CN1997391A - 以聚肌苷酸－聚胞苷酸为主的佐剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种聚核苷酸佐剂组合物以及引发免疫反应的使用方法。本发明亦提供一种免疫原组成物，包含该聚核苷酸佐剂组合物和抗原(例如此二种成份位于一疫苗内)。本发明的佐剂组合物具有特定的物理性质(例如分子量、浓度和pH)，这些性质能符合所需的一种诱导增强免疫反应和改变免疫反应类型的有效且安全的佐剂。本发明更思及这些佐剂组合物的使用方法，特别是诱导对于抗原复合物的免疫反应。

Description

以聚肌苷酸-聚胞苷酸为主的佐剂

技术领域

本发明主要关于佐剂组合物以及使用这些佐剂组合物来促进免疫反应的方法，它特定关于用以促进抗原的免疫原性(immunogenicity)的组合物、疫苗和方法。它更特定关于聚核苷酸佐剂组合物、含有该聚核苷酸佐剂组合物的疫苗，以及利用所述聚核苷酸佐剂组合物和疫苗来促进宿主体内的免疫反应的方法。

发明背景

1.相关技术的叙述

免疫系统具有产生特异性和非特异性免疫力。一般而言，B和T淋巴细胞在他们的细胞表面上有针对特定抗原的特定受体，能产生特异性免疫。该免疫系统会对各抗原以二种方式特异免疫反应：1)体液免疫反应，涉及刺激B细胞产生抗体或免疫球蛋白、抗原提呈细胞(APCs)功能及辅助性T细胞(Th1和Th2)功能，以及2)细胞免疫反应，一般涉及T细胞、包括细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)和其它涉及CTL反应的产生例如，Th1和/或Th2细胞以及APCs。

非特异性免疫包含多种细胞作用机制，例如巨噬细胞(macrophages)或颗粒细胞(granulocytes)的吞噬作用(phagocytosis)以吞噬外来颗粒或抗原，以及天然杀伤细胞(NK细胞)活性等。非特异性免疫力依赖是原来的免疫机制，且不会展现出特异性和记忆性的获得性特性，该获得性特性是特异性免疫反应的典型特点。特异性和非特异性免疫之间的关键性差异是前者由淋巴细胞介导识别特异性抗原基序，具有记忆功能；而后者没有此功能。因此接种疫苗(涉及免疫特异性和记忆性)是一种保护机体以对抗有害病原体的有效机制。

佐剂是增强机体对抗原的免疫反应或改变免疫反应类型的物质，当它和抗原共同给予时(与该抗原相混合，或在给予该抗原以前或后给予)会促进或改变对于该特定抗原的免疫反应及免疫反应的类型。

常见促进免疫反应的典型佐剂包括：铝化合物(该佐剂常被通称为铝佐剂″Alum″)、水包油乳剂(完全弗氏佐剂CFA是一种水包油乳剂，含有经干燥和热杀灭的结核杆菌)、皂甙(从皂质树QuillajaSaponoria皮分离而来，该佐剂活性成份被称为Quile A)、CpG ODN(合成寡去氧核苷酸，含有去甲基化的CpG二聚核苷酸)、MPL(从明尼苏达Re595沙氏杆菌(Salmonella minnesota Re595)的脂多醣衍生而来)、脂质体(通常由如磷脂等可生物降解性材料制成)以及可生物降解性聚合微球体(由如PLGA、聚膦腈(polyphosphazene)和聚酐等多种聚合物制成)。这些物质的佐剂性质已经过评估各有优缺点。

将佐剂应用在人用疫苗，特别是儿童用常规疫苗的最大挑战在于大多数佐剂配方产生毒性和不良反应或者佐剂效果不显著。在疫苗研发所运用的新技术正朝向纯化、亚单位或合成抗原发展，这些抗原本身具有较弱的免疫原性。开发新佐剂以改善免疫原性/有效性并减低不良副作用是疫苗研发面对的一个主要挑战。

聚核苷酸复合物已在试验用作佐剂等多种用途上。双链RNAs(dsRNAs)是非常有效的生物修饰因子，可在毫微摩尔浓度下对细胞引起明显作用。dsRNA的调控效应包括在分子和细胞水平上广泛的作用。

在分子水平上，dsRNAs可诱导如干扰素(interferon)的合成、蛋白质激酶的产生、增进组织兼容性抗原以及抑制代谢作用等生物效应。在细胞水平上，dsRNA可激发如热原性(pyrogenicity)、细胞分裂(mitogenicity)、巨噬细胞活化、活化细胞免疫以及引发抗病毒等生物效应。dsRNAs的巨大前景在于抗微生物治疗上的免疫调控效应。美国专利第4,124,702号提出dsRNAs在活的动物细胞中诱导干扰素产生。美国专利第3,906,092号提出含有聚核苷酸或聚核苷酸复合物的佐剂型疫苗抗体产生增强。Houston等人建立PICLC(聚肌苷酸聚胞苷酸poly-L-赖氨酸-羧甲基纤维素复合物)作一种有效的佐剂，藉此增加初级抗体反应而无需其它佐剂的辅助(参见Houston et al.，Infection andImmunity，14：318-9，1976C)。霉病毒型dsRNA(Mycoviral dsRNA)被发现能显著地增进凝血抗体对于绵羊红血球细胞的反应(参见Wrightand Adler-Moore，Biochemical and Biophysical Research Communications，131：949-45，1985)。

PIC(聚肌苷酸-聚胞苷酸)用于动物时，在一定剂量下会引起严重的毒性反应，例如，Phillips等人报导在2.0mg/kg剂量下亚慢性给予狗PIC会引起严重的毒性作用。毒性的表现为自发性活动减低、协调不良、厌食、呕吐、体重下降，血液变化反映在降低造血功能、碱性磷酸酶和转胺酶活性升高、胸腺退化、骨髓破坏、肝脏的小叶中心区窦状毛细血管扩张、肝细胞坏死、肝结构崩解以及全身性关节炎(参见Phillips et al.，Toxicology and Applied Pharmacology，18：220-30，1971)。

作为被研究最多的聚核苷酸复合物中的一种，PIC在用于猴和人体时并不有效，这是因为PIC在进入灵长类(包括人)体内后，会很快被灵长类以上动物体内的核酸酶降解。因此许多方式用来改进PIC的不足，例如，由PIC与poly-L-lysine hydrobromide复合物对于胰核糖核酸酶水解的抵抗性较原PIC高约5至15倍，又例如PIC与polyL-lysincarboxymethylcellulose复合物(简称PICLC)被发现是非常有效的抗病毒或抗肿瘤剂。PICLC是一种包含有聚核苷酸和聚核糖胞苷酸的合成dsRNA。虽然PICLC是一种有前景的免疫调控剂，在抗微生物与抗癌治疗有很好潜能，但在人体试验中产生严重不良副作用，特别是反复高剂量用药时。有报导的不良副作用包括发热、低血压、白血球减少(leucopenia)、肢体倦痛(myalgia)、血小板减少(thrombocytopenia)以及多关节痛(polyarthralgia)。因此该产品不能用于人体，该产品的毒性和稳定性问题必须被克服。以使得PICLC能使安全用于用人体。此外PICLC的治疗有效性受限于其在活体内的稳定性。

一种包含有聚肌苷酸-聚胞苷酸(PIC)、卡那霉素(kanamycin)和钙离子(该复合物简称Av-PICKCa)的抗病毒药物被用于治疗病毒感染。已证实Av-PICKCa在机体诱导发干扰素与白介素-2的产生。单独给予Av-PICKCa作为抗病毒药物会刺激非特异性免疫反应，例如Av-PICKCa直接刺激下非针对特定抗原干扰素的产生。此种抗病毒反应非常不同于当佐剂与抗原共同给予时所产生的抗原特异性免疫反应。

更重要的是本案发明人发现到Av-PICKCa具有佐剂的性质，也就是当与抗原共同给予时增强特异性免疫反应的能力。本案发明人发现当与狂犬病及出血热病毒抗原共同免疫时，Av-PICKCa是一种有效的佐剂。

Lin等人叙述，Av-PICKCa可用作一种佐剂(参见Lin，et al.，A newimmunostimulatory complex(PICKCa)in experimental rabies：antiviraland adjuvant effects，Arch Virol，131：307-19，1993；中国专利93105862.7号)。中国专利第93105862.7号提供由PIC、卡那霉素和钙离子所构成的复合物(简称PICKCa)在人和哺乳动物作为疫苗佐剂用途。

Av-PICKCa样品在分子大小和重量上是异质的。在文献中，Av-PICKCa是以沉降系数单位(Svedbergs)S所表示的沉降系数值的平均值或范围来叙述。在一个实施例中，抗病毒药剂Av-PICKCa存在于5S至8S之间剂(来源A)，请参见Zhung J.C.，Research recollectionof polyinosinic-polycytidylic acid(PIC).The paper of fifth Chineseinterferon conference in clinical application and theory，Xian 1985，pp23-28。在其它的实施例中，Av-PICKCa的沉降系数是4S至12S，具有一平均值为6S剂(来源B)，或者沉降系数是5S至12S，具有一平均值为7S剂(来源C)，或者沉降系数是8S至10S剂(来源D)，请参见Hu Q.G，Tianjin Av-PICKCa’s laboratory research and clinicalapplication，Fujian Medical Journal，1983.12；(6)：28-30以及Hu Q.GChinese Medical and Pharmaceutical Industry Journal，1983(9)3134。

利用换算公式mw＝1,100xS2.2(参见Su B.X.et al；Introduction ofBiochemical Technology，1st Edition，Zhongshan University，1978，356-357)，Av-PICKCa中的异质分子的沈降系数可换算成对等的分子量(mw，以道尔顿Daltons表示)。下表显示换算成道尔顿的结果：

表A：Av-PICKCa的特性

来源	沉降系数S			分子量道尔顿
							最低	最高	平均	最低	最高	平均
	A	5	8	*	38,000	107,000							*
B							4	12	6	23,000	260,000	57,000
	C	5	12	7	38,000	260,000							79,000

D

8

10

*

107,000

174,000

*

^*参考文献中没有提出的数据

Lin等人将一个样品用于以Av-PICKCa作为佐剂的原始研究中，该样品的分子具有和来源A相类似的特性，也就是它的沉降系数是5S至8S，该沉降系数对等于位在38,000道尔顿至107,000道尔顿范围内的分子的分子量。(参见Lin et al.，同前)。

一般相信，所有形式的PICKCa均是对等地安全且有效，因为Av-PICKCa基本上是PICKCa的一种形式，且Av-PICKCa在过去已被用作为抗病毒药剂。但事实却不是如此。本案发明人所进行的研究显示，当PICKCa和抗原组合而被用作为一佐剂时，PICKCa的有效性和毒性事实上会随着分子量的不同而有变化。本案发明人发现Av-PICKCa作为佐剂时不能提供最佳的有效性/安全性状态，且PICKCa在某些情况下确实会引起令人无法接受的不良副作用。因此，业界仍然需要一种更适于人类使用并且能提供所需免疫反应的安全且有效佐剂。本发明能满足这个需求并提供其它优点，参照后述详细说明即可明暸。

2.文献

相关参考资料列示于下：

JP 1093540A2；

美国专利第4,124,702号

美国专利第3,692,899号

美国专利第3,906,092号

美国专利第4,389,395号

美国专利第4,349,538号

美国专利第4,024,241号

美国专利第3,952,097号

Houston et al.，Infection and Immunity，14：318-9，1976C

Wright and Adler-Moore，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，131：949-45，1985

Phillips et al.，Toxicology and Applied Pharmacology，18：220-30，1971

Lin，et al.，A new immunostimulatory complex(PICKCa)inexperimental rabies：antiviral and adjuvant effects，Arch Virol，131：307-19，1993

中国专利第93105862.7号

Zhung J.C.，Research recollection of polyinosinic-polycytidylic acid(PIC).The paper of fifth Chinese interferon conference in clinicalapplication and theory，Siam 1985，pp23-28

Hu Q.G，Tianjin Av-PICKCa’s laboratory research and clinicalapplication，Fujian Medical Joumal，1983.12；(6)：28-30

Hu Q.G Chinese Medical and Pharmaceutical Industry Journal，1983(9)3134.

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美国专利第4,094,971号

美国专利第4,101,536号

美国专利第4,153,684号

美国专利第4,235,771号

美国专利第4,323,559号

美国专利第4,327,085号

美国专利第4,185,089号

美国专利第4,082,736号

美国专利第4,369,178号

美国专利第4,314,998号

美国专利第4,082,735号

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Laboratory Techniques in Rabies Edited by F X Meslin，M M Kaplan，H Koprowski 4th Edition ISBN 92 4 1544 1

发明内容

本发明提供一种聚核苷酸佐剂组合物以及用以诱导免疫反应的方法。本发明亦提供一种免疫原组成物，包含该聚核苷酸佐剂组合物和抗原(例如此二种成份位于一疫苗内)。本发明的佐剂组合物具有特定的物理性质(例如分子量、浓度和pH)，这些性质能符合于提供一种诱导增强免疫反应和改变免疫反应类型的有效且安全的佐剂。本发明更提供这些佐剂组合物的使用方法，特别是诱发对于抗原物的免疫反应。

在实施例中，本发明提供一种聚核苷酸佐剂组合物，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(polyriboinosinic-polyribocytidylic acid)(PIC)、一抗生素以及一阳离子，其中该抗生素可为卡那霉素，且该阳离子可为一个二价离子，例如钙。本发明亦提供一种免疫原组成物，包含该聚核苷酸佐剂组合物以及抗原或疫苗。

本发明藉由界定一种可安全且有效地用作为一佐剂的新颖组合物，以增进及/或改变一动物或人类宿主体内的免疫反应，从而促进知识的提升。虽然先前技术显示抗病毒药剂Av-PICKCa可用以作为一种佐剂，但是此种形式的PICKCa和抗原共同给予时，被观察到仅能引起有限的特异性免疫反应。此外，PICKCa被发现在某些情况下会引起令人无法接受的不良副作用。

本发明藉由提供一种佐剂组合物来因应这些问题，该组合物在此简称为“PIKA”，其可作为一佐剂而最有效且安全地给予动物，包括人类。

PIKA是一种组合物，包含一聚核苷酸、一抗生素以及一阳离子，该组合物已被特定地研发成为一种佐剂。本发明包括数种组合物，这些组合物具有特殊的产物特性，使这些组合物特别适合使用作为在免疫原组成物内的佐剂，以给予动物及/或人类。

具体上说，本发明提供一种聚核苷酸佐剂组合物，包含一聚核苷酸、一抗生素以及一阳离子，其中该聚核苷酸可为聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)；该抗生素是卡那霉素、蒽环霉素(Anthracycline)、硫酸丁酰苷菌素(butirosin sulfate)、庆大霉素(gentamicin)、潮霉素(hygromycin)、丁胺卡那霉素(amikacin)、双去氧卡那霉素(dibekacin)、暗霉素(nebramycin)、美它酰胺(metrzamide)、新霉素(neomycin)、嘌呤霉素(puromycin)、链霉素或链脲霉素(streptozocin)；以及该离子是钙、镉、锂、镁、铈、铯、铬、钴、氘、镓、碘、铁或锌。

详细地说，本发明提供包含有一聚核苷酸、一抗生素以及一阳离子的组合物的规格，包括分子量、浓度和pH，该组合物能满足对于引起最大所需免疫反应并安全佐剂的需要。

本发明亦提供一种免疫原组成物，包含该聚核苷酸佐剂组合物以及抗原或疫苗。

在某些实施例中，本发明呈现一种组合套装(KIT)的形式，包含该聚核苷酸佐剂以及一免疫原性物质。

此外，本发明提供方法，藉由将该免疫原组成物给予一宿主，以促进对于抗原物质的免疫反应。该宿主可为人类或动物。该给予过程可经由如肌肉内、腹腔内、静脉内或皮下注射等注射或是藉由经呼吸道吸入来完成。在其它实施例中，该免疫原组成物可经由直肠、阴道、鼻、口、眼、局部、透皮或皮内来传输。

据此，本发明提供可安全地使用于人体或动物体的一种佐剂以及一种免疫原组成物。

据此，在一方面，本发明的特点是一种聚核苷酸佐剂组合物，包含一聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、一抗生素以及一阳离子，其中该组合物含有在分子量上为异质的佐剂分子，该分子的分子量为约66,000至1,200,000道尔顿。

在相关实施例中，该组合物中的聚核苷酸佐剂组合物分子在分子量上是异质的，其中该分子量为约300,000至1,200,000道尔顿，或是约66,000至660,000道尔顿，或是约300,000至660,000道尔顿，或是约300,000至2,000,000道尔顿，或是约300,000至to 4,000,000道尔顿，或是约500,000至1,000,000道尔顿，或是约1,000,000至1,500,000道尔顿，或是约1,500,000至2,000,000道尔顿，或是约2,000,000至2,500,000道尔顿，或是约2,500,000至3,000,000道尔顿，或是约3,000,000至3,500,000道尔顿，或是约3,500,000至4,000,000道尔顿，或是约4,000,000至4,500,000道尔顿，或是约4,500,000至5,000,000道尔顿。

在相关实施例中，该组合物中的聚核苷酸佐剂组合物分子具有一平均分子量，该平均分子量等于或高于150,000道尔顿，或是等于或高于250,000道尔顿，或是等于或高于350,000道尔顿，或是等于或高于500,000道尔顿，或是等于或高于650,000道尔顿，或是等于或高于750,000道尔顿，或是等于或高于1,000,000道尔顿，或是等于或高于1,200,000道尔顿，或是等于或高于1,500,000道尔顿，或是等于或高于2,000,000道尔顿。

据此，在一态样中，本发明的特点是一种聚核苷酸佐剂组合物，包含一聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、一抗生素以及一阳离子，其中该组合物含有在分子大小上呈异质的佐剂分子，这些佐剂分子的沈降系数单位(Svedbergs)为约6.43S至24.03S。

在相关实施例中，该组合物中的聚核苷酸佐剂组合物分子在分子大小上是异质的，其中该分子大小为约12.8S至24.03S，或是约6.43至18.31S，或是约12.8至18.31S，或是约12.8S至30.31S，或是约12.8S至41.54S，或是约13.5S至18.31S，或是约13.5S至24.03S，或是约16.14至22.12S，或是约22.12S至26.6S，或是约26.6S至30.31S，或是约30.31S至33.55S，或是约33.55S至36.45S，或是约36.45S至39.1S，或是约39.1S至41.54S，或是约41.54S至43.83S，或是约43.83S至45.95S。

在其它相关实施例中，该聚核苷酸佐剂组合物具有一平均沉降系数单位(Svedbergs)，该平均沈降系数高于9，或是高于12，或是高于13.5，或是高于15，或是高于16，或是高于17，或是高于18，或是高于19，或是高于20，或是高于21，或是高于22，或是高于25，或是高于30。

在一相关实施例中，该组合物中的抗生素是卡那霉素、新霉素、蒽环霉素、硫酸丁酰苷菌素、庆大霉素、潮霉素、丁胺卡那霉素、双去氧卡那霉素、暗霉素、美它酰胺、嘌呤霉素、链霉素或链脲霉素。

在另一相关实施例中，该佐剂组合物更包含一种钙离子。

在另一相关实施例中，该组合物中的阳离子是钙、镉、锂、镁、铈、铯、铬、钴、氘、镓、碘、铁或锌。该阳离子可呈无机盐或有机复合物的形式。

钙离子来源可为例如氯化钙、碳酸钙、氟化钙、氢氧化钙、磷酸钙或硫酸钙。

在一个特别相关方面，本发明提供一种聚核苷酸佐剂组合物，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那霉素和钙，其中该组合物包括在分子量上呈异质的佐剂分子，这些佐剂分子的分子量为约66,000至1,200,000道尔顿。

在相关实施例中，该聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那霉素和钙分子的分子量为约300,000至1,200,000道尔顿，或是约66,000至660,000道尔顿，或是约300,000至660,000道尔顿，或是约300,000至2,000,000道尔顿，或是约300,000至4,000,000道尔顿，或是约500,000至1,000,000道尔顿，或是约1,000,000至1,500,000道尔顿，或是约1,500,000至2,000,000道尔顿，或是约2,000,000至2,500,000道尔顿，或是约2,500,000至3,000,000道尔顿，或是约3,000,000至3,500,000道尔顿，或是约3,500,000至4,000,000道尔顿，或是约4,000,000至4,500,000道尔顿，或是约4,500,000至5,000,000道尔顿。

在其它相关实施例中，该佐剂的聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那霉素和钙分子组合物在分子量上呈异质，这些分子具有一平均分子量，该平均分子量等于或高于150,000道尔顿，等于或高于250,000道尔顿，或是等于或高于350,000道尔顿，或是等于或高于500,000道尔顿，或是等于或高于650,000道尔顿，或是等于或高于750,000道尔顿，或是等于或高于1,000,000道尔顿，或是等于或高于1,200,000道尔顿，或是等于或高于1,500,000道尔顿，或是等于或高于1,500,000道尔顿。

在一个特别相关方面，本发明提供一种聚核苷酸佐剂组合物，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那霉素和钙，其中该组合物包括在分子大小上呈异质的佐剂分子，这些佐剂分子的沈降系数单位(Svedbergs)为约6.43S至24.03S。

在相关实施例中，该组合物中的聚核苷酸佐剂组合物分子在分子大小上是异质的，其中该分子大小为约12.8S至24.03S，或是约6.43至18.31S，或是约12.8至18.31S，或是约12.8S至30.31S，或是约12.8S至41.54S，或是约13.5S至18.31S，或是约13.5S至24.03S，或是约16.14至22.12S，或是约22.12S至26.6S，或是约26.6S至30.31S，或是约30.31S至33.55S，或是约33.55S至36.45S，或是约36.45S至39.1S，或是约39.1S至41.54S，或是约41.54S至43.83S，或是约43.83S至45.95S。

在其它相关实施例中，该聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那霉素和钙组合物具有一平均沉降系数，该平均沈降系数高于9，或是高于12，或是高于13.5，或是高于15，或是高于16，或是高于17，或是高于18，或是高于19，或是高于20，或是高于21，或是高于22，或是高于25，或是高于30。

在一些实施例中，本发明供一种聚核苷酸佐剂组合物，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那霉素和钙，其中该组合物较佳为排除某些组合物分子，特别是在这些被排除的分子不具有显著的免疫原效应的程度上，其中被排除的组合物分子的分子量为大约或低于30,000道尔顿，大约或低于40,000道尔顿，大约或低于50,000道尔顿，大约或低于60,000道尔顿，大约或低于70,000道尔顿，大约或低于80,000道尔顿，大约或低于90,000道尔顿，大约或低于100,000道尔顿，大约或低于150,000道尔顿，大约或低于200,000道尔顿，大约或低于250,000道尔顿，大约或低于300,000道尔顿，大约或低于350,000道尔顿，大约或低于400,000道尔顿，大约或低于450,000道尔顿，大约或低于500,000道尔顿，大约或低于600,000道尔顿，大约或低于700,000道尔顿，大约或低于800,000道尔顿，大约或低于900,000道尔顿，大约或低于1,000,000道尔顿。

在一些实施例中，本发明提供一种聚核苷酸佐剂组合物，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那霉素和钙，其中最好为排除该组合物某些分子，特别是在这些被排除的分子不具有显著程度的免疫原效应的，其中被排除的分子的分子大小为大约或低于4.49S，大约或低于5.12S，大约或低于5.67S，大约或低于6.16S，大约或低于6.6S，大约或低于7.02S，大约或低于7.4S，大约或低于7.77S，大约或低于9.34S，大约或低于10.64S，大约或低于11.78S，大约或低于12.8S，大约或低于13.73S，大约或低于14.59S，大约或低于15.39S，大约或低于16.14S，大约或低于17.54S，大约或低于18.81S，大约或低于19.99S，大约或低于21.09S，大约或低于22.12S。

在一个特别相关方面，本发明提供一种用以促进抗原物的抗原性的免疫原组合物，包含该聚核苷酸佐剂的组合物。

在相关实施例中，该免疫原组成物包含该聚核苷酸佐剂以及抗原。

在相关实施例中，抗原来源是一种人类抗原、一种非人类动物抗原、一种植物抗原、一种细菌抗原、一种真菌抗原、一种病毒抗原、一种寄生虫抗原或是一种癌肿抗原。

在相关实施例中，该免疫原组成物包含该聚核苷酸佐剂组合物以及一狂犬病抗原。

在某些实施例中，抗原可从一天然来源纯化出，藉由固相合成法来合成出或是可藉由重组遗传技术而获得。抗原可包含一个蛋白质片段，该蛋白质片段含有该分子的一或多个免疫原区。抗原亦可藉由活的、减毒的、或截短的或被杀死的完整细胞或微生物(例如完整病毒颗粒)来提供。

在其它的实施例中，抗原包括一或多种成分，源自于感染物、植物抗原、癌肿、过敏性成分以及例如会导致自体免疫疾病的其它人类抗原。在其它的实施例中，抗原包括一或多种感染物，源自于病毒、细菌、分枝杆菌(Mycobacterium)、真菌及寄生虫中的任一种。

本发明的聚核苷酸佐剂组合物亦可用于促进免疫反应，该免疫反应是针对运用DNA疫苗所产生的抗原。这些疫苗中用以编码抗原的DNA序列可以是″裸露的″，或是被容纳在一个如脂小体的载体系统内。

在其它的相关实施例中，狂犬病抗原是选自于人类双倍体细胞疫苗(HDCV)，或是仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病疫苗(HKC-IPRV)，或是仓鼠肾细胞灭活粗制型狂犬病疫苗(HKC-ICRV)，或是纯化型Vero细胞狂犬病疫苗(PVRV)，或是纯化型鸡胚细胞(PCEC)，或是纯化型鸭胚疫苗(PDEV)，或是仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)  或是仓鼠肾细胞灭活粗制狂犬病抗原(HKC-ICRA)。

在一个特别相关方面，本发明提供一种用以促进抗原物的抗原性的免疫原组成物，包含能诱导抗原特异性细胞免疫反应的聚核苷酸佐剂组合物。

在一个特别相关方面，本发明提供一种用以促进抗原物的抗原性的免疫原组成物，包含能诱导抗原特异性B细胞免疫反应的聚核苷酸佐剂组合物。

在一个特别相关方面，本发明提供一种用以促进抗原物的抗原性的免疫原组成物，包含能同时诱导T细胞和B细胞对抗原特异性免疫反应的聚核苷酸佐剂组合物。

在一个特别相关方面方面，本发明提供一种用以促进一物质的抗原性的免疫原组成物，包含该聚核苷酸佐剂组合物以及一仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病抗原，其中该狂犬病抗原的存在应达到一最低量，例如超过1个国际单位(IU)。

在相关实施例中，该免疫原组成物包含该聚核苷酸佐剂组合物以及仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病抗原，其中该狂犬病抗原的存在应达到一最低量，例如超过0.25个国际单位，超过0.5个国际单位，超过1.2个国际单位，超过1.4个国际单位，超过1.6个国际单位，超过1.8个国际单位，超过2.0个国际单位，超过2.2个国际单位，超过2.4个国际单位，超过2.6个国际单位，超过2.8个国际单位，超过3.0个国际单位，超过3.2个国际单位，超过3.4个国际单位，超过3.6个国际单位，超过3.8个国际单位，或是超过4.0个国际单位。

在一个特别相关方面，本发明提供一种用以促进一物质的抗原性的免疫原组成物，它包含该聚核苷酸佐剂组合物以及仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病抗原，其中该佐剂和狂犬病抗原呈现约1比1的比例。

在相关实施例中，该免疫原组成物包含该聚核苷酸佐剂组合物以及仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病抗原，其中该佐剂和狂犬病抗原呈现低于1比10，约1比9，约1比8，约1比7，约1比5，约1比4，约1比3，约1比2，约2比1，约3比1，约4比1，约5比1，约6比1，约7比1，约8比1，约9比1，约10比1，或是大于10比1的比例。

在一个特别相关方面，本发明提供一种佐剂组合物或免疫原组成物，其中该免疫原组成物，或是被包含在该免疫原组成物的佐剂组合物，是呈现一固体或液体形态或是位于溶液或悬浮液内。

在一个特别相关方面，本发明提供一种佐剂组合物或包含一佐剂组合物的免疫原组成物，其中该佐剂组合物或免疫原组成物能被冷冻干燥。

在相关实施例中，本发明提供一种组合套装(KIT)，包含该佐剂组合物以及抗原物质。

在一个特别相关方面，本发明提供一种聚核苷酸佐剂组合物的用途，以制备促进宿主的免疫反应的药剂。

在一个特别相关方面，本发明提供一种用以促进对于抗原物的免疫反应的方法，包括将一用以促进抗原物的抗原性的免疫原组成物给予宿主，该免疫原组成物包含该聚核苷酸佐剂组合物。

在相关实施例中，将该免疫原组成物给予一宿主的方法可选自下列方法中的任一个方式，该方法包括有：胃肠道外注射、肌肉内注射、腹腔内注射、静脉注射、皮下注射、经呼吸道吸入、直肠传输、阴道传输、经鼻传输、经口传输、经眼传输、局部传输、透皮传输或皮内传输。

在一个特别相关方面，本发明提供一种用以促进对于抗原物的免疫反应的方法，包含将一用以促进抗原物的抗原性的免疫原组成物给予一宿主，该免疫原组成物包含该聚核苷酸佐剂组合物，其中该宿主是动物。

在一个特别相关方面，本发明提供一种用以促进对于抗原物的免疫反应的方法，包含将一用以促进抗原物的抗原性的免疫原组成物给予一宿主，该免疫原组成物包含该聚核苷酸佐剂组合物，其中该宿主是人类。

通过后续的详细叙述内容以及所附图式，本发明的上述特点和其它优点将会变得明显。

附图说明

第1图显示Av-PICKCa和PIKA样品的相对分子量。

第2图显示PIKA疫苗诱导特异性产生伽玛干扰素细胞因子的剂量依赖性生成。

具体实施方式

本发明可藉由后续对于本发明某些具体描述以及其中所包括的实施例的详细内容而更容易被了解。

本中请案在整篇内容中参照公开文献，这些公开文献的内容被并入本申请案中作为参考，以充分地叙述本发明所属技术领域的水准。

在进一步叙述本发明之前，应明暸本发明不会被局限于所述特定实施例中，因为这些实施例必然是多样的。亦应明暸本说明书中所使用的用语仅是为了阐述特定实施例，而非作为限制，因为本发明的范围将会被界定在所附申请专利范围中。

除非另行界定，本说明书中所使用的所有技术和科学用语均和本案所属技术领域中具有通常知识的人士所普遍明暸的意义相同。现在就实施本发明的较佳方法和材料加以叙述，但是和本说明书中所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用以实施或测试本发明。本说明书中所提到的所有公开文献均被并入于此作为参考，以揭示并说明所述公开文献中的方法及/或材料。

应注意，如本案说明书和申请专利范围中所使用的用语，除非前后文意指明另有其它意义，否则单数形用语“a”、“and”和“the”包括复数形用语。因此，例如提及“一个文句”即包括此文句的复数形式，提及“该片段”即包括提及一或多个片段以及熟习于本领域技术人士所知悉的等效体等等。此外应注意，申请专利范围可被撰写成排除任何可选择性成分。因此，此一说明是要作为使用例如“仅有(solely)”、“只有(only)”等排除性用语于申请专利范围构成要件的相关载述内容时或是使用“负向”限制(“negative”limitation)时的前述基础(antecedentbasis)。

名词定义

在陈述本发明的详细内容之前，应当了解被使用于本说明书中的数个用语。

使用于此处的“佐剂”此用语是指增加或改变宿主对于抗原物的免疫反应的任何物质或物质混合物。特定地说：

1.“PICKCa”此用语是一般性地指称一个由PIC、卡那霉素和钙所构成的组合物，而组合物无特定的物理和免疫原性特性。

2.“Av-PICKCa”是指PICKCa在商业上被使用作为抗病毒药剂的形式。

3.“PIKA”是指本发明组合物，包含PIC、一抗生素(例如卡那霉素)以及一阳离子(例如钙)，其中所述PIKA的特征在于物理特性(例如本说明书中所叙述的分子量、大小等)，以使得PIKA在给予后可展现出一个佐剂的特性，且具有相较于以PICKCa为例更低的不良副作用(例如毒性降低)以及相较于以Av-PICKCa为例更高的效力强度(例如诱导增进的免疫反应)。

“含PIC分子”或“含PIC物”是非限制性地指称PIC，它可选择性地通过复合或组合以上所述含PIC分子的组合物中的一抗生素(例如卡那霉素)以及一阳离子(例如钙)中的至少一者或二者。

在本发明佐剂组合物的前后文中所使用的“异质”此用语是指该组合物的成份(例如含PIC分子)在分子量、大小或此二者的物理特性上不是均一的。

“动物”此用语包括人类及所有畜养和野生的动物及禽鸟，其非限制性地包括牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡等。

“抗体”此用语包括多株及单株抗体以及这些抗体的抗原物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv片段，以及这些抗体和片段的单链衍生物。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双官能型(bifunctional)和拟人化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。

如本说明书中所使用，“抗原物”此用语是指可在适当情形下被免疫系统所辨识(例如结合至抗体或被加工，以诱导细胞免疫反应)的任何物质。

“抗原”是指一种物质，包括呈现疫苗形式的组成物，其中该疫苗本身包含抗原物，且可以包含或可以不包含除了PIKA以外的佐剂，当经由适当途径(例如胃肠道外)给予时，该抗原会引起例如形成抗体等免疫反应，包括特定地结合该抗原的抗体。抗原的两个特性在于它们的免疫原性以及它们的抗原性，免疫原性也就是它们在活体内引起免疫反应的能力，抗原性也就是它们被抗原诱导产生的抗体所具有的选择性辨识能力。

“细胞免疫(cell-mediated immunity)”和“细胞免疫反应(cell-mediated immune response)”等用语是指淋巴细胞所提供的免疫防御力，例如T淋巴细胞在靠近受害细胞时所提供的防御力。一个细胞免疫反应通常包括淋巴细胞的增殖。当测量“淋巴细胞的增殖”时，会测量淋巴细胞因应一特定抗原的增殖能力。淋巴细胞增殖是指B细胞、T-辅助细胞或细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)的细胞增殖。

“抗原物有效量”是指抗原物的用量将会致使个体产生针对该抗原物的一个特异性免疫反应，该抗原物可选择性地和一佐剂组合。

“增加免疫反应”此表达方式或类似表达方式的意思是，相较于先前的免疫反应状态，免疫反应被提高、改善或上升，而对宿主有利，所述先前的免疫反应状态是例如给予本发明的免疫原组成物之前的免疫反应状态。

“体液免疫力(humoral immunity)”和“体液免疫反应(humoralimmune response)”等用语是指因应抗原刺激而产生抗体分子的免疫形式。

“免疫反应”此用语是指一脊椎动物个体的免疫系统对于抗原物的任何反应。典型的免疫反应包括但不限于细胞和局部及系统性体液免疫反应，例如包括CD8+CTLs的抗原特异性诱导作用在内的CTL反应、包括T-细胞增殖反应和细胞因子释出作用在内的辅助型T-细胞反应，以及包括抗体反应在内的B-细胞免疫反应。

本说明书所使用的“诱导免疫反应”此用语是一般性地包含一免疫反应的诱导及/或增效(induction and/or potentiation)。

“产生免疫反应”此用语是指刺激、起始或引起一个免疫反应。

“增强(potentiating)免疫反应”是指一个既存的免疫反应被改善、助长、补充、扩增、促进、增加或延长。

“聚I:C”或“PIC”等用语是指一个含有聚核糖肌苷和聚核糖胞苷核酸的组合物，亦分别称作为聚肌苷酸-聚胞苷酸。

“免疫原量”此用语是指，相较于没有聚核苷酸佐剂时所观察到的免疫反应，抗原物加入本发明的组合物共同给予时足以刺激免疫反应抗原用量。

“免疫增效量(immunopotentiating amount)”此用语是指，相较于没有聚核苷酸佐剂时所观察到的抗体效价及/或细胞免疫反应，当佐剂和抗原物在本发明组合物内共同给予时，致使抗体效价及/或细胞免疫反应增加所需的佐剂量。

如本说明书中所使用，“混合”此用语包括用以组成组合物的成份的任何方法；这些方法包括但不限于掺合、分配、溶解、乳化、凝集、悬浮或将组合物的组成份合理地加以组合的其它方法。

″药学上可接受的盐″的化学物意指该盐是药用上可接受的，且拥有母化合物的所需药理活性。这些盐包括：(1)合成盐的酸，例如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸共同形成盐；或是和例如乙酸、丙酸、己酸、环戊丙酸、乙二酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯醯基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、葡萄糖甲酸、4，4′-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、三级丁基乳酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、麸胺酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等有机酸等共同形成盐；或是(2)当母化合物中所存在的酸性质子被一如碱金族金属离子、碱土族金属离子或铝离子等金属离子所置换，或是配位有如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、胺基丁三醇(tromethamine)、葡甲胺(N-methylglucamine)等有机碱时，所形成的盐。

“治疗”此用语涵盖对于脊椎动物(特别是人类)体内的疾病的任何处理，且包括：(i)预防一可能有罹病倾向但尚未诊断出罹病的个体发生疾病；(ii)遏制疾病，例如阻止该疾病的发展；或是(iii)舒缓疾病，例如致使该疾病消退。

本说明书中所使用的“单位剂型”此用语是指数个在实体上呈分离的单位，适合作为使用于人类和动物个体的单位剂量，各个单位含有一预定量的本发明组合物，该预定量经计算后呈现一个足以和药学/药理上可接受的稀释剂、载剂或载体共同产生所需效应的用量。

发明总论

本发明关于用在人类、动物或细胞培养物中促进免疫反应的组合物和方法，该免疫反应可为体液及/或细胞免疫反应。一般而言，该组成物包含一种含有一佐剂的免疫原组成物。该佐剂的存在会促进或改变免疫反应。因此，该体液及/或细胞免疫反应因该佐剂的存在而更加有效。此外，该佐剂可藉由影响免疫球蛋白和细胞因子的数种亚型(异构型)的产生而改变免疫反应的品质。

该佐剂的关键特性在于它能诱导所需的免疫反应水平和种类而不会引起相应不良副作用的能力。目前仅有少数经过批准供人类使用的佐剂具有此种特性组合。免疫原物质(特别指疫苗)的安全标准是严格且严厉执行的。因此，研发出一种成功佐剂的主要限制在于研发出一种足以诱导一适当免疫反应的有效产品，而不会引起相应不良副作用。

本发明的较佳实施例是一种聚核苷酸佐剂，其中该聚核苷酸是聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)。PIC已单独地显示为一种有效的佐剂，但会展现出令人无法接受的安全性特质，且在人类和灵长类动物体内不稳定。本发明提供一种由PIC和一抗生素及阳离子相组合而成的组合物，它能促进一佐剂的所需免疫原特性，并改善安全性和稳定性特质。

本发明的进一步基础是来自于发现佐剂组合物的PIKA分子的物理和生物特性会影响免疫反应和不良副作用。本案发明人在研发期间意外地发现，以后述方式来调整该聚核苷酸佐剂的某些特性，它在就会或多或少地变得有效及/或者或多或少地变得具有毒性。因此，从物理特性的角度来界定该佐剂组合物，即有可能更正确地描述该佐剂组合物在提供较佳免疫原性反应和较佳安全性/稳定性特质上的特性。

因此，在此被简称为PIKA佐剂的本发明佐剂完全地被它的化学组成加上构成该佐剂的分子的基本物理特性的组合所界定。因此，展现出优越免疫原性质且同时能安全使用于动物或人类的PIKA的特定形式被最适当地由一或多个通常是呈组合的特定特质所界定，包括组成、分子量、分子大小、浓度和pH。

PIKA通常包含一聚核苷酸、一抗生素以及一阳离子，其中该聚核苷酸可为聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)，且该抗生素是胺基糖苷(例如卡那霉素、链霉素、泰百霉素(tobramycin)、新霉素、蒽环霉素、硫酸丁酰苷菌素、庆大霉素、潮霉素、丁胺卡那霉素、双去氧卡那霉素、暗霉素、美它酰胺、嘌呤霉素或链脲霉素)，以及该离子是钙、镉、锂、镁、铈、铯、铬、钴、氘、镓、碘、铁或锌。

“胺基糖苷”抗生素是指该抗生素在结构上含有藉由糖苷键而接合至一个胺基环醇环(己糖核心)的胺糖。胺基糖苷抗生素是从多种链霉菌(Streptomyces)和小单孢菌(Micromonospora)衍生而来，或是合成生产。例如，卡那霉素是一种得自于土壤细菌SteptomycesKanamycetics的胺基糖苷抗生素，用于治疗多种感染，特别是由格兰式阴性细菌(Gram-negative bacteria)所导致的感染。

PIKA组合物是经由在一个具有pH6至pH8的pH值的氯化钠/磷酸盐缓冲液内，将聚肌苷酸、聚胞苷酸、一抗生素和一阳离子来源加以混合而制成。聚肌苷酸和聚胞苷酸的浓度通常为0.1至10mg/ml，较佳为0.5至5mg/ml且更佳为0.5 to 2.5 mg/ml。增色值(hyperchromicityvalue)应高于10％，较佳为高于15％且更佳为高于20％。PIC的制备以及和卡那霉素和钙的组合最好是在符合于国际优良制程规范的品质标准下进行。

在本发明的某些实施例中，聚核苷酸佐剂组合物内的卡那霉素可和一或多种抗生素共同使用或被一或多种抗生素所取代，这些抗生素选自于包括泰百霉素、蒽环霉素、硫酸丁酰苷菌素、庆大霉素、潮霉素、丁胺卡那霉素、双去氧卡那霉素、暗霉素、美它酰胺、新霉素、嘌呤霉素、链霉素和链脲霉素所构成的群组中。本发明聚核苷酸佐剂组合物内的抗生素(例如卡那霉素等)的浓度通常为约10至100,000单位/ml，较佳为约100至10,000单位/ml，且更佳为约500至5,000单位/ml。

在本发明的某些实施例中，该聚核苷酸佐剂组合物更包含一个阳离子(阳离子)，通常是一个二价阳离子，且通常是一个碱金族金属的一个阳离子。在本发明的组合物内，该阳离子一般被用作为一个阳离子的来源，例如一种盐或复合物，例如一种有机或无机盐或复合物，且通常是一种无机盐或有机复合物。典型的阳离子包括但不必然限于钙、镉、锂、镁、铈、铯、铬、钴、氘、镓、碘、铁或锌。

本发明的组合物内可配有阳离子(例如钙)，该阳离子的浓度位在约10umol至10mmol/ml的范围内，较佳为约50umol至5mmol/ml，且更佳为约100umol至1mmol/ml。

如前所述，阳离子可以呈任何适当的盐或有机复合物的形式，包括但不必然限于氯化物、氟化物、氢氧化物、磷酸盐或硫酸盐。例如，当该阳离子是钙时，则该离子可呈碳酸钙、氯化钙、氟化钙、氢氧化钙、磷酸钙或硫酸钙的形式。

当本发明佐剂组合物中的阳离子是钙时，则它可和其它阳离子相组合或被其它阳离子所取代，这些阳离子包括镉、锂、镁、铈、铯、铬、钴、氘、镓、碘、铁或锌，其中这些离子可呈无机盐或有机复合物的形式。

所得的组合物经由一个额外的制造过程而被进一步转变成为PIKA，这个额外的制造过程涉及分离具有所界定的分子大小及/或重量的分子。利用过滤、层析、热处理、离心分离、电泳以及已经成为标准过程的类似方法来分离出具有特定特性的聚核苷酸分子，是熟习于本领域技术人士所知悉的。

在本发明的某些实施例中，该聚核苷酸佐剂组合物进一步藉由分子量的物理特性来界定。在研发期间，本案发明人意外地发现聚核苷酸佐剂组合物的分子量和有效性之间存在有正相关性。一个含有该聚核苷酸佐剂组合物的免疫原组成物被观测到的效力强度水平，包括诱导免疫球蛋白和细胞因子产生的能力，会随着聚核苷酸佐剂组合物的分子量增加而上升。聚核苷酸佐剂的分子量可藉由实施例1所述琼脂糖凝胶电泳来测定。

如后续实施例部分所述，本案发明人已发现，含有一个多样化分子量的PIKA佐剂的疫苗组成物在分子量和抗原特异性保护效力强度之间会展现出直接的关联(参见实施例2)。类似地，本案发明人已发现，当PIKA佐剂组合物和一狂犬病抗原组合给予宿主时，PIKA佐剂组合物的分子量和诱导伽玛型干扰素产生的能力之间存在直接的关联(参见实施例3)。

本案发明人于1996年在中国所进行的人体试验期间，利用一种带有佐剂的狂犬病疫苗而该佐剂包含极高分子量规格的PICKCa，本案发明人进一步鉴定出，所得组合物意外地显示出具有令人无法接受的不良副作用水平。在1996年临床试验所得到的结果在先前未被公开，现在显示于实施例4中。对于分子量的研究则显示于实施例5和6中。该试验是在中国卫生部食品药物管理部门的管辖下进行。因此，若基于当时的知识已经可以预期到这些不良副作用，则该佐剂将不会在一个受监管的临床环境中给予人体实验。

本案发明人已发现，在临床前试验中分子量达到1.0×106的本发明PIKA佐剂组合物，以及含有分子量达到5.5×105的PIKA佐剂组合物的疫苗组成物，在特定毒性试验中显示出宽广的安全性范围(参见实施例7)。具有最高分子量为1.2×106的PIKA已被成功地使用在临床前研究中(参见实施例3)。本案发明人所进行的进一步研究显示PIKA和一个抗原物合并成疫苗形式时的安全性(参见实施例8)。

本案发明人于2002年在中国所进行的一项后续实验结果亦显示，应用PIKA可提供一种安全且有效的人用佐剂。此实验的结果先前未被公开，现在显示在实施例9中。

因此，以前述观察为基础，PIKA的较佳实施例中所包含的分子在分子量及/或大小上具有物理特性，这些物理特性能够增加效力强度和有效性的益处，同时提供一个适当的安全性范围以不引发任何不良副作用。在Av-PICKCa内所存在的分子，位在分子量范围的较低端，可有效地作为一种抗病毒合成物，但在一免疫原组成物内使用作为佐剂时，显著地较PIKA的分子组成低效。此外，PIKA已显示具有较PICKCa更佳的安全性表现。

因此，本发明的一个关键方面是本发明组合物PIKA的分子量。

PIKA的创作性组成一般包含一组或一群分子，其中这些分子在例如分子量及/或大小上具有物理特性，这些物理特性在诱导免疫反应上提供所需的效应，且更好地减低或避免不良副作用(例如给予PICKCa时所并发的不良副作用)。一般而言，PIKA的分子在分子量及/或大小上是异质的。

除非另外指明，否则本说明书中所通称的本发明佐剂组合物PIKA包括PIC，该PIC可和一抗生素(例如卡那霉素)以及一阳离子(例如钙)相复合。PIKA内的分子在分子量(例如以道尔顿来估算)或是大小(例如以沉降系数来估算)上是异质的。

当使用一个范围来描述PIKA分子的异质特性(例如分子量或大小)时，此一范围的描述在本说明书中是指PIKA分子在组合物内的分子量或大小的概略下及上限，而不是暗示或指出该组合物具有代表该范围内的每一分子量或大小的PIKA分子。因此，例如分子量范围为约66,000至1,200,000道尔顿是指约66,000道尔顿至约1,200,000道尔顿的PIKA分子被包含在组合物内，但88,000道尔顿的PIKA分子不必然存在于组合物内(虽然此分子确实可以存在)。

当以分子量范围来界定本发明组合物内的PIKA分子的物理特性时，这些PIKA分子在分子量上是异质的，其中该分子量范围为约300,000至660,000道尔顿，约300,000至1,200,000道尔顿，约66,000至660,000道尔顿，或是约66,000至1,200,000道尔顿。

本发明亦思及具有在分子量上呈异质的PIKA分子的组合物，其中该分子量范围为约300,000至2,000,000道尔顿，约300,000至4,000,000道尔顿，约500,000至1,000,000道尔顿，约1,000,000至1,500,000道尔顿，约1,500,000至2,000,000道尔顿，约2,000,000至2,500,000道尔顿，约2,500,000至3,000,000道尔顿，约3,000,000至3,500,000道尔顿，约3,500,000至4,000,000道尔顿，约4,000,000至4,500,000道尔顿，或是约4,500,000至5,000,000道尔顿。位在这些范围的上和下限处以及位在这些范围内的PIKA分子均存在于组合物内。

当以平均分子量来界定本发明组合物内的PIKA分子的物理特性时，该PIKA分子的平均分子量可等于或高于150,000道尔顿，等于或高于250,000道尔顿，等于或高于350,000道尔顿，等于或高于500,000道尔顿，等于或高于650,000道尔顿，等于或高于750,000道尔顿，等于或高于1,000,000道尔顿，等于或高于1,200,000道尔顿，等于或高于1,500,000道尔顿，或是等于或高于2,000,000道尔顿。

当以沉降系数来界定本发明组合物内的PIKA分子的物理特性时，沉降系数是分子量和大小的一个度量，该PIKA分子的沈降系数(S)可为高于9S或高于约12S或高于约13.5S，或高于15S，或高于16S，或高于17S，或高于18S，或高于19S，或高于20S，或高于21S，或高于22S，或高于25S，或高于30S。

在一些实施例中，本发明提供一种聚核苷酸佐剂组合物，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那霉素和钙，其中该组合物排除一可测得数量的分子，这些分子的分子量大约或低于30,000道尔顿，大约或低于40,000道尔顿，大约或低于50,000道尔顿，大约或低于60,000道尔顿，大约或低于70,000道尔顿，大约或低于80,000道尔顿，大约或低于90,000道尔顿，大约或低于100,000道尔顿，大约或低于150,000道尔顿，大约或低于200,000道尔顿，大约或低于250,000道尔顿，大约或低于300,000道尔顿，大约或低于350,000道尔顿，大约或低于400,000道尔顿，大约或低于450,000道尔顿，大约或低于500,000道尔顿，大约或低于600,000道尔顿，大约或低于700,000道尔顿，大约或低于800,000道尔顿，大约或低于900,000道尔顿，或大约或低于1,000,000道尔顿。在此实施例中，在这些被排除的分子不具有显著的免疫原效应的程度上排除这些较低分子量分子是特别有利的。

本案发明人已在特定毒性测试中显示，包含分子量达到1.0×106道尔顿的分子的PIKA对于动物是安全的(参见实施例7)。包含有最高分子量为1.2×106道尔顿的分子的PIKA已安全地使用在临床前测验中(参见实施例3)。当PIKA使用于一免疫原组成物时亦显示具有安全性(参见实施例8)。PIKA的组成在有效性上提供了优点。包含有分子量低至6.6×105道尔顿的分子的PIKA在使用于人类及动物时也会诱导有效的免疫反应，且具有广宽范围的安全性。将所需要的最小分子的分子量提高至6.6×105道尔顿，且较佳为提升至3.0×105道尔顿，可改善佐剂的有效性，而无需在安全性标准上妥协。

本案发明人已进一步发现，聚核苷酸佐剂组合物的浓度可能会影响到该组合物内所含分子的分子量。PICKCa的分子量已显示会随着佐剂组合物的浓度的上升而增加(参见实施例5)。本案发明人已观察到，聚核苷酸佐剂浓度上升会造成PICKCa分子的聚结(或称凝集)，而使得分子具有较高的分子量。这个过程已被显示为不可逆。因此，聚核苷酸佐剂组合物后续稀释于一适当媒质中不会造成佐剂分子分子量的降低。如实施例6中所观察，当聚核苷酸佐剂组合物的浓缩大分子形式和狂犬病抗原相组合时，结果得到一个保留有高分子量范围的组合物。以这个方式所形成的一种狂犬病疫苗在人体临床试验中显示出不良副作用(参见实施例4)。

本发明的PIKA组合物可被配入任何生理上可接受的缓冲液内，但以磷酸盐缓冲液为佳。亦可使用如乙酸盐、三羟甲基氨基甲烷(tris)、碳酸氢盐、碳酸盐等其它可接受的缓冲液作为磷酸盐缓冲液的取代品。

水溶液成份的pH值在4.0和10.0之间较佳，但更佳是将该系统的pH值调整至6至8.5，这pH值不会显著降低其它组成份的稳定性，且不至于在生理上不兼容。在某些实施例中，该免疫原组成物的水分是缓冲化的生理盐水。欲以胃肠道外方式给予这些组成物时，较佳是将这些溶液制成张力(即渗透压)基本上和正常生理体液相同，以避免组成物因组成物和生理体液之间的差异性离子浓度而在给予后组织膨胀或快速吸收。

缓冲化生理盐水在这些组成物内的用量是将组成物数值达成整数所需的用量。也就是说，足够的缓冲化生理食盐水用量将会和其它成份相混合而达成100％，以使组成物达到所需体积。

在某些实施例中，抗原可从一天然来源被纯化而得、由固相合成而得，或是由基因重组技术而获得。抗原可包含一个蛋白质片段，该蛋白质片段含有该分子的一或多个免疫原区。抗原亦可从活的、减毒的、或截短的或被灭活的完整细胞或微生物(例如完整病毒颗粒)来提供。

在其它的实施例中，抗原包括一或多种成分，源自于感染性微生物、植物抗原、癌肿、过敏性物质以及例如会引发自体免疫疾病的其它人类抗原。在其它的实施例中，抗原包括一或多种感染性微生物，源自于病毒、细菌、分枝杆菌、真菌及寄生虫中的任一种。

本发明的聚核苷酸佐剂组合物亦可用于促进免疫反应，该免疫反应是针对运用DNA疫苗所产生的抗原。这些疫苗中用以抗原编码的DNA序列可以是″裸露的″，或是被容纳在一个如脂质小体的载体系统内。

在某些实施例中，该聚核苷酸佐剂组合物可和疫苗组合使用。疫苗是可含有其他佐剂或不含其他佐剂。所包括的疫苗种类为抗感染疾病、抗癌、抗过敏、抗自体免疫以及免疫避孕。

本发明亦思及本发明聚核苷酸佐剂和任何适合的狂犬病抗原的组合应用。

在某些实施例中，狂犬病抗原可为如仓鼠肾细胞灭活粗制狂犬病抗原(HKC-ICRA)等灭活粗制狂犬病抗原，或是仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)等灭活纯化型狂犬病抗原。

在某些实施例中，该聚核苷酸佐剂组合物可和一狂犬病疫苗共同使用。适合的狂犬病疫苗是商业上可购得的或是仍在研发中，包括灭活型、亚单位型、基因重组型和多肽型疫苗，例如人类双倍体细胞疫苗(HDCV)，或是仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病疫苗(HKC-IPRV)，或是仓鼠肾细胞灭活粗制狂犬病疫苗(HKC-ICRV)，或是纯化型Vero细胞狂犬病疫苗(PVRV)，或是纯化型鸡胚细胞(PCEC)，或是纯化型鸭胚疫苗(PDEV)。但是，这些狂犬病疫苗并非都能够诱导在暴露前和暴露后免疫法中具有重要性的细胞免疫反应。当聚核苷酸佐剂组合物(例如PIKA)和狂犬病疫苗共同给予时，被引起的免疫反应包括：非-特异性反应(例如巨噬细胞功能上升)、体液反应(例如增进特异性抗体的产生)以及细胞免疫反应(例如产生细胞因子，包括干扰素及白介素-2)。

在某些实施例中，本发明提供一种组合套装(KIT)，包含该聚核苷酸佐剂以及抗原物。

一种包括有PIKA的免疫原组成物能够以二种方式来引起特异性免疫反应：i)体液免疫反应，涉及刺激B细胞产生抗体或免疫球蛋白(其它细胞亦涉及产生抗体反应过程，例如抗原-呈示细胞(APCs，包括巨噬细胞)及辅助性T细胞(Th1和Th2)，以及ii)细胞免疫反应，一般涉及T细胞、包括细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)和其它涉及CTL反应的产生例如，Th1和/或Th2细胞以及APCs。业界已熟知用以评估一个体内的体液及/或细胞免疫反应的方法(参见实施例10、11、12及13)。

此外，该聚核苷酸佐剂组合物可藉由影响所产生的免疫球蛋白亚型(异构型)(对人类IgGs而言是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；对小鼠IgGs而言是IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)以及它们的亲和力，来改变免疫反应的性质。

在鼠体中，被Th1细胞所调控的反应会产生IgG1、IgG2a、IgG2b以及较少的IgG3，亦有利于针对抗原产生细胞免疫反应。若对于抗原的IgG反应是被Th2型细胞所调控，则其主要为增进IgGI and IgA的产生。

利用一种由PIKA佐剂和仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病抗原所构成的组成物来进行的NIH效力实验意外地显示出，该组成物的免疫力强度需要一最少量的狂犬病抗原的存在(参见实施例14)。该组成物的效力强度相对于超过1 IU抗原量的额外狂犬病抗原的存在而迅速增加。因此，经观察，该组成物在效力强度上的增加速率是在组成物存在有约1.5IU至2.5IU的狂犬病抗原时达到最高点。该NIH效力实验被描述在：Laboratory Techniques in Rabies，Edited by F X Meslin，M MKaplan H Koprowski，4th Edition，ISBN 92 4 1544 1。

利用一种由PIKA佐剂和仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病抗原所构成的组成物来进行的试验显示，该组成物的免疫力强度随着佐剂体积超过抗原体积量而增加。当PIKA对于仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病抗原的比例增加时，该效力强度会增加，且较佳体积比例为高于3∶1。(参见实施例15)

本发明思及将本发明聚核苷酸佐剂和抗原共同使用的方法，以例如诱导机体内的抗原特异性体液反应及/或特异性T细胞免疫反应。所诱导的免疫反应可为在之前没有免疫的个体中对于抗原的反应，或是可用以促进一之前已有的免疫反应(例如加强剂)。

在某些实施例中，PIKA佐剂组合物以及一种包含PIKA佐剂和抗原物的免疫原组成物可被冷涷干燥，以呈固体形式长时稳定保存。冷涷干燥法是熟习本领域技术人士所知悉的。将含PIKA和抗原物的免疫原组成物冻干物加水溶解显示其维持原有的有效性水平(参见实施例16)。

该免疫原组成物可被制备成为一种可注射型溶液、悬浮液或乳剂。所需免疫原组成物配方的制备被一般性地叙述在New Trends andDevelopments in vaccines，edited by Voller et al.，University Park Press，Baltimore，Md.，USA，1978。本发明的免疫原组成物可以用作以下剂型，例如胶囊、溶液、乳剂、悬浮液或酏剂等形式来胃肠道给予，任何无活性媒介物可供优选使用，例如生理食盐水，或磷酸盐缓冲化生理食盐水，或是能适当溶解本发明方法所使用的化合物以供本发明方法应用的任何媒介物。

本发明的免疫原组成物可利用多种熟知的方法给予机体。在某些实施例中，免疫原组成物可藉由胃肠道外途径给予，例如肌肉、腹腔、静脉、皮下注射等注射方式，或是经呼吸道吸入。在其它实施例中，该免疫原组成物可经直肠、阴道、鼻、口、眼、透皮或皮内局部来给予。被囊封的抗原物当给予形式是注射时，会停留在注射部位长达两周，从而提供一个在活体内产生持续式释放或脉冲式释放的抗原储释点。这个传输系统可针对需要多次注射才能诱导免疫反应的抗原物制成单次注射型免疫原配方。

例如，对于以水溶液进行胃肠道外给予而言，该溶液在必要时应该被适当地缓冲化，且先以足量的生理食盐水或葡萄糖来稀释以使其呈现等张。这些特定的水性溶液特别适用于静脉和腹腔内给予。关于这点，熟习本领域技术人士将可参照本案揭示内容而知悉可供使用的无菌水性媒媒物。可供本发明使用的典型注射媒介物包括含有或不含有分散剂及/或防腐剂的缓冲液，以及食用油、矿物油、鳕鱼肝油、角鲨烯(squalene)、一-、二-或三酸甘油酯，以及这些成份的混合物。

这些组成所需的精确用量是随着个体不同，依据个体的物种、年龄、体重及一般状态，被治疗或预防的疾病、感染或病况的严重性，所使用的特定物质及它的给予形式等而有所变化。熟习于本领域技术人士得知本说明书的教示内容后，可仅仅利用例行实验而决定适当的用量。初次给予后，个体可再接受一或多次适当间隔的追加免疫。

以上所述内容是一般性地叙述本发明。以下描述实施例将可协助了解本发明。这些实施例仅以例示说明为目的，而非意图对于本发明的范围加以限制。当情势所趋或为因时制宜时，当可思及本发明在形式上的变化和等效性取代。虽然本说明书使用特定的用语，但是这些用语是意图供说明之用，而不是以限制为目的。

实施例

实施例1.测定PIKA和AV-PICKCA的分子量

这个实施例说明PIKA佐剂的测定方式，并和Av-PICKCa作比较。

琼脂糖凝胶电泳已为熟习于本领域技术人士所知悉，因此本说明书仅叙述本发明的特点。本发明所使用的琼脂糖凝胶具有1.5％琼脂糖的浓度。分子标记是100bp至1000bp的100bp DNA梯状谱带，对应于6.6×104至6.6×105道尔顿的分子量范围。4ul加载样品的浓度是1mg/ml。第1图显示参照本段落的教示内容所得到琼脂糖凝胶样品结果的一个代表图。五个(5)不同批次的测验显示它们的分子量分布的宽广范围。它们的分子量上限是位在Av-PICKCa为2.3×105道尔顿至PIKA为5.28×105道尔顿的范围内。

实施例2.PIKA和AV-PICKCA的免疫有效性的比较

这个实施例显示最高分子量为230,000道尔顿的Av-PICKCa和最高分子量为528,000道尔顿的PIKA样品在效力强度上的差异。

将三批不同分子量的PIKA佐剂，以及一批具有对应于Av-PIKA分子量的分子量的分子，和仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)相组合。随后，令所得组成物接受NIH效力试验。

该NIH效力试验是一个严格且大量试验比较性研究，以比较受检狂犬病疫苗和标准型狂犬病疫苗。以一个活狂犬病病毒品系来感染接种疫苗后的小鼠，并测量它们的存活率。将不同稀释程度的狂犬病疫苗给予不同群组的小鼠。将被暴露于实验性及标准型疫苗的小鼠群组之间的存活率加以比较，而测定出实验性疫苗的效力强度(LaboratoryTechniques in Rabies，Edited by F X Meslin，M M Kaplan H Koprowski，4th Edition，ISBN 92 4 1544 1)。

将各个受检验的组合了PIKA佐剂的疫苗的有效性相对疫苗标准品予以规格化，其中疫苗标准品的有效性被标定为1，且将相对有效性标定成受检组合型疫苗的有效性较非组合型标准品增加的倍数。表1概述这些结果。如表1所示，PICKCa佐剂的分子量愈高，增加狂犬病疫苗效价所得的有效性就愈高。

表1.分子量对于狂犬病疫苗效力强度的效应

佐剂种类	抗原	样品#	佐剂的分子量上限	ED50	效力强度(IU/ml)
						PIKA	HKC-IPRA	20000304	5.28×105	2.10	5.00
PIKA	HKC-IPRA	20000907	4.62×105	2.00	3.98
						PIKA	HKC-IPRA	990202	3.96×105	1.98	3.80
Av-PICKCa	HKC-IPRA	000703	2.30×105	1.88	3.00
							HKC-IPRA	疫苗标准品		1.40	1.00

实施例3.PIKA和Av-PICKCA之间的干扰素产生比较

这个实施例显示，具有分子量上限为230,000道尔顿的Av-PICKCa样品和具有分子量上限为1,200,000道尔顿的PIKA样品之间在诱导干扰素产生的能力上的差异。

将二批具有分子量上限为1.2×106道尔顿及4.6×105道尔顿的PIKA，和一批具有分子量上限为2.3×105道尔顿的Av-PICKCa作比较。

令PIKA及Av-PICKCa组合物和仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)相组合。将这些组成物经皮下注射于小鼠。两小时后，测量每只小鼠的干扰素血清中含量量。测量干扰素的一般过程是熟习于本领域技术人士所知悉。简单来说，在一个96孔培养板中，在0.15ml/孔的量下被接种约30,000个L929细胞。三天后，当细胞生长至融合孔底的程度，将血清样品以1∶20至1∶640的比例来稀释，以血清0.1ml/孔加入孔内。各稀释样品均以三个复孔试验。将这些培养板在37℃下培育至隔日。将血清样品洗去。使用疱疹性口炎病毒VSV颗粒来检测干扰素的产生效价。表2显示被这些混合物所诱导产生的干扰素效价。如表2所示，PIKA样品的分子量愈高，被诱导产生的干扰素就愈多。

表2.分子量和干扰素产生之间的关系

佐剂种类

批次#

分子量

HKC-IPR

PIKA：HKC-IPR

干扰素

		道尔顿的上限	A批次#	A的比例	产生的效价
						PIKA	20010601	1.20×106	20001205	4∶1	868.6
PIKA	200009-7	4.62×105	20001205	4∶1	530.6
						Av-PICKCa	000703	2.30×105	20001205	4∶1	46.4

实施例4.1996年人用疫苗临床试验(具有毒性副作用)

这个实施例显示PICKCa佐剂和一疫苗相组合会在给予人体免疫后产生一个令人无法接受的不良副作用水平。

这个研究的目的在于评估一种狂犬病疫苗的安全性及免疫反应，该狂犬病疫苗包含浓度为11.95mg/ml及分子质量为69,700(请注意分子质量在此例中不等于道尔顿，参见实施例5)的PICKCa佐剂，以及仓鼠肾细胞灭活粗制狂犬病抗原(HKC-ICRA)。上述临床试验的结果和结论从未公开。

40位参与临床试验的病人被分成二个20人的群组。各群组在第1天、第3天、第7天、第14天及第30天经肌肉接受五次2ml的剂量注射。一组接受具有PICKCa佐剂的狂犬病抗原，且另一组接受具有铝佐剂的狂犬病抗原。

从安全性的观点，在各次注射后24小时、48小时及72小时就体温、局部和全身性症状进行观察。下列观察是：

表3.注射具有铝佐剂或PICKCa的HKC-ICRA之后的不良副作用

副作用	群组	志愿者数目	具有副作用的数目
				局部性	PICKCa        加HKC-ICRA	20	6
铝佐剂         加HKC-ICRAx5	20	2
			全身性		PICKCa        加HKC-ICRA	20	4

铝佐剂加HKC-ICRAx5

20

0

全身性不良副作用包括：发热(1例)、起疹(2例)、关节痛(2例)、淋巴节重大(1例)、喉部肿胀(1例)。局部性不良反应包括：注射部位皮肤变红(6例)。

本案发明人的后续研究将所观察到的副作用归因于佐剂内分子的分子量和大小(参见实施例5及6)。

实施例5.PICKCA浓度及它的分子量之间的关系

这个实施例显示增加PICKCa佐剂的浓度造成组成物的分子量增加。

可将PICKCa制成具有不同的浓度。假设PICKCa被制成不同浓度时是一种可以不同形式存在的聚合复合物。实验目的可使用激光散射技术来达成。激光散射技术已广泛地用以测定重量平均分子质量(Mw)以及回转半径(Rg)。仪器为商业上可购得且测量过程是熟习于本领域技术人士所知悉的。表4显示出，由激光散射技术所观察到的PICKCa分子量和它的浓度相关。

表4.由激光散射技术所观察到的分子量

PICKCa的浓度(mg/ml)	重量平均分子质量
		11.95	6.97×104
2.00	7.30×103
		1.00	2.00×103

实施例6.PICKCA的前浓度和疫苗分子量之间的关系

这个实施例显示PICKCa佐剂分子量的增加和所得组成物的分子量之间的关系，该所得组成物含有PICKCa佐剂以及仓鼠肾细胞灭活粗制狂犬病疫苗。

PICKCa样品的组合前浓度亦被怀疑会影响疫苗内的抗原。将数个PICKCa样品和一种仓鼠肾细胞灭活粗制狂犬病疫苗相组合。实验目的可使用激光散射技术来达成。激光散射技术已广泛地用以测定重量平均分子质量(Mw)以及回转半径(Rg)。仪器为商业上可购得且测量过程是熟习于本领域技术人士所知悉的。表5显示PICKCa的组合前浓度增加致使狂犬病疫苗的Mw增加。

表5.PICKCa的组合前浓度和狂犬病疫苗的Mw之间的关系

PICKCa的浓度(mg/ml)	重量平均分子质量	回转半径(Rg)
			11.95	29.6×104	17.2×102
4.00	22.2×104	15.0×102
			2.00	13.8×104	11.8×102
1.00	5.60×104	7.55×102
			1.00	5.29×104	6.50×102

实施例7.PIKA毒性测验

这个实验显示PIKA佐剂在限制最高分子量时的安全性特质。

依据中国国家药品标准的规定(WS1-XG-050-2000)进行一个毒性测验。简单来说，以0.5毫升/小鼠的量，将含0.3毫克具有分子量上限为约525,000至约1,000,000道尔顿的PIKA佐剂的氯化钠溶液静脉注射至五只(5)体重约18-22克的小鼠。观察经注射的小鼠7天，并在观察结束后称重。表6概述其结果，显示PIKA佐剂的分子量可高达1.0×106道尔顿，而不具有明显的毒性。

表6.PIKA佐剂毒性测验

批次#	分子量的上限范围(道尔顿)	小鼠的测验前体重(g)	尾部静脉注射量	测验结束时的小鼠状态	小鼠的测验后体重	意见
							20000304	5.25×105	18-19	0.5ml/小鼠	健康	23-26	通过
200101	5.20×105	18-19	0.5ml/	健康	22-25	通过

03			小鼠
							20010816	5.20×105	18-19	0.5ml/小鼠	健康	23-25	通过
20010511	1.00×106	18-20	0.5ml/小鼠	健康	24-26	通过

实施例8：疫苗组成物内的PIKA的毒性研究

这个实验的目的在于确认PIKA佐剂的安全性。

将PIKA佐剂(分子量66,000道尔顿至660,000道尔顿)和仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)以PIKA：HKC-IPRA为4∶1的比例相组合。

将由PIKA和HKC-IPRA所构成的疫苗组成物和一种商业上可购得的灭活纯化型狂犬病疫苗(IPRV)作比较，该灭活纯化型狂犬病疫苗(IPRV)含有一个铝佐剂。

将五剂(5)疫苗组成物在第0天、第3天、第7天、第14天及第28天时给予小鼠。给予的剂量相当于进行正常人类狂犬病免疫法的成人剂量的约300倍。

毒性观察的结果显示在下表7：

表7：给予狂犬病疫苗后的安全性观察

配方	效应	第0天	第3天	第7天	第14天	第28天
							HKC-IPRA加PIKA	过敏	0/20	0/20	0/20	0/20	2/20
HKC-IPRA加PIKA	死亡	0/20	0/20	0/20	0/20	0/20
							HKC-IPRV(包含铝佐剂)	过敏	0/20	0/20	0/20	5/20
HKC-IPRV(包含铝佐剂)	死亡	0/20	0/20	0/20	2/20	7/20

释义：(观察到的发生次数)/(总数)

得到结论是该PIKA/HKC-IPRA组合较商业上可购得的IPRV更安全。

实施例9：PIKA佐剂在人体的安全使用

在2002年，利用一个由PIKA组成物(分子量66,000至660,000道尔顿)和仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)所构成的组成物来免疫五位(5)志愿者。将该疫苗组成物在第0天、第3天、第7天、第14天及第30天时给予志愿者。

任何一位病人在各次接种疫苗后，都没有被观察到局部或系统性副作用。

利用标准NIH效力试验来测量疫苗的效力强度，结果显示在下表8：

表8：狂犬病疫苗的效力强度观察

免疫后天数	ED50	中和抗体IU/ml
			0	0	0
14	＞1.9	＞1.84
			45	2.35	5.17

上述结果指出由PIKA和HKC-IPRA所构成的疫苗组成物诱导特异性免疫反应并诱导了保护性中和抗体的产生。

实施例10.暴露后试验(细胞免疫反应)

暴露后试验是疫苗能够从受感染后的宿主身体根除病原的最明确证明。因此，它是疫苗诱导细胞免疫反应的一个指标。

在暴露后检验中，以狂犬病病毒的一个野生型品系来感染小鼠，随后接种以组合有PIKA佐剂(分子量范围从1.65×105至1.2×106道尔顿)的仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)，或是组合有氢氧化铝佐剂(铝佐剂)的HKC-IPRA，一商业上可购得的狂犬病疫苗(PVRV)，或是磷酸盐缓冲溶液(PBS)。结果显示出PIKA佐剂增进了存活率，参见表9。

表9.暴露后攻毒测验

9.1治疗后的死亡率

群组	预定80％死亡剂量	预定50％死亡剂量
			PIKA加HKC-IPRA	2/20	0/20
铝佐剂加HKC-IPRA	10/20	9/20
			PVRV	16/20	3/20
对照组(PBS)	15/20	14/20

9.2疫苗治疗后的存活率

群组	预定80％死亡剂量	预定50％死亡剂量
			PIKA加HKC-IPRA	90.00％	100.00％
铝佐剂加HKC-IPRA	50.00％	55.00％
			PVRV	20.00％	85.00％
对照组(PBS)	25.00％	30.00％

被皮下注射活狂犬病病毒所感染的小鼠在注射后第6小时、第1天、第2天及第3天以疫苗治疗。

实施例11.抗原特异性细胞免疫反应伽玛型干扰素的产生

伽玛型干扰素的产生是细胞免疫活性的一个指标。

在这个实验中，从二位试验组病人及二位对照组个体中采得血液样品。这些志愿病人已被接种以PIKA狂犬病疫苗，该PIKA狂犬病疫苗含有PIKA(分子量范围位在66,000至660,000道尔顿)以及仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)。在收集血液样品之前2.5年接种疫苗。

第2图中的结果显示出，相较于对照组个体，二位试验组病人所产生的伽玛型干扰素有显著的差异。

将从血液样品中分离出来的PBMCs和原来免疫中所使用相同的HKC-IPRA共同培育。1天后，以ELISPOT方法，检测特异性产生伽玛型干扰素的细胞数量。观察到一个剂量相依性效应。

上述观察所得到的结论是：

含有本发明PIKA佐剂的狂犬病疫苗具有特异性引起伽玛型干扰素产生的能力，且意味着可以诱导特异性细胞免疫反应。(也就是说，该反应是针对狂犬病抗原)，而不同于非特异性反应。

实施例12：PIKA的有效性试验

这个实验的目的在于显示PIKA在诱导伽玛型干扰素及白介素12(IL-12)的产生上的能力。

在干净的环境中，将取自正常健康小鼠分离的脾细胞样品在不同浓度PIKA(分子量范围位在66,000至660,000)的存在下培育。培育三天后，利用IL-12(p40)和伽玛型干扰素特异性抗体，以ELISA试验来分析上清液内的细胞因子水平。实验结果显示在下表10：

表10：细胞因子产生的活体外试验

PIKA刺激浓度ug/ml	IFN-伽玛产生浓度pg/ml	IL-12P40产生浓度pg/ml
			0	3	0
0.4	23	91
			2	22	98
10	30	134
			50	179	186
100	559	N/A
			250	1340	N/A

上述实验所得到结论是，PIKA诱导淋巴细胞剂量相依性产生伽玛型干扰素及IL-12细胞因子。。

在进一步的实验中，四只(4)小鼠经由腹腔注射被给予500ug/小鼠的PIKA(分子量范围位在66,000至660,000)。使用磷酸盐缓冲液作为负对照组试验。注射后5小时，取出血液样品并制备血清。利用IL-12(p40)和伽玛型干扰素特异性抗体，以ELISA试验来检测血清里的细胞因子水平。实验结果显示在下表11：

表11：细胞因子产生的活体内试验

	IFN-伽玛浓度pg/ml	IL-12P40浓度pg/ml
			PBS	4	2
PIKA	410	40

上述实验所得到结论是PIKA提示促进抗原提呈细胞功能，诱导细胞免疫功能。

实施例13：PIKA和灭活纯化型Vero细胞狂犬病抗原的共同使用

这个实验的目的在于评估组合有灭活纯化型Vero细胞狂犬病疫苗(PVRV)的PIKA的有效性。

将具有66,000至660,000道尔顿的分子量范围的PIKA和PVRV相组合，以形成一种狂犬病疫苗。使用NIH效力试验来评估所得疫苗组成物的效力强度。结果显示在下表12：

表12：对于PIKA及灭活纯化型Vero细胞狂犬病疫苗的NIH试验结果

疫苗组成物	抗原	佐剂	组成物效力强度
				PVRV	0.021 IU/ml	无	0.46
PVRV加PIKA	0.021 IU/ml	PIKA	3.68

得到的结论是PIKA会促进灭活纯化型Vero细胞狂犬病疫苗的效力强度。

实施例14.抗原剂量

这个实验显示需要具有最低量的仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)和PIKA佐剂(分子量范围从66,000至660,000道尔顿)共同存在于组成物中，以引起具有实质增进水平的特异性免疫反应。

将递增量的狂犬病抗原加入定量0.1mg的PIKA佐剂。用NIH标准狂犬病疫苗效力试验来检测其效力强度。在可预测到的原始效力强度增加之后，以及在如预期般达到效力强度稳定之前，随着抗原量的增加观察到一个明显且戏剧性的效力强度增加(参见表13)。

表13：增量的仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病抗原的疫苗效力强度

HKC-IPRA(IU)	HKC-IPRA    加0.1mg PIKA(IU)	每单位增加抗原量产生的效价增长倍数
			0.25	0.42	-
0.51	1.43	3.88
			1.01	2.73	2.60
1.40	6.07	8.56
			2.07	19.78	20.46
2.91	21.38	1.90

在HKC-IPRA抗原达到一IU后，观察到增加少量的HKC-IPRA，PIKA诱导疫苗效力强度明显增加。

得到的结论是在显著免疫反应被诱导之前必须存在最低的抗原量。过度的抗原量到某一点后，抗原量增加仅会回馈以些微增加的效力强度。

实施例15.抗原佐剂的比例

这个实验显示出仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)和PIKA佐剂(分子量范围位在66,000至660,000)的最佳混合量。

利用不同剂量抗原和不同剂量佐剂相混合，加入PBS以确保总体积的恒定。利用NIH效力试验来测定所得疫苗的效力强度。结果显示在表14。

试验结果的综合考量指出，最佳的疫苗组合是PIKA对于抗原的比例落在至少3比1的范围内。

表14：各种抗原和佐剂比例下的狂犬病疫苗效力强度

样品

HKC-IP

PIKA

PBS

比例

ED50

效力强

	RA(ml)	(ml)	(ml)	PIKA：HKC-IPRA		度(IU/ml)
							A	0.2	0.8	-	4.0至1	2.65	7.84
B	0.2	0.7	0.1	3.5至1	2.46	5.2
							C	0.2	0.6	0.2	3.0至1	2.4	4.22
D	0.2	-	0.8	0至1	1.85	1.43
							标准品			na	na	2.52	6.7

实施例16.PIKA以及组合有狂犬病疫苗的PIKA的冷冻干燥保存

这个实验显示PIKA在冷冻干燥形式下是稳定的。

冷冻干燥技术已被使用在长期保存狂犬病疫苗，可达三年以上。本案发明人想要试验PIKA(分子量范围从66,000至660,000)以及含有PIKA的狂犬病疫苗在冷冻干燥保存是否有利。下列组成物被使用在冷冻干燥保存试验中：i)未被冷冻的PIKA，加入经复原的冷冻干燥型仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)中，ii)经复原PIKA加HKC-IPRA的冷冻型干燥组成物，iii)经复原的冷冻干燥型市售狂犬病疫苗(未加入PIKA)，以及iv)未被冷冻的狂犬病疫苗标准品。表15显示出，经冷冻干燥的PIKA以及含有PIKA的狂犬病疫苗对于长期保存狂犬病疫苗是理想的。

表15.冷冻干燥保存对于狂犬病疫苗效力强度的影响

样品	ED50	相对效力强度	中和抗体IU/ml
				i)被PIKA所稀释的冷冻干燥型狂犬病疫苗	2.89	2.34	15.71
ii)被PBS所稀释的冷冻干燥型含PIKA狂犬病疫苗	3.00	3.00	20.23
				iii)被PBS所稀释的冷冻干燥型市售狂犬病疫苗	1.85	0.21	1.43

iv)未被冷冻的狂犬病疫苗标准品

2.52

1.00

6.70

虽然本发明是参照特定实施例而被描述，但应明了这些实施例是作例示性说明用，本发明的范围不仅限于此。对于本发明所属技术领域中具有一般知识的人士来说，本发明的选择的具体示例是很明显的。这些选择的实施例落在本发明的精神和范围内。因此，本发明的权利范围是由所附申请专利范围来载述，且能为前述揭示内容所支持。

Claims (26)

1.一种聚核苷酸佐剂组合物，包含：聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、抗生素以及阳离子，其中该组合物含有在分子量或大小中呈异质的聚核苷酸佐剂组合物分子，其中该分子量介于约66,000至1,200,000道尔顿的分子量范围内，且该大小介于约6.4S至24.0S的分子大小范围内。

2.如权利要求1所述的佐剂组合物，其中该聚核苷酸佐剂组合物的分子量范围是从约300,000至1,200,000道尔顿，或该分子大小范围是从约12.8S至24.0S。

3.如权利要求1所述的佐剂组合物，其中该聚核苷酸佐剂组合物的分子量范围是从约66,000至660,000道尔顿，或该分子大小范围是从约6.4S至18.3S。

4.如权利要求1所述的佐剂组合物，其中该聚核苷酸佐剂组合物的分子量范围是从约300,000至660,000道尔顿，或该分子大小范围是从约12.8S至18.3S。

5.一种聚核苷酸佐剂组合物，包含：聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、抗生素以及阳离子，其中该聚核苷酸佐剂组合物具有等于或高于150,000道尔顿的平均分子量，或是具有等于或高于9.3S的平均分子大小。

6.如权利要求5所述的佐剂组合物，其中该聚核苷酸佐剂组合物的平均分子量等于或高于250,000道尔顿，或是该平均分子大小等于或高于11.8S。

7.如权利要求5所述的佐剂组合物，其中该聚核苷酸佐剂组合物的平均分子量等于或高于350,000道尔顿，或是该平均分子大小等于或高于15.3S。

8.如权利要求1至7项中任一项所述的佐剂组合物，其中该抗生素是卡那霉素、新霉素、蒽环霉素、硫酸丁酰苷菌素、庆大霉素、潮霉素、丁胺卡那霉素、双去氧卡那霉素、暗霉素、美它酰胺(metrzamide)、嘌呤霉素、链霉素或链脲霉素。

9.如权利要求1至8项中任一项所述的佐剂组合物，其中该阳离子是钙、镉、锂、镁、铈、铯、铬、钴、氘、镓、碘、铁或锌；且其中该阳离子呈无机盐或有机复合物的形式。

10.如权利要求1至9项中任一项所述的佐剂组合物，其中该阳离子来源是氯化钙、碳酸钙、氟化钙、氢氧化钙、磷酸钙或硫酸钙。

11.如权利要求1至7项中任一项所述的佐剂组合物，其中该抗生素是卡那霉素硫酸盐，且该阳离子是由氯化钙所提供。

12.一种组合套装中，包含如权利要求1至11项中任一项所述的佐剂组合物以及抗原物。

13.一种免疫原组合物，包含如权利要求1至12项中任一项所述的聚核苷酸佐剂组合物以及抗原。

14.如权利要求13所述的免疫原组合物，其中该抗原是人类抗原、非人类动物抗原、植物抗原、细菌抗原、真菌抗原、病毒抗原、寄生虫抗原或是癌肿抗原。

15.如权利要求14所述的免疫原组合物，其中该抗原是狂犬病抗原。

16.如权利要求15所述的免疫原组合物，其中该抗原是灭活纯化型狂犬病抗原。

17.如权利要求16所述的免疫原组合物，其中存在的该仓鼠肾细胞的灭活纯化型狂犬病抗原大于1个国际单位。

18.如权利要求16任一项所述的免疫原组合物，其中该聚核苷酸佐剂组合物与仓鼠肾细胞的灭活纯化型狂犬病抗原的比例大于3比1。

19.如权利要求1至18任一项所述的免疫原组合物，其中该免疫原组合物包括能够同时引发增强的特异体液和/或细胞介导的免疫应答的佐剂。

20.如权利要求1至19任一项所述的佐剂组合物或免疫原组合物，其中该免疫原组合物或该免疫原组合物中包含的该佐剂组合物是呈固体形式或液体形式或存在于溶液或悬浮液中。

21.如权利要求1至20任一项所述的佐剂组合物或免疫原组合物，其中该佐剂组合物和/或该免疫原组合物被冷冻干燥。

22.一种用以增强对抗原物的免疫响应的的方法，该方法包含：将如权利要求1至21项中任一项所述的组合物给药于宿主。

23.如权利要求22所述的方法，其中该免疫原组合物可以通过选自包括下列途径的群组中的一个途径给药，该途径包括胃肠道外注射给药、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射、皮下注射、经呼吸道吸入、直肠给药、阴道给药、经鼻给药、经口给药、经眼给药、局部给药、透皮或皮内给药。

24.如权利要求1至23任一项所述的聚核苷酸佐剂组合物在制备用于增强宿主的免疫响应的药物中的用途。

25.如权利要求1至24任一项所述的方法，其中该宿主是人类。

26.如权利要求1至25任一项所述的方法，其中该宿主是动物。

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