CN117224664B - 一种重组带状疱疹疫苗注射液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种重组带状疱疹疫苗注射液及其制备方法。所述注射液组分包括gE蛋白、佐剂、渗透压调节剂、缓冲液及稳定剂，所述注射液的pH为6.8‑7.8。本发明提供的疫苗注射液制备方法简便、成本低，本发明还为重组带状疱疹疫苗制剂工艺的确定提供实验依据，将两种佐剂同时与抗原混合，其注射液对抗原吸附时间短且吸附率高，有利于保持产品的活性，更适合产业化。
Description
技术领域
本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种重组疱疹疫苗注射液及其制备方法。
背景技术
重组带状疱疹疫苗(CHO细胞)制剂处方体系内，存在抗原、佐剂、缓冲液/辅料之间的多种相互作用。抗原是刺激人体免疫系统产生特异性体液免疫和(或)细胞免疫应答，使人体获得免疫力的成分。铝佐剂是迄今为止使用最广泛的人用疫苗佐剂，在已上市疫苗中显示了可接受的安全性和有效性，疫苗中常用的铝佐剂包括氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂，此外还包括铝佐剂与其他佐剂成分组成的佐剂系统，制剂处方中引入的另一佐剂为CpG佐剂，与铝佐剂构成佐剂系统。CpG佐剂是一种人工合成的具有免疫刺激活性的非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸的DNA重复序列(CpG oligonucleotide，CpG ODN)，作为一种Toll样受体9(TLR9)激动剂，CpG寡聚脱氧核苷酸可以促进抗原递呈细胞成熟，与抗原共同给药可以产生偏向于Th1型的免疫应答。将CpG佐剂与铝佐剂联合可以提升疫苗的有效性，引起更强的机体免疫反应，铝佐剂对抗原的吸附可能是通过疏水作用、静电作用或配体交换等机制发生的。有研究结果表明，当CpG佐剂吸附在铝佐剂上时，CpG佐剂的佐剂效果是最佳的，优于非吸附状态下的CpG佐剂+铝佐剂系统。当CpG佐剂与抗原化学连接或与抗原物理结合时，抗原对免疫反应的激活更有效。
中国发明专利CN116059337A公开了新型佐剂重组带状疱疹疫苗及其制备与应用，该发明提供了一种带状疱疹疫苗，其包括抗原和佐剂；所述抗原为含有VZV-gE蛋白和人IgG4Fc的融合蛋白；所述佐剂为铝佐剂、CpG佐剂或二者的结合。中国另一发明专利CN116211794A公开了一种高通量蛋白药物制剂、筛选方法及试剂盒，该发明包括缓冲液、表面活性剂和/或等渗调节剂；所述制剂的pH为3.5-8.0，根据配方预先配制好不同制剂，蛋白药物制剂早期研究中使用者不必再购置大量药用辅料，仅需要少量的样品，只将不同浓度蛋白样品加入试剂盒混匀，添加不同应力条件(强光、振荡、高温等)进行分析检测(包括但不限于检测Tm、Tagg)。
但上述发明成本高，制备繁琐，且对于早期蛋白药物制剂筛选有一定参考价值但不全面，无法确保蛋白药物全生命周期的稳定。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种重组疱疹疫苗注射液及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种重组疱疹疫苗注射液，所述注射液组分包括gE蛋白、佐剂、渗透压调节剂、缓冲液及稳定剂，所述注射液的pH为6.8-7.8。
优选地，所述佐剂选自铝佐剂和CpG佐剂，所述渗透压调节剂为氯化钠，所述缓冲液选自生理盐水、磷酸-氯化钠缓冲液和枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液中的任意一种，所述稳定剂为聚山梨酯80。
优选地，所述铝佐剂选自氢氧化铝和磷酸铝中的任意一种。
更优选地，所述铝佐剂选自氢氧化铝。
优选地，所述CpG佐剂选自A类(D型)CpG ODN、B类(K型)CpG ODN和C类CpG ODN中的一种或多种，所述CpG佐剂含有完全硫代磷酸根骨架。
更优选地，所述CpG佐剂为C类CpG ODN。
优选地，所述注射液组分还包括稀释剂，所述稀释剂为水。
优选地，所述注射液组分包括gE蛋白0.05-0.20mg/mL、佐剂0.025-1.5mg/mL、渗透压调节剂0.9-3％、缓冲液2-200mM和稳定剂0.01-0.1％。
更优选地，所述注射液组分包括gE蛋白0.1mg/mL、佐剂0.8-1.0mg/mL、渗透压调节剂0.9％、缓冲液2.25-50mM和稳定剂0.01％。
本发明还提供了上述注射液的制备方法，包括如下步骤：
(1)将gE蛋白与缓冲液、稳定剂和稀释剂混合，得溶液1；
(2)CpG佐剂与渗透压调节剂混合，得溶液2；
(3)将溶液1与铝佐剂混合，得溶液3；
(4)将溶液2与溶液3混合，即得。
优选地，步骤(3)中所述溶液1与铝佐剂的体积比为4-5:0.5-2，所述混合的时间为0.25-0.5h。
优选地，步骤(4)中所述溶液2与溶液3的体积比为4-5:4-6，所述混合的时间为1-3h。
优选地，步骤(1)-(4)中所述混合的温度均为15-37℃。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的疫苗注射液制备方法简便、成本低，且吸附抗原时间短，以氯化钠为渗透压调节剂，将两种佐剂同时与抗原混合，更适合产业化。
(2)本发明配制了不同配方的实验疫苗，考察不同条件下制备的实验疫苗的吸附效果，为重组带状疱疹疫苗制剂工艺的确定提供实验依据，且疫苗注射液的pH为6.8-7.8，提高了疫苗注射液的质量和稳定性。
具体实施方式
值得说明的是，本发明采用的gE蛋白的生产厂家为简达生物医药(南京)有限公司，gE蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO.1)如下所示：
SVLRYDDFHIDEDKLDTNSVYEPYYHSDHAESSWVNRGESSRKAYDHNSPYIWPRNDYDGFLENAHEHHGVYNQGRGIDSGERLMQPTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLNGDDRHKIVNVDQRQYGDVFKGDLNPKPQGQRLIEVSVEENHPFTLRAPIQRIYGVRYTETWSFLPSLTCTGDAAPAIQHICLKHTTCFQDVVVDVDCAENTKEDQLAEISYRFQGKKEADQPWIVVNTSTLFDELELDPPEIEPGVLKVLRTEKQYLGVYIWNMRGSDGTSTYATFLVTWKGDEKTRNPTPAVTPQPRGAEFHMWNYHSHVFSVGDTFSLAMHLQYKIHEAPFDLLLEWLYVPIDPTCQPMRLYSTCLYHPNAPQCLSHMNSGCTFTSPHLAQRVASTVYQNCEHADNYTAYCLGISHMEPSFGLILHDGGTTLKFVDTPESLSGLYVFVVYFNGHVEAVAYTVVSTVDHFVNAIEERGFPPTAGQPPATTKPKEITPVNPGTSPLLRYAAWTGGLA。
本发明采用的CpG佐剂的生产厂家为凯莱英医药集团(天津)股份有限公司、广州市锐博生物科技有限公司或者生工生物工程(上海)股份有限公司，CpG佐剂核苷酸序列(SEQ ID NO.2)如下所示：
5'TCG TCG TTT TCG GCG CGC GCC G 3'。
本发明使用的其余原料均为普通市售产品。
实施例1
一种重组带状疱疹疫苗注射液，所述注射液组分含有gE蛋白0.1mg/mL，氢氧化铝1mg/mL，CpG佐剂0.5mg/mL(生产厂家为凯莱英医药集团(天津)股份有限公司)，氯化钠0.9％，枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液2.25mM，聚山梨酯80 0.01％，稀释剂为注射用水，注射液pH为6.8。
按如下步骤进行制备：
(1)将gE蛋白原液、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液、聚山梨酯80和注射用水混合，得溶液1；
(2)将CpG佐剂与氯化钠混合，得溶液2；
(3)将溶液1与氢氧化铝溶液按体积比4.5:1混合0.25h，得溶液3；
(4)溶液2与溶液3按体积比4.5:5.5混合1h，得注射液。
其中，步骤(1)-(4)中混合的温度均为15℃。
实施例2
一种重组带状疱疹疫苗注射液，所述注射液组分含有gE蛋白0.1mg/mL，氢氧化铝1mg/mL，CpG佐剂0.5mg/mL(生产厂家为凯莱英医药集团(天津)股份有限公司)，氯化钠0.9％，生理盐水，聚山梨酯80 0.01％，稀释剂为注射用水，注射液pH为6.8。
如下步骤进行制备：
(1)将gE蛋白原液、生理盐水、聚山梨酯80和注射用水混合，得溶液1；
(2)将CpG佐剂与氯化钠混合，得溶液2；
(3)将溶液1与氢氧化铝溶液按体积比4.5:1混合0.25h，得溶液3；
(4)溶液2与溶液3按体积比4.5:5.5混合1h，得注射液。
其中，步骤(1)-(4)中混合的温度均为15℃。
实施例3
一种重组疱疹疫苗注射液，所述注射液组分含有gE蛋白0.1mg/mL，氢氧化铝1mg/mL，CpG佐剂0.5mg/mL(生产厂家为凯莱英医药集团(天津)股份有限公司)，氯化钠0.9％，0.5mM磷酸-50mM氯化钠缓冲液，聚山梨酯80 0.01％，稀释剂为注射水，注射液pH为6.8。
如下步骤进行制备：
(1)将gE蛋白原液、磷酸-氯化钠缓冲液、聚山梨酯80和注射用水混合，得溶液1；
(2)将CpG佐剂与氯化钠混合，得溶液2；
(3)将溶液1与氢氧化铝溶液按体积比4.5:1混合0.25h，得溶液3；
(4)溶液2与溶液3按体积比4.5:5.5混合1h，得注射液。
其中，步骤(1)-(4)中混合的温度均为15℃。
实施例4
一种重组带状疱疹疫苗注射液，所述注射液组分含有gE蛋白0.1mg/mL，氢氧化铝0.8mg/mL，CpG佐剂0.5mg/mL(生产厂家为广州市锐博生物科技有限公司)，氯化钠0.9％，10mM磷酸-50mM氯化钠缓冲液，聚山梨酯80 0.01％，稀释剂为注射用水，注射液pH为6.8。
如下步骤进行制备：
(1)将gE蛋白原液、磷酸-氯化钠缓冲液、聚山梨酯80和注射用水混合，得溶液1；
(2)将CpG佐剂与氯化钠混合，得溶液2；
(3)将溶液1与氢氧化铝溶液按体积比4:0.5混合0.5h，得溶液3；
(4)溶液2与溶液3按体积比4:6混合3h，得注射液。
其中，步骤(1)-(4)中混合的温度均为37℃。
实施例5
一种重组带状疱疹疫苗注射液，所述注射液组分含有gE蛋白0.1mg/mL，氢氧化铝0.8mg/mL，CpG佐剂0.5mg/mL(生产厂家为广州市锐博生物科技有限公司)，氯化钠0.9％，生理盐水，聚山梨酯80 0.01％，稀释剂为注射用水，注射液pH为7.8。
如下步骤进行制备：
(1)将gE蛋白原液、生理盐水、聚山梨酯80和注射用水混合，得溶液1；
(2)将CpG佐剂与氯化钠混合，得溶液2；
(3)将溶液1与氢氧化铝溶液按体积比4:0.5混合0.5h，得溶液3；
(4)溶液2与溶液3按体积比4:6混合3h，得注射液。
其中，步骤(1)-(4)中混合的温度均为37℃。
实施例6
一种重组带状疱疹疫苗注射液，所述注射液组分含有gE蛋白0.2mg/mL，氢氧化铝1mg/mL，CpG佐剂0.5mg/mL(生产厂家为生工生物工程(上海)股份有限公司)，氯化钠3％，10mM磷酸-50mM氯化钠缓冲液，聚山梨酯80 0.1％，稀释剂为注射用水，注射液pH为6.8。
制备方法：
(1)将gE蛋白原液、磷酸-氯化钠缓冲液、聚山梨酯80和注射用水混合，得溶液1；
(2)将CpG佐剂与氯化钠混合，得溶液2；
(3)将溶液1与氢氧化铝溶液按体积比4:0.5混合0.5h，得溶液3；
(4)溶液2与溶液3按体积比4:6混合3h，得注射液。
其中，步骤(1)-(4)中混合的温度均为37℃。
对比例1
一种重组带状疱疹疫苗注射液，所述注射液组分含有gE蛋白0.1mg/mL，氢氧化铝1mg/mL，CpG佐剂0.5mg/mL(生产厂家为凯莱英医药集团(天津)股份有限公司)，蔗糖0.9％，枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液2.25mM，聚山梨酯80 0.01％，稀释剂为注射用水，注射液pH为6.8。
按如下步骤进行制备：
(1)将gE蛋白原液、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液、聚山梨酯80和注射用水混合，得溶液1；
(2)将CpG佐剂与蔗糖混合，得溶液2；
(3)将溶液1与氢氧化铝溶液按体积比4.5:1混合0.25h，得溶液3；
(4)溶液2与溶液3按体积比4.5:5.5混合1h，得注射液。
其中，步骤(1)-(4)中混合的温度均为15℃。
对比例2
一种重组带状疱疹疫苗注射液，所述注射液组分含有gE蛋白0.1mg/mL，氢氧化铝1mg/mL，CpG佐剂0.5mg/mL(生产厂家为凯莱英医药集团(天津)股份有限公司)，海藻糖0.9％，枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液2.25mM，聚山梨酯80 0.01％，稀释剂为注射用水，注射液pH为6.8。
按如下步骤进行制备：
(1)将gE蛋白原液、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液、聚山梨酯80和注射用水混合，得溶液1；
(2)将CpG佐剂与海藻糖混合，得溶液2；
(3)将溶液1与氢氧化铝溶液按体积比4.5:1混合0.25h，得溶液3；
(4)溶液2与溶液3按体积比4.5:5.5混合1h，得注射液。
其中，步骤(1)-(4)中混合的温度均为15℃。
对比例3
一种重组带状疱疹疫苗注射液，所述注射液组分含有gE蛋白0.1mg/mL，氢氧化铝0.8mg/mL，CpG佐剂0.5mg/mL(生产厂家为广州市锐博生物科技有限公司)，氯化钠0.9％，10mM磷酸-50mM氯化钠缓冲液，聚山梨酯80 0.01％，稀释剂为注射用水，注射液pH为8.0。
如下步骤进行制备：
(1)将gE蛋白原液、磷酸-氯化钠缓冲液、聚山梨酯80和注射用水混合，得溶液1；
(2)将CpG佐剂与氯化钠混合，得溶液2；
(3)将溶液1与氢氧化铝溶液按体积比4:0.5混合0.5h，得溶液3；
(4)溶液2与溶液3按体积比4:6混合3h，得注射液。
其中，步骤(1)-(4)中混合的温度均为37℃。
对比例4
一种重组带状疱疹疫苗注射液，所述注射液组分含有gE蛋白0.1mg/mL，氢氧化铝0.8mg/mL，CpG佐剂0.5mg/mL(生产厂家为广州市锐博生物科技有限公司)，氯化钠0.9％，10mM磷酸-50mM氯化钠缓冲液，稀释剂为注射用水，注射液pH为6.8。
如下步骤进行制备：
(1)将gE蛋白原液、磷酸-氯化钠缓冲液、聚山梨酯80和注射用水混合，得溶液1；
(2)将CpG佐剂与氯化钠混合，得溶液2；
(3)将溶液1与氢氧化铝溶液按体积比4:0.5混合0.5h，得溶液3；
(4)溶液2与溶液3按体积比4:6混合3h，得注射液。
其中，步骤(1)-(4)中混合的温度均为37℃。
实验一渗透压调节剂对抗原吸附率和CpG佐剂吸附率的影响
1.实验方法：室温下，将实施例1和对比例1、2制备得到的疫苗注射液疫放于混悬仪上过夜吸附后，取全液100μL和上清液50μL，用ELISA法检测全液及上清中抗原含量，计算各试样的抗原吸附率，用UV检测CpG佐剂吸附率，吸附率公式如下式所示。
抗原吸附率＝上清液中抗原吸光度值/全液中抗原吸光度值×100％
CpG佐剂吸附率＝上清液中CpG佐剂吸光度值/全液中CpG佐剂吸光度值×100％
2.结论分析：由表1可知，以氯化钠作为渗透压调节剂对抗原吸附率和CpG佐剂吸附率效果优于海藻糖和蔗糖，其渗透压均位于正常人体血液的渗透压摩尔浓度范围285-310mOsmol/kg内。
表1
实验二本发明缓冲液对注射液稳定性的影响
1.实验方法：室温下，将实施例1-3制备的疫苗注射液放于混悬仪上吸附过夜，第二天取出500μL进行抗原吸附率、CpG佐剂吸附率、渗透压和pH值检测，其中疫苗注射液在30天内连续进行gE抗原吸附率检测和CpG佐剂吸附率检测，在第11天和第18天检测疫苗注射液的pH，考察制剂稳定性。
2.结论分析：15天内连续进行gE抗原吸附率检测的结果由表2可知，在三种稀释液体系中，疫苗注射液的检测结果均＞95％。
8天内连续进行CpG佐剂吸附率检测的结果由表3可知，在三种稀释液：生理盐水、0.5mM磷酸-50mM氯化钠缓冲液、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液中，疫苗注射液在第1天和第8天检测的吸附率均＞95％。
对于渗透压和pH值检测结果由表4和表5可知，在三种稀释液：生理盐水、0.5mM磷酸-50mM氯化钠缓冲液、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液中，疫苗注射液的渗透压检测值均位于正常人体血液的渗透压摩尔浓度范围285-310mOsmol/kg内，在第11天和第18天检测的pH值均位于中性附近。
表2
表3
表4
| 试样 | 缓冲液 | 渗透压(mOsmol/kg) |
| 实施例1 | 枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液 | 285 |
| 实施例2 | 生理盐水 | 286 |
| 实施例3 | 0.5mM磷酸-50mM氯化钠缓冲液 | 299 |
表5
实验三注射液的pH对抗原吸附率的影响
1.实验方法：室温下，将实施例4、5和对比例3制备的疫苗注射液放于混悬仪上吸附过夜后，取全液100μL和上清液50μL，用ELISA法检测全液及上清中抗原含量，计算各试样的抗原吸附率。
2.结论分析：由表6可知，在将体系pH值由6.8提高至8.0时，gE抗原吸附率下降，提示在近中性条件下更有利于Al(OH)3发挥吸附作用。
表6
| 试样 | pH | 抗原吸附率(％) |
| 实施例4 | 6.8 | 98.4 |
| 实施例5 | 7.8 | 99.6 |
| 对比例3 | 8.0 | 77.1 |
实验四稳定剂对抗原吸附率的影响
1.实验方法：室温下，将实施例4、6和对比例4制备的疫苗注射液放于混悬仪上吸附过夜后，取全液100μL和上清液50μL，用ELISA法检测全液及上清中抗原含量，计算各试样的抗原吸附率。
2.结论分析：由表7可知，当配制处方中Al(OH)3浓度为0.8mg/mL时，加入聚山梨酯80后提高了对gE抗原的吸附，且抗原吸附率均＞98.0％；将Al(OH)3浓度提升至1.0mg/mL时，保证抗原吸附率均＞98.0％的同时；未加入聚山梨酯80后抗原吸附率<90％。
表7
| 试样 | Al(OH)3(mg/mL) | CpG(mg/mL) | 聚山梨酯80 | 抗原吸附率(％) |
| 实施例4 | 0.8 | 0.5 | 0.01％ | 98.4 |
| 实施例6 | 1 | 0.5 | 0.01％ | 99.1 |
| 对比例4 | 0.8 | 0.5 | \ | 87.2 |
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (7)
1.一种重组疱疹疫苗注射液，其特征在于，所述注射液组分由gE蛋白、佐剂、渗透压调节剂、缓冲液、稀释剂及稳定剂组成，所述注射液的pH为6.8-7.8；
所述稀释剂为水；
所述佐剂选自铝佐剂和CpG佐剂，所述渗透压调节剂为氯化钠，所述缓冲液选自生理盐水、磷酸-氯化钠缓冲液和枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液中的任意一种，所述稳定剂为聚山梨酯80；
所述铝佐剂选自氢氧化铝和磷酸铝中的任意一种，所述CpG佐剂为C类CpG ODN，所述CpG佐剂含有完全硫代磷酸根骨架；
所述注射液组分包括gE蛋白0.05-0.20 mg/mL、佐剂0.025-1.5 mg/mL、渗透压调节剂0.9-3%、缓冲液2-200 mM和稳定剂0.01-0.1%；
所述gE蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
所述CpG佐剂核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2.根据权利要求1所述的注射液，其特征在于，所述注射液组分包括gE蛋白0.1 mg/mL、佐剂0.8-1.0 mg/mL、渗透压调节剂0.9%、缓冲液2.25-50 mM和稳定剂0.01%。
3.一种如权利要求1或2所述的注射液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将gE蛋白与缓冲液、稳定剂和稀释剂混合，得溶液1；
（2）CpG佐剂与渗透压调节剂混合，得溶液2；
（3）将溶液1与铝佐剂混合，得溶液3；
（4）将溶液2与溶液3混合，即得。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述溶液1与铝佐剂的体积比为4-5:0.5-2，所述混合的时间为0.25-0.5 h。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述溶液2与溶液3的体积比为4-5:4-6，所述混合的时间为1-3 h。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）-（4）中所述混合的温度均为15-37℃。
7.一种如权利要求1-2任意一项所述的注射液或者权利要求3-6任意一项所述的制备方法制备得到的注射液在制备用于预防或改善带状疱疹后神经痛的药物中的应用。
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