CN116942808A - 一种重组带状疱疹疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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- C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Abstract
本申请涉及疫苗的技术领域,具体公开了一种重组带状疱疹疫苗组合物及其制备方法和应用。本申请公开的重组带状疱疹疫苗组合物包括gE蛋白和佐剂,所述佐剂包含以下浓度的组分:0.6‑4.5mg/ml CpG、20‑30mg/ml角鲨烯、2‑3mg/ml吐温‑80、2‑3mg/ml司盘85;所述gE蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示;所述CpG的核苷酸序列选自SEQ ID NO.2‑SEQ ID NO.5中所示的至少一种。本申请还公开了上述疫苗组合物的制备方法和应用。本申请公开的重组带状疱疹疫苗组合物可以诱导出较高水平的抗体、IL‑2和IFN‑γ,显示出高免疫活性。
Description
技术领域
本申请涉及疫苗的技术领域,具体涉及一种重组带状疱疹疫苗组合物及其制备方法和应用。
背景技术
水痘带状疱疹病毒(varicella zoster virus,VZV)是八种感染人类的疱疹病毒之一,也称作3型人疱疹病毒(Human herpes viruses-3,HHV-3)。该病毒是引起水痘-带状疱疹病毒的病原体,仅一个血清型。水痘-带状疱疹病毒分布广泛且传染性强,儿童时初次感染诱发,随后潜伏于人体,当人体免疫力下降到一定阈值时可再度激活水痘-带状疱疹病毒。据估计每年约有100万例水痘-带状疱疹病例。发病时患者有明显疼痛感并可持续数周至数月,重症患者可持续数年。导致患者生活质量下降,且发病率随年龄增长而增长。
目前市售疫苗佐剂多为铝盐佐剂,但是铝盐可引起注射部位的炎症并刺激局部红斑、肉芽肿和皮下结节,同时,铝盐佐剂可能会延缓部分疫苗的中和抗体的产生,在应用时受到多种限制,因此亟需开发新颖的佐剂以提升疫苗的抗原专一性或抗肿瘤抗感染的能力。
重组带状疱疹疫苗Shringrix成功上市,该产品使用水痘-带状疱疹病毒表面糖蛋白E(gE)+AS01佐剂形成有效的重组带状疱疹疫苗,对50岁以上人群患水痘-带状疱疹病毒的保护率达90%以上,且保护效果并不会随年龄增长而明显下降,在80岁以上人群中仍有89.1%的保护率。研究发现,Shringrix在老年人群形成长期保护的原因可能与其能够诱导较高水平的IL-2、IFN-γ有关。
但是,重组带状疱疹疫苗Shringrix因产能等问题全球缺货,因此,急需一种自主研发的重组带状疱疹疫苗用于减少由带状疱疹及其并发症引起的疾病负担。
发明内容
为了解决上述技术问题,本申请提供一种重组带状疱疹疫苗组合物及其制备方法和应用。
第一方面,本申请提供一种重组带状疱疹疫苗组合物,包括gE蛋白和佐剂,所述佐剂包含以下浓度的组分:0.6-4.5mg/ml CpG、20-30mg/ml角鲨烯、2-3mg/ml吐温-80、2-3mg/ml司盘85;
所述gE蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示;
所述CpG选自CpG1、CpG2、CpG3、CpG4中的一种或多种,所述CpG1、所述CpG2、所述CpG3、所述CpG4的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.5所示。
本申请使用上述种类的CpG、角鲨烯、司盘85、吐温-80四种原料组分并控制各组分的浓度作为佐剂,将该佐剂和氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的水痘带状疱疹病毒的表面蛋白(gE蛋白)进行结合制备得到的疫苗组合物可以诱导出高水平的抗体、IL-2和IFN-γ,进而显示出高免疫活性。
优选地,所述重组带状疱疹疫苗组合物中,所述gE蛋白的含量为0.08-0.12mg/ml。
在一个具体地实施例中,所述gE蛋白的含量可以为0.08mg/ml、0.1mg/ml、0.12mg/ml。
在一些具体地实施例中,所述gE蛋白的含量还可以为0.08-0.1mg/ml、0.1-0.12mg/ml。
优选地,所述佐剂中,所述CpG的浓度为2.5-4.5mg/ml。
在一个具体地实施例中,所述CpG的浓度可以为0.6mg/ml、1mg/ml、2.5mg/ml、3.4mg/ml、4.5mg/ml。
在一些具体地实施例中,所述CpG的浓度还可以为0.6-1mg/ml、0.6-2.5mg/ml、0.6-3.4mg/ml、0.6-4.5mg/ml、1-2.5mg/ml、1-3.4mg/ml、1-4.5mg/ml、2.5-3.4mg/ml、2.5-4.5mg/ml、3.4-4.5mg/ml。
经过试验分析可知,本申请使用上述浓度的CpG添加于佐剂中,可以进一步提高重组带状疱疹疫苗组合物对抗体、IL-2和IFN-γ的诱导水平。
优选地,所述CpG为CpG1和CpG2。
进一步地,所述CpG为重量比为(11-16):(3-5)的CpG1和CpG2。
在一个具体地实施例中,所述CpG1和CpG2的重量比可以为11:3、11:4、11:5、13:3、13:4、13:5、16:3、16:4、16:5。
在一些具体地实施例中,所述CpG1和CpG2的重量比还可以为(11-13):3、(11-13):4、(11-13):5、(13-16):3、(13-16):4、(13-16):5、16:(3-4)、16:(4-5)、16:(3-5)。
经过试验分析可知,本申请选择上述重量比的CpG1和CpG2作为CpG添加于佐剂中,可以进一步提高重组带状疱疹疫苗组合物对抗体、IL-2和IFN-γ的诱导水平。
优选地,所述佐剂还包括浓度为0.02-0.06mg/ml的植物多酚。
进一步地,所述植物多酚选自柑橘多酚、柿子多酚中的一种或多种。
植物多酚作为多羟基酚类物质,以苯环的多羟基取代基为特征;在结构上具有多个活性反应位点,使其表现出抗病毒功效。本申请的申请人经过试验发现:当使用不同种类的植物多酚添加于佐剂中,制备得到的重组带状疱疹疫苗组合物对抗体和因子的诱导作用和诱导强弱是不同的;相比于茶多酚和白藜芦醇,在佐剂中添加柑橘多酚或者柿子多酚,可以明显提高重组带状疱疹疫苗组合物诱导抗体、IL-2和IFN-γ的稳定性。
综上所述,本申请的技术方案具有以下效果:
本申请使用相应浓度的CpG、角鲨烯、吐温-80、司盘85作为佐剂,将该佐剂和氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的gE蛋白结合制备得到的重组带状疱疹疫苗组合物可以诱导出高水平的抗体、IL-2和IFN-γ,进而显示出高免疫活性。
本申请通过进一步筛选佐剂中CpG的种类和浓度,进一步提高了重组带状疱疹疫苗组合物对抗体以及多种因子的诱导水平。
本申请在佐剂中添加合适浓度和特定种类的植物多酚,可以明显提高重组带状疱疹疫苗组合物对抗体以及多种因子的诱导稳定性。
具体实施方式
以下结合制备例、实施例、对比例以及性能检测试验对本申请作进一步详细描述,这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
制备例
制备例1
本制备例提供了一种gE蛋白。
通过检索NCBI上带状疱疹病毒糖蛋白E(gE)基因信息,在线分析预测胞外域,选择1-537的氨基酸序列,即选择SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行DNA序列转换并进行CHO细胞密码子优化,形成表达用基因序列。按照分子生物学领域的常规技术,将上述序列转移到表达质粒上并转染CHO细胞,经稳转筛选和单克隆筛选后获得稳定表达gE蛋白的细胞株。使用该细胞株进行表达,经深层过滤、离子交换层析、疏水层析、羟基磷灰石层析、除病毒纳滤、超滤浓缩换液获得gE蛋白。
SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为:
MGTVNKPVVGVLMGFGIITGTLRITNPVRASVLRYDDFHIDEDKLDTNSVYEPYYHSDHAE
SSWVNRGESSRKAYDHNSPYIWPRNDYDGFLENAHEHHGVYNQGRGIDSGERLMQPTQM
SAQEDLGDDTGIHVIPTLNGDDRHKIVNVDQRQYGDVFKGDLNPKPQGQRLIEVSVEENHP
FTLRAPIQRIYGVRYTETWSFLPSLTCTGDAAPAIQHICLKHTTCFQDVVVDVDCAENTKED
QLAEISYRFQGKKEADQPWIVVNTSTLFDELELDPPEIEPGVLKVLRTEKQYLGVYIWNMR
GSDGTSTYATFLVTWKGDEKTRNPTPAVTPQPRGAEFHMWNYHSHVFSVGDTFSLAMHLQ
YKIHEAPFDLLLEWLYVPIDPTCQPMRLYSTCLYHPNAPQCLSHMNSGCTFTSPHLAQRVAS
TVYQNCEHADNYTAYCLGISHMEPSFGLILHDGGTTLKFVDTPESLSGLYVFVVYFNGHVEAVAYTVVSTVDHFVNAIEERGFPPTAGQPPATTKPKEITPVNPGTSPLLR。
制备例2
本制备例提供了一种gE蛋白。
本制备例通过检索NCBI上带状疱疹病毒糖蛋白E(gE)基因信息(GenBank:AEW88548.1),在线分析预测胞外域,选择1-538的氨基酸序列来制备gE蛋白,制备方法同制备例1。
制备例3
本制备例提供了一种gE蛋白。
本制备例通过检索NCBI上带状疱疹病毒糖蛋白E(gE)基因信息(GenBank:AEW88548.1),在线分析预测胞外域,选择1-546的氨基酸序列来制备gE蛋白,制备方法同制备例1。
实施例
实施例1-11
实施例1-11分别提供了一种重组带状疱疹疫苗组合物。
上述实施例的不同之处在于:佐剂中CpG的种类不同,具体如表1所示。
上述实施例中重组带状疱疹疫苗组合物的制备方法包括以下步骤:
取2.5g吐温-80均匀溶解于500ml柠檬酸钠缓冲液中,35-45℃加热搅拌25-35min,作为水相;
取2.5g司盘85均匀溶解于25g角鲨烯中,35-45℃加热搅拌25-35min,作为油相;
将油相和水相混合均匀,经过均质、过滤除菌,得到乳剂;
取乳剂与2g浓度为10mg/ml的CpG混合,加PBS补齐至1000ml,得到佐剂;
取50μl浓度为1mg/ml的gE蛋白(来源于制备例1)与450μl佐剂混合均匀,即得重组带状疱疹疫苗组合物。
其中,CpG1的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示,具体为5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3';CpG2的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示,具体为5'-ATCGACTCTCGAGCGTTCTC-3';CpG3的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示,具体为5'-GAGCGTTCTCGAGCGTTCTC-3';CpG4的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示,具体为5'-TCTCGAGCGTTCTCGAGCGTTCTC-3'。
表1实施例1-11中佐剂中CpG的种类
实施例12-22
实施例12-22分别提供了一种重组带状疱疹疫苗组合物。
上述实施例与实施例9的不同之处在于:佐剂中各组分的浓度不同,具体如表2所示。
表2实施例12-22中佐剂中各组分的浓度
实施例23-26
实施例23-26分别提供了一种重组带状疱疹疫苗组合物。
上述实施例与实施例9的不同之处在于:重组带状疱疹疫苗组合物中gE蛋白的含量不同,具体为:
实施例23中:取50μl浓度为0.8mg/ml的gE蛋白与450μl佐剂混合均匀,即得重组带状疱疹疫苗组合物,重组带状疱疹疫苗组合物中gE蛋白的含量为0.08mg/ml。
实施例24中:取50μl浓度为1.2mg/ml的gE蛋白与450μl佐剂混合均匀,即得重组带状疱疹疫苗组合物,重组带状疱疹疫苗组合物中gE蛋白的含量为0.12mg/ml。
实施例25中:取50μl浓度为0.6mg/ml的gE蛋白与450μl佐剂混合均匀,即得重组带状疱疹疫苗组合物,重组带状疱疹疫苗组合物中gE蛋白的含量为0.06mg/ml。
实施例26中:取50μl浓度为1.4mg/ml的gE蛋白与450μl佐剂混合均匀,即得重组带状疱疹疫苗组合物,重组带状疱疹疫苗组合物中gE蛋白的含量为0.14mg/ml。
实施例27-34
实施例27-34分别提供了一种重组带状疱疹疫苗组合物。
上述实施例与实施例9的不同之处在于:佐剂中还包括植物多酚,具体如表3所示。
实施例27-33中所使用的茶多酚(规格为50%)、白藜芦醇(规格为50%)、柑橘多酚(规格为50%)、柿子多酚(规格为20:1)购自信阳市沐凡生物科技有限公司。
上述实施例中重组带状疱疹疫苗组合物的制备方法包括以下步骤:
按照表3所示的植物多酚的种类和浓度,取植物多酚、2.5g吐温-80均匀溶解于500ml柠檬酸钠缓冲液中,35-45℃加热搅拌25-35min,作为水相;
取2.5g司盘85均匀溶解于25g角鲨烯中,35-45℃加热搅拌25-35min,作为油相;
将油相和水相混合均匀,经过均质、过滤除菌,得到乳剂;
取乳剂与2g浓度为10mg/ml的CpG混合,加PBS补齐至1000ml,得到佐剂;
取50μl浓度为1mg/ml的gE蛋白与450μl佐剂混合均匀,即得重组带状疱疹疫苗组合物。
表3实施例27-34中佐剂中植物多酚的种类和浓度
对比例
对比例1-3
对比例1-3分别提供了一种重组带状疱疹疫苗组合物。
上述对比例与实施例9的不同之处在于:佐剂中CpG的种类不同,具体为:
对比例1中CpG的核苷酸序列为5’-ATAATCGACGTTCAAGCAAG-3’(CpG-1760)。
对比例2中CpG的核苷酸序列为5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’(CpG-7909)。
对比例3中CpG的核苷酸序列为5’-GACTCTCGAGCGTTCTCGAGCGTTCTC--3’(CpG-K3-27)。
对比例4-11
对比例4-11分别提供了一种重组带状疱疹疫苗组合物。
上述对比例与实施例9的不同之处在于:佐剂中各组分的浓度不同,具体如表4所示。
表4对比例4-11中佐剂中各组分的浓度
对比例12-13
对比例12-13分别提供了一种重组带状疱疹疫苗组合物。
上述对比例与实施例9的不同之处在于:gE蛋白的种类不同,具体为:
对比例12中所采用的gE蛋白来源于制备例2,即gE蛋白的氨基酸序列为1-538的抗原;对比例13中所采用的gE蛋白来源于制备例3,即gE蛋白的氨基酸序列为1-546的抗原。
对比例14
本对比例提供了一种重组带状疱疹疫苗组合物。
本对比例与实施例9的不同之处在于:佐剂为AS01佐剂。
本对比例中重组带状疱疹疫苗组合物的制备方法为:取50μl浓度为1mg/ml的gE蛋白(来源于制备例1)与450μl含50μg QS-21、50μg MPL、1mg二油酰基磷脂胆碱、0.25mg胆固醇的AS01佐剂混合,缓慢颠倒混匀,静置5-10min,即得重组带状疱疹疫苗组合物。
性能检测试验
(1)以实施例1-34和对比例1-14提供的重组带状疱疹疫苗组合物为检测对象,检测疫苗组合物对抗体、IL-2和IFN-γ的诱导水平以及诱导稳定性。
对照组1:利用PBS缓冲溶液作为对照组1。
对照组2:将复苏后的MRC-5细胞接种于含10%胎牛血清的MEM培养基中,37℃静置培养并传代至工作代次;按MOI=0.01-0.1的比例接种VZV-Oka株病毒种子,并更换培养液为含2%胎牛血清的MEM培养基,36℃静置培养;待细胞病变达到70%-80%时,超声均质收集样品;离心处理后,加入保护液并冻存,作为对照组2。
检测方法具体为:
将4-6周龄的雌性Balb/c小鼠随机分为50组,每组6只,将实施例1-34和对比例1-14提供的重组带状疱疹疫苗组合物及对照组1、对照组2的样品进行10倍稀释,即各组合物取含量的1/10,用PBS补至0.1ml,分别对每组小鼠进行皮下注射0.1ml,每组小鼠免疫两次,间隔2周。
将二次免疫后14天的小鼠摘眼球取血,37℃静置30min,4000g、10min离心,收集血清。将MRC-5细胞传代至T25细胞培养瓶中并生长为致密单层,弃培养基,接种适量水痘-带状疱疹病毒,补加5ml病毒培养液,于37℃,5%CO2条件下培养,每天观察细胞病变情况;待病变达到50%-75%时终止培养,弃培养基,胰酶消化细胞,300g、10min离心弃上清,细胞计数并将细胞稀释至1.2×107个细胞/ml。载玻片中每孔加入6000个细胞,湿盒中37℃放置40min后80%丙酮固定10min,彻底风干去除丙酮,将倍比稀释的小鼠血清加至载玻片的对应孔中,每孔10μl,4℃湿盒中孵育过夜,弃孔内液体,用PBS洗涤3次载玻片并晾干,用终浓度为0.01%伊文思蓝的PBS缓冲液按1:100的比例稀释FITC标记二抗,每孔加入10μl,置于37℃湿盒中孵育1h。弃孔内液体,用PBS洗涤3次载玻片并晾干,载玻片每孔滴加3μl 60%甘油,盖上盖玻片,荧光倒置显微镜下观察,检测每组试验中6只小鼠血清中和抗体滴度,以评价疫苗组合物对抗体的诱导水平,同时计算6只小鼠血清中和抗体滴度值的变异系数(变异系数=标准偏差/平均值×100%),以评价疫苗组合物对抗体诱导水平的稳定性。
将二次免疫后14天的小鼠,颈椎脱臼处死,75%酒精浸泡转移至生物安全柜汇中。分离小鼠脾脏,放置于200目细胞筛网上,滴加2ml PBS缓冲液,并用5ml注射器手柄在200目细胞筛上研磨至无明显组织。反复缓慢冲洗筛网后,收集悬液并转移至15ml离心管中,300g、10min离心。弃上清,加入4ml ACK裂解液,吹打混匀并放置3-5min,300g、10min离心。弃上清,加入4ml含10% FBS的RPMI 1640培养基,吹打混匀,300g、10min离心。弃上清,加入4ml含10% FBS的RPMI 1640培养基,吹打混匀并通过细胞计数仪计数。将每组细胞稀释为2×106cells/ml,加入预活化的IFNγ和IL2检测用PVDF板中(Mabtech),每孔50ul。设阴性对照、gE蛋白刺激(10μg/ml)和阳性对照(PHA)。阴性对照用培养基补齐至100μl/孔,gE蛋白刺激和阳性对照分别用培养基将gE蛋白和PHA稀释为20μg/ml后,每孔加入50μl,每组样品做3个复孔。37℃、5% CO2条件下孵育细胞48h。倾倒孔内液体,每孔加入200μl PBS洗涤5次后将加入稀释好的生物素标记抗体,每孔100μl,室温孵育2h。倾倒孔内液体,每孔加入200μlPBS洗涤5次后将加入稀释好的ALP标记链霉亲和素,每孔100μl,室温孵育1h。倾倒孔内液体,每孔加入200μl PBS洗涤5次后每孔加入100μl已过滤的NCIP/NBT-plus溶液显影5-30min至出现明显斑点,去离子水冲洗终止显色。采用ELISPOT方法检测每组试验中IL-2和IFN-γ水平,以评价疫苗组合物对IL-2和IFN-γ的诱导水平,同时计算6只小鼠中IL-2和IFN-γ水平的变异系数,以评价疫苗组合物对IL-2和IFN-γ诱导水平的稳定性。
检测结果:如表5所示。
表5实施例1-34和对比例1-14中重组带状疱疹疫苗组合物对抗体、IL-2、IFN-γ的诱导水平和诱导稳定性
结合表5,通过对比实施例1-34与对比例1-14的检测结果,本申请利用CpG、角鲨烯、吐温-80、司盘85作为佐剂,并控制各原料的浓度,将制备得到的佐剂和氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的gE蛋白结合制备得到的重组带状疱疹疫苗组合物可以诱导出高水平的抗体、IL-2和IFN-γ,且本申请提供的重组带状疱疹疫苗组合物对抗体、IL-2和IFN-γ的诱导水平具有较高的稳定性,进而显示出优异的免疫活性。
通过对比实施例1-11与对比例1-3的检测结果,当佐剂中CpG的种类选择为CpG-1760或者CpG-7909、CpG-K3-27时,制备的重组带状疱疹疫苗组合物对抗体、IL-2和IFN-γ的诱导水平较低,即利用这三种CpG制备的重组带状疱疹疫苗组合物的免疫活性较差。而本申请选择使用核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.5所示的CpG1、CpG2、CpG3、CpG4中的一种或多种添加于佐剂时,制备的重组带状疱疹疫苗组合物对抗体、IL-2和IFN-γ的诱导水平较高。进一步地,本申请选择重量比为(11-16):(3-5)的CpG1和CpG2添加于佐剂中。
通过对比实施例9、12-22与对比例4-11的检测结果可知,当佐剂中的各原料的浓度过低时,制备的重组带状疱疹疫苗组合物对抗体、IL-2和IFN-γ的诱导水平较低,而当佐剂中的各原料的浓度过高时,制备的重组带状疱疹疫苗组合物对抗体、IL-2和IFN-γ的诱导水平降低,且诱导稳定性较差。因此,本申请合理控制了各原料的浓度为0.6-4.5mg/mlCpG、20-30mg/ml角鲨烯、2-3mg/ml吐温-80、2-3mg/ml司盘85。
通过对比实施例9与对比例12-13的检测结果,可知不同氨基酸长度的gE蛋白获得的重组带状疱疹疫苗组合物对抗体、IL-2和IFN-γ的诱导水平有较大的影响,相比于选择使用氨基酸长度为1-538的gE蛋白,或者选择使用氨基酸长度为1-546的gE蛋白,本申请利用氨基酸长度为1-537的gE蛋白与本申请提供的佐剂相互混合制备的疫苗组合物对抗体、IL-2和IFN-γ的诱导水平较高,且具有较高的诱导稳定性。进一步地,通过对比实施例9、23-26的检测结果,本申请将疫苗组合物中gE蛋白的含量控制为0.08-0.12mg/ml。
通过对比实施例9与实施例27-34的检测结果,可知,当选择使用茶多酚作为植物多酚添加于佐剂中,制备的疫苗组合物对抗体、IL-2和IFN-γ的诱导水平提高程度较弱,且诱导稳定性未得到提高;当选择使用白藜芦醇作为植物多酚添加于佐剂中,制备的疫苗组合物对抗体、IL-2和IFN-γ的诱导稳定性提高程度较弱,且使得疫苗组合物对抗体、IL-2和IFN-γ的诱导水平有所降低;相比之下,本申请选择柑橘多酚、柿子多酚作为植物多酚添加于佐剂中,使得制备的疫苗组合物诱导水平不降低的同时,可以明显提高疫苗组合物的诱导稳定性。
(2)以实施例1-11、27-34和对比例1-3、14提供的重组带状疱疹疫苗组合物为检测对象,检测疫苗组合物对IL-12和IFN-α的诱导水平以及诱导稳定性。
检测方法具体为:
将4-6周龄的雌性Balb/c小鼠随机分为23组,每组6只,将实施例1-11、27-33和对比例1-3、14提供的重组带状疱疹疫苗组合物样品进行10倍稀释,即各组合物取含量的1/10,用PBS补至0.1ml,分别对每组小鼠进行皮下注射0.1ml,每组小鼠免疫两次,间隔2周。
将二次免疫后14天的小鼠,颈椎脱臼处死,75%酒精浸泡转移至生物安全柜汇中。分离小鼠脾脏,放置于200目细胞筛网上,滴加2ml PBS缓冲液,并用5ml注射器手柄在200目细胞筛上研磨至无明显组织。反复缓慢冲洗筛网后,收集悬液并转移至15ml离心管中,300g、10min离心。弃上清,加入4ml ACK裂解液,吹打混匀并放置3-5min,300g、10min离心。弃上清,加入4ml含10% FBS的RPMI 1640培养基,吹打混匀,300g、10min离心。弃上清,加入4ml含10% FBS的RPMI 1640培养基,吹打混匀并通过细胞计数仪计数。将每组细胞稀释为2×106cells/ml,加入预活化的IFNα和IL12检测用PVDF板中(Mabtech),每孔50ul。设阴性对照、gE蛋白刺激和阳性对照(PHA)。阴性对照用培养基补齐至100μl/孔,gE蛋白刺激和阳性对照分别用培养基将gE蛋白和PHA稀释为20μg/ml后,每孔加入50μl,每组样品做3个复孔。37℃5% CO2条件下孵育细胞48h。倾倒孔内液体,每孔加入200μl PBS洗涤5次后将加入稀释好的生物素标记抗体,每孔100μl,室温孵育2h。倾倒孔内液体,每孔加入200μl PBS洗涤5次后将加入稀释好的ALP标记链霉亲和素,每孔100μl,室温孵育1h。倾倒孔内液体,每孔加入200μl PBS洗涤5次后每孔加入100μl已过滤的NCIP/NBT-plus溶液显影5-30min至出现明显斑点,去离子水冲洗终止显色。采用ELISPOT方法检测IL-12和IFN-α水平。
检测结果:如表6所示。
表6实施例1-11、27-34和对比例1-3、14中重组带状疱疹疫苗组合物对IL-12、IFN-α的诱导水平和诱导稳定性
结合表6,通过对比实施例1-11、27-34和对比例1-3、14的检测结果,本申请提供的佐剂和氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的gE蛋白结合制备得到的重组带状疱疹疫苗组合物还可以诱导出高水平的IL-12、IFN-α,且该诱导水平具有较高的稳定性;结合表5的分析结果,即本申请的疫苗组合物可以诱导出高水平的抗体、IL-2和IFN-γ,上述检测结果表明本申请提供的重组带状疱疹疫苗组合物可以诱导出高水平的抗体和多种因子,表现出优异的免疫活性。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种重组带状疱疹疫苗组合物,其特征在于,包括gE蛋白和佐剂,
所述佐剂包含以下浓度的组分:0.6-4.5mg/ml CpG、20-30mg/ml角鲨烯、2-3mg/ml吐温-80、2-3mg/ml司盘85;
所述gE蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示;
所述CpG选自CpG1、CpG2、CpG3、CpG4中的一种或多种,所述CpG1、所述CpG2、所述CpG3、所述CpG4的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的重组带状疱疹疫苗组合物,其特征在于,所述重组带状疱疹疫苗组合物中,所述gE蛋白的含量为0.08-0.12mg/ml。
3.根据权利要求1所述的重组带状疱疹疫苗组合物,其特征在于,所述佐剂中,所述CpG的浓度为2.5-4.5mg/ml。
4.根据权利要求1所述的重组带状疱疹疫苗组合物,其特征在于,所述CpG为CpG1和CpG2。
5.根据权利要求4所述的重组带状疱疹疫苗组合物,其特征在于,所述CpG为重量比为(11-16):(3-5)的CpG1和CpG2。
6.根据权利要求1所述的重组带状疱疹疫苗组合物,其特征在于,所述佐剂还包括浓度为0.02-0.06mg/ml的植物多酚。
7.根据权利要求6所述的重组带状疱疹疫苗组合物,其特征在于,所述植物多酚选自柑橘多酚、柿子多酚中的一种或多种。
8.如权利要求1-7中任一项所述的重组带状疱疹疫苗组合物的制备方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
取所述吐温-80均匀溶解于柠檬酸钠缓冲液中,作为水相;取所述司盘85均匀溶解于所述角鲨烯中,作为油相;
将所述油相和所述水相混合均匀,经过均质、过滤除菌,得到乳剂;
将所述乳剂与所述CpG混合,得到所述佐剂;
将所述gE蛋白与所述佐剂混合均匀,即得所述重组带状疱疹疫苗组合物。
9.如权利要求1-7中任一项所述的重组带状疱疹疫苗组合物在制备预防带状疱疹疾病的药物或带状疱疹疾病并发症的药物中的应用。
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