸，诸如9个、10个、12个或15个氨基酸。术语“抗原”表示亚单位抗原(即，从与抗原在自然界中关联的完整生物体分离和离散的抗原)，以及被杀死、减毒或灭活的细菌、病毒、真菌、寄生虫或其他微生物。抗体诸如抗独特型抗体或其片段，以及可以模拟抗原或抗原决定簇的合成肽模拟表位，也可以在本文使用的抗原定义下捕获。类似地，在体内表达抗原或抗原决定簇的寡核苷酸或多核苷酸，诸如在基因治疗和DNA免疫接种应用中，也被包括在本文抗原的定义中。

术语“抗体”涵盖多克隆和单克隆抗体制品，以及包括杂合抗体、改变的抗体、嵌合抗体和人源化抗体的制品，以及：杂合(嵌合)抗体分子和从这些分子获得的任何功能片段，其中这些片段保留了亲本抗体分子的特异性结合性质。

术语“杂交(hybridize)”和“杂交(hybridization)”是指在核苷酸序列之间形成复合物，这些序列充分互补以通过Watson-Crick碱基配对形成复合物。当引物与靶(模板)“杂交”时，这样的复合物(或杂交物)足够稳定，以起到例如DNA聚合酶启动DNA合成所需的引发功能。

如本文所用，“生物样品”是指从受试者分离的组织或流体的样品，包括但不限于例如血液、血浆、血清、粪便、尿液、骨髓、胆汁、脊髓液、淋巴液、皮肤样品、皮肤外分泌物、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、眼泪、唾液、乳汁、血细胞、器官、活检以及体外细胞培养成分的样品，包括但不限于由培养基中的细胞和组织生长产生的条件培养基，例如重组细胞和细胞成分。特别地，ASF病毒可以从包括但不限于血液、血清、脾、肝、肺、淋巴结、扁桃体和肾的生物样品获得。

“受试者”是指猪科(suidae)的任何成员，包括但不限于家猪(sus domesticus)。该术语不表示特定年龄。因此，成年和新生个体都意图被覆盖。

术语“变体”、“类似物”和“突变蛋白”是指保留所需活性的参考分子的生物活性衍生物，所述活性诸如诱导针对ASF的免疫应答的抗原活性。通常，术语“变体”和“类似物”是指相对于天然分子具有一个或更多个氨基酸添加、取代(通常在性质上保守)和/或缺失的具有天然多肽序列和结构的化合物，只要这些修饰不破坏生物活性，并且它们与下面定义的参考分子“基本同源”。通常，当比对两个序列时，此类类似物的氨基酸序列将与参考序列具有高度的序列同源性，例如，氨基酸序列同源性大于50％，通常大于60％-70％，甚至更具体地80％-85％或更多，例如至少90％-95％或更多。通常，类似物将包括相同数量的氨基酸，但将包括如本文解释的取代。术语“突变蛋白”还包括具有一个或更多个氨基酸样分子的多肽，包括但不限于仅包含氨基和/或亚氨基分子的化合物，含有一个或更多个氨基酸类似物(包括，例如，非天然氨基酸等)的多肽，具有取代的键的多肽，以及本领域已知的其他修饰，天然存在和非天然存在(例如，合成)、环化、支化分子等。该术语还包括包含一个或更多个N-取代的甘氨酸残基(“类肽”)和其他合成氨基酸或肽的分子。(参见例如，美国专利第5,831,005号；第5,877,278号；及第5,977,301号)。在实施方案中，类似物或突变蛋白具有至少与天然分子相同的抗原活性。用于制备多肽类似物和突变蛋白的方法是本领域已知的，并在下面进一步描述。

如上所述，类似物通常包括性质上保守的取代，即发生在其侧链相关的氨基酸家族内的那些取代。具体而言，氨基酸通常分为四个家族：(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性--赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性--丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被归类为芳香族氨基酸。例如，可合理地预期，用异亮氨酸或缬氨酸单个地替换亮氨酸、用谷氨酸替换天冬氨酸、用丝氨酸替换苏氨酸或用结构相关的氨基酸类似地保守替换氨基酸，将不会对生物活性具有大的影响。例如，感兴趣的多肽可以包括多达约5-10个保守或非保守氨基酸取代，或甚至多达约15-25个保守或非保守氨基酸取代，或5-25之间的任何整数，只要期望的分子功能保持不受影响。本领域技术人员通过参考本领域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle图可以容易地确定感兴趣的分子中可容忍变化的区域。

本文中使用的术语“多表位融合抗原”或“多表位融合蛋白”是指其中多个ASF病毒抗原是单个连续氨基酸链的一部分的多肽，该链在自然界中不存在。ASF病毒抗原可以通过肽键直接相互连接，或者可以通过中间的氨基酸序列间隔。融合抗原可以包含p30/p54 ASF病毒编码的多肽或其片段。融合抗原也可以包含ASF病毒的外源性序列。此外，存在的序列可以来自ASF病毒的多种基因型和/或分离株。

在免疫原性组合物的上下文中，“治疗有效量”是指将诱导免疫应答的免疫原(例如，免疫原性多肽、融合蛋白、多聚蛋白或编码抗原的核酸)的量，用于抗体产生或用于ASF感染的治疗或预防。这样的应答通常会导致受试者对组合物发展抗体介导的免疫应答和/或分泌性免疫应答或细胞免疫应答。通常，这样的应答包括但不限于以下一种或更多种作用：产生来自任何免疫学类别的抗体，诸如免疫球蛋白A、D、E、G或M；B和T淋巴细胞增殖；向免疫细胞提供激活、生长和分化信号；辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞和/或γ、δ-T细胞群体的扩增。

出于本公开内容的目的，佐剂的“有效量”将是增强对共施用的抗原或编码抗原的核酸的免疫应答的量。

如本文所用，“治疗”是指(i)预防感染或再感染，如在传统疫苗中，(ii)减轻或消除症状，和(iii)基本或完全消除所讨论的病原体中的任何一种。治疗可以是预防性地(感染前)或治疗性地(感染后)实现。

在详细描述本公开内容之前，应当理解，除非另有指示，否则本公开内容的实践将采用病毒学、微生物学、分子生物学、重组DNA技术和免疫学的常规方法，所有这些都在本领域的普通技术范围内。此类技术在文献中被充分地解释。尽管在请求保护的本发明的实践中可以使用与本文描述的方法和材料类似或等效的许多方法和材料，但本文描述了材料和方法。

本公开内容包括用于针对ASF感染对受试者进行免疫接种的组合物和方法。本公开内容提供了包含编码来自一种或更多种ASF病毒株的衣壳蛋白和/或其他免疫原性多肽的核酸的免疫原性组合物，包含来源于一种或更多种ASF病毒株的免疫原性多肽的组合物。在本发明主题的实践中使用的免疫原性多肽可以包括ASF病毒衍生的多肽，包括多表位融合抗原。此外，免疫原性组合物可包含一种或更多种佐剂或编码佐剂的核酸，其中免疫原性多肽与佐剂混合或共表达。免疫原性组合物还可以包含除ASF病毒抗原之外的其他抗原，诸如可用于针对引起腹泻疾病的病原体的免疫接种的抗原。

为了进一步理解所公开的主题，下面提供了关于用于免疫原性组合物的核酸和多肽的产生以及在治疗或预防ASF感染中使用这些组合物的方法的更详细的讨论。

结构多肽、非结构多肽和多聚蛋白

本文所述的免疫原性组合物可以包含衍生自ASF病毒的一种或更多种基因型和/或分离株的一种或更多种多肽。可用于实践本文公开的主题的多肽包括结构蛋白、非结构蛋白和多聚蛋白。这样的多肽可以是能够引发对ASF病毒的免疫应答的全长蛋白质或其变体或免疫原性片段。

免疫原性组合物中的多肽可以由ASF病毒基因组的任何区域编码。多种多肽可以被包含在免疫原性组合物中。这样的组合物可以包含来自相同ASF病毒分离株或来自不同毒株和分离株的多肽，包括具有各种ASF病毒基因型中的任何一种的分离株，以提供针对广泛的ASF病毒基因型的增强保护。ASF病毒的多种病毒株是已知的，并且包含衍生自这些毒株中任何一种的表位的多种多肽可用于免疫原性组合物中。

本公开内容的免疫原性组合物中使用的抗原可以作为单独的个体多肽存在于组合物中。通常，本公开内容的重组蛋白表达为GST融合蛋白和/或加His标签的融合蛋白。

多表位融合蛋白

本文所述的免疫原性组合物也可以包含多个表位融合蛋白。这样的融合蛋白包括来源于ASF病毒的一种或更多种基因型和/或分离株的两种或更多种病毒多肽的多个表位。多表位融合蛋白提供了两个主要优点：首先，自身可能不稳定或表达不良的多肽可以通过添加合适的杂合配偶体(hybrid partner)来帮助克服该问题；第二，商业生产被简化，因为只需要采用一种表达和纯化来生产两种在抗原性上都有用的多肽。

融合蛋白中的多肽可以来源于相同的ASF病毒分离株或不同的毒株和分离株，包括具有各种ASF病毒基因型中的任何一种的分离株，以提供针对宽范围的病毒基因型的增强保护。ASF病毒的多种病毒株是已知的，并且衍生自这些毒株中任何一种的表位可用于融合蛋白中。

众所周知，任何给定的生物体物种因个体生物体而异，并且此外，给定的生物体诸如病毒可能具有许多不同的毒株。例如，如上所述，ASF病毒包括至少24个基因群。一般来说，抗原决定簇在氨基酸序列方面可能具有高度同源性，当比对时，同源性程度通常为30％或更高、40％或更高。融合蛋白还可以包含表位的多个拷贝，其中所述融合蛋白的一个或更多个多肽包含含有相同表位的精确拷贝的序列。此外，多肽可以基于特定地理区域中特有的特定病毒分支来选择，在该区域将使用含有融合物的疫苗组合物。很明显，主题融合物提供了一种在各种情况下治疗_____感染的有效方法。

多表位融合抗原可以由式NH₂-A-{-X-L-}_n-B--COOH表示，其中：X是ASF病毒抗原或其片段的氨基酸序列；L是任选的接头氨基酸序列；A是任选的N末端氨基酸序列；B是任选的C末端氨基酸序列；并且n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。

如果--X--部分具有野生型形式的前导肽序列，这可能在多表位融合抗原中被包含或省略。在一些实施方案中，除了位于杂合蛋白N末端的--X--部分的前导肽之外，前导肽将被缺失，即，X₁的前导肽将被保留，但X₂...X_n的前导肽将被省略。这相当于缺失所有前导肽并使用X₁的前导肽作为-A-部分。

对于(--X-L-)的每n个实例，接头氨基酸序列-L-可以存在或不存在。例如，当n＝2时，杂合体可以是NH₂--X₁-L₁-X₂-L₂-COOH、NH₂--X₁--X₂--COOH、NH₂--X₁-L₁-X₂--COOH、NH₂--X₁--X₂-L₂-COOH等。接头氨基酸序列-L-通常是短的，例如20个或更少的氨基酸(即20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。实例包括促进克隆的短肽序列、多甘氨酸接头(Gly，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)和组氨酸标签(His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。其他合适的接头氨基酸序列对于本领域技术人员将是明显的。一个有用的接头是GSGGGG，其Gly-Ser二肽从BamHI限制性位点形成，这有助于克隆和操作，以及(Gly)₄四肽是典型的多甘氨酸接头。此外，还可以添加蛋白酶底物序列(例如，TEV蛋白酶：ENLYFQG)。

-A-是任选的N末端氨基酸序列。这通常是短的，例如40个或更少的氨基酸(即40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。实例包括指导蛋白质运输的前导序列或促进克隆或纯化的短肽序列(例如组氨酸标签His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。其他合适的N末端氨基酸序列对于本领域技术人员将是明显的。如果X₁缺乏自身的N末端甲硫氨酸，则-A-是提供N末端甲硫氨酸的寡肽(例如，具有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)。

--B--是任选的C末端氨基酸序列。这通常是短的，例如40个或更少的氨基酸(即40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。实例包括指导蛋白质运输的序列、促进克隆或纯化的短肽序列(例如，His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)，或增强蛋白质稳定性的序列。其他合适的C末端氨基酸序列对于本领域技术人员将是明显的，包括，当TEV蛋白酶底物序列在这样的His_n之前时(例如，ENLYFQGHis_n)，可移除His_n序列。

多表位融合抗原内的免疫原性组合物的单个抗原(单个--X--部分)可以来自一种或更多种毒株或来自一种或更多种M型。例如，当n＝2时，X₂可以来自与X₁相同的毒株或类型或者来自不同的毒株或类型。当n＝3时，毒株可能是(i)X₁＝X₂＝X₃，(ii)X₁＝X₂不等于X₃，(iii)X₁不等于X₂＝X₃，(iv)X₁不等于X₂不等于X₃，或(v)X₁＝X₃不等于X₂，等等。

在使用多个表位融合抗原的情况下，融合蛋白内的单个抗原(即单个--X--部分)可以来自一个或更多个毒株。例如，当n＝2时，X₂可以来自与X₁相同的毒株或者来自不同的毒株。当n＝3时，毒株可能是(i)X₁＝X₂＝X₃，(ii)X₁＝X₂不等于X₃，(iii)X₁不等于X₂＝X₃，(iv)X₁不等于X₂不等于X₃，或(v)X₁＝X₃不等于X₂，等等。

因此，在实施方案中，可以存在来自不同ASF病毒株的抗原决定簇。下面讨论用于本公开内容的代表性多表位融合蛋白，包括衍生自ASF病毒分离株的多肽。然而，应当理解，包含衍生自ASF病毒基因组的其他表位的多表位融合蛋白或包含不同表位排列的多表位融合蛋白也将用于所公开的免疫原性组合物中。

在某些实施方案中，融合蛋白包含来自一种或更多种ASF病毒分离株的一种或更多种衣壳和/或次要结构多肽。

在另一种实施方案中，融合蛋白包含来自多于一种病毒株的ASF病毒多肽。

在本文描述的所有融合物中，病毒区域不需要按照它们自然存在的顺序。此外，每个区域可以来源于相同或不同的ASF病毒分离株。存在于上述各种融合物中的各种ASF病毒多肽可以是全长多肽或其部分。

如果需要，融合蛋白或这些蛋白的单个组分也可以包含其他氨基酸序列，诸如氨基酸接头或信号序列，以及可用于蛋白质纯化的配体，诸如谷胱甘肽-S-转移酶和葡萄球菌蛋白A。

核酸

本文公开的用于例如多肽产生的核酸可以来源于ASF病毒基因组的各种区域中的任何一个。

来自ASF病毒的代表性序列是已知的，包括SEQ ID NO:1、7、9、11、13和14。

可用于核酸免疫接种以引发对ASF病毒的免疫应答的这些序列中的任何一个，以及其片段和变体，将用于本发明方法中。因此，本公开内容提供了上述序列的变体，所述变体与上述序列显示至少约80％-100％序列同一性，包括这些范围内的任何同一性百分比，诸如与上述序列的81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性。本公开内容还提供了编码衍生自任何上述序列或其变体的ASF病毒多肽的免疫原性片段的多核苷酸。多核苷酸还可以包含天然存在的多肽的编码序列，或者可以是天然不存在的人工序列。

多核苷酸可以包含少于整个ASF病毒基因组，或者可选地可以包括整个病毒基因组DNA的序列。

在实施方案中，多核苷酸包含编码一种或更多种ASF病毒分离株的p30、p54、p72和/或血凝素蛋白的一种或更多种ASF病毒序列。

在实施方案中，本公开内容提供了编码如本文所述的多表位融合蛋白的多核苷酸。多表位融合蛋白可以包括来自ASF病毒的一种或更多种基因型和/或分离株的序列。

根据本公开内容的核酸可以以多种方式制备(例如，通过化学合成，从基因组或cDNA文库，从生物体本身等)并且可以采取各种形式(例如，单链、双链、载体、探针等)。在实施方案中，核酸以基本上纯的形式制备(即，基本上不含其他宿主细胞或非宿主细胞核酸)。

例如，核酸可以通过筛选来自感染病毒的细胞的cDNA和/或基因组文库，或通过从已知包含该文库的载体衍生基因来获得。例如，感兴趣的多核苷酸可以从来源于病毒DNA的基因组文库分离，该文库存在于例如受感染个体的毛发或血液样品中。可选地，ASF病毒核酸可以从受感染的哺乳动物或从收集自受感染个体的生物样品分离。扩增方法诸如PCR可用于从编码多核苷酸的ASF病毒基因组DNA扩增多核苷酸。可选地，多核苷酸可以在实验室中合成，例如，使用自动合成仪。核苷酸序列可以用所需的特定氨基酸序列的适当密码子来设计。一般来说，人们将为将表达序列的预期宿主选择优选的密码子。感兴趣的多核苷酸的完整序列可以由通过标准方法制备的重叠寡核苷酸组装而成，并组装成完整的编码序列。多核苷酸可以是RNA或单链或双链DNA。在实施方案中，分离出不含其他组分诸如蛋白质和脂质的多核苷酸。

因此，特定的核苷酸序列可从携带所需序列的载体获得，或在适当时使用本领域已知的各种寡核苷酸合成技术(诸如定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术)完全或部分地合成。特别地，获得编码所需序列的核苷酸序列的一种方法是通过退火在常规的自动化多核苷酸合成仪中产生的重叠合成寡核苷酸的互补组，随后用合适的DNA连接酶连接并通过PCR扩增连接的核苷酸序列。引物序列可包括但不限于SEQ ID NO:2、3、4、5、15和16。

免疫原性多肽的产生

本文所述的多肽可以以任何合适的方式(例如，重组表达、从细胞培养物纯化、化学合成等)和以各种形式(例如，天然的、融合的、非糖基化的、脂化的等)制备。这样的多肽包括天然存在的多肽、重组产生的多肽、合成产生的多肽或通过这些方法的组合产生的多肽。制备这样的多肽的方法是本领域熟知的。多肽以基本上纯的形式制备(即基本上不含其他宿主细胞或非宿主细胞蛋白质)。

多肽可以通过肽领域技术人员已知的几种技术中的任何一种，方便地以化学方式合成。通常，这些方法采用一个或更多个氨基酸向生长的肽链的顺序添加。通常，第一个氨基酸的氨基或羧基基团被合适的保护基团保护。然后，在允许形成酰胺键的条件下，通过加入序列中具有适当保护的互补(氨基或羧基)基团的下一个氨基酸，保护的或衍生的氨基酸可以连接到惰性固体支持物或在溶液中利用。然后从新加入的氨基酸残基除去保护基团，并且然后加入下一个氨基酸(适当保护的)，以此类推。在所需的氨基酸以适当的序列连接后，任何剩余的保护基团(和任何固体支持物，如果使用固相合成技术)被顺序或同时去除，以得到最终的多肽。通过对该一般程序的简单修改，可以一次向生长链添加一个以上的氨基酸，例如，通过(在不使手性中心消旋的条件下)将受保护的三肽与适当受保护的二肽偶联，以在去保护后形成五肽。

典型的保护基团包括叔丁氧羰基(Boc)、9-芴基甲氧羰基(Fmoc)、苄氧羰基(Cbz)；对甲苯磺酰基(Tx)；2,4-二硝基苯基；苄基(Bzl)；联苯基异丙氧基羧基羰基、叔戊基氧基羰基、异冰片基氧基羰基、o-溴苄氧基羰基、环己基、异丙基、乙酰基、o-硝基苯磺酰基等。典型的固体支持物是交联聚合物支持物。这些可包括基于二乙烯基苯交联苯乙烯的聚合物，例如，二乙烯基苯-羟甲基苯乙烯共聚物、二乙烯基苯-氯甲基苯乙烯共聚物和二乙烯基苯-二苯甲基氨基聚苯乙烯共聚物。

本公开内容的多肽也可以通过其他方法化学制备，诸如通过同时多种肽合成的方法化学制备。

可选地，可以重组地产生上述免疫原性多肽、多聚蛋白和多表位融合蛋白。分离或合成了所需蛋白质的编码序列后，可以将它们克隆到任何合适的载体或复制子中进行表达。本领域技术人员已知许多克隆载体，并且选择合适的克隆载体是一个选择的问题。本领域中有多种细菌、酵母、植物、哺乳动物和昆虫的表达系统可获得，并且可以使用任何这样的表达系统。任选地，编码这些蛋白质的多核苷酸可以在无细胞翻译系统中翻译。这些方法是本领域熟知的。

用于克隆的重组DNA载体和它们可以转化的宿主细胞的实例包括噬菌体λ(大肠杆菌(E.coli))、pBR322(大肠杆菌)、pACYC177(大肠杆菌)、pKT230(革兰氏阴性菌)、pGV1106(革兰氏阴性菌)、pLAFR1(革兰氏阴性菌)、pME290(非大肠杆菌革兰氏阴性菌)、pHV14(大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、pBD9(芽孢杆菌)、pIJ61(链霉菌)、pUC6(链霉菌)、YIp5(酵母)、YCp19(酵母)和牛乳头瘤病毒(哺乳动物细胞)。

昆虫细胞表达系统，诸如杆状病毒系统，也可以使用，并且是本领域技术人员已知的，并且在例如Summers和Smith,Texas Agricultural Experiment Station BulletinNo.1555(1987)中描述。杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法是以试剂盒形式可商购的，特别是从Invitrogen,San Diego,CA(“MaxBac”试剂盒)。

植物表达系统也可用于产生免疫原性蛋白质。通常，这样的系统使用基于病毒的载体用异源基因转染植物细胞。

病毒系统，诸如基于痘苗的感染/转染系统，也将用于本文公开的主题。在该系统中，首先用编码噬菌体T7 RNA聚合酶的痘苗病毒重组体在体外转染细胞。这样的聚合酶表现出精致的特异性，因为它只转录带有T7启动子的模板。感染后，在T7启动子的驱动下，用感兴趣的DNA转染细胞。在来自痘苗病毒重组体的细胞质中表达的聚合酶将转染的DNA转录成RNA，然后由宿主翻译机制将RNA翻译成蛋白质。该方法提供了大量RNA及其翻译产物的高水平、瞬时、细胞质产生。

可以将基因置于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)和任选的操纵子(本文统称为“控制”元件)的控制下，使得编码所需免疫原性多肽的DNA序列在由含有该表达构建体的载体转化的宿主细胞中被转录成RNA。编码序列可以包含或不包含信号肽或前导序列。对于本文公开的本主题，可以使用天然存在的信号肽或异源序列二者。前导序列可能在翻译后加工中被宿主移除。参见例如美国专利第4,431,739号；第4,425,437号；第4,338,397号，每一个通过引用以其整体并入本文。这样的序列包括但不限于tpa前导序列以及蜜蜂蜂毒肽信号序列。

也可能需要其他调控序列，其允许相对于宿主细胞的生长调节蛋白质序列的表达。这样的调控序列是本领域技术人员已知的，并且实例包括那些响应于化学或物理刺激(包括调控化合物的存在)导致基因表达被开启或关闭的调控序列。载体中也可能存在其他类型的调控元件，例如增强子序列。

控制序列和其他调控序列可以在插入载体之前连接到编码序列。可选地，可以将编码序列直接克隆到已经包含控制序列和适当限制性位点的表达载体中。

在实施方案中，可能需要修改编码序列，使得它可以以适当的方向附接到控制序列；即保持适当的阅读框。也可能需要产生免疫原性多肽的突变体或类似物。突变体或类似物可以通过缺失编码蛋白质的序列的一部分、插入序列和/或取代序列中的一个或更多个核苷酸来制备。用于修饰核苷酸序列的技术，诸如定点诱变，是本领域技术人员所熟知的。

然后使用表达载体转化合适的宿主细胞。许多哺乳动物细胞系是本领域已知的，并且包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系，诸如但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)以及其他细胞。类似地，细菌宿主诸如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和链球菌属种(Streptococcus spp.)，将与本发明的表达构建体一起使用。对所公开的主题有用的酵母宿主包括，除其他外，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、麦芽糖念珠菌(Candida maltosa)、多形汉森氏菌(Hansenula polymorpha)、脆弱克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、Pichia guillerimondii、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。与杆状病毒表达载体一起使用的昆虫细胞包括，除其他外，埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)、家蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。

根据所选择的表达系统和宿主，本文公开的蛋白质通过在表达感兴趣蛋白质的条件下培养由上述表达载体转化的宿主细胞来产生。适当生长条件的选择在本领域技术范围内。然后使用化学、物理或机械方法破坏细胞，这使细胞溶解但保持ASF病毒免疫原性多肽基本完整。细胞内蛋白质也可以通过从细胞壁或膜上去除组分来获得，例如通过使用去污剂或有机溶剂，使得发生免疫原性多肽的泄漏。

例如，用于本文公开的主题的破坏细胞的方法包括但不限于：声处理或超声波处理；搅动；液体或固体挤出；热处理；冻融；干燥；爆炸减压；渗透性休克；用包括蛋白酶诸如胰蛋白酶、神经氨酸酶和溶菌酶的裂解酶处理；碱处理；以及使用去污剂和溶剂如胆盐、十二烷基硫酸钠、Triton、NP40和CHAPS。用于破坏细胞的特定技术在很大程度上是一个选择的问题，并且将取决于表达多肽的细胞类型、培养条件和所使用的任何预处理。

细胞破裂后，通常通过离心除去细胞碎片，并使用标准纯化技术进一步纯化细胞内产生的ASF病毒免疫原性多肽，这些技术诸如但不限于柱层析、离子交换层析、尺寸排阻层析、电泳、HPLC、免疫吸收技术、亲和层析、免疫沉淀等。

例如，获得本文公开的细胞内ASF病毒免疫原性多肽的一种方法涉及亲和纯化，诸如通过使用特异性抗体的免疫亲和层析。合适的亲和树脂的选择在本领域的能力范围内。亲和纯化后，免疫原性多肽可以使用本领域熟知的常规技术进一步纯化，诸如通过上述任何技术。

可能希望同时产生多种多肽(例如，来自一种或更多种病毒株的结构和/或非结构蛋白或与多肽佐剂组合的病毒多肽)。两种或更多种不同多肽的产生可以通过例如用编码不同多肽的构建体共转染宿主细胞来容易地完成。共转染可以反式或顺式完成，即通过使用单独的载体或通过使用编码多肽的单个载体。如果使用单个载体，多肽的表达可以由单个控制元件组驱动，或者可选地，编码多肽的序列可以存在于单个表达盒中的载体上，由单个控制元件调控。

本文所述的多肽可以连接到固体支持物。可在实践中与本文公开的主题一起使用的固体支持物包括基底，诸如硝化纤维素(例如，膜或微量滴定孔形式)；聚氯乙烯(例如，片或微量滴定孔)；聚苯乙烯胶乳(例如，珠或微量滴定板)；聚偏氟乙烯；重氮化纸；尼龙膜；活化珠、磁响应珠等。

通常，固体支持物首先在合适的结合条件下与固相组分(例如，一种或更多种ASF病毒抗原)反应，使得组分充分固定到支持物。有时，通过首先将抗原与具有更好结合特性的蛋白质偶联，可以增强抗原与支持物的固定。合适的偶联蛋白包括但不限于大分子，诸如血清白蛋白，包括牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白和本领域技术人员熟知的其他蛋白。可用于将抗原结合到支持物的其它分子包括多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物等。这样的分子和将这些分子偶联到抗原的方法是本领域普通技术人员熟知的。

如果需要，可以使用常规技术标记多肽。合适的标记包括荧光团、发色团、放射性原子(特别是³²P和¹²⁵I)、电子致密试剂、酶和具有特异性结合配偶体的配体。酶通常通过它们的活性来检测。例如，辣根过氧化物酶通常通过其将3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)转化为蓝色色素的能力来检测，可用分光光度计定量。“特异性结合配偶体”是指能够以高特异性结合配体分子的蛋白质，例如在抗原和对其特异性的单克隆抗体的情况下。其他特异性结合配偶体包括生物素和亲和素或链霉亲和素、IgG和蛋白A，以及本领域已知的许多受体-配体对。如本文所公开的，可以使用单个标记或标记的组合。

在配制后，本文公开的组合物可以直接施用于受试者(例如，如上所述)，或者可选地，使用方法(诸如以上所述的方法)离体递送至来源于受试者的细胞。

免疫原性组合物

本公开内容还提供了包含一种或更多种本文所述的免疫原性多肽和/或多聚蛋白、多表位融合蛋白的组合物。不同的多肽、多聚蛋白和多表位融合蛋白可以在单一制剂中混合在一起。在这样的组合中，免疫原性组合物的抗原可以存在于一种以上的多肽或多表位多肽或多聚蛋白中。

免疫原性组合物可以包含多肽的混合物，其继而可以使用相同或不同的媒介物递送。抗原可以单独或组合施用，在例如预防性(即预防感染)或治疗性(治疗感染)免疫原性组合物中。免疫原性组合物可被给予多于一次(例如，“初免”施用，随后是一次或更多次“加强”)以达到所需的效果。可以在一个或更多个初免和一个或更多个加强步骤中施用相同的组合物。可选地，不同的组合物可用于初免和加强。

免疫原性组合物通常将包含一种或更多种“药学上可接受的赋形剂或媒介物”，诸如水、盐水、甘油、乙醇等。此外，辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等，可以存在于这样的媒介物中。

除了上述组分之外，免疫原性组合物通常还包含一种或更多种“药学上可接受的载体”。这些包括本身不诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体(例如油滴或脂质体)。这类载体是本领域普通技术人员所熟知的。组合物还可以包含稀释剂，诸如水、盐水、甘油等。另外，可以存在辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。药学上可接受的组分的深入讨论在Gennaro(2000)Remington:TheScience and Practice of Pharmacy.第20版,ISBN:0683306472中可获得。

药学上可接受的盐也可用于本文公开的组合物中，例如矿物盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐，以及有机酸盐，诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或苯甲酸盐。特别有用的蛋白质基底是血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、破伤风类毒素和本领域技术人员熟知的其他蛋白质。公开的组合物还可以单独或组合地包含液体或赋形剂，诸如水、盐水、甘油、右旋糖、乙醇等，以及诸如润湿剂、乳化剂或pH缓冲剂的物质。抗原也可以吸附到脂质体和颗粒载体诸如PLG，包埋在它们中，或者以其他方式与它们缔合。

抗原可以与载体蛋白缀合，以增强免疫原性。这在使用糖或糖类抗原的组合物中特别有用。

载体蛋白可以包括但不限于细菌毒素或类毒素，诸如白喉或破伤风类毒素。可以使用CRM₁₉₇白喉类毒素。其它载体多肽包括脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)外膜蛋白(EP-A-0372501)、合成肽(EP-A-0378881和EP-A-0427347)、热休克蛋白(WO 93/17712和WO 94/03208)、百日咳蛋白(WO 98/58668和EP-A-0471177)、来自流感嗜血杆菌(H.influenzae)的蛋白D(WO 00/56360)、细胞因子(WO 91/01146)、淋巴因子、激素、生长因子、来自艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B(WO 00/61761)、铁摄取蛋白诸如运铁蛋白(WO 01/72337)等。当混合物包含来自血清群A和C二者的荚膜糖时，MenA糖:MenC糖的比率(w/w)可以大于1(例如，2:1、3:1、4:1、5:1、10:1或更高)。不同的糖可以与相同或不同类型的载体蛋白缀合。可以使用任何合适的缀合反应，必要时使用任何合适的接头。

免疫原性组合物，包括公开的疫苗，可以与其他免疫调节剂一起施用。例如，本文公开的疫苗可以包含佐剂。佐剂包括但不限于下述一种或更多种类型的佐剂。

含矿物的组合物

适合用作本文公开的佐剂的含矿物的组合物包含矿物盐，诸如铝盐和钙盐。本文公开的盐包括矿物盐，诸如氢氧化物(例如，羟基氧化物(oxyhydroxides))、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等，或不同矿物化合物的混合物(例如，磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，任选地具有过量的磷酸盐)，化合物采取任何合适的形式(例如，凝胶、结晶、无定形等)。含矿物的组合物也可以配制成金属盐颗粒(WO 00/23105)。

在疫苗中可以包含铝盐，使得Al³⁺的剂量在每剂0.2和1.0mg之间。

在实施方案中，用于所公开用途的铝基佐剂是明矾(硫酸铝钾(AlK(SO₄)₂)或明矾衍生物，诸如通过将磷酸盐缓冲液中的抗原与明矾混合，随后用碱诸如氢氧化铵或氢氧化钠滴定和沉淀而原位形成的明矾衍生物。

另一种用于本发明疫苗制剂的铝基佐剂是氢氧化铝佐剂(Al(OH)₃)或结晶氢氧化铝(AlOOH)，其是优异的吸附剂，具有约500m²/g的表面积。可选地，提供了磷酸铝佐剂(AlPO₄)或羟基磷酸铝，其含有代替氢氧化铝佐剂的部分或全部羟基基团的磷酸基团。在实施方案中，本文提供的磷酸铝佐剂是无定形的，并且可溶于酸性、碱性和中性介质。

在实施方案中，本文公开的佐剂包含磷酸铝和氢氧化铝二者。在一个方面，佐剂具有比氢氧化铝更大量的磷酸铝，诸如按重量计磷酸铝与氢氧化铝的比例为2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或大于9:1。更具体地，疫苗中的铝盐以每剂疫苗0.4至1.0mg，或每剂疫苗0.4至0.8mg，或每剂疫苗0.5至0.7mg，或每剂疫苗约0.6mg存在。

通常，铝基佐剂或多种铝基佐剂(诸如磷酸铝与氢氧化铝)的比例通过优化分子之间的静电吸引力来选择，使得抗原在所需pH携带与佐剂相反的电荷。例如，磷酸铝佐剂(iep＝4)在pH 7.4吸附溶菌酶，但不吸附白蛋白。如果白蛋白是靶，将选择氢氧化铝佐剂(即，11.4)。可选地，用磷酸盐预处理氢氧化铝会降低其等电点，使其成为更碱性抗原的优选佐剂。

油-乳液

适于用作佐剂的油-乳液组合物可包括角鲨烯-水乳液，诸如MF59(5％角鲨烯、0.5％TWEEN 80^TM和0.5％ SPAN 85^TM，使用微流化器配制成亚微米颗粒)。参见WO 90/14837。MF59用作FLUAD^TM流感病毒三价亚单位疫苗中的佐剂。

特别用于组合物中的佐剂是亚微米水包油乳液。用于在本文使用的亚微米水包油乳液可以是任选地含有不同量MTP-PE的角鲨烯/水乳液，诸如含有4％-5％w/v的角鲨烯、0.25％-1.0％w/v的TWEEN 80^TM(聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)，和/或0.25％-1.0％的SPAN85^TM(山梨聚糖三油酸酯)的亚微米水包油乳液，和任选地N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(β-2’-二棕榈基-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)，例如称为“MF59”的亚微米水包油乳液(国际公布第WO 90/14837号；美国专利第6,299,884号和第6,451,325号)。MF59包含4％-5％w/v的角鲨烯(例如4.3％)、0.25％-0.5％w/v的TWEEN 80^TM和0.5％w/v的SPAN 85^TM并且任选地包含各种量的MTP-PE，使用微流化器诸如110Y型微流化器(Microfluidics,Newton,Mass.)配制成亚微米颗粒。例如，MTP-PE可以以约0-500μg/剂、0-250μg/剂和0-100μg/剂的量存在。如本文所用，术语“MF59-0”是指缺乏MTP-PE的上述亚微米水包油乳液，而术语MF59-MTP是指含有MTP-PE的制剂。例如，“MF59-100”每剂含有100μg MTP-PE，以此类推。本文使用的另一种亚微米水包油乳液MF69含有4.3％w/v的角鲨烯、0.25％w/v的TWEEN 80^TM和0.75％w/v的SPAN 85^TM和任选的MTP-PE。又另一种亚微米水包油乳液是MF75，也称为SAF，含有10％的角鲨烯、0.4％的TWEEN 80^TM、5％的pluronic嵌段聚合物L121和thr-MDP，也被微流化成亚微米乳液。MF75-MTP指含有MTP的MF75制剂，诸如每剂100-400μg的MTP-PE。

亚微米水包油乳液、其制备方法和用于组合物的免疫刺激剂，诸如胞壁酰肽，在国际公布号WO 90/14837和美国专利第6,299,884号和第6,451,325号中详细描述。

完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)也可用作佐剂。

皂苷制剂

皂苷制剂也可用作佐剂。皂苷是见于多种植物物种的树皮、叶、茎、根甚至花中的甾醇糖苷和三萜苷的异源组。从皂皮树(Quillaia saponaria,Molina tree)树皮分离的皂苷作为佐剂已被广泛研究。皂苷也可以从菝葜(Smilax ornata,sarsaprilla)、圆锥石头花(Gypsophilla paniculata)(brides veil)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)市售获得。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂，诸如QS21，以及脂质制剂，诸如ISCOM。

使用高效薄层层析(HP-TLC)和反相高效液相层析(RP-HPLC)纯化皂苷组合物。已经鉴定了使用这些技术的特定纯化级分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。在实施方案中，皂苷是QS21。美国专利第5,057,540号公开了一种生产QS21的方法。皂苷制剂也可以包含甾醇，诸如胆固醇(参见WO 96/33739)。

皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒。ISCOM通常还包含磷脂，诸如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷都可以用于ISCOM。在实施方案中，ISCOM包括Quil A、QHA和QHC中的一个或更多个。ISCOM在EP0109942、WO 96/11711和WO 96/33739中进一步描述。可选地，ISCOM可以不含另外的去污剂。参见WO 00/07621。

细菌或微生物衍生物

适合用于本文公开用途的佐剂包括细菌或微生物衍生物，诸如：

(1)肠杆菌脂多糖(LP)的无毒衍生物

这样的衍生物包括单磷酸脂质A(MPL)和3-O-脱酰化MPL(3dMPL)。3dMPL是3De-O-酰化单磷酸脂质A与4、5或6个酰化链的混合物。EP 0689 454中公开了一种“小颗粒”形式的3De-O-酰化单磷酸脂质A。这样的3dMPL的“小颗粒”小到足以通过0.22微米的膜进行无菌过滤(参见EP 0689 454)。其他无毒LPS衍生物包括单磷酸脂质A模拟物，诸如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸衍生物，例如RC-529。

(2)脂质A衍生物

脂质A衍生物包括来自大肠杆菌的脂质A衍生物，诸如OM-174。

(3)免疫刺激性寡核苷酸

适合用作佐剂的免疫刺激性寡核苷酸可以包括含有CpG基序(含有未甲基化胞嘧啶后跟鸟苷并通过磷酸键连接的序列)的核苷酸序列。含有回文或多(dG)序列的细菌双链RNA或寡核苷酸也显示出免疫刺激性。

CpG可以包括核苷酸修饰/类似物，诸如硫代磷酸酯修饰，并且可以是双链或单链的。任选地，鸟苷可以被类似物诸如2’-脱氧-7-脱氮鸟苷代替。

CpG序列可以针对TLR9，诸如基序GTCGTT或TTCGTT。CpG序列可以特异性地诱导Th1免疫应答，诸如CpG-A ODN，或者它可以更特异性地诱导B细胞应答，诸如CpG-B ODN。在实施方案中，CpG是CpG-AODN。

在实施方案中，CpG寡核苷酸可以构建成使得5’末端可用于受体识别。任选地，两个CpG寡核苷酸序列可以在它们的3’末端连接以形成“immunomer”。

(4)ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物(Detoxified Derivatives)。

细菌ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物可用作佐剂。在实施方案中，该蛋白可以来源于大肠杆菌(即大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”)、霍乱(“CT”)或百日咳(“PT”)。WO 95/17211中描述了将解毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，并且WO 98/42375中描述了将其用作肠胃外佐剂。在实施方案中，佐剂是解毒的LT突变体，诸如LT-K63、LT-R72和LTR192G。

生物粘附剂和粘膜粘附剂

生物粘合剂和粘膜粘合剂也可以用作佐剂。合适的生物粘合剂包括酯化的透明质酸微球或粘膜粘合剂，诸如聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。壳聚糖及其衍生物也可用作佐剂。例如WO 99/27960。

胞壁酰肽

适合用作佐剂的胞壁酰肽的实例包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰-1-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰基胞壁酰-1-丙氨酰-d-异谷氨酰-1-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-s-n-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。

咪唑喹啉化合物。

适合用作佐剂的咪唑喹啉化合物的实例包括咪喹莫特及其类似物(参见例如，美国专利第4,689,338号、第5,389,640号、第5,268,376号、第4,929,624号、第5,266,575号、第5,352,784号、第5,494,916号、第5,482,936号、第5,346,905号、第5,395,937号、第5,238,944号和第5,525,612号)。

缩氨基硫脲化合物。

适合用作佐剂的缩氨基硫脲化合物的实例，以及所有化合物的配制、制造和筛选方法包括WO 04/60308中描述的那些。缩氨基硫脲在刺激人类外周血单个核细胞以产生细胞因子诸如TNF-α方面特别有效。

色胺酮化合物。

适合用作如本文公开的佐剂的色胺酮化合物的实例，以及所有化合物的配制、制造和筛选方法包括WO 04/64759中描述的那些。色胺酮化合物在刺激人类外周血单个核细胞以产生细胞因子诸如TNF-α方面特别有效。

上面鉴定的一种或更多种佐剂的方面的组合可以应用于本文公开的组合物。例如，可以使用下列佐剂组合物：

(1)皂苷和水包油乳液(WO 99/11241)；(2)皂苷(例如，QS21)+无毒的LPS衍生物(例如，3dMPL)(参见WO 94/00153)；(3)皂苷(例如，QS21)+无毒LPS衍生物(例如，3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(例如，QS21)+3dMPL+IL-12(任选地+甾醇)(WO 98/57659)；(5)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳液的组合(参见欧洲专利申请0835318、0735898和0761231)；(6)SAF，包含10％的角鲨烷、0.4％的TWEEN 80^TM、5％的pluronic嵌段聚合物L121，和thr-MDP，被微流化成亚微米乳液，或者涡旋以产生更大粒径的乳液。(7)RIBI^TM佐剂系统(RAS)，(RibiImmunochem)，包含2％的角鲨烯、0.2％的TWEEN 80^TM和一种或更多种细菌细胞壁组分，所述细菌细胞壁组分来自由单磷酸脂质A(MPL)、海藻糖二分枝酸盐(TDM)和细胞壁骨架(CWS)组成的组、MPL+CWS(DETOX^TM)；和(8)一种或更多种无机盐(诸如铝盐)+LPS的无毒衍生物(诸如3dPML)。(9)一种或更多种矿物盐(诸如铝盐)和一种或更多种免疫刺激性寡核苷酸(诸如包括CpG基序的核苷酸序列)和一种或更多种解毒的ADP-核糖基化毒素(诸如LT-K63和LT-R72)，(10)菊粉和菊粉乙酸酯制剂(参见例如，WO 2013/110050，以其整体并入本文)。

另外的抗原

本文公开的组合物可任选地包含一种或更多种不衍生自ASF病毒蛋白的另外的多肽抗原。这样的抗原包括细菌、病毒或寄生虫抗原。

在一些实施方案中，ASF病毒抗原与一种或更多种抗原组合，所述抗原包括但不限于源自细菌或病毒的抗原，诸如源自以下的抗原：正粘病毒(流感)、肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、肠道病毒(脊髓灰质炎)、HBV、冠状病毒(SARS)和水痘带状疱疹病毒(VZV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)(破伤风)、白喉角杆菌(Cornynebacterium diphtheriae)(白喉)、B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae B)(Hib)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌)和大肠杆菌。

在其他实施方案中，ASF病毒抗原与一种或更多种抗原组合，所述抗原包括但不限于脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌(A组链球菌)、卡他莫拉菌、百日咳博德特氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、破伤风梭菌(破伤风)、白喉角杆菌(白喉)、B型流感嗜血杆菌(Hib)、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、无乳链球菌(B组链球菌)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、正粘病毒(流感)、肺病毒(RSV)、副粘病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、肠道病毒(脊髓灰质炎)、HBV、冠状病毒(SARS)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)。

在其他实施方案中，ASF病毒抗原与一种或更多种抗原结合，所述抗原可用于设计用于保护个体免受引起腹泻疾病的病原体的疫苗。这样的抗原包括但不限于轮状病毒、志贺氏菌属种(Shigella spp.)、产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)抗原。在实施方案中，一种或更多种诺如病毒抗原可以衍生自诺沃克病毒、雪山病毒和/或夏威夷病毒，与轮状病毒抗原在免疫原性组合物中组合。

可用于本发明组合物的抗原包括但不限于下述一种或更多种抗原，或源自下述一种或更多种病原体的抗原：

细菌抗原

本文公开的合适的细菌抗原包括蛋白质、多糖、脂多糖和外膜囊泡，它们可以从细菌分离、纯化或衍生。此外，细菌抗原可包括细菌裂解物和灭活细菌制剂。细菌抗原可以通过重组表达产生。细菌抗原包括可能在细菌生命周期的至少一个阶段暴露在细菌表面的表位。细菌抗原在多种血清型间可能是保守的。细菌抗原包括来源于下述一种或更多种细菌的抗原以及下述鉴定的特定抗原实例。

脑膜炎奈瑟菌：脑膜炎抗原可包括蛋白质(诸如参考文献1-7中鉴定的那些)、糖(包括多糖、寡糖或脂多糖)或纯化或衍生自脑膜炎奈瑟菌血清群的外膜囊泡，诸如A、C、W135、Y和/或B。脑膜炎蛋白抗原可选自粘附物、自身转运蛋白、毒素、Fe获取蛋白和膜相关蛋白(例如，整合外膜蛋白)。

肺炎链球菌：肺炎链球菌抗原可以包括来自肺炎链球菌的糖(包括多糖或寡糖)和/或蛋白质。糖抗原可选自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F。蛋白质抗原可以选自WO 98/18931、WO 98/18930、美国专利第6,699,703号、美国专利第6,800,744号、WO 97/43303和WO 97/37026中鉴定的蛋白质。肺炎链球菌蛋白可以选自多组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短体、LytX家族、LytX截短体、CbpX截短体-LytX截短体嵌合蛋白、肺炎链球菌素(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125或Sp133。

化脓性链球菌(A组链球菌)：A组链球菌抗原可以包括在WO 02/34771或WO 2005/032582中鉴定的蛋白质(包括GAS 40)、GAS M蛋白质片段的融合物(包括在WO 02/094851中描述的那些)、纤连蛋白结合蛋白(Sfb1)、链球菌血红素相关蛋白(Shp)和链球菌溶血素S(SagA)。

卡他莫拉菌：莫拉菌抗原包括在WO 02/18595和WO 99/58562中鉴定的抗原、外膜蛋白抗原(HMW-OMP)、C-抗原和/或LPS。

百日咳博德特氏菌：百日咳抗原包括来自百日咳博德特氏菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，任选地还与百日咳杆菌粘附素和/或凝集原2和3抗原组合。

金黄色葡萄球菌：金黄色葡萄球菌抗原包括金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖，任选地与无毒重组铜绿假单胞菌外毒素A缀合，诸如STAPHVAX^TM，或衍生自表面蛋白、侵袭素(杀白细胞素、激酶、透明质酸酶)、抑制吞噬细胞吞噬的表面因子(荚膜，蛋白A)、类胡萝卜素、过氧化氢酶产生、蛋白A、凝固酶、凝血因子和/或溶解真核细胞膜的膜损伤毒素(任选解毒的)(溶血素、白细胞毒素、杀白细胞素)的抗原。

表皮葡萄球菌：表皮葡萄球菌抗原包括粘液相关抗原(SAA)。

破伤风梭菌(破伤风)：破伤风抗原包括破伤风类毒素(TT)，可与本公开内容的组合物组合/缀合用作载体蛋白。

白喉角杆菌(白喉)：白喉抗原包括白喉毒素，包括解毒的，诸如CRM₁₉₇。此外，设想了能够调节、抑制ADP核糖基化或与ADP核糖基化相关的抗原与本公开内容的组合物组合/共施用/缀合。白喉类毒素可用作载体蛋白。

B型流感嗜血杆菌(Hib)：Hib抗原包括Hib糖抗原。

铜绿假单胞菌：假单胞菌抗原包括内毒素A、Wzz蛋白、铜绿假单胞菌LPS(更特别是从PAO1(O5血清型)分离的LPS)，和/或外膜蛋白(包括外膜蛋白F(OprF))。

嗜肺军团菌。细菌抗原可以来源于嗜肺军团菌。

无乳链球菌(B组链球菌)：B组链球菌抗原包括在WO 02/34771、WO 03/093306、WO04/041157或WO 2005/002619中鉴定的蛋白质或糖抗原(包括蛋白GBS 80、GBS 104、GBS276和GBS 322，并包括衍生自血清型Ia、Ib、Ia/c、II、III、IV、V、VI、VII和VIII的糖抗原)。

淋病奈瑟菌：淋病抗原包括Por(或孔蛋白)蛋白(诸如PorB)、运铁蛋白结合蛋白(诸如TbpA和TbpB)、不透明蛋白(诸如Opa)、可还原修饰蛋白(Rmp)和外膜囊泡(OMV)制品(参见例如WO 99/24578、WO 99/36544、WO 99/57280、WO 02/079243)。

沙眼衣原体：沙眼衣原体抗原包括衍生自以下的抗原：血清型A、B、Ba和C(沙眼的病原体，致盲的原因)，血清型L₁、L₂&L₃(与性病淋巴肉芽肿相关)和血清型D-K。沙眼衣原体抗原还可以包括在WO 00/37494、WO 03/049762、WO 03/068811或WO 05/002619中鉴定的抗原，包括PepA(CT045)、LcrE(CT089)、ArtJ(CT381)、DnaK(CT396)、CT398、OmpH样(CT242)、L7/L12(CT316)、OmcA(CT444)、AtosS(CT467)、CT547、Eno(CT587)、HrtA(CT823)和MurG(CT761)。

梅毒螺旋体(梅毒)：梅毒抗原包括TmpA抗原。

杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)(引起软下疳)：杜克雷抗原包括外膜蛋白(DsrA)。

粪肠球菌或屎肠球菌(Enterococcus faecium)：抗原包括美国专利第6,756,361号中提供的三糖重复序列或其他肠球菌衍生的抗原。

幽门螺杆菌：幽门螺杆菌抗原包括Cag、Vac、Nap、HopX、HopY和/或脲酶抗原。

腐生葡萄球菌(staphylococcus saprophyticus)：抗原包括腐生葡萄球菌抗原的160kDa血凝素。

小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)抗原包括LPS。

大肠杆菌：大肠杆菌抗原可以来源于产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAggEC)、扩散粘附性大肠杆菌(DAEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)和/或肠出血性大肠杆菌(EHEC)。

炭疽杆菌(Bacillus anthracis)(炭疽)：炭疽杆菌抗原任选地是解毒的，并且可以选自A-组分(致死因子(LF)和水肿因子(EF))，这两种组分可以共享称为保护性抗原(PA)的共同B-组分。

鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)(鼠疫)：鼠疫抗原包括F1荚膜抗原。

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)：结核抗原包括脂蛋白、LPS、BCG抗原、任选地配制在阳离子脂质囊泡中的抗原85B(Ag85B)和/或ESAT-6的融合蛋白、结核分枝杆菌(Mtb)异柠檬酸脱氢酶相关抗原和/或MPT51抗原。

立克次氏体(Rickettsia)：抗原包括外膜蛋白，包括外膜蛋白A和/或B(OmpB)。

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)。细菌抗原可以来源于单核细胞增生李斯特菌。

肺炎衣原体：抗原包括WO 02/02606中鉴定的抗原。

霍乱弧菌：抗原包括蛋白酶抗原、LPS(特别是霍乱弧菌II的脂多糖)、O1稻叶O特异性多糖、霍乱弧菌O139、IEM108疫苗的抗原和/或闭塞小带毒素(Zot)。

伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)(伤寒)：抗原包括荚膜多糖，包括缀合物(Vi，即vax-TyVi)。

伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)(莱姆病)：抗原包括脂蛋白(诸如OspA、OspB、Osp C和Osp D)、其他表面蛋白诸如OspE相关蛋白(Erp)、核心蛋白聚糖结合蛋白(诸如DbpA)和抗原性可变的VI蛋白，诸如与P39和P13 VlsE抗原变异蛋白相关的抗原。

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)：抗原包括牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白(OMP)。

克雷伯氏菌：抗原包括OMP，包括OMP A，或任选地与破伤风类毒素缀合的多糖。

本公开内容的其他细菌抗原可以是上述任何一种的荚膜抗原、多糖抗原或蛋白质抗原。其他细菌抗原也可以包括外膜囊泡(OMV)制品。此外，抗原包括任何前述细菌的活的、减毒的和/或纯化的形式。本公开内容的抗原可以来源于革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。本公开内容的抗原可以来源于需氧或厌氧细菌。

另外，任何上述细菌来源的糖(多糖、LPS、LOS或寡糖)可以与另一种剂或抗原，诸如载体蛋白(例如CRM₁₉₇)缀合。这样的缀合可以是通过糖上的羰基部分与蛋白质上的氨基基团的还原胺化而实现的直接缀合，如美国专利第5,360,897号中提供的。可选地，糖可以通过接头诸如琥珀酰胺或其它键来缀合。

病毒抗原

适用于公开的组合物的病毒抗原包括纯化的亚单位制剂，可从病毒分离、纯化或衍生的病毒蛋白，和病毒样颗粒(VLP)。病毒抗原可以来源于在细胞培养物或其他基底上繁殖的病毒。可选地，病毒抗原可以重组表达。病毒抗原包括在病毒生命周期的至少一个阶段暴露在病毒表面上的表位。病毒抗原在多种血清型或分离株间可以是保守的。病毒抗原包括来源于下述一种或更多种病毒的抗原以及下述鉴定的特定抗原实例。

正粘病毒：病毒抗原可以来源于正粘病毒，诸如甲型、乙型和丙型流感病毒。正粘病毒抗原可以选自一种或更多种病毒蛋白，包括血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M1)、膜蛋白(M2)、一种或更多种转录酶组分(PB1、PB2和PA)。在实施方案中，抗原包括HA和NA。

流感抗原可以来源于大流行间(年度)流感毒株。可选地，流感抗原可以衍生自具有引起大流行性大流行爆发潜力的毒株(即，与当前流行毒株中的血凝素相比，具有新血凝素的流感毒株，或在禽类受试者中具有致病性并有在人群中水平传播的潜能的流感毒株，或对人类具有致病性的流感毒株)。

副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒：病毒抗原可以来源于副粘病毒科病毒，诸如肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PIV)和麻疹病毒(麻疹)。

肺病毒：病毒抗原可以来源于肺炎病毒，诸如呼吸道合胞病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒、小鼠肺炎病毒和火鸡鼻气管炎病毒。在实施方案中，肺病毒是RSV。肺病毒抗原可以选自以下蛋白质中的一种或更多种，包括表面蛋白融合(F)、糖蛋白(G)和小疏水蛋白(SH)、基质蛋白M和M2、核衣壳蛋白N、P和L以及非结构蛋白NS1和NS2。肺病毒抗原可以包括F、G和M。肺病毒抗原也可以在嵌合病毒中配制或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合RSV/PIV病毒可以包含RSV和PIV二者的组分。

副粘病毒：病毒抗原可以来源于副粘病毒，诸如副流感病毒1-4型(PIV)、腮腺炎、仙台病毒、猿猴病毒5、牛副流感病毒和新城疫病毒。在实施方案中，副粘病毒是PIV或腮腺炎。副粘病毒抗原可选自下列一种或更多种蛋白质：血凝素-神经氨酸酶(HN)、融合蛋白F1和F2、核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)和基质蛋白(M)。副粘病毒蛋白可包括HN、F1和F2。副粘病毒抗原也可以在嵌合病毒中配制或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合RSV/PIV病毒可以包含RSV和PIV二者的组分。市售腮腺炎疫苗包括单价形式或与麻疹和风疹疫苗(MMR)组合的减毒腮腺炎活疫苗。

麻疹病毒：病毒抗原可以来源于麻疹病毒，诸如麻疹。麻疹病毒抗原可以选自下列蛋白质中的一种或更多种：血凝素(H)、糖蛋白(G)、融合因子(F)、大蛋白(L)、核蛋白(NP)、聚合酶磷蛋白(P)和基质(M)。市售麻疹疫苗包括减毒活麻疹病毒，通常与腮腺炎和风疹(MMR)组合。

小核糖核酸病毒：病毒抗原可以来源于小核糖核酸病毒，诸如肠道病毒、鼻病毒、嗜肝RNA病毒、心脏病毒和口蹄疫病毒。可以使用来源于肠道病毒诸如脊髓灰质炎病毒的抗原。

肠道病毒：病毒抗原可以衍生自肠道病毒，诸如脊髓灰质炎病毒1、2或3型、柯萨奇A病毒1至22和24型、柯萨奇B病毒1至6型、埃可病毒(ECHO)病毒1至9型、11至27型和29至34型以及肠道病毒68至71型。在实施方案中，肠道病毒可以是脊髓灰质炎病毒。肠道病毒抗原可以包括下列衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4中的一种或更多种。市售脊髓灰质炎疫苗包括灭活脊髓灰质炎疫苗(IPV)和口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)。

嗜肝RNA病毒：病毒抗原可以来源于嗜肝RNA病毒，诸如甲型肝炎病毒(HAV)。市售HAV疫苗包括灭活HAV疫苗。

披膜病毒：病毒抗原可以来源于披膜病毒，诸如风疹病毒属病毒(Rubivirus)、甲病毒或动脉病毒。可以使用来源于风疹病毒属病毒的抗原，诸如风疹病毒。披膜病毒抗原可选自E1、E2、E3、C、NSP-1、NSPO-2、NSP-3或NSP-4。披膜病毒抗原包括E1、E2或E3。市售风疹疫苗包括适应寒冷的活病毒，通常与腮腺炎和麻疹疫苗(MMR)组合。

黄病毒：病毒抗原可以来源于黄病毒，诸如蜱传脑炎(TBE)、登革热(1、2、3或4型)、黄热病、日本脑炎、西尼罗脑炎、圣路易斯脑炎、俄罗斯春夏脑炎、波瓦桑脑炎。黄病毒抗原可以选自PrM、M、C、E、NS-1、NS-2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。黄病毒抗原可以包括PrM、M和E。市售的TBE疫苗包括灭活病毒疫苗。

瘟疫病毒：病毒抗原可以来源于瘟疫病毒，诸如牛病毒性腹泻(BVDV)、经典型猪瘟(CSFV)或边境病(BDV)。

嗜肝DNA病毒：病毒抗原可以来源于嗜肝DNA病毒，诸如乙型肝炎病毒。嗜肝DNA病毒可以选自表面抗原(L、M和S)、核心抗原(HBc、HBe)。市售HBV疫苗包括包含表面抗原S蛋白的亚单位疫苗。

丙型肝炎病毒：病毒抗原可以来源于丙型肝炎病毒(HCV)。HCV抗原可以选自E1、E2、E1/E2、NS345多聚蛋白、NS 345核心多聚蛋白、核心和/或来自非结构区的肽中的一种或更多种。

棒状病毒：病毒抗原可以来源于棒状病毒，诸如狂犬病病毒(Lyssavirus，Rabiesvirus)和水泡病毒(VSV)。棒状病毒抗原可以选自糖蛋白(G)、核蛋白(N)、大蛋白(L)、非结构蛋白(NS)。市售狂犬病病毒疫苗包括在人类二倍体细胞或胎恒河猴肺细胞上生长的灭活病毒。

杯状病毒科(Caliciviridae)：病毒抗原可以来源于杯状病毒科，诸如诺沃克病毒，以及诺沃克样病毒，诸如夏威夷病毒和雪山病毒。

冠状病毒：病毒抗原可以来源于冠状病毒、SARS、人类呼吸道冠状病毒、禽传染性支气管炎(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)。冠状病毒抗原可以选自刺突(S)、包膜(E)、基质(M)、核衣壳(N)和血凝素酯酶糖蛋白(HE)。在实施方案中，冠状病毒抗原衍生自SARS病毒。SARS病毒抗原描述于WO 04/92360；

逆转录病毒：病毒抗原可以来源于逆转录病毒，诸如肿瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒。肿瘤病毒抗原可以来源于HTLV-1、HTLV-2或HTLV-5。慢病毒抗原可以来源于HIV-1或HIV-2。逆转录病毒抗原可选自gag、pol、env、tax、tat、rex、rev、nef、vif、vpu和vpr。HIV抗原可以选自gag(p24gag和p55gag)、env(gp160和gp41)、pol、tat、nef、rev、vpu、微蛋白(例如，p55 gag和gp140v delete)。HIV抗原可衍生自下列毒株中的一种或更多种：HIV_IIIb、HIV_SF2、HIV_LAV、HIV_LAI、HIV_MN、HIV-1_CM235、HIV-1_US4。

呼肠孤病毒：病毒抗原可以来源于呼肠孤病毒，诸如正呼肠孤病毒、轮状病毒、环状病毒或Coltivirus。呼肠孤病毒抗原可选自结构蛋白λ1、λ2、λ3、μ1、μ2、σ1、σ2或σ3，或非结构蛋白σNS、μNS或σ1s。呼肠孤病毒抗原可以来源于轮状病毒。轮状病毒抗原可以选自VP1、VP2、VP3、VP4(或裂解产物VP5和VP8)、NSP 1、VP6、NSP3、NSP2、VP7、NSP4或NSP5。轮状病毒抗原可以包括VP4(或裂解产物VP5和VP8)和VP7。参见例如，WO 2005/021033、WO 2003/072716、WO 2002/11540、WO 2001/12797、WO 01/08495、WO 00/26380、WO 02/036172；通过引用以其整体并入本文。

细小病毒：病毒抗原可以来源于细小病毒，诸如细小病毒B19。细小病毒抗原可以选自VP-1、VP-2、VP-3、NS-1和NS-2。在实施方案中，细小病毒抗原是衣壳蛋白VP-2。

丁型肝炎病毒(HDV)：病毒抗原可以来源于HDV，特别是来自HDV的δ-抗原(参见例如，美国专利第5,378,814号)。

戊型肝炎病毒(HEV)：病毒抗原可以来源于HEV。

庚型肝炎病毒(HGV)：病毒抗原可以来源于HGV。

人类疱疹病毒：病毒抗原可以来源于人类疱疹病毒，诸如单纯疱疹病毒(HSV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、人类疱疹病毒6(HHV6)、人类疱疹病毒7(HHV7)和人类疱疹病毒8(HHV8)。人类疱疹病毒抗原可选自立即早期蛋白(α)、早期蛋白(β)和晚期蛋白(γ)。HSV抗原可以来源于HSV-1或HSV-2毒株。HSV抗原可以选自糖蛋白gB、gC、gD和gH、融合蛋白(gB)或免疫逃逸蛋白(gC、gE或gI)。VZV抗原可以选自核心蛋白、核衣壳蛋白、被膜蛋白或包膜蛋白。VZV减毒活疫苗是市售的。EBV抗原可以选自早期抗原(EA)蛋白、病毒衣壳抗原(VCA)和膜抗原(MA)的糖蛋白。CMV抗原可选自衣壳蛋白、包膜糖蛋白(诸如gB和gH)和被膜蛋白。

乳多空病毒：抗原可以来源于乳多空病毒，诸如乳头瘤病毒和多瘤病毒。乳头瘤病毒包括HPV血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63和65。在实施方案中，HPV抗原来源于血清型6、11、16或18。HPV抗原可以包括衣壳蛋白(L1)和(L2)，或E1-E7，或其融合物。多瘤病毒包括BK病毒和JK病毒。多瘤病毒抗原可以选自VP1、VP2或VP3。

圆环病毒：抗原可以来源于圆环病毒，诸如猪圆环病毒(PCV)1、PCV 2、PCV 3和PCV4。

真菌抗原

合适的真菌抗原可以来源于下述一种或更多种真菌。

真菌抗原可来源于皮肤真菌，包括：絮状表皮霉菌(Epidermophyton floccusum)、奥多尼小孢子菌(Microsporum audouini)、犬小孢子菌(Microsporum canis)、扭曲小孢子菌(Microsporum distortum)、马小孢子菌(Microsporum equinum)、Microsporum gypsum、Microsporum nanum、同心毛癣菌(Trichophyton concentricum)、马毛癣菌(Trichophytonequinum)、鸡毛癣菌(Trichophyton gallinae)、石膏毛癣菌(Trichophyton gypseum)、Trichophyton megnini、须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、Trichophytonquinckeanum、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、舍氏毛癣菌(Trichophytonschoenleini)、断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)、疣状毛癣菌(Trichophytonverrucosum)、疣状毛癣菌album变种、疣状毛癣菌discoides变种、疣状毛癣菌ochraceum变种、紫色毛癣菌(Trichophyton violaceum)和/或Trichophyton faviforme。

真菌病原体可衍生自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、萨氏曲霉菌(Aspergillus sydowi)、黄曲霉(Aspergillusflavatus)、灰曲霉(Aspergillus glaucus)、头状芽生裂殖酵母(Blastoschizomycescapitatus)、白色念珠菌(Candida albicans)、烯醇化酶念珠菌(Candida enolase)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、克鲁塞念珠菌(Candidakrusei)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、星状念珠菌(Candida stellatoidea)、克鲁斯念珠菌(Candida kusei)、Candida parakwsei、葡萄念珠菌(Candida lusitaniae)、假热带念珠菌(Candida pseudotropicalis)、Candida guilliermondi、卡氏枝孢霉(Cladosporiumcarrionii)、粗球类芽生菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、棒状地霉(Geotrichumclavatum)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、Pythiumn insidiosum、卵形糠秕孢子菌(Pityrosporumovale)、酿酒酵母、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、粟酒酵母(Saccharomycespombe)、Scedosporium apiosperum、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、贝氏丝孢菌(Trichosporon beigelii)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)、马拉色菌属种(Malassezia spp.)、着色芽生菌属种(Fonsecaea spp.)、Wangiella spp.、孢子丝菌属种(Sporothrix spp.)、蛙粪霉属种(Basidiobolus spp.)、耳霉属种(Conidiobolus spp.)、根霉属种(Rhizopus spp.)、毛霉属种(Mucor spp.)、犁头霉属种(Absidia spp.)、被孢霉属种(Mortierella spp.)、小坎宁安霉属种(Cunninghamella spp.)、Saksenaea spp.、链格孢属种(Alternaria spp.)、弯孢菌属种(Curvularia spp.)、蠕孢属种(Helminthosporium spp.)、镰孢属种(Fusariumspp.)、曲霉属种(Aspergillus spp.)、青霉属种(Penicillium spp.)、Monolinia spp.、丝核菌属种(Rhizoctonia spp.)、拟青霉属种(Paecilomyces spp.)、鼓孢瘤座霉属种(Pithomyces spp.)和枝孢菌属种(Cladosporium spp.)。

产生真菌抗原的方法是本领域熟知的(参见美国专利第6,333,164号)。在一种方法中，从可从其细胞壁已被基本去除或至少部分地去除的真菌细胞获得的不溶性级分提取和分离的溶解级分，其特征在于该方法包括以下步骤：获得活的真菌细胞；获得其细胞壁已被基本去除或至少部分地去除的真菌细胞；使其细胞壁已被基本去除或至少部分地去除的真菌细胞爆裂；获得不溶性级分；以及从所述不溶性级分提取和分离溶解级分。

呼吸道抗原

本文公开的组合物可以包含一种或更多种来源于引起呼吸道疾病的病原体的抗原。例如，呼吸道抗原可以来源于呼吸道病毒，诸如正粘病毒(流感)、肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PIV)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、VZV和冠状病毒(SARS)。呼吸道抗原可以来源于引起呼吸道疾病的细菌，诸如肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、百日咳博德特氏菌、结核分枝杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、炭疽杆菌和卡他莫拉菌。来源于这些病原体的特异性抗原的实例如上所述。

本文公开的免疫原性组合物可以以各种形式制备。例如，组合物可以制备为注射剂，作为液体溶液或悬浮液。也可以制备适合于在注射前溶解在液体媒介物中或悬浮在液体媒介物中的固体形式(例如，冻干组合物或喷雾冻干组合物)。组合物可以制备成用于表面施用，例如作为软膏、乳膏或粉末。组合物可以制备成用于口服施用，例如片剂或胶囊或喷雾剂。组合物可以制备成用于肺部施用，例如作为使用细粉或喷雾剂的吸入器。组合物可以制备为栓剂或阴道环。组合物可制备成用于鼻、耳或眼施用，例如滴剂。这样的药物组合物的制备属于本领域的一般技术。参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,第18版,1990。

组合物可以是试剂盒形式，其被设计成使得组合的组合物在施用到患者之前被重构。这样的试剂盒可以包含一种或更多种液体形式的____抗原或编码这样的抗原的核酸，以及本文所述的任何另外的抗原和佐剂。

所公开的包含多肽抗原的免疫原性组合物是疫苗组合物。这样的组合物的pH在6和8之间，约为7。可以通过使用缓冲液来保持pH。组合物可以是无菌的和/或无热原的。组合物可以相对于受试者是等渗的。根据本公开内容的疫苗可以用于预防或治疗，但通常是预防性的，并且可以用于治疗动物(包括农场、游戏、伴侣和实验室哺乳动物)。

用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的抗原和/或编码抗原的核酸，以及所需的任何其他组分。“免疫有效量”是指以单剂量或系列剂量的一部分对个体施用该量对治疗或预防是有效的。该量根据待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类组(例如，猪、牛等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配方、治疗兽医对医学状况的评估以及其他相关因素而变化。预计该量将落入可通过常规试验确定的相对宽的范围内。

施用

本文公开的组合物通常将直接施用于受试者。直接递送可以通过肠胃外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织的间隙)或粘膜，诸如通过直肠、口服(例如片剂、喷雾剂)、阴道、表面、透皮(参见例如WO 99/27961)或经皮(参见例如WO 02/074244和WO 02/064162)、鼻内(参见例如WO 03/028760)、眼、耳、肺或其他粘膜施用来实现。免疫原性组合物也可以通过直接转移到皮肤表面来表面施用。表面给药可以在不使用任何装置的情况下完成，或者通过使用绷带或类似绷带的装置将裸露的皮肤与免疫原性组合物接触来完成(参见例如，美国专利第6,348,450号)。

在实施方案中，施用模式可以是肠胃外、粘膜或粘膜和肠胃外免疫接种的组合。在一个方面，施用模式是肠胃外、粘膜或粘膜和肠胃外免疫接种的组合，总共接种1-2次，间隔1-3周。在一个方面，施用途径包括但不限于口服递送、肌肉内递送以及口服和肌肉内递送的组合。

已经证明，对抗原诸如幽门螺杆菌抗原的粘膜和全身免疫应答可以通过粘膜初免随后全身加强免疫来增强。在实施方案中，用于治疗ASF病毒感染的方法包括向有相应需要的受试者粘膜施用包含一种或更多种ASF病毒抗原的第一免疫原性组合物，随后肠胃外施用治疗有效量的包含一种或更多种ASF病毒抗原的第二免疫原性组合物。

免疫原性组合物可用于引发全身和/或粘膜免疫，以引发增强的全身和/或粘膜免疫。

在实施方案中，免疫应答的特征在于诱导血清IgG和/或肠IgA免疫应答。

如上所述，可以采用初免-加强方法，其中在“初免”步骤中递送一种或更多种基因递送载体和/或多肽抗原，并且随后在“加强”步骤中递送一种或更多种第二基因递送载体和/或多肽抗原。在某些实施方案中，用本文所述的一种或更多种基因递送载体或多肽抗原初免和加强后，用一种或更多种含多肽的组合物(例如，包含ASF病毒抗原的多肽)进行额外加强。

在涉及共施用的任何方法中，各种组合物可以以任何顺序递送。因此，在包括递送多种不同组合物或分子的实施方案中，核酸不需要全部在多肽之前递送。例如，初免步骤可以包括递送一种或更多种多肽，并且加强包括递送一种或更多种核酸和/或一种或更多种多肽。多个多肽施用之后可以是多个核酸施用，或者多肽和核酸施用可以以任何顺序进行。因此，本文所述的一种或更多种基因递送载体和本文所述的一种或更多种多肽可以以任何顺序和通过任何施用途径共施用。因此，本文所述的多核苷酸和多肽的任何组合可用于引发免疫反应。

剂量方案

剂量治疗可以根据单剂量方案或多剂量方案。在初次免疫方案和/或加强免疫方案中可以使用多剂量。在多剂量方案中，各种剂量可以通过相同或不同的途径给予，例如，肠胃外初免和粘膜加强、粘膜初免和肠胃外加强等。

在实施方案中，剂量方案增强了抗体应答的亲合力，导致具有中和特性的抗体。体外中和测定可用于测试中和性抗体。

有一个强有力的证据表明血清抗体水平和对ASF病毒引起的疾病的保护之间存在相关性。

确定免疫应答效力的试验

评估治疗性治疗的效力的一种方法包括在施用所公开的组合物后监测感染。评估预防性治疗功效的一种方法包括在施用组合物后监测针对所公开的组合物中抗原的免疫应答。

评估本公开内容的免疫原性组合物的组分蛋白的免疫原性的另一种方法是重组表达蛋白，并通过免疫印迹筛选患者血清或粘膜分泌物。蛋白质和患者血清之间的阳性反应表明，患者先前已经对所讨论的蛋白质产生了免疫应答--也就是说，该蛋白质是一种免疫原。该方法也可用于鉴定免疫显性蛋白质和/或表位。

检查治疗性治疗的功效的另一种方法包括在施用本公开内容的组合物后监测感染。检查预防性治疗功效的一种方法包括在施用组合物后，监测针对本公开内容的组合物中抗原的全身(诸如监测IgG1和IgG2a产生的水平)和粘膜(诸如监测IgA产生的水平)免疫应答。典型地，血清特异性抗体应答在免疫接种后但在攻击前确定，而粘膜特异性抗体应答在免疫后和攻击后确定。

本公开内容的免疫原性组合物可以在宿主之前在体外和体内动物模型中评价。特别有用的小鼠模型包括腹膜内免疫后进行腹膜内攻击或鼻内攻击的模型。

本公开内容的免疫原性组合物的功效也可以通过用免疫原性组合物攻击感染的动物模型例如豚鼠或小鼠或恒河猴，在体内确定。免疫原性组合物可以或可以不衍生自与攻击毒株相同的毒株。在实施方案中，免疫原性组合物可以衍生自与攻击毒株相同的毒株。

体内功效模型包括但不限于：(i)使用人类毒株的鼠感染模型；(ii)鼠疾病模型，其是使用小鼠适应毒株的鼠模型，诸如在小鼠中特别毒力的毒株，和(iii)使用人类分离株的灵长类动物模型。由NIH和美国疾病控制中心(CDC)支持的人类攻击模型也是可用的。

免疫应答可以是TH1免疫应答和TH2应答中的一种或二者。免疫应答可以是改进的或增强的或改变的免疫应答。免疫应答可以是全身免疫应答和粘膜免疫应答中的一种或二者。在实施方案中，免疫应答是增强的全身和/或粘膜应答。

增强的全身和/或粘膜免疫反映在增强的TH1和/或TH2免疫应答中。在实施方案中，增强的免疫应答包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA产生的增加。在实施方案中，粘膜免疫应答是TH2免疫应答。在一个方面，粘膜免疫应答包括IgA产生的增加。

活化的TH2细胞增强抗体产生，并且因此在响应细胞外感染方面有价值。活化的TH2细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一种或更多种。TH2免疫应答可导致IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞的产生，用于未来的保护。

TH2免疫应答可以包括以下中的一种或更多种：与TH2免疫应答相关的一种或更多种细胞因子(诸如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)的增加，或IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞产生的增加。在实施方案中，增强的TH2免疫应答将包括IgG1产生的增加。

TH1免疫应答可以包括以下中的一种或更多种：CTL的增加、与TH1免疫应答相关的一种或更多种细胞因子(诸如IL-2、IFNγ和TNFβ)的增加、活化巨噬细胞的增加、NK活性增加或IgG2a产生的增加。在实施方案中，增强的TH1免疫应答将包括IgG2a产生的增加。

本公开内容的免疫原性组合物，特别是包含本公开内容的一种或更多种抗原的免疫原性组合物可以单独使用或与其它抗原组合使用，任选地与能够引发Th1和/或Th2应答的免疫调节剂组合使用。

本公开内容的免疫原性组合物还可以包含一种或更多种免疫调节剂，诸如矿物盐，诸如铝盐和含有CpG基序的寡核苷酸。在实施方案中，免疫原性组合物包含铝盐和含有CpG基序的寡核苷酸。可选地，免疫原性组合物包含ADP核糖基化毒素，诸如解毒的ADP核糖基化毒素和含有CpG基序的寡核苷酸。在一个方面，一种或更多种免疫调节剂包括佐剂。佐剂可以选自由上面进一步讨论的TH1佐剂和TH2佐剂组成的组中的一种或更多种。

本发明组合物的免疫原性组合物可以引发细胞介导的免疫应答以及体液免疫应答二者，以便有效地解决感染。这种免疫应答可诱导持久(例如中和)抗体和细胞介导的免疫，其可在暴露于一种或更多种感染性抗原时快速应答。举例来说，受试者血液样品中中和抗体的证据被认为是保护的替代参数，因为它们的形成对于TBE感染中的病毒消除具有决定性的重要性。

免疫原性组合物作为药物的用途

本公开内容还提供了一种用作药物的组合物。该药物可以能够在哺乳动物中引起免疫应答(即，它是免疫原性组合物)，并且可以是疫苗。本公开内容还提供了本发明组合物在制造用于引起哺乳动物免疫应答的药物中的用途。药物可以是疫苗。在实施方案中，疫苗用于预防和/或治疗肠道感染，诸如肠胃炎，包括急性肠胃炎。胃肠炎可能是由离子和/或水运输的不平衡引起的，导致水样腹泻和/或肠蠕动和/或运动(呕吐)。

本公开内容提供了使用上述组合物诱导或增加免疫应答的方法。免疫应答可以是保护性的，并且可以诱导抗体和/或细胞介导的免疫(包括全身和粘膜免疫)。免疫应答包括加强应答。

本公开内容还提供了一种在哺乳动物中引起免疫应答的方法，包括施用有效量的本公开内容的组合物的步骤。免疫应答可以是保护性的，并且可以涉及抗体和/或细胞介导的免疫。在实施方案中，免疫应答包括TH1免疫应答和TH2免疫应答中的一种或二者。该方法可引起加强应答。

试剂盒

本公开内容还提供包含一个或更多个如本文所述的组合物的容器的试剂盒。组合物可以是液体形式，也可以是冻干的，单个抗原也是如此。用于组合物的合适容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器和测试管。容器可以由各种材料形成，包括玻璃或塑料。容器可以具有无菌进入端口(例如，容器可以是静脉溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。

试剂盒还可以包括第二容器，该第二容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水、Ringer's溶液或右旋糖溶液。它还可以包含对最终用户有用的其他材料，包括其他药学上可接受的配制溶液，诸如缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器或其他递送装置。试剂盒还可以包括包含佐剂的第三组分。

试剂盒还可以包括包含诱导免疫或治疗感染的方法的书面说明的包装插页。包装插页可以是未经批准的草案包装插页，也可以是由美国食品和药物管理局(FDA)或其他监管机构批准的包装插页。

在实施方案中，递送装置预填充有本文公开的免疫原性组合物。

产生ASF病毒特异性抗体的方法

本文所述的ASF病毒多肽可用于分别产生特异性结合ASF病毒抗原/对ASF病毒抗原具有选择性的ASF病毒特异性多克隆抗体和单克隆抗体。多克隆抗体可以通过向哺乳动物诸如小鼠、兔、山羊或马施用ASF病毒多肽来产生。收集来自免疫的动物的血清，并通过例如用硫酸铵沉淀，随后进行层析，包括亲和层析，从血浆纯化抗体。产生和加工多克隆抗血清的技术是本领域已知的。

也可以容易地产生针对多肽中存在的ASF病毒特异性表位的单克隆抗体。来自用ASF病毒多肽免疫的哺乳动物诸如小鼠的正常B细胞可以与例如HAT敏感的小鼠骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。产生ASF病毒特异性抗体的杂交瘤可以使用RIA或ELISA进行鉴定，并通过在半固体琼脂中克隆或通过有限稀释进行分离。通过另一轮筛选分离出产生ASF病毒特异性抗体的克隆。

针对ASF病毒表位的抗体，即单克隆抗体和来自多克隆血清的抗体(多克隆抗体)，对于检测样品中ASF病毒抗原的存在特别有用，诸如来自ASF病毒感染受试者的血清样品。用于ASF病毒抗原的免疫测定可以使用一种抗体或若干种抗体。ASF病毒抗原的免疫测定可以使用例如针对ASF病毒表位的单克隆抗体、针对一种ASF病毒多肽表位的单克隆抗体的组合、针对不同ASF病毒多肽表位的单克隆抗体、针对相同ASF病毒抗原的多克隆抗体、针对不同ASF病毒抗原的多克隆抗体或单克隆抗体和多克隆抗体的组合。免疫测定方案可以基于例如使用例如标记的抗体的竞争、直接反应或夹心型测定。标记可以是例如荧光的、化学发光的或放射性的。

多克隆或单克隆抗体可进一步用于通过免疫亲和柱分离ASF病毒颗粒或抗原。可以通过例如吸附或通过共价连接将抗体附着到固体支持物，从而使抗体保持其免疫选择性活性。任选地，可以包括间隔基团，使得抗体的抗原结合位点保持可及。然后，固定的抗体可用于结合来自生物样品诸如血液或血浆的ASF病毒颗粒或抗原。结合的ASF病毒颗粒或抗原通过例如改变pH从柱基质回收。

本公开内容中引用的所有专利文献通过引用以其整体并入本文。

实施例

实施例1.杆状病毒蛋白亚单位的产生

重组杆状病毒蛋白表达系统是基于靶向的ASF病毒蛋白的核酸序列。最终序列为了在内部(in-house)草地夜蛾昆虫细胞(Sf9)中表达而进行优化，以确保在序列末端存在适当的限制性核酸内切酶位点。

使用pBacPAK8克隆载体(Clontech Laboratories,Inc.,Mountain View,CA)制备含有靶序列的质粒载体。质粒载体包含与线性BestBac 2.0杆状病毒载体(ExpressionSystems,Davis,CA)同源的侧翼序列，使得当含有ASF病毒p30、p30/p54、p72和/或血凝素插入物的质粒与线性BestBac 2.0病毒杆状病毒主链(Expression Systems,Davis,CA)共转染到Sf9细胞中时，同源重组将H3插入物交换为杆状病毒的多面体蛋白基因。然后收获所得到的含有在多面体启蛋白动子控制下表达的ASF病毒序列的杆状病毒。细胞和病毒在从不含动物源成分配制的表达系统(培养基ES 99-300)获得的培养基中生长。从购买的储备溶液(Gibco Cat#15710)加入庆大霉素溶液，最终浓度为10μg/ml。在最后收获时，将感染的培养物离心以去除细胞并收集上清液。上清液通过0.2微米无菌一次性过滤器处理。对预培养物进行滴度以确定最终浓度。

利用玻璃或无菌一次性塑料容器体积将Sf9细胞扩大规模到产生量。当达到产生所需的最终细胞培养体积时，病毒感染发生在与准备细胞的最终传代相同的容器中。培养物混合通过摇动/摇晃容器或利用低剪切型叶轮设计来实现。调节混合速度和强度，以保持细胞悬浮，而不会产生过度剪切或起泡，这将导致细胞破裂。

用终浓度为0.2％-0.3％的β-丙内酯(BPL)灭活病毒液。在灭活之前，使用2-10NNaOH作为碱或10％-38％ HCl或10％硝酸作为酸，将破碎流体(disrupted fluids)的pH调节至7.5-8.0。在加入BPL之前，允许被破坏的流体升温至室温1-18小时。BPL以上述指定的浓度加入，并混合。加入BPL后，利用“从底到底”的转移过程将病毒液转移到灭活容器中，以确保所有液体都与BPL接触。破碎的流体在17-27℃搅拌孵育18-48小时。灭活过程完成后，如上所述，用酸或碱将pH调节至7.0-7.5。灭活的病毒液储存在2-8℃，直到进一步加工。用水/油/水(WOW)佐剂制备抗原。

实施例2.基于ASF抗原的疫苗的现场评价

如上所述制造抗原(即血凝素，SEQ ID NO:17，和p30/p54融合蛋白，SEQ ID NO:6)。

八(8)个商业农场被选入本研究。农场使用的动物来自没有感染ASF的其他农场。

实验设计

纳入、排除和退出标准

本试验中使用的所有动物在试验开始时都是表面上健康的。按照正常的管理实践，任何生病、不健壮或严重创伤或跛行的猪都将被排除在外。

随机化

符合所有纳入标准且没有任何排除标准的猪被随机分配到两个治疗组中的一个或安慰剂组。来自每个治疗组的相等数量的猪和百分之二十五(25)的安慰剂被分配到每个围栏。

患病的处理

按照农场标准操作程序或治疗方案对患病动物进行治疗。注意并记录任何原因的发病率。

收集来自怀疑患有ASF(严重嗜睡、四肢变色等)的动物和/或死亡动物的血液，用于使用快速检测试剂盒初步筛查ASF抗原的存在，并且随后提交相同的血液样品进行确认检测。

治疗组：

个体动物是实验单位。每头猪都被双重标记(每只耳朵一个标记)，并在每个围栏中与来自不同疫苗接种组和对照组的同等数量的猪共混。使用的围栏在一栋单独的建筑物里。

疫苗接种

疫苗接种组中的动物接受两种疫苗中的一种，并给予两剂1mL，两剂之间间隔3周。

血液采集用于血清学检测：

收集数据和结果

从第0天开始，每天监测动物的不良事件，并持续到第二次疫苗接种后21天。记录所有不良事件。特别注意：注射部位的肿胀/炎症、疼痛、发红、脓肿、肿块、病变和发热。要记录的其他观察结果包括但不限于：跛行、缺乏健壮性、厌食和普遍缺乏正常行为。

使用Biochek非洲猪瘟抗体检测试剂盒检测所有血清样品中抗ASF p54抗原抗体的存在。该试验是通过检测对疫苗制剂中p30/p54融合蛋白的p54部分的免疫应答来确定对实验疫苗的血清转化。

使用Ingenza PPA CROM检测所有样品中针对ASF p72抗原的抗体的存在。这用作筛选试验，以检测实验中的动物是否已经暴露于ASF病毒。

使用ID Screen ASF间接ELISA检测所有样品是否存在针对ASF p30(32)、p62和p72抗原的抗体。该试验是通过检测对疫苗制剂中p30/p54融合蛋白的p30部分的免疫应答来确定对实验疫苗的血清转化。

在对研究期间收集的样品进行的3项测定中，其中2项用于评估动物对疫苗接种的免疫应答，即Biocheck和ID筛查。这些测试中的每一项测量了疫苗制剂中p30/p54融合蛋白的不同部分。测量p30(32)抗原的ID筛选测定表现为证明了在研究的疫苗接种过程和观察期期间的免疫应答。

结论

免疫应答

当评估在两个治疗组1和2中施用含有p30/p54融合蛋白的测试疫苗的动物的免疫应答时。可以得出结论，疫苗接种确实导致了对ID筛查间接试剂盒中检测的p30(32)抗原的免疫应答。从研究第21天左右开始，在治疗组1的幼稚农场中检测到抗体存在增加，在研究第42天采血时，两个治疗组之间的抗体浓度非常相似。

基于这些结果，该制剂确实产生了针对ASF抗原的免疫应答。

尽管已经参考上述实例描述了本发明，但应理解，修改和变化包含在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅由所附的权利要求书限制。

序列表

<110> 威斯特有限责任公司，以梅德基因实验室名义营业

<120> 非洲猪瘟(ASF)病毒疫苗

<130> MEDG-A-ASF-PCT

<150> US 63/128,318

<151> 2020-12-21

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1213

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(6)

<223> EcoRI

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(6)

<223> EcoRI限制性位点

<220>

<221> misc_feature

<222> (1159)..(1175)

<223> TEV蛋白酶位点

<220>

<221> misc_feature

<222> (1176)..(1205)

<223> HIS标签+终止密码子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1206)..(1213)

<223> NotI限制性位点

<400> 1

gaattcatgg attctgaatt ttttcaaccg gtttatccgc ggcattatgg tgagtgtttg 60

tcaccagtca ctacaccaag cttcttctcc acacatatgt atactattct cattgctatc 120

gtggtcttag tcatcattat catcgttcta atctacttat tctcttcaag aaagaaaaaa 180

gctgctgcta ttgaggagga agatatacag tttataaatc cttatcaaga tcagcagtgg 240

gtagaagtca ctccacaacc aggtacctct aaaccagctg gagcgactac agcaagtgta 300

ggcaagccag tcacgggcag accggcaaca aacagaccag caacaaacaa accagttacg 360

gacaacccag ttacggacag actagtcatg gcaactggcg ggccggcagc cgctatggat 420

tttattttaa atatatccat gaaaatggag gtcatcttca aaacggattt aagatcatct 480

tcacaagttg tgtttcatgc gggtagcctg tataattggt tttctgttga gattatcaat 540

agcggtagaa ttgttacgac cgctataaaa acattgctta gtactgttaa gtatgatatt 600

gtgaaatctg ctcgtatata tgcagggcaa gggtatactg aacatcaggc tcaagaagaa 660

tggaatatga ttctgcatgt gctgtttgaa gaggagacgg aatcctcagc atcttcggag 720

aacattcatg aaaaaaatga taatgaaacc aatgaatgca catcctcctt tgaaacgttg 780

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aagactgtgc aacatattga acaatatgga aaggcacctg attttaacaa ggttattaga 900

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gccgctagtg ctcctgctca tccggctgag ccttacacga cagtcactac tcagaacact 1080

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gacctagaaa actccttgaa aggcgagaac ctgtattttc aaggccacca tcatcaccat 1200

cactagcggc cgc 1213

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR引物

<400> 2

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<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR引物

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<211> 20

<212> DNA

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<220>

<223> PCR引物

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<210> 5

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<212> DNA

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<220>

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cgctctaaca taccacccta aa 22

<210> 6

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<212> PRT

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 6

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Met Lys Met Glu Val Ile Phe Lys Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln

145 150 155 160

Val Val Phe His Ala Gly Ser Leu Tyr Asn Trp Phe Ser Val Glu Ile

165 170 175

Ile Asn Ser Gly Arg Ile Val Thr Thr Ala Ile Lys Thr Leu Leu Ser

180 185 190

Thr Val Lys Tyr Asp Ile Val Lys Ser Ala Arg Ile Tyr Ala Gly Gln

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

His Glu Lys Asn Asp Asn Glu Thr Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu

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Leu Met Val Ile Lys Leu Leu Lys Lys Ile Ser Phe Tyr Leu Thr Tyr

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Ile Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala His Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr

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gatccttttg gaagacccat tgtacccggc acaaagaatg cgtaccgaaa cttggtttac 540

tactgcgaat accccggaga acgactttat gaaaacgtaa gattcgatgt aaatggaaat 600

tccctagacg aatatagttc ggatgtcacc agcgttgtgc gcaaattttg catcccaggg 660

gataaaatga ctggatataa gcacttggtt ggccaggagg tatcggtgga gggaaccagt 720

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Thr Ala Gly Lys Gln Asp Ile Thr Pro Ile Thr Asp Ala Tyr Thr Leu

290 295 300

Asp Ile Arg Arg Asn Val His Tyr Ser Cys Asn Gly Pro Gln Thr Pro

305 310 315 320

Lys Tyr Tyr Gln Pro Pro Leu Ala Leu Trp Ile Lys Leu Arg Phe Trp

325 330 335

Phe Asn Glu Asn Val Asn Leu Ala Ile Pro Ser Val Ser Ile Pro Phe

340 345 350

Gly Glu Arg Phe Ile Thr Ile Leu Lys Ala Ser Gln Lys Asp Leu Val

355 360 365

Asn Glu Phe Pro Gly Leu Phe Val Arg Gln Ser Arg Phe Ile Ala Gly

370 375 380

Arg Pro Ser Arg Arg Asn Ile Arg Phe Lys Pro Trp Phe Ile Pro Gly

385 390 395 400

Val Ile Asn Glu Ile Ser Leu Thr Asn Asn Glu Leu Tyr Ile Asn Asn

405 410 415

Leu Phe Val Thr Pro Glu Ile His Asn Leu Phe Val Lys Arg Val Arg

420 425 430

Phe Ser Leu Ile Arg Val His Lys Thr Gln Val Thr His Thr Asn Asn

435 440 445

Asn His His Asp Glu Lys Leu Met Ser Ala Leu Lys Trp Pro Ile Glu

450 455 460

Tyr Met Phe Ile Gly Leu Lys Pro Thr Trp Asn Ile Ser Asp Gln Pro

465 470 475 480

Asn His Gln His Arg Asp Trp His Lys Phe Gly His Val Val Asn Ala

485 490 495

Ile Met Gln Pro Thr His His Ala Glu Ile Ser Phe Gln Asp Arg Asp

500 505 510

Thr Ala Leu Pro Asp Ala Cys Ser Ser Ile Ser Asp Ile Ser Pro Val

515 520 525

Thr Tyr Pro Ile Thr Leu Pro Ile Ile Lys Asn Ile Ser Val Thr Ala

530 535 540

His Gly Ile Asn Leu Ile Asp Lys Phe Pro Ser Lys Phe Cys Ser Ser

545 550 555 560

Tyr Ile Pro Phe His Tyr Gly Gly Asn Ala Ile Lys Thr Pro Asp Asp

565 570 575

Pro Gly Ala Met Met Ile Thr Phe Ala Leu Lys Pro Arg Glu Glu Tyr

580 585 590

Gln Pro Ser Gly His Ile Asn Val Ser Arg Ala Arg Glu Phe Tyr Ile

595 600 605

Ser Trp Asp Thr Asp Tyr Val Gly Ser Ile Thr Thr Ala Asp Leu Val

610 615 620

Val Ser Ala Ser Ala Ile Asn Phe Leu Leu Leu Gln Asn Gly Ser Ala

625 630 635 640

Val Leu Arg Tyr Ser Thr Lys Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly His

645 650 655

His His His His His

660

<210> 9

<211> 664

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 9

gaattcatgg attttatttt aaatatatcc atgaaaatgg aggtcatctt caaaacggat 60

ttaagatcat cttcacaagt tgtgtttcat gcgggtagcc tgtataattg gttttctgtt 120

gagattatca atagcggtag aattgttacg accgctataa aaacattgct tagtactgtt 180

aagtatgata ttgtgaaatc tgctcgtata tatgcagggc aagggtatac tgaacatcag 240

gctcaagaag aatggaatat gattctgcat gtgctgtttg aagaggagac ggaatcctca 300

gcatcttcgg agaacattca tgaaaaaaat gataatgaaa ccaatgaatg cacatcctcc 360

tttgaaacgt tgtttgagca agagccctca tcggaggtac ctaaagactc caagctgtat 420

atgcttgcac aaaagactgt gcaacatatt gaacaatatg gaaaggcacc tgattttaac 480

aaggttatta gagcacataa ttttattcaa accatttatg gaacccctct aaaggaagaa 540

gaaaaagagg tggtaagact catggttatt aaacttttaa aaaaaataag cttttatctc 600

acctacatta aaggcgagaa cctgtatttt caaggccacc atcatcacca tcactagcgg 660

ccgc 664

<210> 10

<211> 216

<212> PRT

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 10

Met Asp Phe Ile Leu Asn Ile Ser Met Lys Met Glu Val Ile Phe Lys

1 5 10 15

Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln Val Val Phe His Ala Gly Ser Leu

20 25 30

Tyr Asn Trp Phe Ser Val Glu Ile Ile Asn Ser Gly Arg Ile Val Thr

35 40 45

Thr Ala Ile Lys Thr Leu Leu Ser Thr Val Lys Tyr Asp Ile Val Lys

50 55 60

Ser Ala Arg Ile Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala Gln

65 70 75 80

Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr Glu

85 90 95

Ser Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile His Glu Lys Asn Asp Asn Glu Thr

100 105 110

Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro Ser

115 120 125

Ser Glu Val Pro Lys Asp Ser Lys Leu Tyr Met Leu Ala Gln Lys Thr

130 135 140

Val Gln His Ile Glu Gln Tyr Gly Lys Ala Pro Asp Phe Asn Lys Val

145 150 155 160

Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln Thr Ile Tyr Gly Thr Pro Leu Lys

165 170 175

Glu Glu Glu Lys Glu Val Val Arg Leu Met Val Ile Lys Leu Leu Lys

180 185 190

Lys Ile Ser Phe Tyr Leu Thr Tyr Ile Lys Gly Glu Asn Leu Tyr Phe

195 200 205

Gln Gly His His His His His His

210 215

<210> 11

<211> 613

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 11

gaattcatgg attctgaatt ttttcaaccg gtttatccgc ggcattatgg tgagtgtttg 60

tcaccagtca ctacaccaag cttcttctcc acacatatgt atactattct cattgctatc 120

gtggtcttag tcatcattat catcgttcta atctatctat tctcttcaag aaagaaaaaa 180

gctgctgcta ttgaggagga agatatacag tttataaatc cttatcaaga tcagcagtgg 240

gtagaagtca ctccacaacc aggtacctct aaaccagctg gagcgactac agcaagtgta 300

ggcaagccag tcacgggcag accggcaaca aacagaccag caacaaacaa accagttacg 360

gacaacccag ttacggacag actagtcatg gcaactggcg ggccggctgc tgcacctgca 420

gctgcgagtg ctcctgctca tccggctgag ccttacacga cagtcactac tcagaacact 480

gcttcacaaa caatgtcggc tattgaaaat ttacgacaaa gaaacaccta tacgcataaa 540

gacctagaaa actccttgaa aggcgagaac ctgtattttc aaggccacca tcatcaccat 600

cactagcggc cgc 613

<210> 12

<211> 199

<212> PRT

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 12

Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu

1 5 10 15

Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe Phe Ser Thr His Met Tyr

20 25 30

Thr Ile Leu Ile Ala Ile Val Val Leu Val Ile Ile Ile Ile Val Leu

35 40 45

Ile Tyr Leu Phe Ser Ser Arg Lys Lys Lys Ala Ala Ala Ile Glu Glu

50 55 60

Glu Asp Ile Gln Phe Ile Asn Pro Tyr Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu

65 70 75 80

Val Thr Pro Gln Pro Gly Thr Ser Lys Pro Ala Gly Ala Thr Thr Ala

85 90 95

Ser Val Gly Lys Pro Val Thr Gly Arg Pro Ala Thr Asn Arg Pro Ala

100 105 110

Thr Asn Lys Pro Val Thr Asp Asn Pro Val Thr Asp Arg Leu Val Met

115 120 125

Ala Thr Gly Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala

130 135 140

His Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser

145 150 155 160

Gln Thr Met Ser Ala Ile Glu Asn Leu Arg Gln Arg Asn Thr Tyr Thr

165 170 175

His Lys Asp Leu Glu Asn Ser Leu Lys Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln

180 185 190

Gly His His His His His His

195

<210> 13

<211> 1083

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 13

atgataatac ttattttttt aatattttct aacatagttt taagtattga ttattgggtt 60

agttttaata aaacaataat tttagatagt aatattacta atgataataa tgatataaat 120

ggagtatcat ggaatttttt taataattct tttaatacac tagctacatg tggaaaagca 180

ggtaactttt gtgaatgttc taattatagt acatcaatat ataatataac aaataattgt 240

agcttaacta tttttcctca taatgatgta tttgatacaa catatcaagt agtatggaat 300

caaataatta attatacaat aaaattatta acacctgcta ctcccccaaa tatcacatat 360

aattgtacta attttttaat aacatgtaaa aaaaataatg gaacaaacac taatatatat 420

ttaaatataa atgatacttt tgttaaatat actaatgaaa gtatacttga atataactgg 480

aataatagta acattaacaa ttttacagct acatgtataa ttaataatac aattagtaca 540

tctaatgaaa caacacttat aaattgtact tatttaacat tgtcatctaa ctatttttat 600

acttttttta aattatatta tattccatta agcatcataa ttgggataac aataagtatt 660

cttcttatat ccatcataac ttttttatct ttacgaaaaa gaaaaaaaca tgttgaagaa 720

atagaaagtc caccacctga atctaatgaa gaagaacaat gtcagcatga tgacaccact 780

tccatacatg aaccatctcc cagagaacca ttacttccta agccttacag tcgttatcag 840

tataatacac ctatttacta catgcgtccc tcaacacaac cactcaaccc atttccctta 900

cctaaaccgt gtcctccacc caaaccatgt ccgccaccca aaccatgtcc tccacctaaa 960

ccatgtcctt cagctgaatc ctattctcca cccaaaccac tacctagtat cccgctacta 1020

cccaatatcc cgccattatc tacccaaaat atttcgctta ttcacgtaga tagaattatt 1080

taa 1083

<210> 14

<211> 1160

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(15)

<223> EcoRI限制性位点

<220>

<221> misc_feature

<222> (1096)..(1122)

<223> TEV限制性位点

<220>

<221> misc_feature

<222> (1123)..(1143)

<223> HIS标签+终止密码子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1151)..(1156)

<223> NotI限制性位点

<400> 14

ggacctaagg aattcatgat aattctgatc tttttgatat tcagtaatat cgtgttatcg 60

atagactact gggtgtcttt caataagact atcattttag actcaaacat taccaatgac 120

aacaacgata tcaatggagt ctcttggaat ttttttaaca acagtttcaa cactcttgca 180

acttgcggga aggctggtaa tttttgtgag tgtagcaact actccacgtc tatctataat 240

attacaaata actgttcatt gactattttt cctcataacg acgtattcga cacaacatac 300

caggtagtgt ggaatcaaat aataaattac actatcaaac ttctgacacc ggcgacgccc 360

cccaacatca catataattg tacgaatttc cttataacat gcaaaaagaa caacggtacc 420

aatactaata tctacctgaa catcaacgat accttcgtta aatatactaa tgagtcgatc 480

ttagagtaca actggaacaa ttctaatatt aacaatttta ctgccacttg tataataaat 540

aacactataa gtacgtccaa tgagaccacg cttatcaact gcacatattt gacactatct 600

tctaactatt tttatacgtt ttttaagttg tattatatcc ctctgtcaat catcataggg 660

ataacaatca gcatacttct catttcaatt atcacttttt taagccttcg taaacgcaag 720

aagcatgtgg aagaaataga atctcctccg ccggagagca atgaagagga acaatgtcag 780

catgacgata caacatcaat ccatgagcca tcgcctagag agccactgct gcccaaacct 840

tattcacgtt atcaatacaa tacgccaata tattacatgc gccctagcac acagccacta 900

aatccgtttc cgctgccgaa gccgtgtcca ccccctaagc cgtgcccacc gcctaaaccc 960

tgccctcctc ccaagccatg tccctcggca gagtcatatt ccccacctaa gcccttaccg 1020

tccatccctc tgctaccaaa tatacctccc ctgagtaccc aaaatatttc cttaatccat 1080

gtagaccgaa tcatcaaggg cgaaaacttg tactttcaag gccatcacca tcaccatcac 1140

taggcggccg caattgccaa 1160

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR引物

<400> 15

cggcggagga gattctattt 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR引物

<400> 16

tccaatgaga ccacgcttat c 21

<210> 17

<211> 375

<212> PRT

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 17

Met Ile Ile Leu Ile Phe Leu Ile Phe Ser Asn Ile Val Leu Ser Ile

1 5 10 15

Asp Tyr Trp Val Ser Phe Asn Lys Thr Ile Ile Leu Asp Ser Asn Ile

20 25 30

Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe Phe Asn

35 40 45

Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn Phe Cys

50 55 60

Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn Asn Cys

65 70 75 80

Ser Leu Thr Ile Phe Pro His Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr Tyr Gln

85 90 95

Val Val Trp Asn Gln Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu Thr Pro

100 105 110

Ala Thr Pro Pro Asn Ile Thr Tyr Asn Cys Thr Asn Phe Leu Ile Thr

115 120 125

Cys Lys Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ile Asn

130 135 140

Asp Thr Phe Val Lys Tyr Thr Asn Glu Ser Ile Leu Glu Tyr Asn Trp

145 150 155 160

Asn Asn Ser Asn Ile Asn Asn Phe Thr Ala Thr Cys Ile Ile Asn Asn

165 170 175

Thr Ile Ser Thr Ser Asn Glu Thr Thr Leu Ile Asn Cys Thr Tyr Leu

180 185 190

Thr Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Tyr Thr Phe Phe Lys Leu Tyr Tyr Ile

195 200 205

Pro Leu Ser Ile Ile Ile Gly Ile Thr Ile Ser Ile Leu Leu Ile Ser

210 215 220

Ile Ile Thr Phe Leu Ser Leu Arg Lys Arg Lys Lys His Val Glu Glu

225 230 235 240

Ile Glu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Asn Glu Glu Glu Gln Cys Gln His

245 250 255

Asp Asp Thr Thr Ser Ile His Glu Pro Ser Pro Arg Glu Pro Leu Leu

260 265 270

Pro Lys Pro Tyr Ser Arg Tyr Gln Tyr Asn Thr Pro Ile Tyr Tyr Met

275 280 285

Arg Pro Ser Thr Gln Pro Leu Asn Pro Phe Pro Leu Pro Lys Pro Cys

290 295 300

Pro Pro Pro Lys Pro Cys Pro Pro Pro Lys Pro Cys Pro Pro Pro Lys

305 310 315 320

Pro Cys Pro Ser Ala Glu Ser Tyr Ser Pro Pro Lys Pro Leu Pro Ser

325 330 335

Ile Pro Leu Leu Pro Asn Ile Pro Pro Leu Ser Thr Gln Asn Ile Ser

340 345 350

Leu Ile His Val Asp Arg Ile Ile Lys Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln

355 360 365

Gly His His His His His His

370 375

Claims (20)

1.一种用于产生非洲猪瘟(ASF)病毒衍生的免疫原性多肽和/或肽的方法，其中任选地，所述免疫原性多肽和/或肽与一种或更多种佐剂混合或共表达。

2.根据权利要求1所述的方法，包括在诱导所述多肽和/或肽表达的条件下培养被核酸转化的宿主细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述免疫原性多肽和/或肽组成重组亚单位疫苗，并且其中这样表达的多肽和/或肽使用杆状病毒/昆虫细胞方法产生。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽和/或肽包含SEQ ID NO:6、8、10、12、17中所列的氨基酸序列或其组合。

5.根据权利要求2所述的方法，其中编码所述ASF病毒衍生的免疫原性多肽和/或肽的核酸通过化学合成来制备。

6.根据权利要求5所述的方法，其中编码所述ASF衍生的免疫原性多肽和/或肽的核酸使用基于引物的扩增方法产生。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述基于引物的扩增方法是PCR。

8.一种免疫原性组合物，包含SEQ ID NO:6、8、10、12、17中所列的多肽或其组合。

9.一种在受试者中引发免疫应答的方法，包括施用权利要求8所述的组合物。

10.根据权利要求9所述的方法，还包括施用佐剂。

11.根据权利要求10所述的方法，其中通过表面、肠胃外或粘膜施用向所述受试者施用所述免疫原性组合物。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述施用是通过多次施用。

13.根据权利要求12所述的方法，其中第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物是相同的。

14.根据权利要求12所述的方法，其中第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物是不同的。

15.一种用于治疗非洲猪瘟病毒感染的方法，包括向有相应需要的受试者施用治疗有效量的权利要求8的免疫原性组合物。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述组合物包含ASF病毒p30/p54融合蛋白。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述组合物包含ASF病毒血凝素蛋白。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述组合物包括施用包含ASF病毒p30/p54融合蛋白和ASF病毒血凝素蛋白的组合物。

19.根据权利要求15所述的方法，其中所述受试者是猪。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述蛋白基本上同时或顺序施用。