CN116284260B - 一种非洲猪瘟多组分亚单位疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟多组分亚单位疫苗及其制备方法与应用，涉及包括抗原的疫苗或医药配制品领域。本发明所要解决的技术问题是如何预防非洲猪瘟。为了解决该技术问题，本发明提供了用于预防非洲猪瘟的蛋白质组合物，包括SEQ IDNo.1‑4所示的蛋白质，本发明还公开了包括SEQ ID No.5‑8所示融合蛋白质的融合蛋白组合物及由其制备的非洲猪瘟多组分亚单位疫苗。本发明的疫苗在4℃可稳定储存6个月以上，能够满足产业化应用，同时具备免疫原性强、安全性好、高效、质量可控、不存在免疫干扰、不存在导致病毒变异的生物安全隐患、能够同时诱导体液免疫和细胞免疫的优点，可有效预防和保护猪免受非洲猪瘟病毒的感染。

Description

一种非洲猪瘟多组分亚单位疫苗及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域，涉及包括抗原的疫苗或医药配制品领域，具体涉及一种非洲猪瘟多组分亚单位疫苗及其制备方法与应用。
背景技术
非洲猪瘟(Africa Swine Fever，ASF)是由ASF病毒(African Swine FeverVirus，ASFV)引起的一种高致死率的猪出血性疾病，而在野猪宿主中无症状。该病在没有有效疫苗预防控制的情况下，对养猪业所造成的重大经济损失是不可避免的。作为世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health，OIE)要求必须报告的一类疫病，非洲猪瘟在我国被列为一类动物疫病。
ASFV是一种大型胞浆内复制、分子结构复杂的双链DNA病毒，是Asfarviridae家族的唯一成员。病毒基因组由单分子线性、共价闭端双链DNA组成。不同分离株的基因组长度在170到193kbp之间，编码151到167个开放阅读框。ASFV主要衣壳蛋白p72(pB646L)是病毒体最主要的结构成分，约占病毒体总质量的31％～33％，识别p72的单克隆抗体可中和毒性ASFV分离株。p72蛋白具有良好的反应原性和抗原性，表达于ASFV感染晚期，是构成病毒衣壳的重要成分。p12(12kDa)是一种预测的跨膜蛋白，由O61R基因编码。对不同病毒株的蛋白p12的氨基酸序列进行比较，发现该多肽具有高度的保守性，纯化的重组病毒蛋白p12可阻断病毒颗粒与易感细胞的特异性结合。p54(E183L)蛋白是病毒存活和将前体募集到组装位点所必需的，具有很强的免疫原性。CD2v蛋白(pEP402R)是唯一已知的细胞CD2分子同源物，CD2是一种参与细胞激活共同调节的T细胞蛋白。CD2v是介导ASFV感染细胞对猪红细胞吸附的必要和充分条件。
IFN-α与细胞上的IFN-α受体结合后能够诱导具有抗病毒作用的干扰素诱导基因的产生，从而发挥抗病毒作用，同时IFN-α也具有一定的免疫调节功能。IL-2能够有效增强体液免疫和细胞免疫，参与调解机体免疫应答反应，显著增强疫苗的免疫保护效力，在疫苗研发中具有非常重要的实用和理论意义。抗体Fc片段可以促进抗原呈递，与其他类型的疫苗相比，该类抗原-Fc融合蛋白疫苗具有更高的安全性和更高的成本效益。
目前已经证实，ASF的灭活疫苗不能提供有效保护，ASF减毒活疫苗虽然可提供较好的同源保护，但尚存在潜在的生物安全问题，且生产成本较高，生产工艺可控性较差。ASF亚单位疫苗研究尚处于探索阶段，p72、p30、p54、CD2v等几种非洲猪瘟病毒蛋白可在免疫猪体内诱导体液免疫反应，已有研究者探索了基于多组分混合亚单位疫苗(公开号为CN111658768A)，这些疫苗可诱导较好的体液免疫，但仍然难以抵抗强毒攻击，可能是因为疫苗不能有效地激活细胞免疫，不能提供完全的免疫攻毒保护作用。由于ASFV复杂的免疫逃逸机制和庞大的基因结构，目前非洲猪瘟的防控还没有安全、有效的疫苗，探索和开发更安全、更有效的ASF亚单位疫苗已成为ASF防控中亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何预防非洲猪瘟。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了用于预防非洲猪瘟的蛋白质组合物，所述蛋白质组合物可包括蛋白质tCD2v、tp54、tp12和p72，所述tCD2v可为氨基酸序列是SEQID No.1的蛋白质；所述tp54可为氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；所述tp12可为氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；所述p72可为氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质。
进一步地，所述蛋白质组合物可由蛋白质tCD2v、tp54、tp12和p72组成，所述tCD2v可为氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；所述tp54可为氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；所述tp12可为氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；所述p72可为氨基酸序列是SEQ IDNo.4的蛋白质。
所述tCD2v可为非洲猪瘟病毒外膜蛋白(表面囊膜蛋白)CD2v(pEP402R)的截短蛋白，即CD2v蛋白的胞外域部分(CD2v蛋白全长氨基酸序列中第16-206位氨基酸)。
所述tp54可为非洲猪瘟病毒内膜蛋白p54的截短蛋白，即去除了跨膜区的p54蛋白。
所述tp12可为非洲猪瘟病毒结构蛋白p12的截短蛋白，即去除了跨膜区的p12蛋白。
所述p72可为非洲猪瘟病毒核衣壳蛋白p72的全长蛋白。
所述CD2v、p54、p12和p72均来源于非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)，是非洲猪瘟病毒(ASFV)的结构蛋白。
本发明还提供了所述蛋白质组合物在制备用于预防非洲猪瘟的融合蛋白组合物或非洲猪瘟疫苗中的应用。
本发明还提供了用于预防非洲猪瘟的融合蛋白组合物，所述融合蛋白组合物可包括将所述tCD2v、tp54、tp12和p72分别与IFN-α、IL-2(IL2)和Fc片段中的一种或两种融合得到的融合蛋白。
进一步地，所述融合蛋白组合物可由将所述tCD2v、tp54、tp12和p72分别与IFN-α、IL-2(IL2)和Fc片段中的一种或两种融合得到的融合蛋白组成。
进一步地，所述融合可为将IFN-α、IL-2或Fc片段直接或者通过接头(linker)连接(融合)至所述tCD2v、tp54、tp12和/或p72的N端或C端。
进一步地，所述融合可为将IFN-α、IL-2和Fc片段中的任意两种直接或者通过接头(linker)连接(融合)至所述tCD2v、tp54、tp12和/或p72的N端和C端。
进一步地，所述融合蛋白组合物可包括融合蛋白IFN-CD2v-Fc、IL2-p54-Fc、p12-Fc和p72-IFN，所述IFN-CD2v-Fc可为在SEQ ID No.1所示的tCD2v的N端融合IFN-α，C端融合Fc片段得到的融合蛋白；所述IL2-p54-Fc可为在SEQ ID No.2所示的tp54的N端融合IL2，C端融合Fc片段得到的融合蛋白；所述p12-Fc可为在SEQ ID No.3所示的tp12的N端融合人IL-10分泌信号肽，C端融合Fc片段得到的融合蛋白；所述p72-IFN可为在SEQ ID No.4所示的p72的C端融合IFN-α得到的融合蛋白。
进一步地，所述融合蛋白组合物可由融合蛋白IFN-CD2v-Fc、IL2-p54-Fc、p12-Fc和p72-IFN组成，所述IFN-CD2v-Fc可为在SEQ ID No.1所示的tCD2v的N端融合IFN-α，C端融合Fc片段得到的融合蛋白；所述IL2-p54-Fc可为在SEQ ID No.2所示的tp54的N端融合IL2，C端融合Fc片段得到的融合蛋白；所述p12-Fc可为在SEQ ID No.3所示的tp12的N端融合人IL-10分泌信号肽，C端融合Fc片段得到的融合蛋白；所述p72-IFN可为在SEQ ID No.4所示的p72的C端融合IFN-α得到的融合蛋白。
进一步地，所述Fc片段可为猪IgG1a的Fc片段。
进一步地，所述Fc片段可为猪IgG1a的Fc片段去除CH1，仅保留铰链区和CH2、CH3，命名为Fc-23。
进一步地，所述猪IgG1a的Fc片段(Fc-23)的氨基酸序列可为SEQ ID No.5的第376-605位。
进一步地，所述IFN-α可为猪IFN-α。
进一步地，所述IFN-α可为将所述猪IFN-α的信号肽替换为人IL-10分泌信号肽得到的蛋白质，命名为IFN-α-10。
进一步地，所述IFN-α-10的氨基酸序列可为SEQ ID No.5的第1-184位。
进一步地，所述IL-2可为猪IL-2。
进一步地，所述IL-2可为将所述猪IL-2的信号肽替换为人IL-10分泌信号肽得到的蛋白质，命名为IL-2-10。
进一步地，所述IL-2-10的氨基酸序列可为SEQ ID No.6的第1-152位。
进一步地，所述人IL-10分泌信号肽的氨基酸序列可为SEQ ID No.5的第1-18位。
其中，猪IFN-α和猪IL-2作为细胞因子佐剂与所述tCD2v、tp54、tp12和/或p72融合。
进一步地，所述融合蛋白组合物中，所述融合蛋白IFN-CD2v-Fc可为下述任一种蛋白质：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质；
A2)在A1)所示的蛋白质的羧基端和/或氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白质；
所述融合蛋白IL2-p54-Fc可为下述任一种蛋白质：
A3)氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质；
A4)在A3)所示的蛋白质的羧基端和/或氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白质；
所述融合蛋白p12-Fc可为下述任一种蛋白质：
A5)氨基酸序列是SEQ ID No.7的蛋白质；
A6)在A5)所示的蛋白质的羧基端和/或氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白质；
所述融合蛋白p72-IFN可为下述任一种蛋白质：
A7)氨基酸序列是SEQ ID No.8的第1-816位或SEQ ID No.8的蛋白质；
A8)在A7)所示的蛋白质的羧基端和/或氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白质。
其中，SEQ ID No.5的第1-18位为人IL-10分泌信号肽，第19-184位为猪IFN-α(无信号肽的猪IFN-α)，第185-188位为柔性接头(linker)GGGS，第189-379位为tCD2v蛋白(SEQID No.1)，第380-609位为猪IgG1a的Fc区域。
SEQ ID No.6的第1-18位为人IL-10分泌信号肽，第19-152位为猪IL-2(无信号肽的猪IL-2)，第153-156位为柔性接头(linker)GGGS，第157-319位为tp54蛋白(SEQ IDNo.2)，第320-549位为猪IgG1a的Fc区域。
SEQ ID No.7的第1-18位为人IL-10分泌信号肽，第19-55位为tp12蛋白(SEQ IDNo.3)，第56-285位为猪IgG1a的Fc区域。
SEQ ID No.8的第1-646位为p72蛋白(SEQ ID No.4)，第647-650位为柔性接头(linker)GGGS，第651-816位为猪IFN-α。为了便于融合蛋白p72-IFN的分离纯化，在融合蛋白p72-IFN的C端通过柔性接头(linker)GGGS(SEQ ID No.8的第817-820位)连接His标签(HHHHHH，SEQ ID No.8的第821-826位)，得到带有His标签的融合蛋白p72-IFN。
进一步地，所述融合蛋白包括所述融合蛋白本身以及与所述融合蛋白具有80％以上的同一性且具有相同功能的任何功能等同蛋白。
本领域技术人员所知晓的是，为了使蛋白质便于纯化或检测，可在蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白，所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。连接了标签蛋白的融合蛋白质，均是衍生于本发明的蛋白质并且等同于本发明的蛋白质。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对编码本发明融合蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的融合蛋白的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码本发明融合蛋白且具有本发明融合蛋白的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本发明还提供了用于预防非洲猪瘟的生物材料，所述生物材料可为下述任一种：
B1)核酸分子组合物，所述核酸分子组合物可包括编码所述IFN-CD2v-Fc的核酸分子、编码所述IL2-p54-Fc的核酸分子、编码所述p12-Fc的核酸分子、编码所述p72-IFN的核酸分子；
B2)表达所述融合蛋白组合物的重组载体组合物或重组载体；
B3)表达所述融合蛋白组合物的重组微生物组合物或重组微生物；
B4)表达所述融合蛋白组合物的重组细胞组合物或重组细胞。
进一步地，上述生物材料中，B1)中所述核酸分子组合物可由分别编码所述IFN-CD2v-Fc的核酸分子、编码所述IL2-p54-Fc的核酸分子、编码所述p12-Fc的核酸分子、编码所述p72-IFN的核酸分子组成。
上述生物材料中，B1)中所述核酸分子组合物可为下述任一种：
H1)包括核苷酸序列分别是SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ IDNo.12的第1-2448位的DNA分子的核酸分子组合物；
H2)包括核苷酸序列分别是SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ IDNo.12的DNA分子的核酸分子组合物。
进一步地，上述生物材料中，B1)中所述核酸分子组合物可由核苷酸序列分别是SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12(或SEQ ID No.12的第1-2448位)的DNA分子组成。
SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12(或SEQ ID No.12的第1-2448位)所示的DNA分子可为通过密码子优化得到的DNA分子，分别命名为nCD2v、np54、np12和np72。
SEQ ID No.9所示的DNA分子(nCD2v基因)编码氨基酸序列是SEQ ID No.5的融合蛋白IFN-CD2v-Fc。
SEQ ID No.10所示的DNA分子(np54基因)编码氨基酸序列是SEQ ID No.6的融合蛋白IL2-p54-Fc。
SEQ ID No.11所示的DNA分子(np12基因)编码氨基酸序列是SEQ ID No.7的融合蛋白p12-Fc。
SEQ ID No.12所示的DNA分子(np72基因)编码氨基酸序列是SEQ ID No.8的融合蛋白p72-IFN(带有His标签)。
SEQ ID No.12的第1-2448位所示的DNA分子(np72基因)编码氨基酸序列是SEQ IDNo.8的第1-816位的融合蛋白p72-IFN(不带His标签)。
本文所述核酸分子可以是DNA或mRNA，包括在本发明所述核苷酸分子序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子或与本发明所述核酸分子序列一致性为90％以上且来源相同种属的核酸分子。通过常规技术，如PCR方法、重组法或人工合成的方法，本领域技术人员可以很容易获得本发明所述的核酸分子。
进一步地，B2)中所述重组载体组合物可包括分别含有编码氨基酸序列如SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8(或SEQ ID No.8的第1-816位)所示蛋白质的核酸分子的重组载体；或B2)中所述重组载体组合物可由分别含有编码氨基酸序列如SEQID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8(或SEQ ID No.8的第1-816位)所示蛋白质的核酸分子的重组载体组成。
进一步地，B2)中所述重组载体组合物可包括分别含有SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12(或SEQ ID No.12的第1-2448位)所示DNA分子的重组载体；或B2)中所述重组载体组合物可由分别含有SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11和SEQ ID No.12(或SEQ ID No.12的第1-2448位)所示DNA分子的重组载体组成。
进一步地，B2)中所述重组载体可含有编码氨基酸序列如SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8(或SEQ ID No.8的第1-816位)所示蛋白质的核酸分子。
进一步地，B2)中所述重组载体可含有SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12(或SEQ ID No.12的第1-2448位)所示的DNA分子。
进一步地，B3)中述重组微生物组合物可包括分别含有编码氨基酸序列如SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8(或SEQ ID No.8的第1-816位)所示蛋白质的核酸分子的重组微生物；或B3)中所述重组微生物组合物可由分别含有编码氨基酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8(或SEQ ID No.8的第1-816位)所示蛋白质的核酸分子的重组微生物组成。
进一步地，B3)中所述重组微生物组合物可包括分别含有SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12(或SEQ ID No.12的第1-2448位)所示DNA分子的重组微生物；或B3)中所述重组微生物组合物可由分别含有SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11和SEQ ID No.12(或SEQ ID No.12的第1-2448位)所示DNA分子的重组微生物组成。
进一步地，B3)中所述重组微生物可含有编码氨基酸序列如SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8(或SEQ ID No.8的第1-816位)所示蛋白质的核酸分子。
进一步地，B3)中所述重组微生物可含有SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11和SEQ ID No.12(或SEQ ID No.12的第1-2448位)所示的DNA分子。
进一步地，B4)中述重组细胞组合物可包括分别含有编码氨基酸序列如SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8(或SEQ ID No.8的第1-816位)所示蛋白质的核酸分子的重组细胞；或B4)中所述重组细胞组合物可由分别含有编码氨基酸序列如SEQID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8(或SEQ ID No.8的第1-816位)所示蛋白质的核酸分子的重组细胞组成。
进一步地，B4)中所述重组细胞组合物可包括分别含有SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12(或SEQ ID No.12的第1-2448位)所示DNA分子的重组细胞；或B4)中所述重组细胞组合物可由分别含有SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11和SEQ ID No.12(或SEQ ID No.12的第1-2448位)所示DNA分子的重组细胞组成。
进一步地，B4)中所述重组细胞可含有编码氨基酸序列如SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8(或SEQ ID No.8的第1-816位)所示蛋白质的核酸分子。
进一步地，B4)中所述重组细胞可含有SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12(或SEQ ID No.12的第1-2448位)所示的DNA分子。
本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、狂犬病病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、杆状病毒或痘苗病毒等)，只要能在宿主细胞中稳定复制，任何质粒和载体都可使用。本领域技术人员可利用DNA重组技术等一系列技术，构建含本发明所述核酸分子组合物、合适的转录和翻译调控序列、启动子及选择性标记基因等特定元件的表达载体。在本发明的实施方案中，所述载体具体可为pcDNA3.4载体和/或pET-32a(+)载体。
本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。在本发明的实施方案中，所述微生物具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。
本文所述细胞是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于：真核细胞(如酵母细胞、曲霉菌)、动物细胞(如哺乳动物细胞、昆虫细胞)或原核细胞(如大肠杆菌或枯草杆菌)。在本发明的实施方案中，所述细胞具体可为HEK293悬浮细胞。
B2)中所述重组载体组合物包括pcDNA3.4-nCD2v、pcDNA3.4-np54、pcDNA3.4-np12和pET-32a-np72；或由pcDNA3.4-nCD2v、pcDNA3.4-np54、pcDNA3.4-np12和pET-32a-np72组成。
所述重组载体pcDNA3.4-nCD2v是对pcDNA3.4载体修改(插入NotI和XbaI识别位点)后，将序列表中SEQ ID No.9的DNA片段插入到NotI和XbaI识别位点之间，保持修改后PcDNA3.4载体的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体。
所述重组载体pcDNA3.4-np54是对pcDNA3.4载体修改(插入NotI和XbaI识别位点)后，将序列表中SEQ ID No.10的DNA片段插入到NotI和XbaI识别位点之间，保持修改后pcDNA3.4载体的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体。
所述重组载体pcDNA3.4-np12是对pcDNA3.4载体修改(插入NotI和XbaI识别位点)后，将序列表中SEQ ID No.11的DNA片段插入到NotI和XbaI识别位点之间，保持修改后pcDNA3.4载体的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体。
所述重组载体pET-32a-np72是将pET-32a(+)载体的BamHI和XhoI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.12的DNA片段，保持pET-32a(+)载体的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体。
B4)中所述重组细胞具体可为HEK293/pcDNA3.4-nCD2v、HEK293/pcDNA3.4-np54和/或HEK293/pcDNA3.4-np12。
所述重组细胞HEK293/pcDNA3.4-nCD2v是将所述重组载体pcDNA3.4-nCD2v导入HEK293细胞中得到的重组细胞。重组细胞HEK293/pcDNA3.4-nCD2v含有SEQ ID No.9所示的DNA分子，表达氨基酸序列是SEQ ID No.5的融合蛋白IFN-CD2v-Fc。
所述重组细胞HEK293/pcDNA3.4-np54是将所述重组载体pcDNA3.4-np54导入HEK293细胞中得到的重组细胞。重组细胞HEK293/pcDNA3.4-np54含有SEQ ID No.10所示的DNA分子，表达氨基酸序列是SEQ ID No.6的融合蛋白IL2-p54-Fc。
所述重组细胞HEK293/pcDNA3.4-np12是将所述重组载体pcDNA3.4-np12导入HEK293细胞中得到的重组细胞。重组细胞HEK293/pcDNA3.4-np12含有SEQ ID No.11所示的DNA分子，表达氨基酸序列是SEQ ID No.7的融合蛋白p12-Fc。
B3)中所述重组微生物具体可为重组菌BL21(DE3)/pET-32a-np72。
所述重组菌BL21(DE3)/pET-32a-np72是将所述重组载体pET-32a-np72导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中得到的重组微生物。重组菌BL21(DE3)/pET-32a-np72含有SEQID No.12所示的DNA分子，表达氨基酸序列是SEQ ID No.8的融合蛋白p72-IFN。
B4)中所述重组细胞组合物可包括HEK293/pcDNA3.4-nCD2v、HEK293/pcDNA3.4-np54、HEK293/pcDNA3.4-np12和BL21(DE3)/pET-32a-np72。
B4)中所述重组细胞组合物可由HEK293/pcDNA3.4-nCD2v、HEK293/pcDNA3.4-np54、HEK293/pcDNA3.4-np12和BL21(DE3)/pET-32a-np72组成。
本发明还提供了非洲猪瘟疫苗，所述疫苗可包括本文任一所述融合蛋白组合物。
所述非洲猪瘟疫苗可为非洲猪瘟多组分亚单位疫苗，所述非洲猪瘟疫苗用于提供抗非洲猪瘟的免疫应答。
进一步地，所述非洲猪瘟疫苗中所述融合蛋白组合物的含量可为1～100μg/mL。
进一步地，所述非洲猪瘟疫苗中所述融合蛋白组合物的含量可为50μg/mL。
进一步地，所述非洲猪瘟疫苗中所述融合蛋白组合物中融合蛋白IFN-CD2v-Fc、IL2-p54-Fc、p12-Fc和p72-IFN的质量比可为1:1:1:1。
进一步地，所述非洲猪瘟疫苗还可包括佐剂(adjuvant)和/或疫苗递送系统(vaccine delivery system)。
所述佐剂可为一种可以刺激机体产生针对与其一同接种的抗原更强烈体液和/或细胞免疫应答的物质。本文所述佐剂是本领域技术人员公知的，包括但不限于：植物佐剂(如烷基胺、酚类成分、奎宁、皂角素、倍半萜、蛋白质、多肽、多糖、糖脂、植物血凝素等)、细菌佐剂(如霍乱毒素、大肠埃希菌不耐热毒素、细菌脂多糖等)、铝佐剂及其他无机成分佐剂(如钙佐剂)、细胞因子和核酸佐剂(如单核细胞克隆刺激因子、白细胞因子IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-γ、CpG基序、核酸载体等)、乳剂佐剂(如弗氏佐剂)。所述佐剂可为药学上可以接受的佐剂。在本发明的实施方案中，所述佐剂为Montanide ISA206 VG佐剂(赛彼科(上海)特殊化学用品有限公司产品，货号30622E)。
所述疫苗递送系统可为一类能够将抗原物质携带至机体的免疫系统，并在其中较长时间存储和发挥其抗原作用的物质。本文所述疫苗递送系统可为吕盐凝胶佐剂疫苗递送系统、乳剂佐剂疫苗递送系统、脂质体佐剂疫苗递送系统或纳米佐剂疫苗递送系统。
本领域技术人员所熟知的是，为了增强抗原蛋白的免疫原性，除了加入具有免疫增强作用的化合物作为佐剂外，还可通过调整基因组合使之表达成颗粒性结构；或在体外加以聚团化，包入脂质体或胶囊微球中。
本文所述亚单位疫苗可为基因工程亚单位疫苗(gene engineered subunitvaccine)，所述基因工程亚单位疫苗是利用基因工程表达的蛋白抗原经纯化后，配合相应的佐剂制备而成的疫苗。
本发明还提供了本文任一所述融合蛋白组合物的下述任一种应用：
C1)在制备用于预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的产品中的应用；
C2)在制备用于诱导非洲猪瘟病毒抗原的免疫反应的药剂中的应用；
C3)在制备预防非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的疫苗中的应用；
C4)在制备抗非洲猪瘟病毒药物中的应用。
本发明还提供了本文任一所述融合蛋白组合物在非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的防控中的应用。
本发明还提供了本文任一所述融合蛋白组合物在制备预防ASFV基因工程亚单位疫苗中的应用。
本发明还提供了所述疫苗在非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的防控中的应用。
本发明还提供了本文任一所述生物材料的下述任一种应用：
D1)在制备用于预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的产品中的应用；
D2)在制备用于诱导非洲猪瘟病毒抗原的免疫反应的药剂中的应用；
D3)在制备预防非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的疫苗中的应用；
D4)在制备抗非洲猪瘟病毒药物中的应用。
本文所述非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病为非洲猪瘟。
所述非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒感染引起的。
本发明还提供了本文任一所述生物材料在非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的防控中的应用。
本发明还提供了一种制备非洲猪瘟多组分亚单位疫苗的方法，所述方法包括如下步骤：
1)制备融合蛋白IFN-CD2v-Fc(SEQ ID No.5)、IL2-p54-Fc(SEQ ID No.6)、p72-IFN(SEQ ID No.7)和p12-Fc(SEQ ID No.8)；
2)将步骤1)中制备的融合蛋白混合制备成抗原液；
3)将步骤2)中制备的抗原液(0.2mg/mL)与佐剂按照体积比1:1混合，得到非洲猪瘟多组分亚单位疫苗。
进一步地，步骤2)中的所述混合可为将所述融合蛋白IFN-CD2v-Fc、IL2-p54-Fc、p72-IFN和p12-Fc按照1:1:1:1的质量比混合。
进一步地，所述佐剂可为Montanide ISA206 VG佐剂。
进一步地，所述非洲猪瘟多组分亚单位疫苗中，融合蛋白组合物(IFN-CD2v-Fc、IL2-p54-Fc、p72-IFN和p12-Fc)的含量可为50μg/mL。
进一步地，所述抗原液中每头份含融合蛋白组合物50μg。
本发明还提供了一种抑制非洲猪瘟病毒感染动物的方法，所述方法包括给受体动物施用本文中任一所述的融合蛋白组合物或所述非洲猪瘟疫苗。
本发明还提供了一种预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的方法，所述方法包括给受体动物施用本文中任一所述的融合蛋白组合物或所述非洲猪瘟疫苗。
进一步地，所述受体动物可为家猪。
上述方法中，所述非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病为非洲猪瘟。
上述方法中，所述非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒感染引起的。
本发明所述疫苗抗原可为细胞因子佐剂和非洲猪瘟病毒(ASFV)的结构蛋白一起融合表达，所得到的融合蛋白称为佐剂-融合蛋白(也称为佐剂-融合抗原)，所述佐剂-融合蛋白以疫苗的形式施用与家猪，以引起针对ASFV的免疫应答。
本发明所述非洲猪瘟疫苗(基因工程亚单位疫苗)的给药方式包括肌内注射。
本发明提供了一种能预防非洲猪瘟的多组分亚单位疫苗，该疫苗具备免疫原性强、安全性好、高效、质量可控、不存在免疫干扰、不存在导致病毒变异的生物安全隐患、能够同时诱导体液免疫和细胞免疫的优点；通过该疫苗进行免疫接种，可有效预防和保护猪免受非洲猪瘟病毒的感染；同时，本发明制备的非洲猪瘟亚单位疫苗至少能够在4℃稳定储存6个月以上，能够满足产业化应用。
附图说明
图1为氨基酸序列如SEQ ID No.5所示融合蛋白IFN-CD2v-Fc的SDS-PAGE(图1中A)和色谱图(图1中B)。
图2为氨基酸序列如SEQ ID No.6所示融合蛋白IL2-p54-Fc的SDS-PAGE(图2中A)和色谱图(图2中B)。
图3为氨基酸序列如SEQ ID No.7所示融合蛋白p12-Fc的SDS-PAGE(图3中A)和色谱图(图3中B)。
图4为氨基酸序列如SEQ ID No.8所示融合蛋白p72-IFN的表达鉴定(图4中A)、纯化后SDS-PAGE(图4中B)和色谱图(图4中C)。
图5为多组分疫苗免疫后抗体水平检测ELISA。
图6为多组分疫苗免疫后细胞免疫ELISPOT。
图7为多组分疫苗免疫血清病毒中和滴度。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的Montanide ISA206 VG佐剂为赛彼科(上海)特殊化学用品有限公司产品，货号36022E。
下述实施例采用SPSS统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用one-way ANOVA检验方法，P＜0.05(*)表示具有统计学差异，P＜0.01(**)表示统计学差异显著，P＜0.001(***)表示统计学差异极为显著，P＜0.0001(****)表示统计学差异极为显著。
下述实施例中的pcDNA3.4载体为上海百英生物科技有限公司产品。
下述实施例中的pET-32a(+)载体为北京擎科生物科技有限公司产品。
下述实施例中的HEK293悬浮细胞为上海百英生物科技有限公司产品。
下述实施例中的PK-15细胞来自美国典型培养物保藏中心。
下述实施例中的水泡性口炎病毒(VSV)来源于中国科学院微生物研究所，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的非洲猪瘟病毒(ASFV)Pig/HLJ/2018(HLJ/18)株(ASFV SY18)来源于军事医学科学院军事兽医研究所，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、融合蛋白IFN-CD2v-Fc、IL2-p54-Fc、p12-Fc和p72-IFN的制备
1、融合蛋白设计及密码子优化
本实施例以非洲猪瘟病毒毒株Pig/HLJ/2018(HLJ/18)全基因序列(GenBank：MH766894.2)为模板，选择非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)结构蛋白CD2v蛋白(pEP402R)、p12蛋白(O61R)、p54蛋白(E183L)和p72蛋白(B646L)的氨基酸序列进行跨膜区及信号肽序列预测，针对CD2v蛋白仅选择胞外域序列(即CD2v蛋白全长氨基酸序列中第16-206位氨基酸序列)，然后去除膜蛋白p54和p12的跨膜区，p72蛋白为全长蛋白，重新设计后的四个蛋白质分别命名为tCD2v、tp54、tp12和p72。
tCD2v的氨基酸序列为SEQ ID No.1，为非洲猪瘟病毒外膜蛋白(表面囊膜蛋白)CD2v(pEP402R)的截短蛋白，即CD2v蛋白的胞外域部分(CD2v蛋白全长氨基酸序列中第16-206位氨基酸)。
tp54的氨基酸序列为SEQ ID No.2，为非洲猪瘟病毒内膜蛋白p54的截短蛋白，即去除了跨膜区的p54蛋白。
tp12的氨基酸序列为SEQ ID No.3，为非洲猪瘟病毒结构蛋白p12的截短蛋白，即去除了跨膜区的p12蛋白。
p72的氨基酸序列为SEQ ID No.4，为非洲猪瘟病毒核衣壳蛋白p72的全长蛋白。
在SEQ ID No.1所示的tCD2v蛋白N端通过柔性接头(linker)连接猪IFN-α，并将猪IFN-α信号肽替换为人IL-10分泌信号肽；同时在C端融合猪IgG1a的Fc区域，得到的融合蛋白命名为IFN-CD2v-Fc，氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。其中，SEQ ID No.5的第1-18位为人IL-10分泌信号肽，第19-184位为猪IFN-α(无信号肽的猪IFN-α)，第185-188位为柔性接头(linker)GGGS，第189-379位为tCD2v蛋白，第380-609位为猪IgG1a的Fc区域。
在SEQ ID No.2所示的tp54蛋白N端通过柔性接头(linker)连接猪IL-2，并将猪IL-2信号肽替换为人IL-10分泌信号肽；同时在C端融合猪IgG1a的Fc区域，得到的融合蛋白命名为IL2-p54-Fc，氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。其中，SEQ ID No.6的第1-18位为人IL-10分泌信号肽，第19-152位为猪IL-2(无信号肽的猪IL-2)，第153-156位为柔性接头(linker)GGGS，第157-319位为tp54蛋白，第320-549位为猪IgG1a的Fc区域。
在SEQ ID No.3所示的tp12蛋白N端连接人IL-10分泌信号肽，同时在C端融合猪IgG1a的Fc区域，得到的融合蛋白命名为p12-Fc，氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。其中，SEQID No.7的第1-18位为人IL-10分泌信号肽，第19-55位为tp12蛋白，第56-285位为猪IgG1a的Fc区域。
在SEQ ID No.4所示的p72蛋白C端通过柔性接头(linker)连接猪IFN-α，得到的融合蛋白命名为p72-IFN，氨基酸序列如SEQ ID No.8的第1-816位所示。为了便于融合蛋白p72-IFN的分离纯化，在融合蛋白p72-IFN的C端通过柔性接头(linker)GGGS连接His标签(HHHHHH)，得到带有His标签的融合蛋白p72-IFN，氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。其中，SEQ ID No.8的第1-646位为p72蛋白，第647-650位为柔性接头(linker)GGGS，第651-816位为猪IFN-α，第817-820位为柔性接头(linker)GGGS，第821-826位为纯化His标签。
通过密码子优化，得到SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ IDNo.12(或SEQ ID No.12的第1-2448位)所示的DNA分子，分别命名为nCD2v、np54、np12和np72。
SEQ ID No.9所示的DNA分子(nCD2v基因)编码氨基酸序列是SEQ ID No.5的融合蛋白IFN-CD2v-Fc。
SEQ ID No.10所示的DNA分子(np54基因)编码氨基酸序列是SEQ ID No.6的融合蛋白IL2-p54-Fc。
SEQ ID No.11所示的DNA分子(np12基因)编码氨基酸序列是SEQ ID No.7的融合蛋白p12-Fc。
SEQ ID No.12所示的DNA分子(np72基因)编码氨基酸序列是SEQ ID No.8的融合蛋白p72-IFN(带有His标签)。
SEQ ID No.12的第1-2448位所示的DNA分子(np72基因)编码氨基酸序列是SEQ IDNo.8的第1-816位的融合蛋白p72-IFN(不带His标签)。
2、真核表达载体质粒构建
分别将SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示DNA分子通过分子克隆方法，插入到修改后pcDNA3.4载体(即在pcDNA3.4载体上插入NotI和XbaI识别位点)的NotI和XbaI酶切位点间，该序列合成及载体修改工作(在载体上增加NotI和XbaI识别位点)委托上海百英生物科技有限公司完成。获得的重组载体分别命名为pcDNA3.4-nCD2v、pcDNA3.4-np54和pcDNA3.4-np12。
重组载体pcDNA3.4-nCD2v是对pcDNA3.4载体修改(插入NotI和XbaI识别位点)后，将序列表中SEQ ID No.9的DNA片段插入到NotI和XbaI识别位点之间，保持修改后PcDNA3.4载体的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体。
重组载体pcDNA3.4-np54是对pcDNA3.4载体修改(插入NotI和XbaI识别位点)后，将序列表中SEQ ID No.10的DNA片段插入到NotI和XbaI识别位点之间，保持修改后pcDNA3.4载体的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体。
重组载体pcDNA3.4-np12是对pcDNA3.4载体修改(插入NotI和XbaI识别位点)后，将序列表中SEQ ID No.11的DNA片段插入到NotI和XbaI识别位点之间，保持修改后pcDNA3.4载体的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体。
3、原核表达载体质粒构建
将SEQ ID No.12所示的DNA分子通过分子克隆方法，插入到pET-32a(+)载体的BamH I和XhoI酶切位点间，该序列合成工作委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。获得的重组载体命名为pET-32a-np72。
重组载体pET-32a-np72是将pET-32a(+)载体的BamH I和XhoI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.12的DNA片段，保持pET-32a(+)载体的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体。
4、制备重组真核表达蛋白
培养基准备：准备Expi293TM(Gibco)培养基置于培养箱中进行预热，培养箱的温度设置为37℃。
宿主细胞准备：选择生长状态良好且细胞密度为80％培养瓶中的HEK293悬浮细胞进行传代处理；离心弃掉原培养基，缓慢加入预热培养基，调整细胞密度至2×106/mL。
预转染质粒：pcDNA3.4-nCD2v、pcDNA3.4-np54和pcDNA3.4-np12。
转染复合物准备：将预转染质粒(67μg/L)分别稀释在一定体积的无血清Opti-MEM培养基，轻轻混匀，室温静置5min；再取PEI脂质体(DNA：PEI＝1：1)转染试剂，稀释在无血清Opti-MEM培养基中，轻轻混匀，室温静置5min，最后将稀释的质粒和PEI脂质体混合在一起，加入到细胞中，转染得到重组细胞，分别命名为HEK293/pcDNA3.4-nCD2v、HEK293/pcDNA3.4-np54和HEK293/pcDNA3.4-np12。
重组细胞HEK293/pcDNA3.4-nCD2v是将所述重组载体pcDNA3.4-nCD2v导入HEK293细胞中得到的重组细胞。重组细胞HEK293/pcDNA3.4-nCD2v含有SEQ ID No.9所示的DNA分子，表达氨基酸序列是SEQ ID No.5的融合蛋白IFN-CD2v-Fc。
重组细胞HEK293/pcDNA3.4-np54是将所述重组载体pcDNA3.4-np54导入HEK293细胞中得到的重组细胞。重组细胞HEK293/pcDNA3.4-np54含有SEQ ID No.10所示的DNA分子，表达氨基酸序列是SEQ ID No.6的融合蛋白IL2-p54-Fc。
重组细胞HEK293/pcDNA3.4-np12是将所述重组载体pcDNA3.4-np12导入HEK293细胞中得到的重组细胞。重组细胞HEK293/pcDNA3.4-np12含有SEQ ID No.11所示的DNA分子，表达氨基酸序列是SEQ ID No.7的融合蛋白p12-Fc。
蛋白表达检测：转染48h和72h后，吸取少量细胞上清检测蛋白表达(SDS-PAGE和高效液相色谱检测)，并收集细胞上清；将收集到的细胞培养上清在4℃条件下，5000rpm离心15min以除去细胞及细胞碎片，并用0.22μm PVDF滤膜过滤至新的离心管中，分装标记后于-80℃保存。
结果如图1、图2和图3所示，图1为融合蛋白IFN-CD2v-Fc的SDS-PAGE(图1中A)(M：蛋白Marker，R：还原样品，N-R：非还原样品)和色谱图(图1中B)；图2为融合蛋白IL2-p54-Fc的SDS-PAGE(图2中A)(M：蛋白Marker，R：还原样品，N-R：非还原样品)和色谱图(图2中B)；图3为融合蛋白p12-Fc的SDS-PAGE(图3中A)(M：蛋白Marker，R：还原样品，N-R：非还原样品)和色谱图(图3中B)。SDS-PAGE结果表明，融合蛋白IFN-CD2v-Fc、IL2-p54-Fc和p12-Fc的分子量与预期一致。结果表明在转化的细胞培养上清中，均检测到了产物(融合蛋白)的生成。
5、重组真核表达蛋白纯化
Protein A具有和IgG的Fc片段结合的活性。重组蛋白(即本发明的融合蛋白IFN-CD2v-Fc、IL2-p54-Fc和p12-Fc)携带抗体Fc标签，因此采用Protein A柱子纯化表达蛋白，具体操作步骤如下：
1)细胞培养上清预处理：0.22μm孔径滤器过滤细胞上清，调节pH至7.8，此时亲和挂柱效果较好。
2)平衡亲和柱：用10倍体积的PBS(pH7.4)清洗柱子，同时将柱子下端与AKTA蛋白检测仪进液口连接固定。
3)上样：PBS平衡柱体时，调节AKTA蛋白检测仪数值稳定在0左右，将样品加入上样柱床，蛋白检测仪上数值慢慢升高，收集液体(此液体简称流穿液，流穿液中可能还会有未被柱子捕获的蛋白，所以暂时收集以再次过柱纯化使用)。
4)上样完毕后，用PBS(pH7.2)洗杂蛋白，当蛋白检测仪的数值下降到平衡数值，不再下降时，停止收集流穿液。
5)蛋白洗脱：当核酸蛋白检测仪的数值保持较低数值并稳定时，待柱床液面快流干时，轻轻在柱床上加入洗脱液(40mM柠檬酸，pH 3.4)；当AKTA蛋白检测仪上数值迅速升高时，迅速顺次分管承接洗脱的液体，承接时多管顺次接取，并记录顺序。
6)洗脱完毕后，当数值变低并不再变动时，用至少5倍柱床体积的PBS以2mL/min流速清洗平衡柱子。
7)柱床用保存液(含20％乙醇的PBS)保存，并封闭柱子上下两端，4℃保存。
8)洗脱蛋白用PBS(pH7.2)透析3次，每次4h以上。
9)测蛋白浓度，并通过Nanodrop仪器测定蛋白浓度及纯度。
纯化得到融合蛋白IFN-CD2v-Fc、IL2-p54-Fc和p12-Fc，其中IFN-CD2v-Fc融合蛋白纯度>95％，IL2-P54-Fc蛋白纯度为26.25％，P12-Fc蛋白纯度为86.28％，见图1中A、图2中A和图3中A。
6、干扰素活性测定(细胞病变抑制法)
本法系依据干扰素可以保护猪肾细胞(PK-15)免受水泡性口炎病毒(VSV)破坏的作用，根据待测样品不同稀释度的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。具体步骤如下：
使PK-15细胞在培养基中贴壁生长，洗涤消化后收集细胞，用完全培养液配制成每1mL含2.5×105～3.5×105个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，于37℃、5％二氧化碳条件下培养4～6小时；将待测蛋白用含4％FBS和双抗的DMEM培养基按照1:4的比例倍比稀释，移入接种PK-15细胞的96孔培养板中，每孔加入100μL，于37℃、5％二氧化碳条件下培养18～24h；弃去细胞培养板中的上清液，将保存的水泡性口炎病毒(VSV，-70℃保存)用含4％FBS和双抗的DMEM培养基稀释至约1000TCID50，每孔100μL，于37℃、5％二氧化碳条件下培养24h(镜检细胞病变)。
待测干扰素的效价(IU/mL)＝预先稀释倍数×4(d+(d-0.5)/(d-d1))。
式中d代表大于50％比例的稀释度，d1代表小与50％的比例的稀释度。
最终测定的IFN-CD2v-Fc融合蛋白的干扰素活性为1.774×106U/mL。
7、原核p72-IFN融合蛋白诱导表达、鉴定和纯化
蛋白表达鉴定：将重组载体pET-32a-np72转入大肠杆菌BL21(DE3)培养得到重组菌BL21(DE3)/pET-32a-np72，将测序正确的阳性克隆菌进行p72-IFN蛋白的诱导表达，待菌液OD600nm在0.6-0.8之间时加入终浓度为500μM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃摇床180rpm诱导8h，收集菌体，加入无菌PBS重悬菌体，进行超声破碎，超声参数为：功率30W；发射3s，间歇3s。超声完成后，12000rpm、4℃离心20min，分别收集上清和包涵体沉淀，分别加入5×SDS loading buffer进行SDS-PAGE蛋白电泳鉴定。将破碎包涵体沉淀用PBST(PBS中加入0.5％Triton X-100)洗涤两次后，加入尿素变性剂4℃过夜变性(8M尿素，2mm EDTA，50mm Tris-HCl,pH 8.5)，12000rpm、4℃离心20min，过滤上清得到变性蛋白。
重组菌BL21(DE3)/pET-32a-np72是将所述重组载体pET-32a-np72导入BL21(DE3)中得到的重组微生物。重组菌BL21(DE3)/pET-32a-np72含有SEQ ID No.12所示的DNA分子，表达氨基酸序列是SEQ ID No.8的融合蛋白p72-IFN。
如图4中A所示，SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色结果表明，诱导后P72-IFN蛋白表达，并主要在细菌包涵体表达。M：蛋白Marker，泳道1：诱导前全菌、泳道2：诱导后全菌、泳道3：细菌破碎上清、泳道4：细菌包涵体。
融合蛋白p72-IFN的纯化：His标签蛋白纯化步骤如下：
1)安装His柱，设置柱压为0.3MPa；
2)柱平衡：以5倍柱体积的去离子水冲洗His柱，彻底去除酒精；再以5倍柱体积的平衡buffer平衡Ni柱，直至蛋白检测仪离子浓度达到平衡；
3)上样：将过滤稀释后的包涵体按照1mL/min的流速上柱，加入包涵体的量要根据柱子的承载力确定，保留流穿液后续分析；
4)洗杂：用Binding buffer冲洗柱子，直到紫外吸收线走平为止；
5)洗脱蛋白：用2-5倍柱体积Elution buffer洗脱蛋白，1ml/管收集纯化蛋白；
6)复性：将复性液(L-精氨酸、EDTA-2Na、Tris base、葡萄糖、氧化型谷胱甘肽、还原性谷胱甘肽、甘油、PMSF，pH 8.0)置于4℃冷库中磁力搅拌器上，转速调整至120-150rpm/min，将过滤后的纯化蛋白液加入注射器中，使之逐滴滴入到复性液中，至少复性24h；
7)透析：将复性蛋白吸至透析袋放入装有1×PBS的烧杯中透析、浓缩，得到含有高浓度融合蛋白p72-IFN的溶液，测定蛋白浓度。
图4中B为SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色，结果表明纯化后融合蛋白p72-IFN蛋白纯度为89.6％。图4中C为融合蛋白p72-IFN的色谱图。
实施例2、非洲猪瘟亚单位疫苗的制备
本实施例的非洲猪瘟亚单位疫苗是利用实施例1中制备的融合蛋白IFN-CD2v-Fc、IL2-p54-Fc、p12-Fc和p72-IFN(融合蛋白组合物)制备而成。
所用制备疫苗的耗材和材料都需预先经过无菌处理，制备过程是在生物安全柜或其他可以保证整个制备过程都无菌的仪器或环境中完成。
疫苗制备方法如下：
水相准备：根据疫苗中蛋白含量，使用磷酸盐缓冲液PBS将IFN-CD2v-Fc、IL2-p54-Fc、p72-IFN和p12-Fc融合蛋白按照1:1:1:1的质量比混合后稀释适当浓度(0.2mg/mL)，即为水相(抗原液)；
油相准备：根据制备疫苗总量，按照抗原相和佐剂体积比为1:1，量取5mL ISA206VG佐剂(即Montanide ISA206 VG佐剂)；
乳化：将油相预热到42℃，水相置4℃暂存，然后将5mL水相缓缓加到5mL油相中，200-500rpm搅拌20-30min，于室温静置1h后置于4℃过夜；
分装、贮存：根据需要进行分装，检合格后于4℃保存备用。
最终制备得到融合蛋白组合物的含量为50μg/mL的非洲猪瘟亚单位疫苗。其中融合蛋白组合物中，各组分IFN-CD2v-Fc、IL2-p54-Fc、p72-IFN和p12-Fc的质量比为1:1:1:1。
实施例3、非洲猪瘟亚单位疫苗免疫实验
1、疫苗制备：按照实施例1、2的方法制备融合蛋白和疫苗，具体疫苗信息及免疫剂量见下表1所示：
表1 疫苗信息及免疫剂量
组别 抗原组成 免疫剂量 抗原比例
疫苗组 IFN-CD2v-Fc、IL2-p54-Fc、p72-IFN、p12-Fc 50μg/头 1:1:1:1
2、免疫程序：筛选21-28日龄体重为15-20kg的长白猪断奶仔猪10头(CSFV和PCV2、ASFV、PRRSV抗原抗体阴性)，随机分成2组，每组5头，采用一次初始免疫和一次增强免疫方案，设置空白对照组，肌肉注射生理盐水，免疫组肌肉注射2mL相应的疫苗，使实施例2的融合蛋白组合物的免疫剂量为50μg/头，初免三周(21天)后加强免疫一次，空白对照组每次肌肉注射2mL生理盐水。免疫前、二免前和二免后21天采集血清，检测抗体效价。
3、非洲猪瘟多组分亚单位疫苗免疫评价
3.1、猪血清特异性抗体ELISA
包被抗原为表达纯化的p72-IFN蛋白。将包被抗原用包被稀释液稀释至1μg/mL，以每孔100μL的量加入96孔板，4℃过夜PBST洗涤3次。加入浓度为4％BSA的PBST在37℃温箱中封闭3小时，PBST洗涤3次；将采集的猪血清先进行1:1000倍稀释后，再按照1:3的比例梯度稀释，加入96孔板中，每孔100μL，在37℃温箱中孵育1小时，PBST洗3次；加入HRP标记的羊抗猪二抗(1:5000稀释)，每孔100μL，在37℃温箱中孵育45min；PBST洗3次；加入TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)显色底物，每孔100μL，在37℃温箱中孵育10分钟；加入2M硫酸终止液终止显色，每孔100μL。酶标仪上450nm读数，以大于2.1倍阴性血清OD450nm的稀释度为阳性抗体滴度终点。
实验结果如图5所示，使用非洲猪瘟p72-IFN蛋白包被的抗原ELISA检测结果显示：一免21天(二免前)免疫组抗体水平显著上升，与空白对照组相比差异极显著(P<0.0001)。在二免后21天，抗体水平较一免21天抗体水平显著升高(P<0.0001)，差异极为显著。说明本发明提供的非洲猪瘟亚单位疫苗能够有效的刺激产生体液免疫应答反应。
3.2、细胞免疫水平ELISPOT
3.2.1、猪淋巴细胞分离
采用猪淋巴细胞分离液(猪外周血单个核细胞分离液，索莱宝北京索莱宝科技有限公司，P4420产品)进行体外分离，具体操作步骤如下：
1)取新鲜猪抗凝全血(EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝均可)或者去纤维蛋白血液，用等体积的全血及组织稀释液或者PBS稀释全血。
2)在离心管中加入适量分离液(当稀释后血液体积小于3mL时，加入3mL分离液；大于等于3mL，加入等体积分离液。但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果)，将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰(可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多加样时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象)。
3)室温，水平转子500～1000g，离心20～30min，并将降速调低，防止速度下降快，分层被打乱。
4)离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为淋巴细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞。
5)小心的吸取白膜层细胞到15mL洁净的离心管中，10mL PBS或细胞洗涤液洗涤白膜层细胞。250g，离心10min。
6)弃上清，立即重悬，5mL的1640培养基重悬细胞，250g，离心10min。
7)重复步骤6。
8)弃上清，细胞重悬备用，最终得到猪外周血单个核细胞(PBMC)。
3.2.2、细胞介导的免疫应答检测
采用pig IFN-γsingle-color ELISPOT kit(pIFNgp-1m/10，CTL)试剂盒(CTL公司产品)进行ELISPOT检测，以检测猪外周血单个核细胞(PBMC)分泌的IFN-γ(即检测本发明的融合蛋白诱导机体T细胞分泌IFN-γ的能力)，具体操作步骤如下：
①ELISPOT板子每孔加入200μL PBS(根据试剂盒要求加入相应液体)置于37℃中反应20min后甩掉并拍干，按照终浓度10μg/mL稀释融合蛋白，每孔加入100μL，阳性对照组每孔加入终浓度为10μg/mL的刀豆蛋白A(Con A)100μL(用双抗+10％牛血清的1640培养基稀释)；每孔再加入稀释好的PBMC 100μL，调整每个孔中细胞的终浓度为4×105个/孔，轻轻震荡板子，放入37℃、5％ CO2培养箱培养15-20h。孵育期间不要晃动或移动孔板。
②弃掉板中的细胞，用Wash液洗涤三次，每次洗涤后轻拍干净。洗涤完成后加入稀释好的IFN-γ捕获抗体(利用稀释剂A按照1:400的比例稀释)100μL，盖上板盖，室温下孵育2h。
③弃掉板中IFN-γ捕获抗体，Wash液洗涤三次后，加入稀释好的亲和素碱性磷酸酶底物(利用稀释剂B按照1:1000的比例稀释)100μL，盖上板盖，室温下孵育1h。
④弃掉板中亲和素碱性磷酸酶，加入蓝色显影缓冲显色液80μL。室温下反应5-15min(避光显色)。
⑤用蒸馏水充分洗涤板子的两面。吸水纸上轻拍，使膜干燥。保存时，将板倒置以免残留的液体流回膜上。膜干燥后，读取点数。4℃下放置一夜，点会比较明显。
⑥读板计数。
实验结果如图6所示，分别用IFN-CD2v-Fc、IL2-p54-Fc、p72-IFN、p12-Fc蛋白刺激猪PBMC，其中p72-IFN蛋白刺激分泌IFN-γ产生的斑点数最高，与空白对照组相比，结果差异极显著(****，p<0.0001)。其他蛋白刺激分泌IFN-γ产生的斑点数由高到低依次分别是p12-Fc、IL2-p54-Fc和IFN-CD2v-Fc蛋白刺激产生的斑点，IFN-CD2v-Fc和IL2-p54-Fc蛋白刺激产生的斑点数略高于p12-Fc蛋白刺激产生的斑点数，但三者之间无差异(ns)。p72-IFN与p12-Fc、IL2-p54-Fc和IFN-CD2v-Fc刺激产生的斑点数差异显著(****，p<0.0001)。p12-Fc蛋白刺激产生的斑点数最少，但是与IFN-CD2v-Fc蛋白和IL2-p54-Fc蛋白组差异并不显著。ELISPOT实验说明本发明提供的非洲猪瘟多组分混合疫苗能够有效的激活细胞免疫应答。
4、非洲猪瘟病毒中和滴度测定
将免疫后猪血清在含有7％ FBS和抗生素的1640培养基中稀释。一式三份测定免疫后血清中和滴度。每个测定板包括一个阳性对照(仅病毒无mAb)和一个阴性对照(不加病毒)。将100μL免疫猪血清与100μL ASFV SY18以500TCID50/mL的滴度在96孔板上混合，并在37℃下孵育2h。随后，将样品转移到单层培养的96孔猪原代肺巨噬细胞(PAM)细胞板中，并在37℃、5％ CO2下继续孵育3-4天。用本实验室制备的抗p72鼠单抗进行IFA染色后检测感染的细胞。在EVOS FL Auto显微镜(Thermo Fisher)上对10个显微镜视野中的阳性细胞数进行计数。中和百分比计算为：((1-(阳性细胞的平均数/阴性对照中阳性细胞的平均数))×100)。
血清中和滴度测定结果如图7所示，首免后血清中和滴度可达到1:64～1:128，二免后血清中和滴度范围在1:128～1:512。首免后中和滴度与对照组相比，差异极显著(****，p<0.0001)。而且，二免后血清中和滴度与首免血清中和滴度也有一定的差异(**，p<0.01)。血清中和数据说明本发明亚单位多组分混合疫苗诱导的抗体可以有效中和病毒，增强体液免疫。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (6)

1.用于预防非洲猪瘟的融合蛋白组合物，其特征在于，所述融合蛋白组合物由融合蛋白IFN-CD2v-Fc、IL2-p54-Fc、p12-Fc和p72-IFN组成，所述IFN-CD2v-Fc是在SEQ ID No.1所示的tCD2v的N端融合IFN-α，C端融合Fc片段得到的融合蛋白；所述IL2-p54-Fc是在SEQ IDNo.2所示的tp54的N端融合IL2，C端融合Fc片段得到的融合蛋白；所述p12-Fc是在SEQ IDNo.3所示的tp12的N端融合人IL-10分泌信号肽，C端融合Fc片段得到的融合蛋白；所述p72-IFN是在SEQ ID No.4所示的p72的C端融合IFN-α得到的融合蛋白；
所述融合蛋白IFN-CD2v-Fc为下述任一种蛋白质：
A1）氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质；
A2）在A1）所示的蛋白质的羧基端和/或氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白质；
所述融合蛋白IL2-p54-Fc为下述任一种蛋白质：
A3）氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质；
A4）在A3）所示的蛋白质的羧基端和/或氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白质；
所述融合蛋白p12-Fc为下述任一种蛋白质：
A5）氨基酸序列是SEQ ID No.7的蛋白质；
A6）在A5）所示的蛋白质的羧基端和/或氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白质；
所述融合蛋白p72-IFN为下述任一种蛋白质：
A7）氨基酸序列是SEQ ID No.8的第1-816位或SEQ ID No.8的蛋白质；
A8）在A7）所示的蛋白质的羧基端和/或氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白质。
2.用于预防非洲猪瘟的生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：
B1）核酸分子组合物，所述核酸分子组合物由编码权利要求1中所述IFN-CD2v-Fc的核酸分子、编码权利要求1中所述IL2-p54-Fc的核酸分子、编码权利要求1中所述p12-Fc的核酸分子和编码权利要求1中所述p72-IFN的核酸分子组成；
B2）表达权利要求1所述融合蛋白组合物的重组载体组合物或重组载体；
B3）表达权利要求1所述融合蛋白组合物的重组微生物组合物或重组微生物；
B4）表达权利要求1所述融合蛋白组合物的重组细胞组合物或重组细胞。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，B1）中所述核酸分子组合物为下述任一种：
H1）由核苷酸序列分别是SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12的第1-2448位的DNA分子组成的核酸分子组合物；
H2）由核苷酸序列分别是SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12的DNA分子组成的核酸分子组合物。
4.非洲猪瘟疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求1所述的融合蛋白组合物。
5.根据权利要求4所述的非洲猪瘟疫苗，其特征在于，所述非洲猪瘟疫苗中所述融合蛋白组合物的含量为1～100 μg/mL。
6.权利要求1中任一所述的融合蛋白组合物的下述任一种应用：
C1）在制备用于诱导非洲猪瘟病毒抗原的免疫反应的药剂中的应用；
C2）在制备预防非洲猪瘟病毒感染所引起的疾病的疫苗中的应用；
C3）在制备抗非洲猪瘟病毒药物中的应用。
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