CN116059337A - 新型佐剂重组带状疱疹疫苗及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了新型佐剂重组带状疱疹疫苗及其制备与应用。本发明提供了一种带状疱疹疫苗，其包括抗原和佐剂；所述抗原为含有VZV‑gE蛋白和人IgG4Fc的融合蛋白；所述佐剂为铝佐剂、CpG佐剂或二者的结合；本发明的疫苗使用常规的铝佐剂和CpG佐剂联合，价格低廉容易获得，克服了GSK研制的Shingrix疫苗配方复杂，抗原需要冻干并且需要和佐剂分开，以及佐剂原材料稀缺，价格昂贵等缺陷。同时，由于GSK研制的Shingrix(GSK‑shingrix)抗原需要冻干并且需要和佐剂分开，导致在制备抗原、制剂工艺以及后续的使用上均较为麻烦。本发明的抗原和佐剂可以直接混合，预灌充注射器分装制剂，非常便利。

Description

新型佐剂重组带状疱疹疫苗及其制备与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种疫苗制剂，特别涉及新型佐剂重组带状疱疹疫苗及其制备与应用。

背景技术

带状疱疹是由潜伏的水痘-带状疱疹病毒(VZV)重新激活引起的感染性皮肤病，好发于中老年人，常表现为沿感觉神经支配的区域形成单侧皮疹，并伴有神经病理性疼痛，最普遍的并发症是带状疱疹后遗神经痛(PHN)。随着我国人口老龄化趋势日益加重，带状疱疹的发病率呈显著上升趋势，带状疱疹的防治已经成为重要的公共卫生问题，接种带状疱疹疫苗来防止该病发生是最为行之有效的手段。

水痘带状疱疹病毒(VZV)属于疱疹病毒属A疱疹病毒科，VZV基因组有71个基因，编码67个不同蛋白，包括6种糖蛋白(gpⅠ～gpⅥ)，现统一分别命名为gE、gB、gH、gI、gC和gL。其中gE在病毒包膜含量最丰富，是宿主免疫系统识别的最主要糖蛋白，由orf68基因编码，位于vzv基因组的短片区，含623个氨基酸，其中亲水膜外区544个，跨膜区17个，胞内区62个。已有研究表明以gE为抗原诱导的免疫反应，能保护动物免受病毒攻击。VZV gE单克隆抗体可介导抗体依赖性的细胞毒性，能中和病毒的感染性。目前的挑战是gE仅可以诱导低水平的体液免疫，无法满足疫苗使用的要求。

全球已上市的带疱疫苗产品有Zostavax(默沙东)、Shingrix(GSK)以及NBP608(SK化学，仅韩国市场销售)。Zostavax与SkyZoster是减毒活疫苗，通过处理实现结构改变、毒性减弱但保留免疫原性，从而建立免疫反应；Shingrix为重组亚单位疫苗，通过水痘-带状疱疹糖蛋白E抗原和AS01B佐剂在体内产生和增强免疫反应。临床数据表明，Shingrix在50至69岁有效率为97％，70岁以上有效率仍然高达为91％；Zostavax在50至69岁有效率为70％，整体有效率为51％，Shingrix的有效性要优于Zostavax。但Shingrix疫苗配方复杂，抗原需要冻干并且需要和佐剂分开，佐剂ASO1B，特别是其中的QS21不能化学合成，原材料稀缺，价格贵，导致供应不足。

因此有必要开发安全、有效，且配方简单、成本低的VZV疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供新型佐剂重组带状疱疹疫苗及其专用抗原。

第一方面，本发明提供了一种带状疱疹疫苗，其包括抗原和佐剂；

所述佐剂为铝佐剂、CpG佐剂或二者的结合；

所述CpG佐剂为SEQ ID NO:5-8中任一条序列所示的核苷酸；

所述疫苗为带状疱疹的灭活疫苗、减毒活疫苗、病毒载体疫苗、亚单位疫苗、重组疫苗、多糖疫苗、结合疫苗、类毒素疫苗、核酸疫苗；所述核酸疫苗为mRNA疫苗、DNA疫苗。

上文中，所述核酸疫苗为mRNA疫苗或DNA疫苗。

第二方面，本发明提供了带状疱疹疫苗，

所述带状疱疹疫苗为亚单位疫苗，其抗原为融合蛋白；

所述融合蛋白包括VZV-gE蛋白和人IgG4 Fc；

所述VZV-gE蛋白为如下任一种：

(a1)SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(a3)将(a1)-(a2)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

(a4)与(a1)-(a2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

所述人IgG4 Fc蛋白为如下任一种：

(b1)SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

(b2)在(b1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(b3)将(b1)-(b2)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

(b4)与(b1)-(b2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。

上文带状疱疹疫苗中，所述融合蛋白为如下任一种：

(c1)SEQ ID NO.3所示的蛋白质；

(c2)在(c1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(c3)将(c1)-(c2)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

(c4)与(c1)-(c2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。

上文带状疱疹疫苗中，所述铝佐剂为AL(OH)₃或ALPO₄。

上文带状疱疹疫苗中，所述佐剂由铝佐剂和CpG佐剂组成；

所述铝佐剂为AL(OH)₃；

所述CpG佐剂为SEQ ID NO:5所示的核酸分子，且所有核苷酸残基均硫代修饰。

上文带状疱疹疫苗，所述抗原和所述佐剂混合包装或单独包装。

上文带状疱疹疫苗中，所述抗原、所述AL(OH)₃(AL)和所述CpG佐剂质量比为2.5-30：10-200：1-10。

上文带状疱疹疫苗中，所述带状疱疹疫苗中，所述抗原、所述AL(OH)₃(AL)和所述CpG佐剂质量比为7.5：50：5。

上文的疫苗可以分装入2ml西林瓶内(或预填充玻璃注射器内)，每瓶0.5ml(或1.0ml)。

在本发明的实施例中，每100ul双佐剂疫苗制剂中，抗原含量2.5-30μg，氢氧化铝佐剂10-200ug，CpG佐剂1-10μg均较佳，具体举例每100ul双佐剂疫苗制剂中，抗原含量5μg，氢氧化铝佐剂50ug，CpG佐剂2μg。

每500ul双佐剂疫苗制剂中，抗原含量75μg，氢氧化铝佐剂500ug，CpG佐剂50μg均较佳。

每50ul双佐剂疫苗制剂中，抗原含量7.5μg，氢氧化铝佐剂50ug，CpG佐剂5μg均较佳。

第二个方面，本发明提供了第一方面中的所述CpG佐剂；

第三个方面，本发明提供了第一方面中的所述CpG佐剂和铝佐剂在如下任一种的应用：

1)制备带状疱疹疫苗中的应用；

2)提高带状疱疹疫苗的免疫原性。

第四个方面，本发明提供了一种制备第一方面带状疱疹疫苗的方法，包括如下步骤：将第一方面中的所述抗原和所述佐剂混匀，得到带状疱疹疫苗。

上文中的混匀为将第一方面中的所述抗原和所述佐剂按照上文所需质量比混匀。

第五方面，本发明提供了第一方面所述的融合蛋白，和，第一方面中的所述铝佐剂和所述CpG佐剂在如下任一中的应用：

1)制备预防或治疗带状疱疹的产品；

2)制备中和带状疱疹病毒的产品；

3)制备诱导机体对带状疱疹病毒产生体液免疫和/或细胞免疫的产品；

4)制备带状疱疹病毒抗体。

上文的应用中，所述产品为疫苗。

第六方面，本发明提供了第一方面中的所述融合蛋白或其在如下任一中的应用：

1)作为带状疱疹疫苗抗原；

2)制备预防或治疗带状疱疹的产品；

3)制备中和带状疱疹病毒的产品；

4)制备诱导机体对带状疱疹病毒产生体液免疫和/或细胞免疫的产品；

5)制备带状疱疹病毒抗体。

上文带状疱疹病毒抗体具有中和带状疱疹病毒的功能。

本发明具有如下的有益效果：

1、本发明的疫苗中使用人IgG4Fc突变体，减少单分子形成的同时减少了ADCC效应、克服生产过程中出现末端不均一的问题，保证了本发明疫苗更安全和稳定；

2、VZV-gE与人IgG4Fc连接形成二聚体有利于促进表达和纯化，同时抗原提呈给DC细胞提高免疫反应水平，此外gE形成二聚体增加了分子量有利于增加gE的免疫原性；

3、本发明使用VZV gE的膜外区与人IgG4 Fc片段融合，在哺乳类动物细胞(CHO)获得了高效表达的分泌型的gE-Fc融合蛋白，表达量达到3g/L；

4、本发明的CHO细胞表达的重组VZV-gE-IgG4Fc融合蛋白质为糖基化蛋白，保持了天然gE蛋白质的空间结构，免疫原性好，细胞免疫检测IL-2和IFN-γ均有作用；且该融合蛋白与双佐剂组合使用免疫原性显著增加；

5、本发明CpG-cjx1佐剂在细胞免疫方面发挥了重要作用，同时，本发明CpG-cjx1佐剂与铝佐剂联用在激发细胞免疫方面具有显著提高作用。

本发明的疫苗使用常规的铝佐剂和CpG佐剂联合，价格低廉容易获得，克服了GSK研制的Shingrix疫苗配方复杂，抗原需要冻干并且需要和佐剂分开，以及佐剂原材料稀缺，价格昂贵等缺陷。同时，由于GSK研制的Shingrix(GSK-shingrix)抗原需要冻干并且需要和佐剂分开，导致在制备抗原、制剂工艺以及后续的使用上均较为麻烦。本发明的抗原和佐剂可以直接混合，预灌充注射器分装制剂，非常便利。

附图说明

图1为VZV-gE-Fc纯化结果。

图2为不同铝盐佐剂配制的重组VZV-gE-Fc疫苗免疫小鼠的免疫效果对比。

图3为不同剂量氢氧化铝佐剂的免疫效果对比。

图4为CpG ODN体外刺激小鼠脾细胞通过MTT法的检测结果。

图5为CpG ODN体外刺激人PBMC通过MTT法的检测结果。

图6为不同种类CpG佐剂与铝佐剂配合使用的免疫效果对比。

图7为不同剂量CpG佐剂与铝佐剂配合使用的免疫效果对比。

图8为不同剂量抗原的双佐剂疫苗的免疫效果对比。

图9为不同疫苗组分免疫效果对比(ELISA)。

图10为双佐剂疫苗免疫后ELISPOT细胞免疫效果评价，其中，图10a为IFN-γ的检测结果，图10b为IL-2的检测结果。

图11为双佐剂VZV-gE-Fc重组带状疱疹疫苗(VZV-Genevax)和葛兰素史克欣安立适Shingrix(GSK-Shingrix)免疫小鼠免疫效果对比，其中，图11a为ELISA测定的一免和二免后的结合抗体效价，图11b为ELISPOT细胞免疫IFN-γ的检测结果。

图12为双佐剂VZV-gE-Fc重组带状疱疹疫苗(VZV-Genevax)和葛兰素史克欣安立适Shingrix(GSK-Shingrix)免疫食蟹猴免疫效果对比，其中，图12a为ELISA测定的一免和二免后的结合抗体效价，图12b为流式细胞术试验测定CD4/CD8T细胞表达IFN-γ、IL-2、TNFa(Th1)和IL-4(Th2)细胞因子水平，图12c为ELISPOT细胞免疫IFN-γ的检测结果。

具体实施方式

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

下述实施例中的C57BL/6雌性小鼠均购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。

实施例1、融合蛋白VZV-gE-Fc的制备

本实施例的重组带状疱疹亚单位疫苗抗原靶点选择VZV-gE(SEQ ID NO.1)。在抗原结构设计时，加入了人IgG4 Fc片段(SEQ ID NO.2)，将VZV-gE蛋白和人IgG Fc片段通过连接肽融合，得到VZV-gE-Fc融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。两条相同的VZV-gE-Fc融合蛋白通过二硫键连接成同源二聚体。

设计偏向CHO-K1细胞的高表达的VZV-gE-Fc融合蛋白编码基因的序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

1、重组载体的制备

通过金斯瑞生物技术有限公司合成基因片段VZV-gE-Fc(SEQ ID NO.4)并两端添加HindIII、Not I酶切位点，HindIII、Not I酶切合成基因片段VZV-gE-Fc和PKS001空载体(购自中山康晟生物有限公司，货号A13201)，酶切后回收目的条带和载体大片段，将两者连接，转化至大肠杆菌top10感受态细胞，转化菌用含有氨苄的LB液体筛选培养基复壮后扩大培养，37℃振荡培养过夜后用无内毒素质粒大提试剂盒(增强型)(天根生化科技(北京)有限公司，货号DP120-01)提取质粒，经测序鉴定无误，成功构建的重组表达载体命名为PKS001gEFc。

2、融合蛋白VZV-gE-Fc的表达

将含有VZV-gE-Fc基因的重组表达载体PKS001gEFc，采用电转方法转染CHO-K1(中山康晟生物有限公司，货号A14101)细胞，转染后CHO-K1细胞在培养基CD04(中山康晟生物有限公司,货号A11004)中培养。转染48小时后，用含有25μM蛋氨酸亚砜亚胺(Methionine Sulphoximine，简称：MSX sigma-Aldrich公司产品，货号：M5379)的培养基CD04(即选择培养基)置换转染后的CHO-K1细胞，按照每孔10000个细胞/200μl接种至96孔细胞培养板中，放置于37℃细胞培养箱中静置培养2-3周，在光学显微镜下查看并标记单克隆细胞的培养孔，当细胞长满至超过培养孔面积的三分之二时，通ELISA筛选出15株表达较高的细胞株，这15株单克隆细胞通过摇瓶补料培养后收获的上清经Protein A亲和层析一步纯化后，进行理化分析(采用SEC检测分析目的VZV-gE-Fc蛋白聚集体、二聚体及小分子碎片的含量)，基于产量和质量最终确定三株细胞1E11、3B7和2D10作为后续开发的候选细胞株。

根据细胞的连续传代稳定性研究、生长状态、倍增时间及表达量，最终确定将3B7细胞株作为生产用细胞株(采用细胞目的基因测序分析，未见碱基插入、缺失、突变，与目的基因全长序列进行DNA序列比对，确认在细胞中目的基因DNA序列完全正确)。

复苏3B7细胞至摇瓶中培养，在第3、5、7、9、11天，给细胞添加补料和葡萄糖，第6天开始细胞培养温度降至33℃，当细胞活率降至50％左右，12000r/min高速离心30min时间去除细胞及细胞碎片，收集细胞培养物上清液。培养上清液经过检测最终的产物表达量达到3g/L以上。

将上述3B7细胞的培养物上清液经0.45μm滤膜过滤后采用Protein A凝胶色谱柱亲和纯化，低pH病毒灭活后采用疏水层析、然后再用DEAE Sepharose 4Fast Flow用不同浓度的NaCl溶液进行梯度洗脱，得到目标蛋白溶液。

目标蛋白溶液经过SDS-PAGE电泳检测，结果如图1所示，可以看出，得到大小为110KD左右的目标蛋白，其大小表明VZV-gE-Fc融合蛋白形成了同源二聚体，目标蛋白为VZV-gE-Fc融合蛋白二聚体。

进一步WB检测和质谱测序确定得到了目标蛋白VZV-gE-Fc，经SEC检测分析目标蛋白的纯度达到97％以上。

实施例2、疫苗组的筛选及免疫原性研究

一、疫苗的制备

以实施例1纯化得到的VZV-gE-Fc融合蛋白二聚体为免疫原，具体为将实施例1纯化得到的VZV-gE-Fc融合蛋白二聚体用含有20mM组氨酸盐酸、140mM精氨酸盐酸盐和0.02％(体积百分含量)聚山梨酯80的稀释缓冲溶液(该溶液的溶剂为水，溶质为对应浓度的组氨酸盐酸、精氨酸盐酸盐和聚山梨酯80，pH值为6.0)稀释，得到0.5mg/ml稀释抗原。

1、铝佐剂疫苗制备

室温条件下将0.5mg/ml的稀释抗原与氢氧化铝铝佐剂混悬液或磷酸铝佐剂混悬液(其中铝含量10mg/ml，溶质为氢氧化铝或磷酸铝，溶剂为PBS；购自长春生物制品研究所)按照不同体积置于加有转子的玻璃瓶中150r/min混合均匀，得到不同铝盐佐剂疫苗，其中抗原与佐剂的质量比如表1或表2所示。

2、CpG佐剂疫苗制备

室温条件下将0.5mg/ml的稀释抗原和10mg/ml表3所示各个CpG的溶液(溶剂为生理盐水，溶质为CpG)按照不同体积置于加有转子的玻璃瓶中低速混合均匀，得到不同CpG佐剂疫苗，其中抗原与佐剂的质量比如表7所示。

3、双佐剂疫苗制备

室温条件下将0.5mg/ml的稀释抗原、铝佐剂(氢氧化铝混悬液(其中铝含量10mg/ml)、10mg/ml浓度CpG的溶液按照不同体积置于加有转子的玻璃瓶中低速混合均匀，得到不同双佐剂疫苗，其中抗原与佐剂的质量比如表4或表5或表6或表7所示。

将上述制备的疫苗，无菌条件下分装入2ml西林瓶内(或预填充玻璃注射器内)，每瓶0.5ml(或1.0ml)，密封后放置于2～8℃避光保存。

二、免疫

取出上述一制备的疫苗，以C57BL/6小鼠(购自斯贝福(北京)生物技术有限公司)为动物模型开展了免疫原性研究。

选择6-8周龄C57BL/6小鼠随机分组，每组5只小鼠，肌肉注射上述一制备的疫苗，并设置疫苗组、蛋白组和佐剂组(具体按照下述四中的各组设置)，在0、3周(以第一次免疫当天记作第0天，免疫当天起的一周，记作免疫的第1周)进行二次免疫(免疫剂量和方式如下述四中所示)，二次免疫间隔21天。

在免疫第3、5周采血，第5周取脾脏。

三、ELISA法检测血清中抗VZV-gE-Fc蛋白的抗体滴度(即总IgG)

采用ELISA法检测血清中的抗VZV-gE-Fc蛋白的抗体滴度(即总IgG)，结果显示本发明的VZV gE-人IgG Fc蛋白(VZV-gE-Fc)所制备得到的疫苗组合免疫原性非常好，可作为潜在的重组带状疱疹候选疫苗抗原，具体操作如下：

I、ELISA试剂配制

ELISA包被液(1X)配制：取ELISA包被液(10X)(购自索莱宝，货号：C1055)用无菌蒸馏水稀释至1X。

PBS配制：取出PBS powder(购自索莱宝，货号：P1003)，每袋用2L无菌蒸馏水溶解。

洗液：为PBST(含0.05％Tween-20的PBS)，按照如下制备：量取1L过滤后的PBS到蓝盖瓶中，加入500μLTween-20，充分混匀，存于2-8℃备用。根据实际情况，按此方法配制所需体积的PBST。注：PBST现用现配，当天使用。

封闭液或样品稀释液(含5％脱脂奶粉的PBS)：称取PBS体积的5％的脱脂奶粉(奶粉质量/g＝PBS体积/mLx5％)，将从2-8℃取出的PBS平衡至室温，量取所需体积的PBS溶液至已加入奶粉的离心管中，然后充分溶解，备用。注：封闭液和样品稀释液现用现配，当天使用。

稀释羊抗鼠二抗：将规格为1mL的二抗(购自CST，货号7076s)平衡至室温，然后进行分装，放置在-20℃±5℃保存。每次使用之前取出，按1:4000进行稀释，此处稀释液为PBS。注：稀释后的二抗，当天使用。

TMB显色液1购自湖州英创生物科技有限公司，货号TMB-S-001。

终止液，购自索莱宝，货号C1058。

II、ELISA检测血清结合抗体滴度：

1)包被：取VZV-gE-his抗原(SEQ ID NO.1所示的VZV-gE的C末端添加6个his得到的蛋白，北京吉诺卫制品有限公司制备，浓度为2mg/ml)用ELISA包被液(1X)稀释到1000ng/mL，包被酶标版，100μl/孔，4℃放置过夜。

2)封闭：将包被板从4℃取出后，洗板3次，每次洗液体积为300μl/孔，洗完后若孔内残留洗液，则要在吸水纸上拍干；然后在已包被孔中加入预先配制的封闭液，300μl/孔，盖封板膜，37℃，90min。

3)血清稀释：在离心管内用样品稀释液将待检血清稀释至合适浓度，得到待检样品。

4)加样：将封闭后的包被板洗板3次，每次洗液体积为300μl/孔，洗完后若孔内残留洗液，则要在吸水纸上拍干。将已稀释好的各个浓度的待检样品依次加入至样品孔中，100μl/孔；加入100μl样品稀释液作为空白对照(Blk)，设置5个复孔，盖上封板膜，37℃孵育60min。

5)加二抗：弃去样品，洗板3次，每次洗液体积为300μl/孔，洗完后若孔内残留洗液，则要在吸水纸上拍干；加入稀释羊抗鼠二抗，100μl/孔，盖封板膜，37℃孵育60min。

6)显色：将96孔板洗板3次，每次洗液体积为300μl/孔，洗完后若孔内残留洗液，则要在吸水纸上拍干，加单组分TMB显色液1(提前从4℃取出，平衡至室温)，100μl/孔，25℃避光显色，15min。

7)终止：显色后立即加入终止液终止反应，50μl/孔，轻晃混匀。

8)检测：将酶标板放入酶标仪，在450nm波长下测吸光度值。

9)判定：大于阴性小鼠OD值的2.1倍判为阳性。

注：以下检测结合抗体效价的ELISA方法都同上。

四、ELISA检测结果

A：筛选最佳的铝佐剂

取6-8周龄C57BL/6雌性小鼠15只，随机分为3组，按表1设计的免疫方案免疫动物，通过检测1、2、3组二免14d(以第二次免疫当天记作二免第0天)ELISA效价，筛选到最佳铝佐剂。

表1为不同铝盐佐剂配制的重组VZV-gE-Fc疫苗免疫小鼠的免疫方案

上表中的组1为肌肉注射PBS；

上表中的组2和组3分别为肌肉注射不同铝佐剂疫苗。

结果见图2，可以看出，不同铝佐剂疫苗中的两种常用的铝佐剂使用无显著性差异，采用AL(OH)₃的铝佐剂疫苗在二免时IgG滴度略高。PBS免疫效果过低不在图中显示。

B：筛选最佳的铝佐剂剂量

取6-8周龄C57BL/6雌性小鼠25只，随机分为5组，按表2设计的免疫方案免疫动物，通过检测4、5、6、7、8、9组一免21d(以第一次免疫当天记作一免第0天)和二免14d(以第二次免疫当天记作二免第0天)结合抗体效价，筛选到铝佐剂最佳剂量。

表2为筛选最佳的铝佐剂剂量的免疫方案

上表中的组4为肌肉注射PBS；

上表中的组5-组9分别为肌肉注射不同剂量的铝佐剂疫苗。

结果如图3所示，含有10ug-200ug铝的铝佐剂疫苗的免疫效果没有无显著性差异。PBS免疫效果过低不在图中显示。

C：筛选最佳的CpG佐剂

1、CpG ODN序列的设计与合成

根据CpG ODN序列设计原则，共设计合成4条候选CpG ODN序列(如表3所示)。将4条候选CpG ODN序列合成后进行全链硫代修饰(用*表示)，合成后利用常规ULTRA-PAGE方法进行纯化，溶于生理盐水，-20℃冰箱中保存备用。其中序列编号1018为阳性对照，为Dynavax公司ISS1018序列。

表3为CpG ODN序列

2、不同CpG ODN序列对小鼠脾细胞免疫刺激活性比较

主要实验试剂：RPMI 1640培养液(Sigma产品，货号：R8758)含L－谷氨酰胺、10％小牛血清、青霉素、链霉素和β－巯基乙醇，4℃储存备用；MTT(Sigma产品，货号：11465007001)：用PBS配成质量浓度为5mg/mL的液体，过滤除菌，4℃储存备用；淋巴细胞分离液购自达科为生物技术有限公司。

实验动物：4～6周龄雌性Balb/c小鼠，购自北京斯贝福(北京)生物技术有限公司。

实验方法：

(1)拉颈处死小鼠，使用75％酒精对其表面进行消毒，无菌条件下用剪刀剪开小鼠左侧中上部皮毛，裸露出皮下缔结组织，剪开组织使脾脏暴露，尽量去除脂肪等不必要成分，取得的完好的脾依次放入装有2mL培养基的六孔板孔内，盖子上做好标记；

(2)5mL注射器手柄在纱网包裹的单只脾脏上研磨，无肉眼可见的组织残留时，将悬液转移到15mL离心管中，并用2mL培养基冲洗六孔板底，一并转移到离心管中，对每个脾都进行如上操作；

(3)在35mm培养皿中放入4mL小鼠淋巴分离液(取用前恢复至室温并摇匀)，研磨；

(4)把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到15mL离心管中，覆盖500μL-1000μL的RPMI 1640培养基(保持液面分界明显)；

(5)室温，水平转子800g离心力离心30min，离心结束后细胞分层；

(6)洗出淋巴细胞层，再加入10mL RPMI 1640培养基，颠倒洗涤。室温，250g离心10min收集细胞；

(7)倾倒上清液，用培养液重悬细胞，计数。接种于24孔板，5×10⁵个脾细胞/孔。

将表3所示的合成的CpG ODN序列用去离子水稀释后以20μg/mL的终浓度加入上述7)获得的脾细胞中作为刺激物，于37℃、5％CO₂培养72h后以MTT法检测CpG ODN诱导小鼠脾细胞增殖水平(检测各组A值)，对CpG ODN佐剂的免疫调节活性进行筛选分析。以加入PBS作为对照(control)。

结果如图4所示，显示4条硫代序列中，各CpG ODN的A值均高于免疫PBS的脾细胞阴性对照组(control)，其中CpG-cjx1的A值达到0.511，与阳性对照ISS1018序列(图中记作1018s)A值(0.521)接近，显示出较好的针对小鼠脾细胞的免疫刺激作用。

3、不同CpG ODN序列对人PBMC免疫刺激活性比较

人PBMC中含有丰富的T、B淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞，这些免疫细胞是人体应对外来病原体感染的主要功能细胞。

以Ficoll分离液将正常健康人PBMC从新鲜全血中分离，悬于含10％FBS的1640培养基中，接种于24孔板，5×10⁵个细胞/孔。将表3所示的合成的4条CpG ODN序列用去离子水稀释后分别以20μg/mL的终浓度加入PBMC细胞作为刺激物，每个序列设3个复孔。于37℃、5％CO₂培养72h后以MTT法检测CpG ODN诱导PBMC细胞增殖水平(检测各组A值)，对自行设计的CpG ODN佐剂的免疫调节活性进行筛选分析。以加入PBS作为对照(control)。

结果如图5所示，4条硫代序列中，各CpG ODN的A值均高于空白PBMC细胞阴性对照组(control)，其中CpG-cjx1的A值接近0.401，与阳性对照ISS1018序列(图中记作1018s)A值(0.393)接近，显示出较好的针对人PBMC的免疫刺激作用。

上述结果表明，利用设计出的4条不同CpG ODN序列对小鼠脾细胞和人PBMC进行体外刺激，结果表明4条CpG ODN序列对小鼠脾细胞和人PBMC体外刺激A值均高于阴性对照组，其中CpG-cjx1与阳性对照Dynavax公司的ISS1018刺激免疫效果相当，对小鼠脾细胞和人PBMC均显示出较好的免疫刺激作用，CpG-cjx1作为候选佐剂。

D：筛选最佳的双佐剂

取6-8周龄C57BL/6雌性小鼠25只，随机分为5组，按照如下表4的方式免疫C57BL/6雌性小鼠。通过检测10-14组一免21d(以第一次免疫当天记作一免0天)和二免14d(以第二次免疫当天记作二免0天)结合抗体效价，筛选到最佳的CpG佐剂。

采用A和B筛选出最佳铝佐剂AL(OH)₃及其剂量与上述C筛选的候选CpG佐剂作为双佐剂，其中，CpG佐剂为CpG-cjx1，Dynavax公司ISS1018序列(CpG1018)和CpG7909(SEQ IDNO.10:5’-TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT-3’，生工合成)。

表4为筛选最佳的CpG佐剂的免疫方案

上表中的组10和组14均为肌肉注射PBS；

上表中的组11-组13分别为肌肉注射不同双佐剂疫苗。

结果如图6所示，双佐剂中使用AL(OH)₃配合CpG-cjx1免疫效果最佳。

D：筛选双佐剂中最佳的CpG佐剂剂量

取6-8周龄C57BL/6雌性小鼠25只，随机分为5组，按表5设计的免疫方案免疫动物，通过检测15、16、17、18、19组一免21d(以第一次免疫当天记作一免0天)和二免14d(以第二次免疫当天记作二免0天)结合抗体效价，筛选到CpG佐剂最佳剂量。

表5为筛选到最佳的CpG佐剂剂量的免疫方案

上表中的组15为肌肉注射PBS；

上表中的组16-组19分别为肌肉注射不同双佐剂疫苗。

结果如图7所示，双佐剂中CpG-cjx1佐剂的剂量在1μg-10μg范围内无显著性差异。

E：探索最佳的抗原剂量

取6-8周龄C57BL/6雌性小鼠25只，随机分为5组，按表6设计的免疫方案免疫动物，通过检测20、21、22、23、23、24、25组一免21d和二免14d结合抗体效价，筛选到最佳抗原剂量。

表6为小鼠上探索最佳的抗原剂量的免疫方案

上表中的组20为肌肉注射PBS；

上表中的组21-组25分别为肌肉注射不同剂量的双佐剂疫苗。

结果如图8所示，双佐剂中2.5-30μg的抗原剂量免疫效果均无显著性差异。

F：体液免疫和细胞免疫测定进一步筛选疫苗处方

取6-8周龄C57BL/6雌性小鼠25只，随机分为5组，按表7设计的免疫方案免疫动物，0,21d肌肉注射免疫两次，二免14d取脾，分离脾淋巴细胞，通过ELISPOT检测26、27、28、29、30组二免14d脾淋巴细胞IFN-γ、IL-2因子表达。

小鼠脾脏ELISPOT检测方法：

根据Murine IFN-γSingle-Color Enzymatic ELISPOT Assay(CTL货号mIFNgp-2M/2)试剂盒说明书对二免14d小鼠的脾淋巴细胞检测。具体步骤如下：

1、脾组织加入5ml小鼠淋巴细胞分离液，轻轻研磨，200目尼龙网过滤至洁净离心管中，在液面以上轻轻加入1mlPBS，以800g，30min，升速快降速慢离心，收集中间淋巴细胞层。

2、加入5ml PBS洗涤细胞，500g，离心5min，弃上清。

3、CTL-Test Medium(补充L-谷氨酰胺终浓度3mM)培养基重悬细胞，细胞计数(流式细胞仪计数)后调整细胞浓度为5×10⁶/ml。

4、准备2倍终浓度的CTL-Test Medium：在26组、27组、28组、29组、30组、的样本管加入VZV-gE-his抗原(2倍终浓度10ug/ml)、肽库(2倍终浓度10ug/ml)。铺到对应的ELISPOT板中，另外预留阴性对照孔(不加任何刺激物)和阳性对照孔(加入PMA和Ionomycin)。37℃，5％CO2孵育20min。

其中肽库购自诺唯赞生物科技有限公司，产品名称Varicella-Zoster Viruspeptide pool，货号：DD9120。

5、加入细胞100ul/孔，相当于5×10⁵/孔，37℃，5％CO2培养48h。

6、用200ul/孔PBS清洗板2次，再用200ul/孔0.05％Tween-PBS清洗板3次。

7、加入anti-murine IFN-γ检测液80ul/孔，室温孵育2h。

8、用200ul/孔0.05％Tween-PBS清洗板3次。

9、加入Tertiary solution 80ul/孔，室温孵育30min。

10、用200ul/孔0.05％Tween-PBS清洗板2次，再用200ul/孔纯水清洗板2次。

11、加入Blue Developer Solution 80ul/孔，室温孵育15min。

12、倒掉液体，用纯水冲洗孔板3次终止反应。

13、ELISPOT板读值。

同时通过检测26、27、28、29、30组一免21d和二免14d结合抗体效价以进一步筛选疫苗处方。

表7为细胞免疫方案设计

上表中的组26为肌肉注射PBS；

上表中的组27-组30分别为肌肉注射不同种类的疫苗。

结合抗体效价结果由图9所示，双佐剂疫苗(组30)结合抗体效价优于单佐剂疫苗组(组28和29)和单抗原疫苗组(组27)。

IFN-γ和IL-2的检测结果由图10a、图10b所示，双佐剂疫苗组刺激极显著优于单佐剂组和不加佐剂的抗原组。

上述结果表明，采用双佐剂疫苗组免疫效果最好，且每100ul双佐剂疫苗制剂中，抗原含量2.5-30μg，氢氧化铝佐剂10-200ug，CpG佐剂1-10μg均较佳，具体举例可以抗原含量5μg，氢氧化铝佐剂50ug，CpG佐剂2μg。

实施例3、双佐剂VZV-gE-Fc重组带状疱疹疫苗(VZV-Genevax)和GSK研制的Shingrix(VZV-GSK)免疫效果对比

将本发明的双佐剂VZV-gE-Fc重组带状疱疹疫苗(命名为VZV-Genevax)和葛兰素史克欣安立适，即GSK研制的Shingrix(VZV-GSK)免疫效果对比。

针对带状疱疹，国内尚无带状疱疹疫苗上市，国外默克公司的ZOSTAVAX和GSK公司的Shingrix两种带状疱疹疫苗获准上市使用。其中，GSK研制的Shingrix是目前带状疱疹疫苗获准上市使用的疫苗中效果最好的，鉴于Shingrix优秀的预防效果，美国CDC推荐Shingrix取代默沙东带状疱疹疫苗Zostavax。然而，GSK的VZV疫苗Shingrix使用的佐剂是AS01B，其中QS21成分限量供应导致Shingrix每剂价格达到150-200美元。这个疫苗使用的时候需将抗原重组gE抗原(CHO细胞表达)单独冻干包装，然后将AS01B单独包装，注射人体前需要将佐剂与抗原混合。通过对比实验，发现本发明的疫苗一免后起效更快，二免检测比GSK研制的Shingrix血清抗体效价也有所提高。同过Elispot试验IFN-r因子的结果显示,本发明的疫苗细胞免疫优于GSK研制的Shingrix。

具体实验和结果如下：

一、双佐剂VZV-gE-Fc重组带状疱疹疫苗的制备

人用双佐剂VZV-gE-Fc重组带状疱疹疫苗(VZV-Genevax)每0.5ml按照如下方法制备：室温条件下将1.5ml 0.5mg/ml浓度稀释抗原VZV-gE-Fc、0.5ml铝佐剂(氢氧化铝混悬液(其中铝含量10mg/ml，购自长春生物制品研究所)、50ul 10mg/ml浓度CpG-cjx1溶液混合均匀，得到双佐剂疫苗，其中抗原VZV-gE-Fc的含量为75μg/500ul、AL(OH)₃的含量为500μg/500ul和CpG-cjx1的含量为50μg/500ul。

VZV-Genevax和GSK研制的Shingrix在小鼠上的免疫剂量均为人用剂量1/10，即免疫50ul/只。

免疫小鼠的50ul VZV-gE-Fc重组带状疱疹疫苗(VZV-Genevax)疫苗里包含7.5ugVZV-gE-Fc，50ugAL(OH)₃和5μgCpG-cjx1，制备方法与上述人用双佐剂VZV-gE-Fc相同。

上述双佐剂VZV-gE-Fc疫苗中，抗原和铝佐剂和CpG-cjx1佐剂质量比为7.5:50:5。

二、小鼠免疫

取6-8周龄C57BL/6雌性小鼠18只，随机分为3组，每组6只。按表8设计的免疫方案免疫动物，用ELISA方法和检测一免21d和二免14d的VZV特异性IgG结合抗体效价；通过ELISPOT检测31、32、33组二免14d脾淋巴细胞IFN-γ因子表达(方法同前)。

表8为双佐剂VZV-gE-Fc重组带状疱疹疫苗和GSK研制的shingrix小鼠免疫方案

ELISA效价结果见图11a所示，ELISPOT结果见图11b所示。结果表明，本发明的VZV-Genevax免疫效果优于GSK-Shingrix。

三、免疫食蟹猴

表9为双佐剂VZV-gE-Fc重组带状疱疹疫苗和GSK研制的shingrix食蟹猴免疫方案

取15只健康食蟹猴，雌雄随机，2-7岁，购买并试验与广西南宁灵康赛诺科生物科技有限公司。动物合格证编号：N0.45002000000032.随机分为3组，每组5只。试验分组见表9：

疫苗试验组(VZV-Genevax)：人用双佐剂VZV-gE-Fc重组带状疱疹疫苗(75μg VZV-gE-Fc+0.5mgAL(OH)₃+0.05mgCpG-cjx1/0.5mL)，0.5mL/剂/只，免疫5只；

对照疫苗试验组(GSK-shingrix)：50μg VZV-gE-Fc+ASO1B/0.5mL，0.5mL/剂/只，免疫5只；

PBS对照组:0.5mgAL(OH)₃+0.05mgCpG-cjx1/0.5mL(与人用双佐剂VZV-gE-Fc重组带状疱疹疫苗相比，仅不添加抗原),0.5mL/剂/只，免疫5只。

在第0天(第一次免疫当天记作第0天)和第28天(第一次免疫当天记作第0天)免疫两次，用ELISA方法检测一免21d和二免14d的VZV特异性IgG结合抗体效价；末次免疫后14d取5mL后肢静脉血，送至南宁维尔凯生物科技有限公司，分离淋巴细胞，通过流式细胞术试验测定CD4/CD8T细胞表达IFN-γ、IL-2、TNFa(Th1)和IL-4(Th2)细胞因子水平。通过ELISPOT检测34、35、36组二免14d外周血淋巴细胞IFN-γ因子表达。ELISPOT检测试剂盒(货号：MBF3421M-4AST-2，品牌：Mabtech)，购自北京元唐盛兴科技有限公司。

上述流式细胞检测食蟹猴Th细胞实验方法如下：

1、实验试剂

表10为实验试剂

2、实验步骤

5ml血液样本和等体积生理盐水混合，倾斜45°用滴管缓缓将稀释后的样本加入到等体积淋巴细胞分离液(根据样本种属来选择合适试剂)的15ml离心管中，要求两层分明。

上升速度2，下降速度2，离心力为1000g离心30min。

用滴管将PBMC层吸至另一15ml离心管中，加入11mL 1640培养基混匀，1200rpm离心5min，弃上清。

加入5mL 1640培养基清洗一次，1200rpm离心5min，弃上清。

用无血清培养基重悬细胞，计数，将细胞密度调整为1*10e7个/mL。

设阴性孔、实验孔、阳性孔，均加入100ul细胞和FBA(阻断剂)，分别加入50ul无血清培养基、含Vzv-his(终浓度5ug/ml)和肽库(终浓度5ug/ml)的无血清培养基、含PHA的无血清培养基。37℃,5％CO2孵育过夜。

孵育结束后，收集细胞，离心弃上清。

细胞重悬于100ul含1‰Zombie Red的PBS，4℃孵育20min。

加入含1％FBS的1ml PBS，1200rpm离心5min，弃上清。

细胞重悬于100ul含1％FBS的PBS，加入CD3、CD4、CD8抗体，混匀，4℃孵育20min。

加入1ml PBS清洗一次，1200rpm离心5min，弃上清。

300ul PBS重悬，加入450ml Fix/Perm Buffer，混匀，室温避光孵育20min。

加入1ml Perm/Wash Buffer，350g离心5min，弃上清。

重复清洗一遍。

用100ul Perm/Wash Buffer重悬细胞，加入IFNg、IL-2、IL4抗体，混匀，4℃避光孵育45min。

每管加入1ml Perm/Wash Buffer，混匀，1200rpm离心5min，弃上清。

200ul PBS重悬，上机。

按表9设计的免疫方案免疫动物，用ELISA方法检测一免21d和二免14d的VZV特异性IgG结合抗体效价，结果见图12a；通过流式细胞术试验测定外周血淋巴细胞CD4/CD8T细胞表达IFN-γ、IL-2、TNFa(Th1)和IL-4(Th2)细胞因子水平，结果见图12b。通过ELISPOT检测二免14d外周血淋巴细胞IFN-γ因子表达，结果见图12c。

从上述图12a可以看出，上述食蟹猴免疫疫苗后的结果证明，本发明的疫苗(VZV-Genevax)一免后起效更快，二免检测比GSK研制的Shingrix(GSK-shingrix)血清抗体效价也有所提高。图12b显示本发明的疫苗(VZV-Genevax)比GSK研制的Shingrix(GSK-shingrix)外周血淋巴CD4/CD8T细胞表达IFN-γ、IL-2、TNFa明显升高，说明本发明的疫苗(VZV-Genevax)引发强烈的CD4+和CD8+T细胞反应，诱导Th1免疫应答，具有突出的疫苗激活细胞免疫反应优势；图12c中IFN-γ的检测显示，本发明的疫苗(VZV-Genevax)比GSK研制的Shingrix(GSK-shingrix)刺激细胞分泌IFN-γ多，说明本发明的疫苗(VZV-Genevax)具有较高的细胞免疫水平，可有效发挥抗病毒和免疫调控的作用。

上述表明，本发明制备的双佐剂VZV-gE-Fc重组带状疱疹疫苗可以诱发机体的体液免疫和细胞免疫。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种带状疱疹疫苗，其包括抗原和佐剂；

所述佐剂为铝佐剂、CpG佐剂或二者的结合；

所述CpG佐剂为SEQ ID NO:5-8中任一条序列所示的核苷酸；

所述带状疱疹疫苗为带状疱疹的灭活疫苗、减毒活疫苗、病毒载体疫苗、亚单位疫苗、重组疫苗、多糖疫苗、结合疫苗、类毒素疫苗或核酸疫苗。

2.根据权利要求1所述的带状疱疹疫苗，其特征在于：

所述带状疱疹疫苗为亚单位疫苗，其抗原为融合蛋白；

所述融合蛋白包括VZV-gE蛋白和人IgG4 Fc；

所述VZV-gE蛋白为如下任一种：

(a1)SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(a3)将(a1)-(a2)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

(a4)与(a1)-(a2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

所述人IgG4 Fc蛋白为如下任一种：

(b1)SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

(b2)在(b1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(b3)将(b1)-(b2)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

(b4)与(b1)-(b2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。

3.根据权利要求1或2所述的带状疱疹疫苗，其特征在于：

所述铝佐剂为AL(OH)₃或ALPO₄。

4.根据权利要求1-3中任一所述的带状疱疹疫苗，其特征在于：

所述佐剂由铝佐剂和CpG佐剂组成；

所述铝佐剂为AL(OH)₃；

所述CpG佐剂为SEQ ID NO:5所示的核酸分子，且所有核苷酸残基均硫代修饰。

5.根据权利要3或4所述的带状疱疹疫苗，其特征在于：

所述带状疱疹疫苗中，所述抗原、所述AL(OH)₃和所述CpG佐剂质量比为2.5-30：10-200：1-10。

6.根据权利要求3-5中任一所述的带状疱疹疫苗，其特征在于：

所述带状疱疹疫苗中，所述抗原、所述AL(OH)₃和所述CpG佐剂质量比为7.5：50：5。

7.权利要求1-6任一中的所述CpG佐剂。

8.权利要求1-6任一中的所述CpG佐剂和权利要求3-6任一中的所述铝佐剂在如下任一种的应用：

1)制备带状疱疹疫苗中的应用；

2)提高带状疱疹疫苗或抗原的免疫原性。

9.一种制备权利要求1-6任一所述的带状疱疹疫苗的方法，包括如下步骤：将权利要求1-6任一中的所述抗原和所述佐剂混匀，得到带状疱疹疫苗。

10.权利要求2-6任一中的所述的融合蛋白，权利要求3-6任一中的所述铝佐剂，和权利要求1-6任一中的所述CpG佐剂在如下任一中的应用：

1)制备预防或治疗带状疱疹的产品；

2)制备中和带状疱疹病毒的产品；

3)制备诱导机体对带状疱疹病毒产生体液免疫和/或细胞免疫的产品；

4)制备带状疱疹病毒抗体；

或，权利要求2-6任一中的所述的融合蛋白或其在如下任一中的应用：

1)作为带状疱疹疫苗抗原；

2)制备预防或治疗带状疱疹的产品；

3)制备中和带状疱疹病毒的产品；

4)制备诱导机体对带状疱疹病毒产生体液免疫和/或细胞免疫的产品；

5)制备带状疱疹病毒抗体。

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