CN112569348A - 一种带状疱疹疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种带状疱疹疫苗，包含VZV重组gE蛋白、BCG‑CpG‑DNA和铝佐剂。BCG‑CpG‑DNA和铝佐剂的配伍有效的提高了疫苗的细胞免疫效果，降低了为达到相同免疫效果所使用的铝佐剂用量，提高了疫苗的安全性。

Description

一种带状疱疹疫苗
技术领域
本发明涉及疫苗领域，尤其是涉及一种带状疱疹疫苗，其制备方法及其在带状疱疹预防中的应用。
背景技术
带状疱疹(HZ)是由潜伏在人感觉神经节的水痘-带状疱疹病毒(VZV)复发导致的一种急性感染性疾病，可持续数周、数月甚至数年，严重影响患者生活质量。带状疱疹常见的严重并发症是疱疹感染后神经痛(PHN)。有数据表明，超过90％的成年人伴有HZ风险，随年龄增长细胞免疫功能逐渐衰减，易继发HZ和PHN。随着我国老龄化社会的来临，受带状疱疹危害的老年人逐年增加，而国内目前尚无上市的带状疱疹疫苗，迫切需要研制具有自主知识产权、安全有效的HZ疫苗。
目前，国际上批准上市的HZ疫苗为默克公司的Zostavax，其预防HZ的有效性为69.8％(50-59岁)和51％(60岁以上)，对预防PHN基本无效。该疫苗为高病毒滴度的活疫苗，存在疫苗相关病例风险，临床上已有Zostavax引起HZ的病例报告。此外，葛兰素史克(GSK)研发了一种佐剂灭活亚单位疫苗(HZ/su)，该疫苗成份为带状疱疹病毒gE蛋白和佐剂系统AS01B。AS01B佐剂系统是一种包含单磷酸酰脂质A和皂素QS-21的脂质体佐剂，能增强细胞免疫应答反应。临床研究表明，HZ/su疫苗可以显著地降低50岁以上人群罹患HZ的风险(91％～97％)，并且能有效地降低随后的PHN风险(≥80％)，已于2018年上市。
上述两种疫苗保护效果差异推测可能有以下原因：1.对于已经感染并潜伏的病毒，减毒活疫苗的免疫效果有限，尤其是目标人群年龄偏大，即使增加病毒剂量也不能有效刺激细胞免疫应答，反而可能诱导感染者带状疱疹复发；2.AS01B佐剂疫苗诱导机体免疫效果优于减毒活疫苗，并采用两次免疫，强化了免疫效果，而Zostavax只有一次免疫。
因此新的带状疱疹疫苗研发立足于亚单位疫苗，需要开发能刺激机体产生细胞免疫的新型佐剂，以获得理想的免疫效果。
目前，人用疫苗佐剂方面，除铝佐剂之外，国外已有6种新佐剂被批准上市，而我国疫苗新佐剂的研究相对滞后，不利于行业竞争。
发明内容
本发明提供一种带状疱疹疫苗组合物，其包含VZV重组gE蛋白、BCG-CpG-DNA和铝佐剂。
根据本发明，铝佐剂可以选自Al(OH)3，或AlPO4。在本发明中，如无特殊说明，所述铝佐剂的含量或浓度均以Al3+的含量或浓度计或表示。
在本发明的具体实施方式中，所用铝佐剂为Al(OH)3。
根据本发明，以单位剂量疫苗组合物来讲，VZV重组gE蛋白的含量为25-100μg，优选为40-60μg。在本发明的一个具体实施方式中为50μg。
以单位剂量疫苗组合物来讲，BCG-CpG-DNA的含量为50-150μg，优选为75-110μg。在本发明的一个具体实施方式中为100μg。
以单位剂量疫苗组合物来讲，铝佐剂的含量以Al3+含量计为50-500μg，优选为125-250μg。在本发明的一个具体实施方式中为125μg。
根据本发明，所述带状疱疹疫苗组合物，进一步包含载体溶液。所述载体溶液提供液体形式的疫苗组合物所需的等渗条件，因此宜选用能提供等渗条件的溶液体系，优选为PBS溶液，例如0.01M-0.07M，pH7.0-7.6的PBS溶液，更优选为0.06M-0.07M，pH7.2-7.6的PBS溶液。所述PBS溶液中，根据需要可以在保证等渗的条件下，进一步添加能够稳定蛋白的无机盐，例如氯化钠、氯化钾等，所述无机盐的浓度可以为0.1M～0.6M，例如0.15M、0.2M、0.4M、0.5M。在本发明的一些优选实施方式中，所述载体溶液为含有0.14-0.17M氯化钠的0.06M-0.07M，pH7.2-7.6的PBS溶液。本申请的发明人在研究过程中发现，PBS溶液的摩尔浓度会对铝佐剂吸附蛋白抗原和DNA的吸附率产生影响，实验中0.067M PBS溶液条件下，铝佐剂对蛋白抗原和DNA的吸附速度快且吸附率高。因此，本发明最优的实施例中，载体溶液为0.067M PBS溶液，pH7.4，进一步含有0.15-0.16M的氯化钠。
根据本发明，所述带状疱疹疫苗组合物为液体形式时，VZV重组gE蛋白的浓度为50-200μg/ml，优选为80-120μg/ml，在本发明的一个具体实施方式中为100μg/ml；BCG-CpG-DNA的浓度为100-300μg/ml，优选为150-220μg/ml，在本发明的一个具体实施方式中为200μg/ml；铝佐剂的浓度以Al3+浓度计为100-1000μg/ml，优选为250-500μg/ml，在本发明的一个具体实施方式中为250μg/ml。
根据本发明，所述带状疱疹疫苗组合物，作为疫苗使用时，通常以一人份疫苗剂量(即，单位剂量)的方式提供，所述一人份疫苗剂量的体积优选为0.5ml。
在本发明的一个具体实施方式中，所述一人份疫苗剂量为0.5ml，含有VZV重组gE蛋白50μg，BCG-CpG-DNA 100μg，铝佐剂的量以Al3+计为125μg。
本发明进一步提供所述带状疱疹疫苗组合物的制备方法。
根据本发明，所述制备方法的一种方式包括：在载体溶液中，将VZV重组gE蛋白、BCG-CpG-DNA和铝佐剂直接混合配制。
根据本发明，所述制备方法的另一种方式包括：在载体溶液中，先将VZV重组gE蛋白与铝佐剂进行预吸附，取预吸附的蛋白溶液再加入BCG-CpG-DNA，混匀完成疫苗组合物的配制。在一个具体的实施方式中，所述制备方法为：在载体溶液中，先将VZV重组gE蛋白与铝佐剂进行预吸附，制备预吸附的蛋白原液，再在载体溶液中，加入预吸附的蛋白原液与适量的BCG-CpG-DNA，补充一定量的载体溶液至规定体积，混匀完成疫苗组合物的配制。
根据本发明，所述制备方法的再一种方式包括：将VZV重组gE蛋白和BCG-CpG-DNA制成冻干粉，在使用前，用铝佐剂以及适量体积的载体溶液进行重构，形成所述疫苗组合物。
根据本发明，所述制备方法的无论哪种方式都优选在10-30℃，例如20-25℃下，进行预吸附、混合或重构。
根据本发明，所述制备方法中，采用预吸附方式时，优选在50-200转/分钟，例如90-110转/分钟的条件下，进行预吸附。根据本发明，所述带状疱疹疫苗组合物，优选采用将VZV重组gE蛋白、BCG-CpG-DNA和铝佐剂直接混合配制疫苗产品的方法制备。所述方法，与先将VZV重组gE蛋白和铝佐剂预吸附，再加入BCG-CpG-DNA配制疫苗的方法相比，疫苗免疫效果更好。
根据本发明，所述制备方法中VZV重组gE蛋白和BCG-CpG-DNA可以固体形式或浓溶液形式加入载体溶液中。所述浓溶液的溶剂体系可以选用本领域常用的缓冲液体系，优选为PBS溶液，例如0.01M-0.07M，pH7.2-7.6的PBS溶液，更优选为0.06M-0.07M，pH7.2-7.6的PBS溶液。所述PBS溶液中，根据需要可以进一步添加无机盐，例如氯化钠、氯化钾等，所述无机盐的浓度可以为0.1M～0.6M，例如0.15M、0.2M、0.4M、0.5M。所述VZV重组gE蛋白的浓溶液优选为用含有0.3-0.5M NaCl的0.01-0.02M，pH7.4-7.6的PBS配置成蛋白浓度为2-8mg/ml的溶液，优选为4-6mg/ml。所述BCG-CpG-DNA的浓溶液优选为用含有0.14-0.17M氯化钠的0.06M-0.07M，pH7.2-7.6的PBS缓冲液配置的BCG-CpG-DNA浓度为0.5-5mg/ml的溶液，优选为1-2mg/ml。
铝佐剂一般商业上销售的就是溶液形式，可以直接加入本发明的载体溶液中。
本发明进一步提供由上述方法制备得到的带状疱疹疫苗组合物。
根据本发明，所述带状疱疹疫苗组合物包含：VZV重组gE蛋白、BCG-CpG-DNA和铝佐剂。以单位剂量疫苗组合物来讲，VZV重组gE蛋白的含量为25-100μg，优选为40-60μg；BCG-CpG-DNA的含量为50-150μg，优选为75-110μg；Al3+的含量为50-500μg，优选为125-250μg。
在载体溶液中，将VZV重组gE蛋白、BCG-CpG-DNA和铝佐剂直接混合配制。或者，在载体溶液中，先将VZV重组gE蛋白与铝佐剂预吸附，取预吸附蛋白溶液再加入BCG-CpG-DNA配制。或者，将VZV重组gE蛋白和BCG-CpG-DNA制成冻干粉，在使用前，用铝佐剂以及适量体积的载体溶液进行重构。
本发明进一步提供所述带状疱疹疫苗组合物在制备预防带状疱疹和/或疱疹感染后神经痛的疫苗中的应用。
根据本发明，所述疫苗是注射液。
根据本发明，所述疫苗采用肌肉内注射给药的方式。
本发明进一步提供一种预防带状疱疹和/或疱疹感染后神经痛的方法。
根据本发明，所述方法包括给予有需要的受试者预防有效量的所述带状疱疹疫苗组合物。
根据本发明，所述方法包括两次给予有需要的受试者预防有效量的疫苗组合物，其中在首次给予疫苗组合物后的第18-30天，给予第二次疫苗组合物。
优选，两次给予疫苗组合物的用量相同。
在本发明中，VZV重组gE蛋白是指重组表达的水痘-带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)的gE糖蛋白，可以商购，也可以采用本领域已知的基因工程技术制备。在本发明的一个实施方式中，所述VZV重组gE蛋白是采用基因工程技术制备的，具体操作为：依据VZV病毒的gE蛋白的氨基酸序列，合成基因序列，将该序列转染至CHO细胞，通过有限稀释法获得能表达gE蛋白的重组CHO细胞，通过扩增培养重组的CHO细胞，获得细胞培养上清液，纯化上清液获得纯度大于95％的gE蛋白。gE糖蛋白是VZV病毒的三个主要蛋白之一，由其诱导的免疫反应对限制病毒扩散及感染的痊愈有重要作用。
本发明所指的BCG-CpG-DNA是从卡介菌(BCG)中提取的双链DNA片段，其含有大量未甲基化的CpG基序，因此简称为“BCG-CpG-DNA”。BCG-CpG-DNA本身具有免疫刺激作用，在信号通路水平上调NF-κB信号通路、MAPKs信号通路中关键蛋白分子的磷酸化水平；在转录水平促进TNF-α和MCP-1转录；在细胞因子分泌水平促进TNF-α、MCP-1、IFN-γ、IL-6及IL-17等细胞因子分泌；在细胞功能水平促进APC细胞增殖，上调MHC-II分子和其他共刺激分子CD40，CD80和CD86的表达、促进吞噬抗原能力。其对固有免疫细胞刺激作用主要依赖于TLR-9受体的存在，是有效的TLR-9受体激动剂。
BCG-CpG-DNA可采用中国发明专利ZL200410033878.1中记载的制备方法：将菌种接种于适合分枝杆菌生长的培养基中培养至对数期时收集菌体；菌体经破碎后离心收集上清液；上清液经CTAB的沉淀物用NaCl溶液溶解后用有机溶剂抽提收集无蛋白层，该无蛋白层再次抽提后的上清液用乙醇处理收集沉淀，对该沉淀进行后处理。
BCG-CpG-DNA也可以采用中国发明专利ZL201310586057.X中记载的制备方法：将卡介菌接种于适合卡介菌生长的培养基中培养至对数期时收集菌体；菌体以去离子水或上样缓冲液经匀浆后获得菌体裂解液，任选对菌体裂解液进行澄清处理后，利用Q SepharoseHP离子交换柱，在TE缓冲液或磷酸钠缓冲液中进行BCG-CpG-DNA的分离。
由这些示例性的方法获得的BCG-CpG-DNA都能用于本发明的疫苗，产生良好的免疫佐剂效果。从制备方法的简便性和获得大分子量的BCG-CpG-DNA角度出发，优选采用中国发明专利ZL201310586057.X中记载的制备方法。在此全文引用ZL200410033878.1和201310586057.X作为参考。
本发明中BCG-CpG-DNA的CpG含量可以通过高效液相检测而获得，例如可以采用ZL200410033878.1中记载的通过反相-高效液相法(RP-HPLC)，采用特异甲基化酶SssI修饰CpG二核苷酸的胞嘧啶(dC)为5-甲基胞嘧啶(m5-dC)，利用核酸酶P1和细菌碱性磷酸酶(BAP)将DNA水解为单个脱氧核苷，利用反相-高效液相法(RP-HPLC)对修饰和未修饰的DNA水解样品中m5-dC检出量的差别而对CpG进行定量。
附图说明
图1：低(2.5μg)、中(5μg)、高(10μg)三个剂量的抗原和7.5μg CpG、7μg Al3+配伍后促进淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-2的结果
图2：低(2.5μg)、中(5μg)、高(10μg)三个剂量的抗原和7.5μg CpG、7μg Al3+配伍后在体内产生抗原特异性抗体的结果
图3：5μg剂量的抗原和7.5μg CpG、7μg Al3+配伍后免疫小鼠，采用荧光抗体膜抗原(FAMA)法测定水痘病毒特异性抗体滴度的结果
图4：5μg剂量的抗原和不同剂量的CpG和Al(OH)3配伍后促进淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-2的结果
图5：5μg剂量的抗原和不同剂量的CpG和Al(OH)3配伍后在体内产生抗原特异性抗体的结果
图6-1、图6-2、图6-3、图6-4：5μg剂量的抗原和不同剂量的CpG和Al(OH)3配伍后免疫小鼠，采用荧光抗体膜抗原(FAMA)法测定水痘病毒特异性抗体滴度的结果
图7：5μg剂量的抗原和不同剂量的CpG和Al(OH)3配伍后免疫小鼠，采用空斑减少实验测定中和抗体效价的结果
图8：预吸附和直接混合配制的疫苗免疫小鼠后，促进淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-2的结果
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。需要说明的是，实施例不能作为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员理解，任何在本发明基础上所作的改进和变化都在本发明的保护范围之内。
以下实施例所用的常规化学试剂均可商购获得。
具体实施方式中的试剂如下：
0.067M PBS：浓度0.067mol/L，pH为7.4，HyClone，批号：ABC212871。其配置方法：氯化钠9.0g，磷酸二氢钾0.144g，磷酸氢钠0.795g，加蒸馏水至1000ml，调节pH 7.2-7.6。
0.01M PBS：pH7.5，含有0.4M NaCl。其配置方法：NaH2PO4·H2O：0.2346g，Na2HPO4：2.5986g，氯化钠：23.4g，加蒸馏水至1000ml，调节pH 7.4-7.6。
0.02M PBS：pH7.5，含有0.5M NaCl。其配置方法：NaH2PO4：2.4g，氯化钠：29.25g，加蒸馏水至1000ml，调节pH 7.4-7.6。
BCG-CpG-DNA佐剂：浓度1mg/ml，批号：M20160702；制备方法如下：将卡介菌菌种接种于马铃薯苏通培养基，37℃培养15天后转种于改良的液体苏通培养基，37℃下培养14-20天。待菌体生长至对数期时，收集菌膜，加入适量去离子蒸馏水洗涤，压干后称重。将收集的菌体以去离子蒸馏水按1g/ml混匀，以组织捣碎匀浆机获得菌体裂解液。将破碎的菌体裂解液以去离子蒸馏水稀释到200mg/ml的浓度，高速冷冻离心机4℃、12000rpm/min离心，共离心两次，每次15分钟，收集上清，将上清用洗脱缓冲液稀释1倍后，过1.0-1.2μm的滤器过滤。采用Q Sepharose HP离子交换柱进行上清中BCG-CpG-DNA的分离：上样缓冲液(0.5M氯化钠、50mM磷酸钠缓冲液，pH 7.5)，洗脱缓冲液(1M氯化钠、50mM磷酸钠缓冲液，pH 7.5)，上样速度2ml/min，梯度洗脱，洗脱速度2ml/min，用50％的洗脱缓冲液洗脱用量7CV，之后用100％的洗脱缓冲液洗脱用量2CV，经电导和紫外检测稳定，收集100％洗脱缓冲液的洗脱峰，是为分离的BCG-CpG-DNA成份，经浓缩后用0.067M PBS缓冲液稀释为1mg/ml的浓度，经检定合格后，为BCG-CpG-DNA佐剂，用于以下试验中的疫苗制备。
重组VZV gE(重组带状疱疹gE蛋白)：由安徽龙科马生物制药有限责任公司提供，产品批号为：20160321-Q；20170701、20180416、P20180708-2Q。制备方法为：根据VZV病毒的gE蛋白的氨基酸序列，合成基因序列，将该序列转染至CHO细胞，通过有限稀释法获得能表达gE蛋白的重组CHO细胞，通过扩增培养重组的CHO细胞，获得细胞培养上清液，纯化上清液，获得纯度大于95％的gE蛋白。将纯化得到的蛋白用含有0.4M NaCl的0.01M PBS，配置成蛋白浓度为5mg/ml的溶液，用于以下试验中的疫苗制备。
Al(OH)3佐剂((丹麦)批号：5240)：Al3+浓度为10mg/ml，以Al(OH)3计浓度为28.9mg/ml，所用溶剂体系为0.85％的氯化钠溶液。
疫苗的配制方法为：在一定体积的PBS中分别加入一定量的重组VZV gE蛋白、Al(OH)3、BCG-CpG-DNA佐剂，充分混匀。
在以下实施例中，为描述方便，将BCG-CpG-DNA和Al(OH)3的复合佐剂简称为“BC复合佐剂”或“BC佐剂”。
以下实施例中，免疫动物的抗原量、佐剂量都是相应人用量的十分之一。
细胞免疫的测定方法：
ELISPOT法检测IFN-γ、IL-2细胞斑点数：无菌分离免疫动物的脾淋巴细胞，并稀释成所需细胞浓度，细胞悬液100μl/孔(保证每孔细胞个数为：2.5×105)，以重组VZV gE蛋白作为体外刺激物(50μl/孔)，随后37℃，5％CO2的培养箱中培养24-48h后显色。
体液免疫：获得免疫动物血清，平均分成三份，50μl/份，-20℃以下冻存，以备抗体检测使用。
采用间接ELISA法检测血清中抗gE蛋白特异性抗体与亚型的滴度：包被液稀释重组VZV gE蛋白至5μg/ml，96孔酶标板每孔加100μl，4℃包被过夜；PBST溶液洗板三次，每孔加入200μl封闭液(PBST+1％的BSA)，37℃封闭1h；PBST溶液洗板三次，待测血清用封闭液按1:100比例稀释，每孔加入100μl，37℃孵育2h；PBST溶液洗板三次，分别加入100μl按1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG、1:5000稀释的IgG1和1:10000稀释的IgG2a二抗，37℃孵育1h；PBST溶液洗板三次，每孔加入100μl酶作用底物TMB，室温避光显色30min，加入50μl终止液终止显色，测OD450nm吸光值。
荧光抗体膜抗原(FAMA)法检测血清中中和抗体滴度：MRC-5细胞传代至T25细胞培养瓶，使其长成致密单层；弃去生长液，接入适量病毒，补加5ml病毒培养液，37℃，5％CO2培养箱培养，并每天观察细胞病变情况；待病变达到50％～75％时，弃掉培养液，加入胰酶消化细胞，将细胞悬液离心弃上清；病变细胞计数后稀释至1.2×107cells/ml，载玻片中每孔加入5μl(确保6000cells/孔)，于湿盒中37℃放置40min以彻底晾干水份；80％丙酮固定细胞10min，彻底风干去掉丙酮；将2倍系列稀释(1:16-1:512)好的血清加至多孔载玻片的对应孔中，每孔10μl，并设阴性、阳性以及血清对照孔，4℃湿盒中孵育过夜；次日，甩去孔内液体，用1×PBS洗涤载玻片3次，每次5min；晾干后用含有终浓度为0.01％伊文思蓝的PBS将FITC荧光标记的二抗按1:100稀释，每孔加入10μl，置于37℃湿盒中孵育60min；1×PBS洗涤载玻片3次，随后载玻片上每孔滴加60％甘油3μl，盖上盖玻片，压好的荧光玻片置于荧光显微镜下观察。
空斑减少实验检测血清抗体的中和效价：MRC-5细胞传代接种至6孔细胞培养板，使其长成致密单层，将病毒稀释至50PFU/100μl(保证每孔空斑数维持在50个左右)；同时，将56℃灭能30min的待测血清与病毒等体积混合，37℃水浴中和1h；取病毒中和混合液100μl接入长满单层细胞的6孔板中，同时设置细胞对照孔(病毒稀释液)、血清对照孔(待测血清)以及病毒对照孔(稀释病毒)；37℃、5％CO2培养吸附1h后(每隔20min依次摇匀，使病毒充分接触细胞)，补充病毒培养液3ml/孔，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养并定期观察空斑形成情况；培养至第7～10d后，将病毒培养液弃掉，每孔加入1ml 1×PBS洗涤，弃掉PBS后每孔加入1ml考马斯亮蓝R250染色液，室温染色10min，弃掉染色液，流水冲掉残留的染液；空斑减少率按以下方法进行判定。
Y(％)＝(1-S/CV)*100
S为检测血清组的平均斑数，CV为病毒对照组的平均斑数。
实施例1不同载体溶液对疫苗组合物中Al(OH)3吸附gE蛋白和BCG-CpG-DNA的吸附率的影响
实验中，所用载体溶液分别为前述：0.067M，pH 7.4的PBS溶液；含有0.4M NaCl的0.01M，pH 7.5的PBS溶液：含有0.5M NaCl的0.02M，pH 7.5的PBS溶液。
实验方法：在不同室温条件下，将Al(OH)3与gE蛋白按照不同重量比例在载体溶液中混合震荡(摇床转速为100转/min)，吸附一定时间后，测量蛋白吸附率。
在不同室温条件下，将Al(OH)3与BCG-CpG-DNA按照不同重量比例在载体溶液中混合震荡(摇床转速为100转/min)，吸附一定时间后，测量DNA吸附率。
蛋白吸附率的测定方法：供试品于6500g离心5分钟取上清，检测上清中蛋白含量，与对照未吸附相同浓度蛋白溶液进行比较，吸附率＝(1-供试品上清蛋白浓度/对照蛋白浓度)×100％
DNA吸附率的测定方法：供试品于6500g离心5分钟取上清，检测上清中DNA含量，与对照未吸附相同浓度DNA溶液进行比较，吸附率＝(1-供试品上清DNA浓度/对照DNA浓度)×100％
实验结果如下：(吸附试验中佐剂量均按Al3+计算)
表1：含0.4M NaCl的0.01M，pH7.5的PBS溶液中Al(OH)3对BCG-CpG-DNA的吸附率
Figure BDA0002221622370000101
Figure BDA0002221622370000111
表2：含0.4M NaCl的0.01M，pH7.5的PBS溶液中Al(OH)3对gE蛋白的吸附率(总体积2.72ml)
Figure BDA0002221622370000112
表3：室温下含0.5M NaCl的0.02M，pH7.5的PBS溶液中Al(OH)3对gE蛋白的吸附率(总体积2ml)
gE：Al<sup>3+</sup> 吸附30min 吸附60min 吸附120min 吸附180min
1:2.5(0.5mg:1.25mg) 24％ 27％ 27％ 28％
1:3(0.5mg:1.5mg) 27％ 34％ 28％ 26％
表4：室温下0.067M，pH7.4的PBS溶液中Al(OH)3对gE蛋白的吸附率
Figure BDA0002221622370000113
表5：室温下0.067M，pH7.4的PBS溶液中Al(OH)3对BCG-CpG-DNA的吸附率(总体积4ml)
Figure BDA0002221622370000114
Figure BDA0002221622370000121
从上述结果可见，室温下0.067M，pH7.4的PBS溶液中，Al(OH)3对gE蛋白和BCG-CpG-DNA的吸附率都能达到90％以上，远高于其他浓度PBS溶液中Al(OH)3对蛋白的吸附率。
按照表4中gE蛋白：Al3+为1:10的样品1ml，再加入不同重量的BCG-CpG-DNA混合震荡，吸附一定时间后，测量蛋白吸附率和DNA吸附率，结果见下表：
表6：室温下0.067M，pH7.4的PBS溶液中Al(OH)3对gE蛋白和BCG-CpG-DNA的吸附率
Figure BDA0002221622370000122
从上表结果可见，室温下0.067M，pH7.4的PBS溶液中，先进行Al(OH)3和gE蛋白的混合吸附，再加入BCG-CpG-DNA，对蛋白吸附率影响不大，而DNA的吸附率也能达到90％以上。
按照gE蛋白:Al3+为1:10的比例，比较gE蛋白、Al(OH)3和BCG-CpG-DNA不同加入顺序对蛋白吸附率的影响。
方法1：先将gE与Al(OH)3在载体溶液中混合震荡(摇床转速为100转/min)进行预吸附后，再加入BCG-CpG-DNA混合震荡。
方法2：将gE、Al(OH)3和BCG-CpG-DNA直接在载体溶液中混合震荡(摇床转速为100转/min)。
测试不同制备方法所得疫苗组合物的蛋白吸附率和DNA吸附率，结果如下表：
表7：室温下0.067M，pH7.4的PBS溶液，不同制备方法，Al(OH)3对gE蛋白和BCG-CpG-DNA的吸附率
Figure BDA0002221622370000131
由上表可见，直接混合和预吸附两种情况下蛋白和DNA的吸附率差别不大。
实施例2重组VZV gE的蛋白剂量的选择
选择重组VZV gE蛋白三个剂量，分别为低剂量(2.5μg)、中剂量(5μg)与高剂量(10μg)与BC复合佐剂进行配伍，采用0.067M的PBS为载体溶液，将重组VZV gE蛋白、BCG-CpG-DNA和Al(OH)3直接混合后制备疫苗，免疫动物评价免疫原性，为疫苗配方中蛋白剂量选择提供依据。
被免疫动物：SPF级Balb/c小鼠，雌性，6-8周龄。免疫体积为100μl。活疫苗组于头背部皮下注射免疫，其余组于大腿内侧肌肉注射免疫。
试验分为8组，每组10只动物。
动物免疫剂量如下表，分别于0天、21天进行免疫，末次免疫后14天、28天进行免疫原性评价。
序号 组别 免疫物质用量
1 gE对照 5μg gE蛋白
2 中剂量gE+BC 5μg gE蛋白+7.5μg CpG+7μg Al<sup>3+</sup>
3 低剂量gE+BC 2.5μg gE蛋白+7.5μg CpG+7μg Al<sup>3+</sup>
4 高剂量gE+BC 10μg gE蛋白+7.5μg CpG+7μg Al<sup>3+</sup>
5 gE+Al(OH)<sub>3</sub>对照 5μg gE蛋白+7μg Al<sup>3+</sup>
6 BC对照 7.5μg CpG+7μg Al<sup>3+</sup>
7 水痘减毒活疫苗对照 1/10人份(约10<sup>3</sup>PFU)
8 PBS对照 PBS
结果：
1.细胞免疫结果(首次免疫后5W、7W抗原特异性细胞因子检测)
取免疫后不同时间的淋巴细胞，体外gE蛋白刺激，检测抗原特异性细胞因子。由图1可见：低、中、高三个剂量的抗原和BC配伍后均能促进抗原特异性细胞因子的产生，其水平远远超过单纯抗原组、抗原与Al佐剂配伍组以及活疫苗组(图1)。
2.体液免疫结果
2.1抗gE蛋白特异性抗体及亚型滴度(间接ELISA法)
包被gE蛋白，检测免疫不同时间的血清中的抗体及亚型。由图2可见，在诱导特异性抗体方面，低、中、高三个剂量的抗原和BC配伍后诱导的IgG、IgG1与抗原与Al佐剂配伍组相当。但在Th1型IgG2a方面，复合佐剂组明显高于Al佐剂组(图2)。
2.2水痘病毒特异性抗体滴度(荧光抗体膜抗原(FAMA)法)
在水痘病毒疫苗株致病变的细胞中加入血清，加入FITC荧光标记的二抗，检测水痘病毒特异性抗体。由图3可见：gE蛋白与BC复合佐剂配伍后能诱导水痘病毒特异性抗体，抗体滴度相比单独采用Al佐剂组高，并且抗体高滴度的持续时间也长于单独采用Al佐剂组。
上述研究结果显示：重组VZV gE蛋白与BC佐剂配伍能诱导很好的细胞和体液免疫反应。低、中、高三个抗原水平和BC佐剂的配伍效果均较好。根据诱导的干扰素和IgG2a的水平，优选中剂量抗原。
实施例3BC复合佐剂各成份剂量配伍选择
在实施例2结果的基础上，以中剂量抗原，对BC复合佐剂各成份不同剂量的配伍效应进行评价，采用0.067M的PBS为载体溶液，将重组VZV gE蛋白、BCG-CpG-DNA和Al(OH)3直接混合后制备疫苗。
被免疫动物：SPF级Balb/c小鼠，雌性，6-8周龄。免疫体积为100μl，于大腿内侧肌肉注射免疫。
试验分为13组，每组动物10只。
动物分别于0天、21天进行免疫，末次免疫后14天、28天免疫原性评价。
Figure BDA0002221622370000151
结果：
1.细胞免疫结果(首次免疫后5W(末次免疫后2W)、7W(末次免疫后4W)抗原特异性细胞因子检测)
取免疫后不同时间的淋巴细胞，体外gE蛋白刺激，检测抗原特异性细胞因子。由图4可见：在促进IFN-γ分泌方面，单纯的BCG-CpG-DNA佐剂与单纯Al佐剂诱导的反应强度小于二者复合作用，复合显示出增强效应，尤其高剂量BCG-CpG-DNA佐剂与高剂量Al佐剂复合作用最佳。在促进IL-2分泌方面，复合佐剂作用与单纯Al佐剂效果类似(图4)。
2.体液免疫结果
2.1抗gE蛋白特异性抗体及亚型滴度(间接ELISA法)
包被gE蛋白，检测免疫不同时间的血清中的抗体及亚型。由图5可见，在诱导特异性抗体方面，尤其在Th1型IgG2a方面，复合佐剂的效果要好于单独的生物佐剂和单独的Al佐剂，并且高剂量BCG-CpG-DNA佐剂与高剂量Al佐剂的复合效果更好。
2.2水痘病毒特异性抗体滴度(荧光抗体膜抗原(FAMA)法)
在水痘病毒疫苗株致病变的细胞中加入血清，加入FITC荧光标记的二抗，检测水痘病毒特异性抗体。由图6-1、6-2可见：低中高不同BCG-CpG-DNA佐剂与高剂量Al佐剂的复合诱导的水痘病毒(疫苗株)特异性抗体水平较高。
采用水痘病毒野毒株进行FAMA试验。由图6-3、6-4可见BCG-CpG-DNA佐剂与Al佐剂复合各组均能产生抗野毒株的抗体，而单独的BCG-CpG-DNA佐剂和单独Al佐剂组则诱导的抗体较低。其中高剂量BCG-CpG-DNA佐剂与高剂量的铝的复合效果更好。
2.3中和抗体效价(空斑减少实验)
分别用水痘疫苗株和野毒株对免疫后的血清中的中和抗体效价进行检测。由图7可见，低中高不同剂量的BCG-CpG-DNA佐剂与不同剂量的Al佐剂复合，诱导的水痘病毒(疫苗株)和野毒株特异性中和抗体水平均高于单独BCG-CpG-DNA佐剂组和单独的Al佐剂组。
发明人在研究中还注意到，复合佐剂的用量是有适宜范围的，过高或过低都不能带来理想的免疫效果。
实施例4BC复合佐剂各成份剂量进一步优化及制剂配制的研究
在实施例3结果的基础上确定动物抗原免疫剂量为5μg，BC复合佐剂中BCG-CpG-DNA与氢氧化铝剂量分别为10μg与40μg(相当于14μg铝)的情况下，进行复合佐剂VZV重组蛋白gE疫苗的制剂配制研究，同时对制剂中Al剂量进行优化，通过动物实验进行评价。
1.制剂配制
制剂配制方案一：gE蛋白与Al佐剂预吸附后再添加BCG-CpG-DNA
选择gE蛋白与不同剂量的Al佐剂进行预吸附，再加入BCG-CpG-DNA配制成免疫用疫苗。
制剂配制方案二：gE蛋白与Al佐剂和BCG-CpG-DNA同时添加混合，配制成免疫用的疫苗。
采用0.067M的PBS为载体溶液，最终配置的疫苗组合物中gE蛋白含量为50μg/0.5ml，低剂量Al佐剂浓度以Al3+计为125μg/0.5ml，中剂量Al3+为250μg/0.5ml，高剂量Al3+为500μg/0.5ml；DNA低剂量浓度为75μg/0.5ml，DNA高剂量浓度为100μg/0.5ml。
2.免疫评价
对上述制剂进行免疫性评价。免疫动物前，将所述制剂进行两倍稀释后使用。
被免疫动物：SPF级Balb/c小鼠，雌性，6-8周龄。免疫体积为100μl，于大腿内侧肌肉注射免疫。
试验分为14组，每组动物10只。
动物分别于0天、21天进行免疫，首次免疫后5W、10W进行评价。
Figure BDA0002221622370000171
Figure BDA0002221622370000181
结果：取免疫后不同时间的淋巴细胞，体外gE蛋白刺激，检测抗原特异性细胞因子。由图8可见：
对于低剂量Al佐剂而言，在促进IFN-γ分泌方面，LD组效果最好，远高于LA组，高于LB组；在促进IL-2分泌方面，LD组也远好于LA组，与LB组相当。
对于中剂量Al佐剂而言，在促进IFN-γ分泌方面，MD组远高于MA组，与MB组相当；在促进IL-2分泌方面，MD组不如MA组和MB组。
对于高剂量Al佐剂而言，在促进IFN-γ和IL-2分泌方面，HD组高于HA组和HB组。
对于直接配制方式获得的疫苗而言，不同剂量的Al佐剂对比可见，低剂量Al佐剂和BCG-CpG-DNA佐剂复合后，其在促进IFN-γ分泌方面，效果好于中剂量和高剂量的Al佐剂；在促进IL-2分泌方面，效果好于中剂量Al佐剂，与高剂量Al佐剂相当。
不受任何已知或未知的特殊理论的限制，发明人根据研究结果认为：对于VZV gE蛋白复合佐剂疫苗，更适于采用直接混合各组分的配制方法制备；并且Al佐剂用量在适当范围内可选择较低的用量。

Claims (10)

1.一种带状疱疹疫苗组合物，其包含VZV重组gE蛋白、BCG-CpG-DNA和铝佐剂；
优选，所述铝佐剂选自Al(OH)3，或AlPO4；
优选，以单位剂量疫苗组合物来讲，VZV重组gE蛋白的含量为25-100μg；优选为40-60μg；
优选，以单位剂量疫苗组合物来讲，BCG-CpG-DNA的含量为50-150μg；优选为75-110μg；
优选，以单位剂量疫苗组合物来讲，铝佐剂的含量以Al3+含量计为50-500μg；优选为125-250μg。
2.如权利要求1所述的带状疱疹疫苗组合物，其特征在于，所述带状疱疹疫苗组合物进一步包含载体溶液；
优选，所述载体溶液为PBS溶液；
优选，所述载体溶液为0.01M-0.07M，pH7.0-7.6的PBS溶液；更优选为0.06M-0.07M，pH7.2-7.6的PBS溶液；
优选，所述PBS溶液中进一步包含无机盐，所述无机盐的浓度为0.1M～0.6M；
优选，所述载体溶液为含有0.14-0.17M氯化钠的0.06M-0.07M，pH7.2-7.6的PBS溶液。
3.如权利要求1或2所述的带状疱疹疫苗组合物，其特征在于，所述带状疱疹疫苗组合物为液体形式时，VZV重组gE蛋白的浓度为50-200μg/ml，优选为80-120μg/ml；BCG-CpG-DNA的浓度为100-300μg/ml，优选为150-220μg/ml；铝佐剂的浓度以Al3+浓度计为100-1000μg/ml，优选为250-500μg/ml。
4.如权利要求1-3任一项所述的带状疱疹疫苗，其特征在于，所述带状疱疹疫苗组合物，作为疫苗使用时，以一人份疫苗剂量的方式提供，所述一人份疫苗剂量的体积为0.5ml；
优选，所述一人份疫苗剂量为0.5ml，含有VZV重组gE蛋白50μg，BCG-CpG-DNA 100μg，铝佐剂的量以Al3+计为125μg。
5.如权利要求1-4任一项所述的带状疱疹疫苗，其特征在于，所述带状疱疹疫苗组合物的制备方法为：在载体溶液中，将VZV重组gE蛋白、BCG-CpG-DNA和铝佐剂直接混合配制；
或者，在载体溶液中，先将VZV重组gE蛋白与铝佐剂进行预吸附，取预吸附的蛋白溶液再加入BCG-CpG-DNA，混匀完成疫苗组合物的配制；
或者，将VZV重组gE蛋白和BCG-CpG-DNA制成冻干粉，在使用前，用铝佐剂以及适量体积的载体溶液进行重构，形成所述疫苗组合物。
6.权利要求1-5任一项所述带状疱疹疫苗组合物的制备方法，其特征在于：在载体溶液中，将VZV重组gE蛋白、BCG-CpG-DNA和铝佐剂直接混合配制；
或者，在载体溶液中，先将VZV重组gE蛋白与铝佐剂进行预吸附，取预吸附的蛋白溶液再加入BCG-CpG-DNA，混匀完成疫苗组合物的配制；
或者，将VZV重组gE蛋白和BCG-CpG-DNA制成冻干粉，在使用前，用铝佐剂以及适量体积的载体溶液进行重构，形成所述疫苗组合物。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在10-30℃下，进行预吸附、混合或重构；采用预吸附方式时，在50-200转/分钟的条件下，进行预吸附。
8.如权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法中VZV重组gE蛋白和BCG-CpG-DNA可以固体形式或浓溶液形式加入载体溶液中；
优选，所述浓溶液的溶剂体系为0.01M-0.07M，pH7.2-7.6的PBS溶液；
优选，所述PBS溶液中进一步包含浓度为0.1M～0.6M的无机盐；
优选，所述VZV重组gE蛋白的浓溶液为用含有0.3-0.5M NaCl的0.01-0.02M pH7.4-7.6的PBS配置成蛋白浓度为2-8mg/ml的溶液；
优选，所述BCG-CpG-DNA的浓溶液为用含有0.14-0.17M NaCl的0.06-0.07M，pH7.2-7.6的PBS缓冲液配置的BCG-CpG-DNA浓度为0.5-5mg/ml的溶液。
9.由权利要求6-8任一项制备方法制备得到的带状疱疹疫苗组合物。
10.权利要求1-5任一项或权利要求9所述的带状疱疹疫苗组合物在制备预防带状疱疹和/或疱疹感染后神经痛的疫苗中的应用；
优选，所述疫苗是注射液；
优选，所述疫苗采用肌肉内注射给药的方式。
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